Se hace por medio de horno

---

SERVICIOS DOCUMENTALE= IZTAPAUPA

Proyecto sobre l a

1

~ Y U D A N T I A EX LA DOCENCIA DE LABORATORIO DE BIOLOGIA ~~~OLECULAR.

I

' /

que presenta e l Pasante de Ing. Bioquimica I n d u s t r i a l

,

J

MARIO EDGARDO VIRAiIIONTES ANZURES

/&

asesorado por e l tutor

1 /

r

J

2.4 Proyecto.

L a r e a ~ i z a c i b n de e s t e proyecto de S e r v i c i o s o c i a l , t i e n e por

-

o b j e t o auxiliar en l a docencia de 13 cursos &e Laboratorio de B i o l o g i a Molecular, impartidos por e l D r . Héctor González Cerezo.

,’ ,

. -

L a l a b o r que se d e s a r r o l l a e n a s t e t i p o de c u r s o s , c o n s i s t e e n d a r a l o s alumnos de 20. t r i m e s t r e una introducción t e ó r i c o - p r á c

-

t i v a , p r e v i a a cada s e s i 6 n de l a b o r a t o r i o ; a s e s o r a r l o s dentro y

f u e r a de l a s h o r a s de c l a s e s ; e n s e ñ a r l e s t é c n i c a s de ma?ipuleo’

en l a b o r a t o r i o , así como e l manejo de algunos aparatos t a l e s

-

como c e n t r í f u g a s , a u t o c l a v e s , balanzas analíticas, e t c . ; r e v i - sar y c o r r e g i r r e p o r t e s i n d i v i d u a l e s , semanales; preveer que

-

las s u b s t a n c i a s , s o l u c i o n e s , r e a c t i v o s , equipo de l a b o r a t o r i o

-

en

g e n e r a l , e t c . , s e encuentre disponible para l a s e s i ó n c o r r e s

-

pondiente o b i e n acondicionarlo, o m o d i f i c a r ( e n a t i m a i n s t a n -

cie),

pequeños a s p e c t o s de l a práctica, de manera que é s t a se

-

pueda l l e v a r a cabo con é x i t o ; por o t r o l a d o , s e deben prep-ar

I

e i m p a r t i r exámenes p a r c i a l e s y f i n a l e s para una evaluación mas

completa d e i alumno.

Estas son, a grandes r a s g o s , las actividades a r e a l i z a r durante e l S. S., en e l c u a l se d e s e a mejorar un poco mas e l n i v e l de

-

aprendizaje d e l alumno, c o n k p r e s e n c i a de dos a u x i l i a r e s ade- más d e l p r o f e s o r t i t u l a r . /

L a s prácticas que normalmente s e l l e v a n a cabo e n e s t e t i p o d e - c u r s o s , son U s s i g u i e n t e s :

Práctica 1.-

Preparaci6n de m a t e r i a l e s t é r i l y m e d i o s de c u l t i v o .

En cuanto a l o que s e r e f i e r e 2 l a e s t e r i l i z a c i ó n de m a t e r i a l e s

se proponen los s i g u i e n t e s métodos:

<''

I'

-

E s t e r i l i z a c i ó n por i n c i n e r a c i ó n de materia o r g á n i c a

o

" c a l o r a l Se hace por medio de mechero e s t e r i l i z a n d o asas de p l a t i n o , a g u j a s , e t c .

-

E s t e r i l i z a c i ó n con vapor o q * c a l o r húmedo". Usando a u t o c l a v e ,

-. ~. para e s t e r i l i z a r medTo-sidTc.uItivo.

-

E s t e r i l i z a c i ó n por 'vcalor seco". Se hace por medio de horno

--.---_______

.- .. ~~ . ~~

-

/ ~ - -

e s t e r i l i z a n d o m a t e r i a l de v i d r i o en general.

-

E s t e r i l i z a c i ó n por f i l t r a c i 6 n . Aquí s e usan membranas o pa?d Whatman de tamaño de poro muy pequeño. S i r v e para e s t e j r i l i z a r i i q u i d o s v i s c o s o s .

-

E s t e r i l i z a c i ó n por e b u l l i c i ó n . Usando m a t e r i a l e s como j e r i n -

gas en baños de agua hirviendo.

-

E s t e r i l i z a c i ó n por r a d i a c i o n e s . E s t e r i l i z a c i ó n de h z b i t a c i o - n e s con l u z u l t r a v i o l e t a o rayos

X

Solamente s e practicará e s t e r i l i z a c i ó n por métodos f i s i c o s ,

-

no químicos.

: En cuanto a l a preparación de medios de c u l t i v o , s e prepara?

... los s i g u i e n t e s medios:

' - Medio r i c o ( c a l d o l u r i a )

--.. Medio minimo

-

Medio d i f e r e n c i a l (para cepas fermentadoras de l a c t o s a )

Esta práctica s e l l e v a a cabo durante dos s e s i o n e s de l a b o r a -

.

'

t o r i o .

_ _ . ' - :

te.:.

-

L a b i b l i o g r a f í a correspondiente a e s t a práctica e s l a s i g u i e n

-

.

~

.

. .. . -

-.

.~

C o l l i n s C.

H.

Métodos m i c r o b i o l 6 g i c o s E t . Acribia, 1 9 6 9 , 22- - .

1

___..

-

.,.

.

ragoza, España.

. .

P e l c z a r , M.

H.

Microbiology, 2a. Ed. Ed. MC G r a w H i l l , Xew

:Lr.; 1 ' . .

' .

~

I

P i a t k i n ,

K o

Microbiología. ed. M i r . 1968, MoscÚ, Rusia.

Davis, B.

D.

y DuibeEco

R.

Microbiology. 2a. ed. Ed. Harper and

I

Row,

1973. New York, U.S.A.

h á c t i c a 2.-

Obtención de ácido desoxirribonucieico y ácido ribonuuleico,

- _

I

bacteriano s .

D. Se pretende aislar e l DNA y RNA de B a c i l l u s S u b t i l i s . SB19, l o

If diversas soluciones. La metodologia en ae3talle sobre como rom-

per l a pared c e l u l a r p o r medio de enzimas para d e i a r l i b r e l o s -

ácidos n u c l e i c o s , i n s o l u b i l i z a r l o s en etanol f r i o y p o s t e r i o r -

mente desproteinizar con cloroformo isopropanol, se encuentrea en l a b i b l i o g r a f í a siguiente.

Marmur, J. A Procedure f o r the i s o l a t i o n o f DNA and &VA f r o m

-

microorganisms. Ed. Journal Mol. Biol.

-

3:

208-218 1961

mas puro p o s i b l e , para l o cual se requiere que e l alumno prepam

E s t a práctica se l l e v a a cabo en

4

sesiones de laboratorio.

Práctica 3.

Análisis de l a ' c o m ~ o s i c i 6 n en bases de los ácidos desoxiribonu- c l e i c o y ribonucleico.

La metodología a seguir, a grandes rasgos e s l a siguiente:

Se' hidrolizan en medio ácido o básico, se& convenga, l o s Zci-

dos nucieicos en ampoiietas eometidas a 1200C de temperatara.

Los hidrolizados se analizan p o r cromatografia en pzpei en f o r -

ma descendente, corriendolos contra l a s bases patrones de a d e G

na, guanina, timina, c i t o s i n a y uracilo. Se secan y se revelan

los cromatogramas en presencia de l u z u l t r a v i o l e t a , midierido

-

10s "Rf" y comparándolos con los Rf reportados en l a b i b l i o g r a - -. .

f í a , s e concluye e l a n á l i s i s e i d e n t i f i c a c i ó n de bases de DNA y

FNA h i d r o l i zado s.

L a b i b l i o g r a f í a correspondiente e s l a s i g u i e n t e :

Watson,

J.

D. B i o l o g í a molecular d e l gen. Ed. Fondo Educativo

-

Interamericano, S. A. 1978. IkMico.

-

Rendina, G . T é c n i c a s de b i o q u h i c a aplicada. Ed. I n t e r a n e r i c a n a

1974. Idéxico.

E s t a práctica s e realiza en dos s e s i o n e s de l a b o r a t o r i o .

P r á c t i c a

4.

Edutaaénesis.

En e s t a p r á c t i c a s e pretende obtener c é l u l a s mutadas de

E s c h e r i c h i a

-

C o l i KL 16 cepa fermentadora de lactosa ( l a c p o s i - tivo).

L a mutación ee l l e v a a cabo con r a d i a c i o n e s de luz u l t r a v i o l e t a

a d i f e r e n t e s tiempos, después de haberse r e a l i z a d o las d i l u c i o - nes correspondientes.

Posteriormente s e siembran t a n t o las c é l u l a s irradiadas como

-

1 as t e s t i g o en agar M c o Conkey (medio d i f e r e n c i a l ) .

b o r a s de incubación se e s p e r a obtener c é l u l a s que no fermenten

I

Tras 18

I*

I l a l a c t o s a hasta á c i d o l á c t i c o , ya que e l agar Mc. Conkey posee

un i n d i c a d o r de pH s e n s i b l e a l ácido l á c t i c o , s e observar& que l a s c o l o n i a s b a c t e r i a n a s que no hayan formado un h a l o a b a r a

-

su alrededor son c é l u l a s mutadas.

Por

l o t a n t o , se e s - e r a obtener l a d i l u c i ó n y e l tieinpo de irrg d i a c i 6 n idóneos para e n c o n t r a r l a cantidad óptima de c é l u l a s

-

mutadas (no fermentadoras de iactosa)

.

L a metodología e n d e t a l l e s e encuentra en:

/

Davis,

B.

D.

Watson, J.D.

Esta práctica

E t .

- -

a l l . Microbiology Ed. Harper and Bow 1973,

New York,USA.

B i o l o g í a liiolecular d e l gen. Ed.

F.

E. I. S . A.

1978. Mex.

Como s e observa, czda una de l a s peacticas t i e n e un tiempo de

-

duración mayor ai de una s e s i 6 n de 4 horas, por e s t a razón solo s e imparten 4 prácticas p o r curso, en t o t a l son 10 s e s i o n e s de

-

prácticas mas e i tiempo dedicado a dos exámenes p a r c i a e s y u n -

f i n a l , hacen un nuevo t o t a l de 11 s e s i o n e s por curso.

En e l repFte-correspond%-extG a es%euroye%to-se

h a r h

l a s o b s e r

-

vaciones y proposiciones p e r t i n e n t e s p a r a v e r de qué manera se

pueden i m p a r t i r mas prácticas o más conocimientos en e l mismo

-

número de sesiones.

_--

i-

I'

...

2.5 Horario que se e s t a b l e c e r á de c o m h acuerdo, e n t r e e l t u t o r

y e l alumno.

I

E l h o r a r i o fue f i j a d o por l o s coordinadores d e l tr'onco c o m b de turno v e s s e r t i n o de 6 a 10 p.m. ( m i é r c o l e s o jueves)

_ E ~ i e m ; ? o - d e d i c a d a - ~ S . S ~ o r - c a d a - u r i o de -los t r e s t r i m e s

-

/- - t r e s proyectados a i m p a r t i r por semana, e s e l s i g u i e n t e :

2 hs. Preparación de c l a s e t e ó r i c o - p r á c t i c a .

2 hs. Preparación de s o l u c i o n e s así como v e r i f i c a c i ó n d e - que l o s r e a c t i v o s y e l equipo se encuentren en bue-

nas condiciones.

4 hs. Horas e f e c t i v z s de c l a s e de l a b o r a t o r i o ( s e s i ó n )

,

1

h. Hora de a s e s o r í a

u

hora e x t r a clese 4 h

I

1

Tiempo dedicado a l a r e v i s i ó n die r e p o r t e s y exámenes

13 hs. T o t a l por semana ,-

Siendo de 10 a 11 semanas por t r i m e s t r e , cada curso c o n s t a

-

de 1 3 0 a 1 4 3 hs. impartiendo 3 c u r s o s s e hace un t o t z l de

-

390 a 430 hs. de S e r v i c i o S o c i a l , y se& e l l t I n s t r u c t i v o de

S e r v i c i o S o c i a l " para t r a b a j o s de t i p o r u t i n a r i o , e l pasante debe c u b i r de 350 a 406) hs. de t r a b a j o .

2.6 Fecha de i n i c i a c i d n y término de S e r v i c i o S o c i a l

Debido a que i m p a r t í dos cursos simultáneos y u n o _{en Otro}

-

t r i m e s t r e , l a s f e c h a s son l a s s i g u i e n t e s :

para e l gruvo

BB51

80 O , se i n i c i ó e l 17 de septiembre de

-

1980 y s e terminó e l 28 de noviembre de 1980; pare l o s gru-

p o s BB51 81 I y BB05 (31 I , s e i n i c i a r o n e l 19 de enero de

-

1981 y s e terminaron e l

3

de a b r i l de 1981

MQxi O, D.

F.,

29 e a b r i l de 19.81

~

___---

M.

en C. José Roberto Gutiérrez Galera

D.C.B.S. de l a UAIiiI.

P r e s e n t e .

----Coordinador Generd del S. S. de l a

Por medio de l a presente, hago constar que e l pasante de Ing.

B i o q u h i c a I n d u s t r i a l , Mario Edgardo Viramontes AnzÚres, no. de cuenta 77326806, r e a l i z ó su Servicio S o c i a l como profesor de

L%

boratorio, de

3

de l o s cursos de Biología Molecular de los gru-

pos BB51 durante los periodos 80

0

y 81 I y en e l g r u p o BB05

-

I

periodo 81 I , a m i cargo.

,-

Durante todo ese tiempo, e l mencionado pasante mostró e l mas

-

a l t o sentido de responsabilidad y dedicación a l trabajo tanto

-

práctico como t e ó r i c o , que l e fue encomendado; habiendo alcanza

-

do, en m i opinión, s i hubiera necesidad de c a l i f i c a r l o , l a s mas altas notas.

Para los usos l e g a l e s que a l interesado convengan, se extiende

l a presente.

S i n m e s p o r e l momento, quedo de usted

A

t e n t a m . e - n t e

.

/'

I

I

I n f o m a f i n a l sobre e l proyecto de

,

-

AYUDANTIA EN LA DOCENCIA DE LABORA p a r a r e a l i z a r e l S e r v i c i o S o c i a l ,

DZ BIOLOGI

i

l l

IIiOLECULAR

que p r e s e n t a e l Pasante de I n g d n i e r í a Bioqufmicz I n d u s t r i a l

1 , __

--

_{, .}

I

/

\

rr

-.-&Y-

r-

o - MARIO EDGBRDO VIRAMONTES

AHZURES

asesorado por e l t y t o r

I

P r á c t i c a 1. i _I

Preparación de m a t e r i e l e s t é r i l medios de c u l t i v o .

E l método que se us6 en e s t a prá t i c a e s relativamente s e n c i l l o

y consiste en: l a v a r correctamente e l material de v i d r i o que se desea u t i l i z a r ( c a j a s p e t r i , pipetas, tubos de ensaye, etc.)

,

’

-~

.. , D..

pesan los componentes para preparar l o s medios de c u l t i v o y se ajustan a pH = 7

Se hacen tapones de algodón y gasa y se tapa e l material que

-

a s i i o requiera (incluyendo los matraces que contienen los me--

dios).

Las

cajas p e t r i se envuelven en papel de e s t r a s a y l a s pipetas

se introducen en un p i p e t e r o

Se coloca e l m a t e r i a l en horno

o

autoclave se& convenga para su e s t e r i l i z a c i ó n .

Despue6 de l a e s t e r i l i z a c i ó n , y de 1 8 a 2 4 horas antes de l a

-

siguiente práctica, inocular B a c i l l u s S u b t i l i s SB 1 9 en e l me-

d i o de c u l t i v o .

OBSERVACIONES:

La

f a l t a de autoclaves en función (hubo un trimestre en que

-

solo había una pequeña), d i f i c u l t ó que l a e s t e r i l i z a c i ó n d e l

-

material de todo e l grupo se l l e v a r a a cabo con raqidez.

Se puede apreciar que e l alumno l l e g a a l 20. $rimestre s i n co-

nocimientos n i e x p e r i e n c i e en l a manipulación básica de mete--

rial de l a b o r a t o r i o r Por ejemylo, pipetean con e l dedo pulgar; absorben burbujas de a i r e y tienen pocas precauciones t a t o pa-

ra

e v i t a r contaminación de l a cepa pipeteada, como para e v i t a r

i n g e r i r l o s microorganismos mientras se pipetea, entre o t r z s

-

cosas.

SUGERENCIAS:

-

Introducir cuando menos una sesión de l a b o r a t o r i o donde se

-

i

. . ..

,

₁

/'

s u t u r a s completamente durante 3

o

mas h o r a s , en e s t a s s o l u c i o n e s L a s s o l u c i o n e s de formaldehido y a l c o h o l l l e g a n a d e s t r u i r virus

y b a c t e r i a s (incluyendo l o s t i p o s esporógenos).

Puesto que t a l e s germicidas son t ó x i c o s , debe de s e r enjuagado

en a l c o h o l i s o p r o p i l i c o y agua d e s t i l a d a e s t é r i l a n t e s de u s a r

3 -

las s u t u r a s

I

E l alumno podrá i n t r o d u c i r l a s u t u r a e n un medio de c u l t i v o y

l u e g o i n c u b a r l o a 37oC durante 24 h o r a s , para asegurerse d e l a e s t e r i l i d a d d e l m a t e r i a l , observando s i hubo c r e c m i e n t o de m i - croorgani smo 5b

-

Despues de l a incubación d e l medio con B a c i l l u s S u b t i l i s , e l

alumno puede h a c e r f r o t i s para c e r c i o r a r s e de que no hay conta-

/ e minación e n dicho medio. Estz práctica f u e l l e v a d a a cabo en

-

dos s e s i o n e s , con completo é x i t o .

-4ctica 2.-

Obtenci6n de Acido d e s o x i r r i b o n u c l e i c o y á c i d o r i b o n u c l e i c o .

Mbétod0.-

-

--

CEPA ( B a c i l l u s S u b t i l i s )

CALDO LURIA (medio r i c o )

I n ubar 18 a 24 h s . ; a T = 37OC con agitrción I

I

CENTRIFUGAR a 5,000 RPM, 20'

4

."

,.

. .

.I t

Rezuspenaer ias celiilas en

una

solucion

ae I k C 1 0.14 i;. Reper;- ' a operacion aos

veces.

I 1

Resuspender las ceiuias en una solucion

s a l m a - c i m a t o (U.). Fonogeneizar.

1

1

1

Aciicionar 10 45. ae l i s o z m e incubar

a 50 OC durante

IO'.

Adicionar 5 gotas de iauril S u l f a t o de-

l

Sodio

a l

2555.

Adicionar I O lez. _{de solución salina--ci-}

trato. Houogene

izar

suavelaent e

.

Centri-

a

3 O00 DIU; 30'; y decantar

a 3 O00

&

Sob e-

p.p.

rpm; 30'

Adicionar I O

iril.

de solución de NaCl 2 IC.

nadante 11

'

1

A g i t a r ugn6ticsrnente; 30';

T:4

OC.

1

1

r

\ " r p m ; 30'.

I

1

~

S e l e somete a f i l t r a c i ó n .

Sobrenadante 11'

y

I11 se juntan.

i

obre nadant e IT.

1

I

i

"

I

Adicionar 2 VolGenes de Etanol as-

1

!

,"

I I

P?P.

Sobreddante

VI

I

J.

Adicionar I O u i i c r o g r u s de desoxirribo- __

m c

easa.

I

I

I

Incubar a 37 OC ;

I

ñr.

Desproteinizar

1

una vez con solución de

-

Cloroforiiio-IEopropanol 5; I. Adicionar

un

Agitar suavemente durante 20'.

I

A

l a

Fase Acuosa adicionar 2 VolLenes

-

tanoi

frío.

6~ a 3 O00 rpu; 301.

1

Disolverlo en

una

solución

-

de Nacl 0.14

E,

utilizando para

ello

5

ul.

/

r'

I

PfP. Fase

-

en golución

D i s o l v e r l o en 5 d..de

Soiu

ión

de I?aci 2

M.

_ _ - - . . . - -

P

Desprote

inizar

con solu-

cidn de Ciororormo-isopro

-

pan01 5:I. Adicionar I Vo

-

l h e n . A g i t a r suavemente

-

durante 20'.

I

CeCntrimsa

3 000 rpm;

SO'

.

PfP

.

.

.

~ Fafie Acuosa Ó

Sobrenadante V

1

1

I

9

Adicionar I

uü..

de Solución de

Nam 0.5

N.

Incubar a 37 %; I

hr.

Desproteinizar 2 veces con solu-

c i ó n de ClorororEio-lsopropanoi 5:

T.

Adicionar

I

volúuien. A g i t a r sua-

v e m t e durente 20'.

Fase Acuosa. Adicionar 2 V o l h e -

nes de Etanol

*io,

estrcltificando.

I

I

P!P. soiitción.

/

1

I

I

I

R e d i s o l v e r l o en una

solución estéril de

-

NaCl 0.14

E.

Conservar-

Z:~&ER~ACIONES: ~~. .

- E n l o s 3 c u r s o s , tras algunas d i f i c u l t a d e s para conseguir r e a c t i v o s como L a u r i i S u l f a t o de sodio, DNAasa y RNasa, s e obtuvo

-

.DNA como un h i l o v i s c o s o , b l s n c o , enredado en una-varilla de vi-

b r i o .

-

L a t e r r i b l e i m p r e c i s i ó n Oe l a s balanzas analíticas, t r a e como

consecuencig e r r o r e s n o t a b l e s en l a medición de l i s o z i m a (10 mg) DNAasa y BNAasa

-

Solo a o s equipos de los

3'

cur.sos pudieron o b t e n e r RNA.

-

. . . . ., ~~ ~ ... . . -__ ~ _ _ -~ _ _ _ .-/-- -~ . . . - _ _ .~

_-

.. . : - . . ~ . . ~ .. Consi-

- :der0 que a' e s t e n i v e l - e l eiumno no t i e n e aun la e x p e r i e n c i a pa- ..-,-

1

r *

aislar de bacterias l o s á c i d o s n u c l e i c o s , por ejemplo, agitan ligeramente mas f u e r t e rompiendo l a s hebras die

R N A

Q u i z á . s e a m a s fácil. . . ~ aislar ácidos . . . . . n u c l e i c o s . . . . . de c é l u l a s -. . . h e p á t i c a s I

. . - -.

~~. . _{. .~ -~}

~

.de rata y l l e v a menos tiem?o

-

Debido a l a c a r e n c i a de DNA asa y RNAasa, se consiguio

un

me-

todo-qu%ÜicÓ~ que s u s t i t u y e r a e s t a s -enzimas, a s a b e r , 0.1~ ml.HC1

. .

-

. . .. -. . . . _ . . . - . . ..

_ _

.. . .

-

-

-6N'3'0.2-

ml.

NaOH

3N respectivamente

SUGERENCIAS :

.

_ - . Preveer que- secoapren ór coi¡s&pli-las camisas d6i-ios - c a b e z a l e s

fs.ae.

centrifuga: n e c e s a r i 0 . s 3;rrs.qus; :todos

30s

:equipas -puedan L t r a -

,.. - ~. .. .. - . _

_ _ _ _

_ . ~ -

-.bajar ..iia l - m i c m o ~ . .. .- -tiemp+r ~. . - - . . - -- .

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-

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Re

p o r t Iir ~ b a l a n z a s a n a l it icas

,

así -c.omo~ -comprar . re-ac - t i v o s faltan - _

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t e s .

-

Cambiar

l a

práctica de obtención de DNA y RNA b a c t e r i a n U s por

.. - . .

. .

- . . _ . .~

_ _

. ..

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. . . . . - . _.--ge&-:. un _. método.rea-

..

'ce~ir-"ai'siana-o'.

DN~..

.y-: oac-t:e.rl"alio

;

'pero

_..-

..

-'-'%izado por Sidney A l t m a n , en e l c u a l se observa que se r e a l i z a en menos tiempo l a práctica ( q u i z á en dos ' s e s i o n e s y no

4 ) ,

ya

&traccidn del A.D.N.

A continuacidn mencionamos cdmo Sidney Alhan realiza dicho

-4’ trabajo en presencia del autor y le bxplica los pasos que

sigue en el mismo.

Aitman saca una botella grande con lSquido gris que parecía

=- agua de fregadero. “Empezaremos con ésto“, son bacterias en

un

medio de cultivo, necesitaremos agua, carbono y algunos aminoácidos. V a n estado creciendo desde que empecé anoche,

por

eso se ve tan turbio, ahora centrifugamos para concentrar

a l a s bacterias”,Altman vaci6 el contenido en 4 tubos anchos de plástico, se llevaron a una centrífuga, Altman incertd los

tubos en los agujeros, fijando una velocidad de 8 0 0 0 rpm, de- jándola por 30’.

Cuando Altman sac6 los tubos, el líquido se había aclarado y

en

el

fondo de cada tubo había

un

pequeño residuo amarillo-gris pálido. A las células les agregó EDTA, etilenediaminetetra ace- tato, que recoge el magnesio de las paredes de las células bac- terianas. Su pared es muy duraperoésto las hace débiles. Agre-

g6 _otro poco de 10% SDS dodecil sulfato de sodio, para solubili-

zar las.paredes celulares, la idea era romperlas para sacar el

DNA.

a t m a n puso un tapón. “Conforme las células se rompen, las bacterias desaparecen y la mezcla se aclara. Al mismo tiem- po este líquido se pondrá viscoso, porque el ADN de cada cé- lula es esencialmente una molécula extremadamente larga y al liberarse se desenrrollan. Altman suspendió el tubo en

un

ba-

ño de agua corriente a temperatura de 37OC y lo dej6 por me- dia hora. Al sacar el líquido del baño éste estaba claro nue- vamente. Agregó fenol “el fenol ataca a la proteína dejando

.-

solamente el ADN”; el fenol y

l a

proteína son más pesados y

.se

irán

al fondo mientras que el ácido nucléico se mantiene en

la

superficie acuosa.

Tap6 el tubo y lo movid suavemente, se formó una espuma ligera tomando un color gris pálido y espeso y moviendo con la mano sua- vemente se evita que el AüN se rompa demasiado.

-

La

otra pasta que queda es proteína,.^ se separa por centrifu- gación. Pes6 el tubo, luego elevó otro que equilibraría el apa- rato. Al cerrar la tapa de la centrífuga, se inicia la rotación inclinando los tubos hacia arriba en forma horizontal. Se deja media hora.

P

y se pone tan viscoso que nos costard trabajo sacarlo sin c

if

i

contaminarlo con l a proteína que está abajo. colocó e l tubo

en una cubeta con h i e l o raspado. Tom6 una probeta de v i d r i o

y t r a t ó de succionar l a capa superior d e l l í q u i d o pero se ca-

í a de nuevo a i tubo. Con nna pipeta a l a cia1 l e hizo una pe-

que* hendidura consiguió su objetivo. Añadió etanol en dobles

I

/

volíhenes. Lentamente vació e l alcohol por e l lado d e l tubo,

para que e l material viscoso quedara flotando en l a superficie. Mezcló agitando lentamente con un agitador de v i d r i o . E l alco-

/

t

I hol precipita al ADN. se jalaron l a s f i b r a s afuera de l a solu- L

cibn como desenrrollando un espagueti. Al torcer e l agitador,

i

i l a punta se empezó a cubrir como s i tuviera telarañas, mojadas

traslúcidas, a l sacarlo l a f i b r a adherida se j a l 6 y form6 un filamento alargado. Este filamento s e podrá analizar su estruc- tura por medio de rayos X.

Actualmente se lucha por analizar e l ADN en procedimiento como l a cromatografía o e l e c t r o f o r e s i s , métodos mediante l o s cuales

una pequeñísima cantidad de sustancias biológicas pueden ser separadas para i d e n t i f i c a r l a s y medirlas mediante l a migración, sea en solución, en un f i l t r o de papel, o a través de una capa

de g e l en algunas v i a j a n más aprisa que otras debido a l a d i f e - rencia en e l peso y solubilidad o carga e l é c t r i c a de l a s molécu- II

2"'

.-.'

8

I

1 2 , 3 i 6

--Células encapsuladas cultivadas en caldo.

Se concentran en centiífuga: resuspendidas en una solución de cloruro de sodio; calentadas

a

65'C para inactivar enzimas que destruyen l a actividad transforma-

dora

Se lavan las células en solución de

cloruro de sodio; luego se mezclan

con

el solvente para lípidos desoxi- colato sódico, para extraer componen-

tes celulares hidrosolubles.

Se separan las células por centrifuga-

ciÓn; al sobrenadante se agregan 3-4

volúmenes de etanol

.

Se separa y escurre el precipitado. E l desoxicolate permanece en sobrenadante. Se disuelve el precipitado en solución de c?oruro de sodio y se agita con clo-

roformo, para extraer proteínas.

Se elimina el cloroformo y l a solución de cloruro de sodio se reprecipita con

etanol. El precipitado se disuelve en una

solución de cloruro de sodio.

Se añaden enzimas para digerir pol isacáridos capsulares; se vuelven a precipitar con eta- nol; se disuelven en solución de cloruro de sodio.

Se agitan con cloroformo para separar las

enzimas añadidas.

fc

.si Se'añade etanol en gotas, agitnado hasta

que las fibras precipiten alrededor de la varilla.

Las fibras removidas de l a varilla y lavadas

en una solución de etanol cloruro de sodio. El producto es DNA químicamente puro.

/

I

1

4

5

/'- ,

e

-

,

c 5

_I

!

8

7

9

I

L a práctica fue r e a l i z a d a en un

60$,

ya que no s e obtuvo siem- pre

RNA

s i n o solamente

DNA.

Se r L a i i z 6

en

4 s e s i o n e s mas tiem

-

I PO e x t r a clase

I

Práctica 3.

. Análisis de l a comuosici6n de b a s e s de los á c i d o s n u c i e i c o s .

__

La

metodología l a resumimos a continuacibn:

Se tomaron 0-5 m l de l a s&ución de

DNA

y s e c e r r ó en una ampo+

l l e t a , antes s e agregó a l

D N A

0.1 mi de €IC1 al

6N

Con l a s o l u c i ó n de RNA s e h i z o l o mismo, solamente s e tom6 0.4 m l de RNA con 0.2 m i de

NaüH 3N

Se i n t r o d u j e r o n en e l autoclave durante

3

h o r a s , para h i d r o l i -

z a r l o s ácidos.

Se c o r t ó e l papel i'ihatman no. 1 de 23 x 57, dividiéndose e n t r e

7 pzra cada n u c i e 6 t i d o y

DNA, RNA.

Se colocaron 1 5 0 m i c r o l i t r o s de

DNA

y &VA en su l u g a r e n e l

-

papel.

E1

cromatogrüma s e c o l o c 6 en l a cámara s a t u r a d a de isopropanol

HCl2N

Despues de 3/4 p a r t e s de corrimiento se s a c a r o n l o s cromatogrs

mas a s e c a r 1 2 noras.

Se r e v e l a n l o s cromatogramas con l u z u l t r a v i o l e t a , s e sacan

-

l o s R f y Rv.

OBSERVXIONES : /

-

En algunos equinos l o s r e s u l t d o c obtenidos e n e s t e análisis

fueron muy buenos, por ejemplo

,,.

Bases Ev R f encontrado R f reportado en b i b l i g r a f .

í’

M e n i n a

97

.39

40

./ Guanina 96 31 . - 2 9

C i t o s i n a 1.01

.54

51

Timina 99

84

a85

-

U r a c i l o

093

9

79

.75

,

í

_{Por l o t a n t o , s e i d e n t i f i c a r o n todas las b a s e s}

-

Se d e j 6 v e r l a c a r e n c i a de cámaras de cromatogrdfía ( s o l o 2),

para

5

g r u ~ o s matutinos y 1 vespertino e

-

Debido a l a c a r e n c i a de cubetas, no s e h i z o cromatografia en formadescendente sino ascendente, obteniéndose me j o r e s r e c u l t a - dos que e n o t r o s grupos que l o r e a l i z a r o n en forma descendente. SUGERLNCIAS.

-

Que s e hagan cromatogramas en forma ascendente.

-

Que s e consigan l a s cámaras n e c e s a r i a s

-

Que s e introduzca l a cromatografía en capa f i n a , ya que t i e n e l a s s i g u i e n t e s v e n t a j a s :

a) Resolución d e l s o l u t o de buena a e x c e l e n t e

b) La ma;orfa de l a s preparaciones se l o g r a n dentro de

5

a 6

h o r a s

c) Se pueden s e p a r a r casi todo t i p o de compuestos

d) No hay l í m i t e e n e l t i 3 0 de método de d e t e c c i ó n que puede

u s a r s e

I

-

Que se p i d a e n e l r e p o r t e Rf obtenido,Rf renortado y

Rv

( y no

solamente Rf obtenido, como s e hace normalmente), para que e l alumno s e de cuenta d e l

%

de e r r o r obtenido.

L a práctica se l l e g 6 a r e a l i z a r en un loo$ en al,@.nos equipos,

un tieinPo de duración de 2 s e s i o n e s m a s tiempo e x t r a ,-.-.ace

\

.

elevada l o s resultados eran a a s i l e t a l e s y no había muchas c o l 2 nias.

-

Es

necesario hacer un cepario de b i o l o g í a molecular, ya que

-

t r a s un f r o t i s que hice me d i cuenta de que l a s cepas que se t r a

-

~ - - - .. .

___

b a a b a n e st&iGSYtFZiüZdamente c ontmiXZdXs.

_ -

--

_-

_{Se introdujo e l concepto de que se ha observado que cuando hay}

un

io$

de supervivencia a una dosis de U.V. se encuentra l a can

-

t i d a d óptima de c é l u l a s mutadas a una d i l u c i ó n dada. A conti--

,

_{nuación presento l o s resultados acompañados de g r á f i c a que se}

-

encontró en una de e s t a s mutaciones, donde se observa que a un tiempo de r s d i a c i ó n de 90' en una dilucibn se encuentra dl

10% de supervivencia de c é l u l a s expuestas a l a U.V.

Se obtuvieron l o s resultados siguientes:

t = 10 seg.

t o

D i l .

#

de colonias

$

D i l .

#

de c o l o n i a s

P

10-4 57 100 10-4 4 7.01 10-5 20 10-5 1 17.543

10-6 11 10-6 3 52.63

I t= 20seg.

t=

60 seg.

10-3

4 50 78.94 incantable

10-4

51

89.47 210 36 e

84

10-5 no se observó

10-4

34

59.65

t = 90 seg. 1

0 '

2 281 4.92

1.0-3 62

io.

a77

?f/$b/%Fwb5w.d

b/é

I '

.

10-4 18 31-58

I

SUGERENCIAS.

I

.

elevada l o s resultados eran e a s i 1 t a l e s y no había muchas c o l o nias.

-

Es

necesario hacer un cepario de b i o l o g i a molecular, ya que

-

tras un f r o t i s que h i c e me d i cuenta de que l a s cepas que se t r a bajaban está? extremadamente contaminadas.

-

Se introdujo e l concepto ide que se ha observado que cuando hay un 10% de supervivencia a una d o s i s de

U.V.

se encuentra l a can

-

t i d a d dptima de c é l u l a s mutadas a una d i l u c i ó n dada. A conti-

-

L

i

_ y ’

nuación presento l o s resuitzdos acompañados de g r á f i c a que se

-

I

encontró en una de e s t a s mutaciones, donde se observa que a un tiempo de rediación de 90’ en una d i l u c i ó n

loL3,

se encuentra d

10% de supervivencia de c é i u i a s expuestas a l a

U.V.

Se obtuvieron l o s resultados siguientes:

.

t o

D i l .

#

de colonias 10-4 57

10-5 20 10-6 11

t=

20seg.

10-3

4 50

10-4 51

10-5 no se observó

t = 90 seg.

10-2 281 10-3 62 10-4 18

t = 10 seg.

%

D i l .

#

de c o l o n i a s

%

100 10-4 4 7.01

10-5, 1 15‘7.543 10-6

3

52-63

t= 60 seg.

78.94 incontable

89.47

210

36

*

84

10-4

34

59065

/

,

4.92 10.877

31- 58

//%i/t?Wbff&

b/f?

SUGERENCIAS.

. .

.

. ,

organismos, balanzas a n a l l t i c a s , etc.

-

Hacer cepareo para l a s bacterias puras y controlarlas.

-

Atender a l a propuesta de elaborar curva de l e t t i l i d a d g r a f i - cando

$

de sobrevivencia contra tiemoo de radiación, para

-

.

que e l alumno aprecie como v a r i a l a población se&

de U.V. y l a dilucibn.

-

/--

L a p r á c t i c a se l l e v ó a cabo en un 80% de l o esperado,

dos sesiones mas tiempo e x t r a clase

durante

I -

He llamado "tiemno extrti clasei* a l a preparaci6n de nedios de c u l t i v o , inoculaciones, conteo de colonias y revelado de croma-

togramas, princinalmente

.

---.-.-Siendo un _ t o t a l de_alumnos.en la. seccion a-mi cargo:

__

3 B 5 1 80 O 20 alumnos BE51

81,

I 24 alumnos BB05 81 I 21 alumnos

,. " 65 alumnos

Por tanto, se revisaron y c o r r i g i e r o n 325 r e p o r t e s y se c a l i f i - caron 195 examenes, a s i p e s se u t i l i z a r o n 132 hs. de c l a s e ,

33

hs. de preparación de c l z s e s , 66 hs. de preparación de solucio-

nes, r e a c t i v o s y equino den general, 60 hs. de asesoriás y horas e x t r a c l a s e y 32 hs. emclezdas para r e v i s a r y c o r r e g i r e x h e n e s ~

y reportes; todo é s t o hace un t o t a l de 423 hs. dedicEdas a In

-

docencia en 3 cursos de Laboratorio de Biologia Uolecualr; por

bitimo, propongo que en v e z de ser

4

p r á c t i c a s se den 6 prácti-

cas, introduciendo dos de adiestramiento d e l zlumno, zcortznao

a s € a dos sesiones ( e n vez de 4) ia p r á c t i c a de obtención de 3:i-i

y RNA siguiendo e l métocio que ya mencioné propuesto por Sidney. Altman

I'