Evaluación de la inmovilización de Zymomonas mobilis CECTB 4286 en dos tipos de soporte para producción de etanol, utilizando como sustrato jugo de Saccharum Officinarum "caña de azucar"

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(1)DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE OTORGAN EL TITULO DE. IC. AC IÓ. N. BIOLOGO – MICROBIOLOGO. M UN. Dr. Orlando Velásquez Benites. Y. CO. Rector de la Universidad Nacional de Trujillo. IC. A. Dra. Vilma Julia Méndez Gil. IN FO. RM ÁT. Vice-Rector Académico de la Universidad Nacional de Trujillo. Dra. Flor Marlene Lunavictoria Mori. EM. AS. DE. Vice-Rector Administrativo de la Universidad Nacional de Trujillo. Dr. Rene Cortes Lara. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. Secretario General de la Universidad Nacional de Trujillo. Dr. Hermes Escalante Añorga. Decano de la Facultad de Ciencias Biológicas. Ms. C. Pedro Alvarado Salinas. Director de la Escuela Académico profesional de Microbiología y Parasicología. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC. AC IÓ. N. MIEMBROS DEL JURADO. M UN. Ms. C. Pedro Alvarado Salinas. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. Presidente. DE. Dr. Pedro Mercado Martínez. Ms. C. Nelly Vásquez Valles Vocal. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. Secretario. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. AC IÓ. N. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO:. IC. En cumplimiento a las disposiciones establecidas por el reglamento de. M UN. Grados y Títulos de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional. CO. de Trujillo, presento a vuestra consideración y claro discernimiento la presente Tesis. Y. titulada: Evaluación de la inmovilización de Zymomonas mobilis CECTB – 4286 en. IC. A. dos tipos de soporte para la producción de etanol, utilizando como sustrato jugo de. RM ÁT. Saccharum officinarum “caña de azúcar”, para obtener el Titulo de Biólogo-. EM. AS. DE. IN FO. Microbiólogo.. RE CC IO. N. DE. SI. ST. Trujillo, 12 de diciembre del 2012. DI. Br. Ever Adrian Lizarraga Otiniano. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEL ASESOR. El que suscribe Dr. Pedro Mercado Martínez, Asesor de la tesis titulada:. AC IÓ. N. Evaluación de la inmovilización de Zymomonas mobilis CECTB – 4286 en dos tipos de soporte para la producción de etanol, utilizando como sustrato jugo de Saccharum. M UN. IC. officinarum “caña de azúcar”. A. Y. CO. CERTIFICA:. RM ÁT. IC. Que el informe ha sido redactado bajo mi asesoramiento, acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas en cumplimiento al formato vigente; por lo. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. que autorizo al Br. Ever Adrián Lizarraga Otiniano, continuar el trámite subsiguiente. RE CC IO. N. Dr. Pedro Mercado Martínez. DI. Asesor. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador,. A. Y. CO. M UN. IC. fundamentos teóricos, siendo aprobada por UNANIMIDAD. AC IÓ. N. declaran que la presente tesis ha cumplido con los requerimientos formales y. RM ÁT. IC. Ms. C. Pedro Alvarado Salinas. AS. DE. IN FO. Presidente. Secretario. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. Dr. Pedro Mercado Martínez. Ms. C. Nelly Vásquez Valles Vocal. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. DEDICATORIA. A mis padres con amor y eterna gratitud, por su invalorable entrega y dedicación en mi formación personal y profesional.. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. A Dios, por darme la fortaleza en cada minuto de mi vida, para concluir satisfactoriamente este trabajo.. DI. A mi hermana con mucho cariño, por el apoyo y comprensión incondicional en todo momento.. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO. IC. AC IÓ. N. Expreso mi más sincero agradecimiento:. M UN. A mi asesor Dr. Pedro Mercado Martínez, por su orientación, su apoyo. CO. incondicional y enseñanza brindados durante el desarrollo y elaboración del presente. IC. A. Y. informe.. RM ÁT. A mis compañeras de trabajo y grandes amigas. Keyby y Lilia, por su. amistad, su colaboración incondicional en el desarrollo del presente trabajo y por su. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. comprensión en momentos cruciales de mi vida personal y profesional.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN. N. En la evaluación del soporte para la inmovilización de Zymomonas mobilis. AC IÓ. para la producción de etanol, utilizando como sustrato jugo de Saccharum. IC. officinarum “caña de azúcar”, se prepararon tres biorreactores, un control con células. M UN. en suspensión y los otros dos con células inmovilizadas en agar agar y alginato de. CO. calcio respectivamente. Para la inmovilización en agar agar se empleó agar agua al. Y. 4%, temperado a 45 ºC mezclado con una suspensión de Z. mobilis de 1,8 x 109. IC. A. células/mL, que se dejó caer sobre aceite helado (6 +2 ºC). Para la inmovilización en. RM ÁT. alginato de calcio, la suspensión de bacterias se mezcló con alginato de sodio al 10%, el cual se goteo sobre una solución de cloruro de calcio al 2%. Posteriormente. IN FO. en los biorreactores se colocaron 450 mL de medio de fermentación y 50 mL de. DE. pellets de agar agar y alginato de calcio respectivamente; al biorreactor control solo. AS. se agregó 5 mL de células en suspensión a la concentración antes indicada, y se. EM. incubaron a 30 ºC durante 72 horas. Luego se determinó la producción de etanol. ST. mediante el ebulliscopio de Milligan, obteniéndose una producción media de 4.175. DE. SI. % y 3.766 % con Z. mobilis inmovilizadas en pellets de agar agar y en pellets de. N. alginato de calcio respectivamente, los cuales al ser evaluados estadísticamente. RE CC IO. presentan diferencia significativa; por lo que se concluye que la mayor producción de. DI. etanol se obtiene con Z. mobilis inmovilizadas en pellets de agar agar.. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ÍNDICE ii. MIEMBROS DEL JURADO. iii. N. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. AC IÓ. PRESENTACIÓN. IC. DEL ASESOR. M UN. APROBACIÓN. CO. DEDICATORIA. Y. AGRADECIMIENTO. IC. A. RESUMEN. RM ÁT. I. INTRODUCCIÓN II. MATERIAL Y MÉTODOS. IN FO. 2.1. Material. vi vii viii ix 1 8 8 8. 2.2. Procedimiento. 8. EM. 8. ST. 2.2.1. Reactivación, control de pureza y conservación del cultivo. RE CC IO. N. DE. SI. 2.2.2. Construcción y esterilización de birreactores. DI. v. 8. AS. 2.1.2. Muestra. DE. 2.1.1. Material Biológico. iv. 9. 2.2.3. Tratamiento de jugo de caña de azúcar. 10. 2.2.4. Preparación del inóculo de Zymomonas mobilis. 10. 2.2.5. Inmovilización de las células de Z .mobilis. 10. 2.2.5.1. Inmovilización en gel de agar. 10. 2.2.5.2. Inmovilización en alginato de calcio. 11. 2.2.6. Establecimiento de Sistema de Fermentación. 12. 2.2.7. Recolección y análisis de datos. 12. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.2.8. Análisis estadístico. 12 13. IV. DISCUSIÓN. 15. V. CONCLUCIÓN. 18. AC IÓ. N. III. RESULTADOS. 19. IC. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. ANEXOS. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. I.. INTRODUCCION. N. Históricamente son las levaduras, en particular, las que fueron utilizadas para. AC IÓ. producción de etanol. Sin embargo desde los años de 1970 la bacteria Zymomonas. las levaduras, debido a que utilizan una vía metabólica. M UN. etanol superior al de. IC. mobilis ha sido objeto de interés creciente a causa de su elevado rendimiento de. CO. diferente. Z. mobilis en consecuencia produce menos biomasa que Sacharomyces. Y. uvarum. Zymomonas mobilis es la especie que presenta probablemente la tolerancia. IC. A. más elevada al etanol; es capaz de producir etanol en concentraciones superiores a. RM ÁT. 13% (p/v), a una velocidad significativamente mas elevada. Por último este microorganismo no necesita oxigeno y presenta en general una mejor tolerancia al. IN FO. etanol que la levadura. En contra partida, esta especie necesita un pH de cultivo más. DE. elevado que el de las levaduras, con el riesgo de contaminación, y solo metaboliza un. EM. AS. espectro reducido de sustratos: glucosa, fructosa y sacarosa 1,2. ST. Zymomonas mobilis es una bacteria quimiorganótrofa. El nitrógeno necesario. DE. SI. para el crecimiento puede proporcionársele por medio de sales minerales,. N. aminoácidos o péptidos. Los nitratos y nitritos no son asimilados por la bacteria. El. RE CC IO. azufre, magnesio y potasio son proporcionados en forma de sales. Los oligoelementos (Mo, Fe, Zn, Mn, ect.) necesarios para el metabolismo de la bacteria. DI. se encuentran en estado de trazas en las sales utilizadas para la preparación del medio de cultivo. Desde el punto de vista energético Z. mobilis ha sido considerada ineficiente para producir biomasa, ya que una sola molécula de ATP es producida por cada molécula de monosacárido metabolizada. Sin embargo, si uno considera la. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. producción de etanol, es claro que la bacteria representa un sistema biológico muy eficaz 3. AC IÓ. N. Debido a las características de producción de etanol por Z. mobilis (tasas. IC. catabólicas elevadas, utilización simultánea de glucosa y de fructosa, tolerancia a. M UN. altas concentraciones de etanol y de azúcares, formación de diferentes subproductos. CO. en función del tipo de sustrato carbonado utilizado, conversión elevada de sustrato en. Y. etanol y en CO2), son las enzimas implicadas en la utilización directa de los azúcares. A. y las enzimas responsables de la formación del etanol a partir del piruvato, las que. RM ÁT. IC. han sido más estudiadas 3. IN FO. El termino inmovilización de células y enzimas se refiere a células y enzimas. DE. físicamente confinadas o localizadas en una cierta región definida en el espacio. AS. reteniendo sus propiedades y actividades catalíticas. Asimismo, dependiendo del tipo. EM. de inmovilización tanto las células como las enzimas pueden ser inmovilizadas de. ST. forma permanente o temporal para ser utilizadas repetida y continuamente en. SI. diversos procesos químicos. Por razones técnicas y económicas la mayoría de los. DE. procesos químicos catalizados por enzimas o células requieren su reutilización o el. RE CC IO. N. uso continuo de biocatalizadores durante largos periodos de tiempo. Bajo esta perspectiva, la inmovilización debería ser definida como una técnica capaz de. DI. reutilizar o dar uso continuo de biocatalizadores y células. Por lo tanto, la sencillez y el bajo costo de los métodos de inmovilización juegan un papel fundamental en la selección de protocolos de inmovilización. Es por ello que por medio de la. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. inmovilización es posible no solo controlar la ubicación de las células o las enzimas sino también modificar sus propiedades selectivamente.4,5. AC IÓ. N. La investigación sobre inmovilización de organismos unicelulares ha. IC. generado gran interés en la comunidad científica, debido a sus grandes ventajas. M UN. técnicas y económicas respecto a la fermentación tradicional. Entre las principales. CO. ventajas que presentan los sistemas biotecnológicos que utilizan células. Y. inmovilizadas se encuentra su facilidad para el manejo de una mayor densidad. A. celular comparado con los procesos tradicionales, un mejor control en sistemas. RM ÁT. IC. continuos y la posible recuperación de la biomasa para su posterior reutilización 5,6. IN FO. El uso de células inmovilizadas es ventajoso debido a que las células libres. DE. son muy difíciles de volver a utilizar o de emplearse en procesos continuos, son. AS. pequeñas para ser filtradas, y su recuperación mediante centrifugación es costosa. El. EM. uso de células inmovilizadas en un proceso de fermentación en lugar de células en. ST. suspensión, además, trae otras ventajas, como el aumento de la productividad. SI. volumétrica (g etanol/L/h), el aumento de la concentración del producto en la. DE. corriente de salida (etanol/L) y la disminución de la concentración de sustrato en la. RE CC IO. N. corriente de la salida (g glucosa/L); además permite un mayor tiempo de. DI. sobrevivencia y por lo tanto permite el uso de la célula por un tiempo mayor 5,6. Por las ventajas anteriormente mencionadas, en algunos bioprocesos. industriales, es frecuente utilizar enzimas o células inmovilizadas; este uso se sustenta en que la enzimas o células inmovilizadas, se pueden reutilizar en procesos. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. batch o usarlos mayor tiempo que cuando se usa células en suspensión en procesos continuos; para que esto ocurra el soporte debe tener resistencia adecuada a las condicione de operación del biorreactor y ser inherentes para las células que se. 7,8. M UN. IC. determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. AC IÓ. N. inmovilizan. La elección del soporte y del tipo de inmovilización resultan. CO. Los métodos de inmovilización de células mas usados son la autofloculación,. Y. la adsorción sobre soportes y la incorporación de células en matrices solidas. La. IC. A. floculación es un proceso que muchas cepas sufren de manera natural. La adsorción. RM ÁT. consiste en la adhesión de las células a la superficie externa de un soporte como es el caso del gluten. La incorporación de células a matrices solidas se realiza por el. IN FO. atrapamiento de las mismas en el seno de un material polimérico. Las matrices más. DE. adecuadas son polímeros naturales como el alginato, el carragenato y el agar ya que. AS. polimerizan en condiciones muy suaves aunque también se pueden usar matrices. ST. EM. sintéticas como poliacrilamida y poliuretano 4,9. SI. Uno de los métodos mas estudiados por su sencillez y bajo costo es la. DE. inmovilización por atrapamiento en alginato y en geles como el agar agar. En estudio. RE CC IO. N. sobre el efecto de la concentración de agar en la inmovilización de Saccharomyces cerevisiae y su capacidad fermentativa se encontró que, la mayor producción se. DI. obtiene a 4% de agar; por otro lado, en procesos continuos, los biorrecatores que trabajan con células de levadura inmovilizadas con agar al 4 y 5% presentaron mayor producción de etanol, pero el biorreactor con células inmovilizadas de agar al 6% se tornó casi constante conforme transcurrió el tiempo 4,9. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Cuando se inmovilizan células de Zymomonas mobilis inmovilizadas en. -. alúmina, esta resulta un biocatalizador eficiente para producción continua de etanol. N. empleando como sustrato extracto de pasas, suplementado con (NH 4)2 SO4 y KH2. AC IÓ. PO4, de esta manera se ha logrado producir 13.48 % (v/v) de etanol, empleando. IC. como sustrato extracto de pasas que contenían 9% (w/v) de azucares reductores,. CO. M UN. suplementado con 0.1 % (w/v) de (NH4)2 SO4 y 0.1 % (w/v) KH2 PO4 10. Y. Las ventajas de trabajar con células inmovilizadas quedaron demostradas en el. IC. A. trabajo realizado con cepas de Zimomonas mobilis var. mobilis (Zmm1 y Zmm2) y. RM ÁT. pomaceae (Zmp1 y Zmp2), utilizando una cepa control de Zymomonas mobilis mobilis (CETC) 560, considerada como alta productora de etanol. Los resultados de. IN FO. este trabajo revelan que, cuando se inmoviliza en matriz de alginato de calcio a una. DE. concentración de 2% p/v, se obtiene un rendimiento de 92.1%, por parte de las cepas. AS. nativas Zmm1 y Zmm2 y de 97.85%, con Zmm 560, comparado con los rendimientos. EM. de etanol obtenidos a partir de células libres, de 72.9% por parte de Zmm1 y 76.74%. ST. con Zmm 560; el análisis de estos datos, demuestra las ventajas de la utilización de. SI. células inmovilizadas frente a células libres, en procesos de fermentación debido a 11. RE CC IO. N. DE. que representan grandes posibilidades para el desarrollo Biotecnológico. Una de las opciones para producir etanol es por fermentación a partir de. DI. materias primas ricas en carbohidratos. Por tal razón, es común designar al etanol obtenido por esta vía “bioetanol”, entre estas materias primas se encuentran las frutas y vegetales como la caña de azúcar y la remolacha. El primer programa masivo de. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. energías renovables a nivel mundial de producción de bioetanol a partir de caña de azúcar, se inició en Brasil en 1975 12. AC IÓ. N. Cuando se estudio la producción de etanol a partir de jugo de caña del azúcar. IC. empleando medios de fermentación con una alta concentración inicial del azúcar, y. M UN. en presencia de etanol; se determinó que la producción de etanol por Zymomona. CO. mobilis fúe baja en ambos medios, ya que la presencia del etanol inicial en el jugo de. Y. caña del azúcar redujo la producción del etanol en 48.8%, la producción de la. IC. A. biomasa en 25.0% y el consumo total del azúcar en 28.3%. Sin embargo la presencia. RM ÁT. del etanol inicial en el otro medio de fermentación no afectó el coeficiente perceptiblemente, elevando la producción de la biomasa (azúcar de g biomas/g. DE. IN FO. consumida) 13. AS. La caña de azúcar es una materia prima para la producción de azúcar y de. EM. etanol con características relevantes que la sitúan como la planta comercial de. ST. mayores rendimientos en biomasa energética, debido a las cantidades de azúcar y. SI. fibra, obtenidos en ciclos de tiempo menores que otras especies. La caña se cultiva. DE. en más de 80 países,. con variaciones en los periodos y manejo de cultivo,. RE CC IO. N. dependiendo de las condiciones edafoclimaticas y factores de producción locales. Se caracteriza como un cultivo de alta eficiencia de fotosíntesis y alta taza de. DI. conversión energética lo que se refleja en una gran producción de biomasa por unidad de área 14. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Z. mobilis es una de las mejores alternativas para la producción industrial del alcohol haciendo énfasis que la bacteria posee ventajas sobre el S. cerevisiae con respecto a productividad y a tolerancia del etanol, lo que anima a los investigadores. AC IÓ. N. para explotar la capacidad de Z. mobilis de utilizar la sacarosa, glucosa, y fructosa. IC. por la única vía de Entner-Doudoroff, que en la actualidad es una alternativa. M UN. interesante para la actual demanda mundial de combustibles derivados del petróleo. Y. CO. 15,16. IC. A. Considerando que la utilización de células inmovilizadas permite el. RM ÁT. confinamiento físico en el interior o en la superficie de un soporte con retención de su viabilidad y capacidad enzimática de forma que permita reutilización económica;. IN FO. al reutilizar las células y mantener altas densidades celulares, las reacciones serán. DE. más rápidas y, por tanto, cabe esperar un aumento de la productividad y faltando. AS. estudios que se hayan realizado comparando la inmovilización en soportes como el. ST. EM. agar agar y alginato de calcio es por eso, que el presente trabajo tuvo por objetivo:. SI. Evaluar los soportes de agar agar y alginato de calcio para la inmovilización de. DE. Zymomonas mobilis en la producción de etanol, utilizando como sustrato jugo de. DI. RE CC IO. N. Saccharum officinarum “caña de azúcar”.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. II. MATERIAL Y MÉTODO 2.1. Material. N. 2.1.1. Material Biológico. AC IÓ. - Cultivo de Zymomonas mobilis CECTB* 4286, donada por la. IC. Universidad Nacional de Piura y conservada en el Departamento de. M UN. Microbiología Industrial de la facultada de Ciencias Biológicas de la. CO. Universidad Nacional de Trujillo.. Y. -Jugo de Saccharum officinarum “caña de azúcar”, obtenido del mercado. RM ÁT. IC. A. La Union de La Ciudad de Trujillo - La libertdad.. *CECTB: Colección Española de Cultivos Tipo B.. IN FO. 2.1.2. Muestra. DE. - Cultivo de Zymomonas mobilis CECTB 4286 inmovilizada en agar. AS. agar y alginato de calcio.. EM. 2.2. Procedimiento. DE. SI. ST. 2.2.1. Reactivación, control de pureza y conservación del cultivo. N. A partir de la cepa CECTB 4286 de Zymomonas mobilis conservada. RE CC IO. en medio de mantenimiento (Anexo 1), se sembró en el medio de mantenimiento y se incubó. a 30 ºC durante 36 horas. Al final de. la. DI. incubación se realizó coloración de Gram (Anexo 4a) para evaluar la pureza del cultivo, de esta manera se descartó contaminación con otros cultivos microbianos, también se realizó coloración de capsula (Anexo 4a) para verificación del cultivo.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. El cultivo reactivado se sembró en tres placas de Petri que contenían agar sacarosa (Anexo 2) y se incubó a 30º C durante 48 horas culminado éste tiempo se realizó coloración de Gram y se observó al microscopio para. y se incubó a 30 ºC durante 48 horas para la. IC. contenían agar sacarosa. AC IÓ. N. evaluar la pureza del cultivo, luego se sembró en frascos planos de vidrio que. RM ÁT. IC. A. 2.2.2. Construcción y esterilización de biorreactores. Y. CO. conservaron en refrigeración (6 +2 ºC). hasta su uso.. M UN. obtención de cultivo puro. Posteriormente los frascos con los cultivos se. Se construyeron tres biorreactores de vidrio de 18 cm. de altura por 10. IN FO. cm. de diámetro, con tapas de microporoso que permiten un cierre hermético,. DE. con un dispositivo para toma de muestra para realizar el monitoreo. EM. AS. correspondiente de pH y sistema de salida de gases.. ST. Para esterilizar los biorreactores, el material de vidrio y las tapas se. SI. lavaron con detergente, se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 2,5% por. DE. espacio de dos horas, y se enjuagaron con agua destilada estéril;. RE CC IO. N. posteriormente se esterilizó el material de vidrio en el horno a 180 ºC x 2 horas y las tapas de microporoso en cámara de luz UV a 400nm por un lapso. DI. de 2 horas. Después de la esterilización los materiales se ensamblaron en condiciones de asepsia (Anexo 4b).. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.2.3. Tratamiento de jugo de caña de azúcar. El jugo de caña de azúcar obtenido del mercado la Unión de la. AC IÓ. N. Ciudad de Trujillo –La Libertad fué esterilizado en autoclave a 121º C a 15. IC. lb. de presión durante 15 minutos, luego se filtró en una gasa estéril en. M UN. condiciones de asepsia para eliminar partículas sólidas producidas durante la. CO. esterilización. Finalmente se midieron los grados Brix empleando un. RM ÁT. 2.2.4. Siembra, cosecha y estandarización. IC. A. Y. brixómetro (Anexo 4c). IN FO. La cepa de Z. mobilis CECTB 4286 conservada en frascos planos de. DE. vidrio se sembró en placas de Petri conteniendo agar sacarosa (Anexo 2) y se. AS. incubó a 30 ºC durante 48 horas, transcurrido éste tiempo el cultivo se. EM. cosechó utilizando 3ml de solución salina fisiológica. Posteriormente se. ST. estandarizó el inóculo a una concentración aproximada de 1,8 x 109. SI. células/mL. comparando con el tubo número 6 del nefelómetro de Mc. RE CC IO. N. DE. Farland.(Anexo 4d). 2.2.5. Inmovilización de las células de Z .mobilis. DI. 2.2.5.1. Inmovilización en gel de agar agar9. El aceite vegetal el cual sirvió solo para dar forma de los pellets, se enfrió en el refrigerador hasta alcanzar una temperatura de 6. 2 ºC.. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Paralelamente se licuó agar agua al (4%) estéril y se enfrió hasta alcanzar una temperatura aproximada de 45ºC, esta temperatura se mantuvo durante todo el proceso de inmovilización. A continuación se adicionó 5 mL de la. AC IÓ. N. suspensión de Z. mobilis en 45 mL del agar licuado y se homogenizó, luego. IC. se cargó una hipodérmica estéril con el agar que contenían Z. mobilis y se. M UN. goteo de forma continua en frascos de boca ancha que contenían 250 mL del. CO. aceite vegetal frió obteniéndose así los pellets de agar agar (Anexo 4e), estos. Y. se lavaron con agua destilada estéril y se colocaron el papel filtro para retirar. IC. A. los restos de aceite, luego se colocaron en el segundo biorreactor estéril que. RM ÁT. contiene el medio de fermentación (Anexo 3). DE. IN FO. 2.2.5.2 Inmovilización en alginato de calcio. AS. Se adicionó 5 mL. de la suspensión de Z. mobilis en 45 mL. de la. EM. solución acuosa de alginato de sodio al 10% y se homogenizó; se cargó una. ST. hipodérmica estéril con el alginato de sodio que contenían Z. mobilis y se. SI. goteo de forma continua en un vaso de precipitación que contenían 50mL. de. DE. solución de cloruro de calcio al 2 %, dicha solución solo sirvió para dar. RE CC IO. N. forma a los pellets, obteniéndose así los pellets de alginato de de calcio (Anexo 4f), los cuales se lavaron con agua destilada esteril y se colocaron en. DI. el tercer biorreactor estéril que contiene el medio de fermentación. (Anexo 3). 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.2.6. Establecimiento de Sistema de Fermentación Los sistemas de fermentación se establecieron de la siguiente manera:. AC IÓ. N. Biorreactor 1: (Control) 495 mL de medio de fermentación más 5 mL de la. IC. suspensión de Z. mobilis . pH 5.5, incubar a 30 °C durante 72. M UN. horas.. CO. Biorreactor 2: (Problema 1) 450 mL de medio de fermentación más 50 mL. Y. de pellets de agar agar con Z. mobilis. pH 5.5, incubar a 30 °C. IC. A. durante 72 horas.. RM ÁT. Biorreactor 3: (Problema 2) 450 mL del medio de fermentación más 50 mL de pellets de alginato de calcio con Z. mobilis. pH 5.5, incubar a. DE. IN FO. 30 °C durante 72 horas.. EM. AS. 2.2.7. Recolección y análisis de datos. ST. A las 72 horas se midió el porcentaje de etanol producido, utilizando. SI. el Ebulliscopio de Malligan (Anexo 4g) en cada uno de los tres biorreactores;. DE. los datos obtenidos en las tres repeticiones se clasificaron y ordenaron en. RE CC IO. N. tablas para su mejor comprensión (Anexo 5). DI. 2.2.8. Análisis estadístico. El promedio de los porcentajes de etanol obtenidos de las tres repeticiones se evaluó utilizando la prueba estadística t de Student (Anexo 6). 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. III. RESULTADOS. Porcentaje promedio de etanol, obtenido a las 72 horas de fermentación del jugo de. AC IÓ. N. Saccharum officinarum, empleando células de Z. mobilis inmovilizadas en pellets de. IC. agar y pellets de alginato), evaluados estadísticamente presentan valores p < a 0.05 lo. M UN. que nos indica que existe diferencia significativa en la producción de etanol por Z.. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. mobilis inmovilizadas en los dos tipos de soporte como se muestra en la tabla1.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 1. Porcentaje promedio de etanol producido durante la fermentación de jugo de Saccharum officinarum “caña de azúcar” por células de Zymomonas. IC. AC IÓ. N. mobilis CECTB- 4286 inmovilizada en dos tipos de soporte.. Porcentaje promedio de etanol (%) 4.175. CO. M UN. Tipo de Inmovilización Agar*. 3.766. IC. IN FO. p< 0.05 para * y **. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. p< 0.05 para * y *** p< 0.05 para ** y ***. 4.375. RM ÁT. Células libres en supencion (control)***. A. Y. Alginato **. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IV.. DISCUSIÓN. Los porcentajes de etanol, obtenidos durante la fermentación de jugo de. AC IÓ. N. Saccharum officinarum por células de Z. mobilis inmovilizadas en agar y en alginato. IC. de calcio, así como en el control son bajos en comparación con los porcentajes de. 10. quien obtuvo el 13.48 % de etanol utilizando células de Z. mobilis. CO. Caballero. M UN. etanol obtenidos en otros trabajos realizados con dicha bacteria, como el de. Y. inmovilizadas en γ-alumina, empleando como sustrato extracto de pasas con un. IC. A. contenido de 9 % (w/u) de azucares reductores, suplementado con 0.1 % (w/u) de. RM ÁT. (NH4)2SO4 y 0.1 % (w/u) de KH2PO4.. IN FO. Las condiciones de fermentación también pueden ser un factor importante en. DE. la producción de etanol; así el pH óptimo para el metabolismo de la bacteria es de 5 –. AS. 6.5; el oxigeno es otro punto interesante puesto que en aerobiosis la producción de. EM. alcohol se reduce en un 25%, lo que indica que Z. mobilis no necesita oxigeno para. ST. su metabolismo 2. El tipo de azucares también es un factor importante, pues cuando. SI. se trabaja con sacarosa el rendimiento en la producción de etanol es. DE. significativamente más bajo que cuando se emplea glucosa o fructosa, éste. RE CC IO. N. rendimiento mas bajo es la consecuencia de la formación de subproductos. DI. importantes: lévanos y sorbitol 7, 18,21.. Como se puede observar en al Tabla 1, el porcentaje de etanol producido por. células de Z. mobilis inmovilizadas en agar es mayor con respecto a las células de Z. mobilis inmovilizadas en alginato de calcio. Esto puede deberse a que la. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. concentración de agar que se utilizó para la inmovilización fue del 4% en cuya concertación se obtiene la mayor producción de etanol 1. Debido a que en esta concentración de agar (4%) se logra una mayor utilización de la fuente carbonada,. AC IÓ. N. nitrogenada y otros nutrientes, que por las células de Z. mobilis inmovilizadas en. IC. alginato. Otra razón seria que la concertación del alginato no seria la adecuada ya. M UN. que los poros del soporte son de menor tamaño, y esto influye en la transferencia de 10,11. Y. CO. masa y energía, que se traduce en una disminución del metabolismo. IC. A. El porcentaje de etanol obtenido por células de Z. mobilis en suspensión es. RM ÁT. mayor que el porcentaje de etanol producido por Z. mobilis inmovilizadas en agar (Tabla 1); entre las razones que explicarían estos resultados, se puede mencionar a la. IN FO. temperatura utilizada en al inmovilización de las células de Z. mobilis , que fluctua. DE. entre 45 y 50 °C esta temperatura pudo haber causado alguna manera de daño. AS. celular, pues la literatura reporta que la temperatura optima de esta bacteria está entre. EM. 25 – 30 °C y como es conocido, a temperaturas mayores y menores de la optima la. ST. actividad metabólica de la célula, disminuye; siendo el daño mayor a medida que los. DE. SI. valores se alejan del optimo 1.. RE CC IO. N. Aun existiendo diferencia significativa entre los resultados (Tabla 1), el uso de las células inmovilizadas es ventajoso debido a que las células libres son muy. DI. difíciles de volver a utilizar o de emplearse en procesos continuos ya que son demasiadas pequeñas para ser filtradas y su recuperación mediante centrifugación es muy costosa; por el contrario las células inmovilizadas presentan la ventaja de que. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. las células que se encuentran en soportes fijos permiten su continua reutilización lo que favorece la producción en sistemas de fermentación continuos 6,7,18.. AC IÓ. N. Otro aspecto que pudo influir negativamente en el proceso de fermentación es. IC. que el aceite usado en la inmovilización no haya sido removido adecuadamente al. M UN. lavar los pellets , aun cundo se utilizo agua destilada estéril (ADE) . El posible aceite. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. remanente haya dificultado la transferencia de masa y energía 10.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. V.. CONCLUSION. Después de evaluar el porcentaje de etanol producido por Zymomonas mobilis. AC IÓ. N. CETB - 4286 inmovilizadas en agar agar y en alginato de calcio, utilizando como. IC. sustrato jugo de Saccharum officinarum “caña de azúcar”, se llegó a la siguiente. El soporte de agar agar es mejor para la inmovilización de Zymomonas. Y. -. CO. M UN. conclusión:. A. mobilis CECTB 4286 en la producción de etanol, que el soporte de alginato. RM ÁT. IC. de calcio; utilizando como sustrato jugo de Saccharum officinarum “caña de. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. azúcar”. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. 1. Levaud, J. y M. Bouix 2000. Microbilogia Industrial. Editorial Acribia S. A.. IC. AC IÓ. N. Zaragoza - España. M UN. 2. Quinteros, R. y et al. 1998. Biotecnología Alimentaria. Editorial Limusa S.A.. E.1999.. Producción. de. Alcohol. de. Zymomonas. mobilis.. IC. A. 3. Torres,. Y. CO. México.. RM ÁT. Biotecnología Alimentaria. Edit. Limusa. México.. IN FO. 4. Fajardo Ochoa, R. 2011. Inmovilización de células y enzimas. Revista. DE. Científica de la Universidad Autónoma de Coahuil- México. Vol. 3. Nº 6 (42. EM. AS. - 56). ST. 5. Ríos N. y et al. 2009. Producción de enzimas exoxilanolíticas por. SI. inmovilización de la bacteria extremófila cepa FT3 en alginato de calcio.. DE. Universidad Mayor de San Andrés, La Paz, Bolivia BIOFARBO Vol. 17. Nº. RE CC IO. N. 1 (22-29).. DI. 6. Pérez Alva, S. 1994. Tópicos sobre Biotecnología. Editorial Libertad E.I.R.L. Trujillo – Perú. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 7. Arroyo, M. 2001. Inmovilizet enzimes: Theory methods of study and applications. University Complutense of Madrid 28040. Madrid - España.. AC IÓ. N. 8. Bourgeois, C. M; J. P. Larpent. 1995. Microbiología Alimentaria. Vol. 2.. M UN. IC. Editorial Acribia. S.A. Zaragoza – España.. CO. 9. Olano, C. 2004. “Efecto de la concertación de agar en al inmovilización de Saccharomyces cerevisae var ellipsoideus MIT –L51 y su capacidad. A. Y. fermentativa”. Tesis para obtener el titulo de Biólogo Microbiólogo.. RM ÁT. IC. Universidad nacional de Trujillo. Trujillo –Peru.. IN FO. 10. Caballero, J. 2000. “Optimización de la concertación de sales y azucares en. DE. extracto de pasas para la producción continua de etanol usando Zymomonas. AS. mobilis Inmovilizadas en γ- alumina”. Tesis para obtener el grado académico. EM. de Maestro en Ciencias con mención en Microbiología Industrial y. SI. ST. Biotecnología. Universidad nacional de Trujillo. Trujillo- Perú.. DE. 11. Matiz, A; C. Torres; R. Poutou. “2002. Producción de etanol con células. RE CC IO. N. inmovilizadas de Zymomonas mobilis spp. Pontificie Universidad de. DI. Córdova. Colombia. Revista MVZ. Córdova. Vol. 7. Nº 2 (216 - 223). 12. Vázquez H.J. y O. Dacosta. 2007. Fermentación alcohólica: Una opción para la producción de energía renovable a partir de desechos agrícolas. Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Azcapotzalco, México. Vol. 8. Nº 4 (249-259). 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 13. Sadae, M. y J. Batista.. 2003. Mobilis Inicial de Zymomonas por del. fermentado de cana-de-acúcar del caldo de efeito da presenca de etanol na producao de etanol em. Universida de estadual de Londrina, londrina. Banda,. IC. AC IÓ. N. Brasil.. caña de azúcar y de etanol en Brasil. Jornadas. CO. producción de. M UN. 14. Da Silva F. C. y A. R. Iturra. 2010. Modelos y análisis de evolución de la. IC. A. Y. iberoamericanas . Santa Cruz - Bolivia.. RM ÁT. 15. Garcias, O; Ponce, M; R. Elizabeth. 2003. Metabolismo del carbono en microorganismos de interés biomédico y biotecnológico: Vía de Entner-. DE. IN FO. Doudoroff. México.. AS. 16. Conway, T. 1992. The Entner- Doudoroff pathway: History, physiology and. SI. ST. EM. molecular bilogy. FEMS Microbiol. Vol. 9. (1 – 27).. DE. 17. Gunasekaran, P y K Chandra Raj. 1995, Tecnología de la fermentación del. N. etanol de Zymomonas mobilis Departamento de la tecnología microbiana.. RE CC IO. Escuela de Ciencias Biologicas. Universidad de Madurai Kamaraj, Madurai.. DI. LA India.. 18. Rebaza, N. J. 2002 “Tasa de producción alcohólica en mosto de Vitis ninifera var cardinal, por Saccharomyces cerevisae MIT – L51 y Zymomonas monbilis CECT – 596 en biorreactores estáticos y agitados.” Perú.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 19. Vásquez, V. Víctor. 2002. Características organolépticas de vino rosado obtenido de Vitis ninifera var cardinal, por Saccharomyces cerevisae MIT – L51 y Zymomonas monbilis CECT – 596 en biorreactores estáticos y. IC. AC IÓ. N. agitados.” Perú.. M UN. 20. Poutou, P. y Raúl, A. 2002. Producción de etanol con células libres e. CO. inmovilizadas de Zymomonas mobilis sp. Autóctonas, a partir de glucosa en. IC. A. Y. cultivo discontinuo. Pontificia Universidad Javeriana. Bogota – Colombia.. RM ÁT. 21. Julián, S. Oscar y Cardona, A. C. 2005. Producción biotecnológica de alcohol. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. carburante I: Obtención a partir de diferentes materias primas. Colombia.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexos. N. Anexo 1. Medio de mantenimiento. 50 g/L. AC IÓ. Sacarosa Extracto de levadura. 5.0g/L. 1.0 g/L. IC. KH2PO4. M UN. (NH4)2 SO4 Mg2 SO4. 7 H2O. 0.5 g/L. RM ÁT. IC. Anexo 2. Medio de cultivo (agar sacarosa). A. Y. CO. pH 5.5 + 0.5. 1.0 g/L. Sacarosa. IN FO. Extracto de levadura KH2PO4. DE. (NH4)2 SO4. 50 g/L 5.0g/L 1.0 g/L 1.0 g/L 0.5 g/L. Agar. 15 g/L. AS. Mg2 SO4. 7 H2O. ST. EM. pH 5.5 + 0.5. DI. RE CC IO. N. DE. SI. Anexo 3. Medio de fermentación. Jugo de caña de azúcar. 13.8 º Brix. Extracto de levadura. 5.0 g/L. KH2PO4. 1.0 g/L. Mg2SO4. 0.5 g/L. (NH4)2 SO4. 1.0 g/L. pH inicial 5.5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 4. Procedimiento. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. A) Reactivación Y control de pureza. Coloración de cápsula. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. Coloración Gram. Cultivo puro. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. B) Construcción De Biorreactores. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. Lijado y pegado de microporoso para tapas. Biorreactores listos para esterilización. DI. RE CC IO. N. DE. SI. Colocación del dispositivo para toma de muestra. Desinfección en hipoclorito de sodio (2 hrs.). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. C) Tratamiento De Jugo Caña De Azúcar. Filtrado de jugo de caña en gasa estéril. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. Jugo de caña estéril. Medición de grados Brix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. D) Siembra, Cosecha y Estandarización. Propagación de inóculo. Suspensión con SSF. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. Cultivo Puro. Estandarizar al tubo Nº 6 Nefelómetro de Mac Farland (1,8x109cel/mL). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RM ÁT. IC. A. Extraer con la jeringa el homogenizado. Gotear el homogenizado en aceite a 6 + 2ºC. Retirar el aceite sobre papel filtro. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. Agregar 5 mL de suspensión de Z. mobilis en 45 mL de Agar (4%) a 45ºC. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. E) Inmovilización En Agar Agar. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Biorreactor Estático. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. Lavado con ADE. Establecimiento del Sistema de Fermentación. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. F) Inmovilización En Alginato De Calcio. Extraer con la jeringa el homogenizado con hipodérmica. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. Agregar suspensión de Z. mobilis en alginato de sodio (10%). Lavar con agua destilada estéril. Establecimiento del Sistema de Fermentación. DI. RE CC IO. N. Gotear el homogenizado en cloruro de calcio (2%). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. G) Medición de % de Etanol. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. Ebulloscopio de Milligan. Lectura de % de etanol. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 5. Recolección de datos. Primer ensayo (%). Segundo ensayo (%). Tercer ensayo Promedio (%) (%). Células libres (control). 4.400. 4.400. 4.325. Agar. 4.100. 4.200. 4.225. Alginato. 3.750. 3.825. 3.725. AC IÓ. N. Tipo de inmovilización. 4.175 3.766. Y. CO. M UN. IC. 4.375. RM ÁT. Los datos se procesaron en el programa MINITAB. IC. A. Anexo 6. Aplicación de la prueba estadística T de student. IN FO. A) Prueba T e IC de dos muestras: alginato vs. agar (asumiendo varianzas iguales). Desv.Est.. 3. ST. 3.7667. 0.0520. 0.030. 3. 4.1750. 0.0661. 0.038. EM. N. AS. Media. Error estándar de la media. SI. DE. T de dos muestras para alginato vs. agar. alginato. RE CC IO. N. DE. agar. Diferencia = mu (alginato) - mu (agar). DI. Estimado de la diferencia: -0.4083 Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -8.40 Valor p = 0.004 GL = 3 Las medias de ambos grupos (agar y alginato) son estadísticamente diferentes, siendo mayor la de agar (Valor p = 0.004 menor que alfa = 0.05).. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. B) Prueba T e IC de dos muestras: alginato vs. control (asumiendo varianzas iguales). alginato. 3. 3.7667. 0.0520. 0.030. control. 3. 4.3750. 0.0433. 0.025. AC IÓ. Desv.Est.. IC. Media. CO. M UN. N. Error estándar de la media. N. T de dos muestras para alginato vs. control. Y. Diferencia = mu (alginato) - mu (control). IC. A. Estimado de la diferencia: -0.6083. RM ÁT. Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -15.56 Valor p = 0.001 GL =3. IN FO. Las medias de ambos grupos (alginato y control) son estadísticamente. DE. diferentes, siendo mayor la del grupo control (Valor P = 0.001 menor que. EM. AS. alfa = 0.05).. SI. ST. C) Prueba T e IC de dos muestras: agar vs. control (asumiendo varianzas iguales). DE. T de dos muestras para agar vs. control. Media. Desv.Est.. agar. 3. 4.1750. 0.0661. 0.038. control. 3. 4.3750. 0.0433. 0.025. DI. RE CC IO. N N. Error estándar de la media. Diferencia = mu (agar) - mu (control) Estimado de la diferencia: -0.2000. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(45) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -4.38 Valor P = 0.022 GL = 3 Las medias de ambos grupos (agar y control) son estadísticamente diferentes,. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. siendo mayor la del grupo control (Valor P = 0.022 menor que alfa = 0.05).. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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