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SERVICIOS DOCUMENTALE= IZTAPAUPAProyecto sobre l a
1
~ Y U D A N T I A EX LA DOCENCIA DE LABORATORIO DE BIOLOGIA ~~~OLECULAR.
I
' /
que presenta e l Pasante de Ing. Bioquimica I n d u s t r i a l
,
J
MARIO EDGARDO VIRAiIIONTES ANZURES
/&
asesorado por e l tutor
1 /
r
J
2.4 Proyecto.
L a r e a ~ i z a c i b n de e s t e proyecto de S e r v i c i o s o c i a l , t i e n e por
-
o b j e t o auxiliar en l a docencia de 13 cursos &e Laboratorio de B i o l o g i a Molecular, impartidos por e l D r . Héctor González Cerezo.,’ ,
. -
L a l a b o r que se d e s a r r o l l a e n a s t e t i p o de c u r s o s , c o n s i s t e e n d a r a l o s alumnos de 20. t r i m e s t r e una introducción t e ó r i c o - p r á c
-
t i v a , p r e v i a a cada s e s i 6 n de l a b o r a t o r i o ; a s e s o r a r l o s dentro yf u e r a de l a s h o r a s de c l a s e s ; e n s e ñ a r l e s t é c n i c a s de ma?ipuleo’
en l a b o r a t o r i o , así como e l manejo de algunos aparatos t a l e s
-
como c e n t r í f u g a s , a u t o c l a v e s , balanzas analíticas, e t c . ; r e v i - sar y c o r r e g i r r e p o r t e s i n d i v i d u a l e s , semanales; preveer que-
las s u b s t a n c i a s , s o l u c i o n e s , r e a c t i v o s , equipo de l a b o r a t o r i o-
en
g e n e r a l , e t c . , s e encuentre disponible para l a s e s i ó n c o r r e s-
pondiente o b i e n acondicionarlo, o m o d i f i c a r ( e n a t i m a i n s t a n -cie),
pequeños a s p e c t o s de l a práctica, de manera que é s t a se-
pueda l l e v a r a cabo con é x i t o ; por o t r o l a d o , s e deben prep-arI
e i m p a r t i r exámenes p a r c i a l e s y f i n a l e s para una evaluación mas
completa d e i alumno.
Estas son, a grandes r a s g o s , las actividades a r e a l i z a r durante e l S. S., en e l c u a l se d e s e a mejorar un poco mas e l n i v e l de
-
aprendizaje d e l alumno, c o n k p r e s e n c i a de dos a u x i l i a r e s ade- más d e l p r o f e s o r t i t u l a r . /
L a s prácticas que normalmente s e l l e v a n a cabo e n e s t e t i p o d e - c u r s o s , son U s s i g u i e n t e s :
Práctica 1.-
Preparaci6n de m a t e r i a l e s t é r i l y m e d i o s de c u l t i v o .
En cuanto a l o que s e r e f i e r e 2 l a e s t e r i l i z a c i ó n de m a t e r i a l e s
se proponen los s i g u i e n t e s métodos:
<''
I'
-
E s t e r i l i z a c i ó n por i n c i n e r a c i ó n de materia o r g á n i c ao
" c a l o r a l Se hace por medio de mechero e s t e r i l i z a n d o asas de p l a t i n o , a g u j a s , e t c .-
E s t e r i l i z a c i ó n con vapor o q * c a l o r húmedo". Usando a u t o c l a v e ,-. ~. para e s t e r i l i z a r medTo-sidTc.uItivo.
-
E s t e r i l i z a c i ó n por 'vcalor seco". Se hace por medio de horno--.---_______
.- .. ~~ . ~~-
/ ~ - -
e s t e r i l i z a n d o m a t e r i a l de v i d r i o en general.
-
E s t e r i l i z a c i ó n por f i l t r a c i 6 n . Aquí s e usan membranas o pa?d Whatman de tamaño de poro muy pequeño. S i r v e para e s t e j r i l i z a r i i q u i d o s v i s c o s o s .-
E s t e r i l i z a c i ó n por e b u l l i c i ó n . Usando m a t e r i a l e s como j e r i n -gas en baños de agua hirviendo.
-
E s t e r i l i z a c i ó n por r a d i a c i o n e s . E s t e r i l i z a c i ó n de h z b i t a c i o - n e s con l u z u l t r a v i o l e t a o rayosX
Solamente s e practicará e s t e r i l i z a c i ó n por métodos f i s i c o s ,
-
no químicos.: En cuanto a l a preparación de medios de c u l t i v o , s e prepara?
... los s i g u i e n t e s medios:
' - Medio r i c o ( c a l d o l u r i a )
--.. Medio minimo
-
Medio d i f e r e n c i a l (para cepas fermentadoras de l a c t o s a )Esta práctica s e l l e v a a cabo durante dos s e s i o n e s de l a b o r a -
.
'
t o r i o ._ _ . ' - :
te.:.
-L a b i b l i o g r a f í a correspondiente a e s t a práctica e s l a s i g u i e n
-
.
~
.
. .. . --.
.~
C o l l i n s C.
H.
Métodos m i c r o b i o l 6 g i c o s E t . Acribia, 1 9 6 9 , 22- - .1
___..
-
.,..
ragoza, España.
. .
P e l c z a r , M.
H.
Microbiology, 2a. Ed. Ed. MC G r a w H i l l , Xew:Lr.; 1 ' . .
' .
~I
P i a t k i n ,
K o
Microbiología. ed. M i r . 1968, MoscÚ, Rusia.Davis, B.
D.
y DuibeEcoR.
Microbiology. 2a. ed. Ed. Harper andI
Row,
1973. New York, U.S.A.h á c t i c a 2.-
Obtención de ácido desoxirribonucieico y ácido ribonuuleico,
- _
I
bacteriano s .
D. Se pretende aislar e l DNA y RNA de B a c i l l u s S u b t i l i s . SB19, l o
If diversas soluciones. La metodologia en ae3talle sobre como rom-
per l a pared c e l u l a r p o r medio de enzimas para d e i a r l i b r e l o s -
ácidos n u c l e i c o s , i n s o l u b i l i z a r l o s en etanol f r i o y p o s t e r i o r -
mente desproteinizar con cloroformo isopropanol, se encuentrea en l a b i b l i o g r a f í a siguiente.
Marmur, J. A Procedure f o r the i s o l a t i o n o f DNA and &VA f r o m
-
microorganisms. Ed. Journal Mol. Biol.-
3:
208-218 1961mas puro p o s i b l e , para l o cual se requiere que e l alumno prepam
E s t a práctica se l l e v a a cabo en
4
sesiones de laboratorio.Práctica 3.
Análisis de l a ' c o m ~ o s i c i 6 n en bases de los ácidos desoxiribonu- c l e i c o y ribonucleico.
La metodología a seguir, a grandes rasgos e s l a siguiente:
Se' hidrolizan en medio ácido o básico, se& convenga, l o s Zci-
dos nucieicos en ampoiietas eometidas a 1200C de temperatara.
Los hidrolizados se analizan p o r cromatografia en pzpei en f o r -
ma descendente, corriendolos contra l a s bases patrones de a d e G
na, guanina, timina, c i t o s i n a y uracilo. Se secan y se revelan
los cromatogramas en presencia de l u z u l t r a v i o l e t a , midierido
-
10s "Rf" y comparándolos con los Rf reportados en l a b i b l i o g r a - -. .
f í a , s e concluye e l a n á l i s i s e i d e n t i f i c a c i ó n de bases de DNA y
FNA h i d r o l i zado s.
L a b i b l i o g r a f í a correspondiente e s l a s i g u i e n t e :
Watson,
J.
D. B i o l o g í a molecular d e l gen. Ed. Fondo Educativo-
Interamericano, S. A. 1978. IkMico.-
Rendina, G . T é c n i c a s de b i o q u h i c a aplicada. Ed. I n t e r a n e r i c a n a1974. Idéxico.
E s t a práctica s e realiza en dos s e s i o n e s de l a b o r a t o r i o .
P r á c t i c a
4.
Edutaaénesis.
En e s t a p r á c t i c a s e pretende obtener c é l u l a s mutadas de
E s c h e r i c h i a
-
C o l i KL 16 cepa fermentadora de lactosa ( l a c p o s i - tivo).L a mutación ee l l e v a a cabo con r a d i a c i o n e s de luz u l t r a v i o l e t a
a d i f e r e n t e s tiempos, después de haberse r e a l i z a d o las d i l u c i o - nes correspondientes.
Posteriormente s e siembran t a n t o las c é l u l a s irradiadas como
-
1 as t e s t i g o en agar M c o Conkey (medio d i f e r e n c i a l ) .
b o r a s de incubación se e s p e r a obtener c é l u l a s que no fermenten
I
Tras 18
I*
I l a l a c t o s a hasta á c i d o l á c t i c o , ya que e l agar Mc. Conkey posee
un i n d i c a d o r de pH s e n s i b l e a l ácido l á c t i c o , s e observar& que l a s c o l o n i a s b a c t e r i a n a s que no hayan formado un h a l o a b a r a
-
su alrededor son c é l u l a s mutadas.
Por
l o t a n t o , se e s - e r a obtener l a d i l u c i ó n y e l tieinpo de irrg d i a c i 6 n idóneos para e n c o n t r a r l a cantidad óptima de c é l u l a s-
mutadas (no fermentadoras de iactosa).
L a metodología e n d e t a l l e s e encuentra en:
/
Davis,
B.
D.Watson, J.D.
Esta práctica
E t .
- -
a l l . Microbiology Ed. Harper and Bow 1973,New York,USA.
B i o l o g í a liiolecular d e l gen. Ed.
F.
E. I. S . A.1978. Mex.
Como s e observa, czda una de l a s peacticas t i e n e un tiempo de
-
duración mayor ai de una s e s i 6 n de 4 horas, por e s t a razón solo s e imparten 4 prácticas p o r curso, en t o t a l son 10 s e s i o n e s de-
prácticas mas e i tiempo dedicado a dos exámenes p a r c i a e s y u n -f i n a l , hacen un nuevo t o t a l de 11 s e s i o n e s por curso.
En e l repFte-correspond%-extG a es%euroye%to-se
h a r h
l a s o b s e r-
vaciones y proposiciones p e r t i n e n t e s p a r a v e r de qué manera sepueden i m p a r t i r mas prácticas o más conocimientos en e l mismo
-
número de sesiones._--
i-
I'
...
2.5 Horario que se e s t a b l e c e r á de c o m h acuerdo, e n t r e e l t u t o r
y e l alumno.
I
E l h o r a r i o fue f i j a d o por l o s coordinadores d e l tr'onco c o m b de turno v e s s e r t i n o de 6 a 10 p.m. ( m i é r c o l e s o jueves)
_ E ~ i e m ; ? o - d e d i c a d a - ~ S . S ~ o r - c a d a - u r i o de -los t r e s t r i m e s
-
/- - t r e s proyectados a i m p a r t i r por semana, e s e l s i g u i e n t e :
2 hs. Preparación de c l a s e t e ó r i c o - p r á c t i c a .
2 hs. Preparación de s o l u c i o n e s así como v e r i f i c a c i ó n d e - que l o s r e a c t i v o s y e l equipo se encuentren en bue-
nas condiciones.
4 hs. Horas e f e c t i v z s de c l a s e de l a b o r a t o r i o ( s e s i ó n )
,
1
h. Hora de a s e s o r í au
hora e x t r a clese 4 hI
1
Tiempo dedicado a l a r e v i s i ó n die r e p o r t e s y exámenes
13 hs. T o t a l por semana ,-
Siendo de 10 a 11 semanas por t r i m e s t r e , cada curso c o n s t a
-
de 1 3 0 a 1 4 3 hs. impartiendo 3 c u r s o s s e hace un t o t z l de
-
390 a 430 hs. de S e r v i c i o S o c i a l , y se& e l l t I n s t r u c t i v o de
S e r v i c i o S o c i a l " para t r a b a j o s de t i p o r u t i n a r i o , e l pasante debe c u b i r de 350 a 406) hs. de t r a b a j o .
2.6 Fecha de i n i c i a c i d n y término de S e r v i c i o S o c i a l
Debido a que i m p a r t í dos cursos simultáneos y u n o en Otro
-
t r i m e s t r e , l a s f e c h a s son l a s s i g u i e n t e s :
para e l gruvo
BB51
80 O , se i n i c i ó e l 17 de septiembre de-
1980 y s e terminó e l 28 de noviembre de 1980; pare l o s gru-
p o s BB51 81 I y BB05 (31 I , s e i n i c i a r o n e l 19 de enero de
-
1981 y s e terminaron e l3
de a b r i l de 1981MQxi O, D.
F.,
29 e a b r i l de 19.81~
___---
M.
en C. José Roberto Gutiérrez GaleraD.C.B.S. de l a UAIiiI.
P r e s e n t e .
----Coordinador Generd del S. S. de l a
Por medio de l a presente, hago constar que e l pasante de Ing.
B i o q u h i c a I n d u s t r i a l , Mario Edgardo Viramontes AnzÚres, no. de cuenta 77326806, r e a l i z ó su Servicio S o c i a l como profesor de
L%
boratorio, de3
de l o s cursos de Biología Molecular de los gru-pos BB51 durante los periodos 80
0
y 81 I y en e l g r u p o BB05-
I
periodo 81 I , a m i cargo.
,-
Durante todo ese tiempo, e l mencionado pasante mostró e l mas
-
a l t o sentido de responsabilidad y dedicación a l trabajo tanto-
práctico como t e ó r i c o , que l e fue encomendado; habiendo alcanza-
do, en m i opinión, s i hubiera necesidad de c a l i f i c a r l o , l a s mas altas notas.
Para los usos l e g a l e s que a l interesado convengan, se extiende
l a presente.
S i n m e s p o r e l momento, quedo de usted
A
t e n t a m . e - n t e.
/'
I
I
I n f o m a f i n a l sobre e l proyecto de
,
-
AYUDANTIA EN LA DOCENCIA DE LABORA p a r a r e a l i z a r e l S e r v i c i o S o c i a l ,DZ BIOLOGI
i
l l
IIiOLECULAR
que p r e s e n t a e l Pasante de I n g d n i e r í a Bioqufmicz I n d u s t r i a l
1 , __
--
, .
I
/
\
rr
-.-&Y-
r-
o - MARIO EDGBRDO VIRAMONTES
AHZURES
asesorado por e l t y t o r
I
P r á c t i c a 1. i I
Preparación de m a t e r i e l e s t é r i l medios de c u l t i v o .
E l método que se us6 en e s t a prá t i c a e s relativamente s e n c i l l o
y consiste en: l a v a r correctamente e l material de v i d r i o que se desea u t i l i z a r ( c a j a s p e t r i , pipetas, tubos de ensaye, etc.)
,
’
-~
.. , D..
pesan los componentes para preparar l o s medios de c u l t i v o y se ajustan a pH = 7
Se hacen tapones de algodón y gasa y se tapa e l material que
-
a s i i o requiera (incluyendo los matraces que contienen los me--dios).
Las
cajas p e t r i se envuelven en papel de e s t r a s a y l a s pipetasse introducen en un p i p e t e r o
Se coloca e l m a t e r i a l en horno
o
autoclave se& convenga para su e s t e r i l i z a c i ó n .Despue6 de l a e s t e r i l i z a c i ó n , y de 1 8 a 2 4 horas antes de l a
-
siguiente práctica, inocular B a c i l l u s S u b t i l i s SB 1 9 en e l me-
d i o de c u l t i v o .
OBSERVACIONES:
La
f a l t a de autoclaves en función (hubo un trimestre en que-
solo había una pequeña), d i f i c u l t ó que l a e s t e r i l i z a c i ó n d e l
-
material de todo e l grupo se l l e v a r a a cabo con raqidez.
Se puede apreciar que e l alumno l l e g a a l 20. $rimestre s i n co-
nocimientos n i e x p e r i e n c i e en l a manipulación básica de mete--
rial de l a b o r a t o r i o r Por ejemylo, pipetean con e l dedo pulgar; absorben burbujas de a i r e y tienen pocas precauciones t a t o pa-
ra
e v i t a r contaminación de l a cepa pipeteada, como para e v i t a ri n g e r i r l o s microorganismos mientras se pipetea, entre o t r z s
-
cosas.SUGERENCIAS:
-
Introducir cuando menos una sesión de l a b o r a t o r i o donde se-
i
. . ..
,
1/'
s u t u r a s completamente durante 3
o
mas h o r a s , en e s t a s s o l u c i o n e s L a s s o l u c i o n e s de formaldehido y a l c o h o l l l e g a n a d e s t r u i r virusy b a c t e r i a s (incluyendo l o s t i p o s esporógenos).
Puesto que t a l e s germicidas son t ó x i c o s , debe de s e r enjuagado
en a l c o h o l i s o p r o p i l i c o y agua d e s t i l a d a e s t é r i l a n t e s de u s a r
3 -
las s u t u r a s
I
E l alumno podrá i n t r o d u c i r l a s u t u r a e n un medio de c u l t i v o y
l u e g o i n c u b a r l o a 37oC durante 24 h o r a s , para asegurerse d e l a e s t e r i l i d a d d e l m a t e r i a l , observando s i hubo c r e c m i e n t o de m i - croorgani smo 5b
-
Despues de l a incubación d e l medio con B a c i l l u s S u b t i l i s , e lalumno puede h a c e r f r o t i s para c e r c i o r a r s e de que no hay conta-
/ e minación e n dicho medio. Estz práctica f u e l l e v a d a a cabo en
-
dos s e s i o n e s , con completo é x i t o .
-4ctica 2.-
Obtenci6n de Acido d e s o x i r r i b o n u c l e i c o y á c i d o r i b o n u c l e i c o .
Mbétod0.-
-
--CEPA ( B a c i l l u s S u b t i l i s )
CALDO LURIA (medio r i c o )
I n ubar 18 a 24 h s . ; a T = 37OC con agitrción I
I
CENTRIFUGAR a 5,000 RPM, 20'
4
."
,.
. .
.I t
Rezuspenaer ias celiilas en
una
solucionae I k C 1 0.14 i;. Reper;- ' a operacion aos
veces.
I 1
Resuspender las ceiuias en una solucion
s a l m a - c i m a t o (U.). Fonogeneizar.
1
1
1
Aciicionar 10 45. ae l i s o z m e incubar
a 50 OC durante
IO'.
Adicionar 5 gotas de iauril S u l f a t o de-
l
Sodio
a l
2555.Adicionar I O lez. de solución salina--ci-
trato. Houogene
izar
suavelaent e.
Centri-
a
3 O00 DIU; 30'; y decantara 3 O00
&
Sob e-p.p.
rpm; 30'
Adicionar I O
iril.
de solución de NaCl 2 IC.nadante 11
'
1
A g i t a r ugn6ticsrnente; 30';
T:4
OC.1
1
r
\ " r p m ; 30'.
I
1
~S e l e somete a f i l t r a c i ó n .
Sobrenadante 11'
y
I11 se juntan.i
obre nadant e IT.1
I
i
"I
Adicionar 2 VolGenes de Etanol as-
1
!
,"
I I
P?P.
SobreddanteVI
I
J.
Adicionar I O u i i c r o g r u s de desoxirribo- __
m c
easa.I
I
IIncubar a 37 OC ;
I
ñr.Desproteinizar
1
una vez con solución de-
Cloroforiiio-IEopropanol 5; I. Adicionarun
Agitar suavemente durante 20'.
I
A
l a
Fase Acuosa adicionar 2 VolLenes-
tanoifrío.
6~ a 3 O00 rpu; 301.
1
Disolverlo en
una
solución-
de Nacl 0.14
E,
utilizando paraello
5ul.
/
r'
I
PfP. Fase
-
en goluciónD i s o l v e r l o en 5 d..de
Soiu
ión
de I?aci 2M.
_ _ - - . . . - -
P
Desprote
inizar
con solu-cidn de Ciororormo-isopro
-
pan01 5:I. Adicionar I Vo
-
l h e n . A g i t a r suavemente-
durante 20'.I
CeCntrimsa
3 000 rpm;SO'
.
PfP
.
..
~ Fafie Acuosa ÓSobrenadante V
1
1
I
9
Adicionar I
uü..
de Solución deNam 0.5
N.
Incubar a 37 %; I
hr.
Desproteinizar 2 veces con solu-
c i ó n de ClorororEio-lsopropanoi 5:
T.
Adicionar
I
volúuien. A g i t a r sua-v e m t e durente 20'.
Fase Acuosa. Adicionar 2 V o l h e -
nes de Etanol
*io,
estrcltificando.I
I
P!P. soiitción.
/
1
II
I
R e d i s o l v e r l o en una
solución estéril de
-
NaCl 0.14E.
Conservar-Z:~&ER~ACIONES: ~~. .
- E n l o s 3 c u r s o s , tras algunas d i f i c u l t a d e s para conseguir r e a c t i v o s como L a u r i i S u l f a t o de sodio, DNAasa y RNasa, s e obtuvo
-
.DNA como un h i l o v i s c o s o , b l s n c o , enredado en una-varilla de vi-
b r i o .
-
L a t e r r i b l e i m p r e c i s i ó n Oe l a s balanzas analíticas, t r a e comoconsecuencig e r r o r e s n o t a b l e s en l a medición de l i s o z i m a (10 mg) DNAasa y BNAasa
-
Solo a o s equipos de los3'
cur.sos pudieron o b t e n e r RNA.-
. . . . ., ~~ ~ ... . . -__ ~ _ _ -~ _ _ _ .-/-- -~ . . . - _ _ .~_-
.. . : - . . ~ . . ~ .. Consi-- :der0 que a' e s t e n i v e l - e l eiumno no t i e n e aun la e x p e r i e n c i a pa- ..-,-
1
r *
aislar de bacterias l o s á c i d o s n u c l e i c o s , por ejemplo, agitan ligeramente mas f u e r t e rompiendo l a s hebras die
R N A
Q u i z á . s e a m a s fácil. . . ~ aislar ácidos . . . . . n u c l e i c o s . . . . . de c é l u l a s -. . . h e p á t i c a s I
. . - -.
~~. . . .~ -~
~
.de rata y l l e v a menos tiem?o
-
Debido a l a c a r e n c i a de DNA asa y RNAasa, se consiguioun
me-todo-qu%ÜicÓ~ que s u s t i t u y e r a e s t a s -enzimas, a s a b e r , 0.1~ ml.HC1
. .
-
. . .. -. . . . _ . . . - . . .._ _
.. . .-
-
-6N'3'0.2-
ml.NaOH
3N respectivamenteSUGERENCIAS :
.
_ - . Preveer que- secoapren ór coi¡s&pli-las camisas d6i-ios - c a b e z a l e s
fs.ae.
centrifuga: n e c e s a r i 0 . s 3;rrs.qus; :todos30s
:equipas -puedan L t r a -,.. - ~. .. .. - . _
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Cambiarl a
práctica de obtención de DNA y RNA b a c t e r i a n U s por.. - . .
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..-'-'%izado por Sidney A l t m a n , en e l c u a l se observa que se r e a l i z a en menos tiempo l a práctica ( q u i z á en dos ' s e s i o n e s y no
4 ) ,
ya&traccidn del A.D.N.
A continuacidn mencionamos cdmo Sidney Alhan realiza dicho
-4’ trabajo en presencia del autor y le bxplica los pasos que
sigue en el mismo.
Aitman saca una botella grande con lSquido gris que parecía
=- agua de fregadero. “Empezaremos con ésto“, son bacterias en
un
medio de cultivo, necesitaremos agua, carbono y algunos aminoácidos. V a n estado creciendo desde que empecé anoche,por
eso se ve tan turbio, ahora centrifugamos para concentrara l a s bacterias”,Altman vaci6 el contenido en 4 tubos anchos de plástico, se llevaron a una centrífuga, Altman incertd los
tubos en los agujeros, fijando una velocidad de 8 0 0 0 rpm, de- jándola por 30’.
Cuando Altman sac6 los tubos, el líquido se había aclarado y
en
el
fondo de cada tubo habíaun
pequeño residuo amarillo-gris pálido. A las células les agregó EDTA, etilenediaminetetra ace- tato, que recoge el magnesio de las paredes de las células bac- terianas. Su pared es muy duraperoésto las hace débiles. Agre-g6 otro poco de 10% SDS dodecil sulfato de sodio, para solubili-
zar las.paredes celulares, la idea era romperlas para sacar el
DNA.
a t m a n puso un tapón. “Conforme las células se rompen, las bacterias desaparecen y la mezcla se aclara. Al mismo tiem- po este líquido se pondrá viscoso, porque el ADN de cada cé- lula es esencialmente una molécula extremadamente larga y al liberarse se desenrrollan. Altman suspendió el tubo en
un
ba-ño de agua corriente a temperatura de 37OC y lo dej6 por me- dia hora. Al sacar el líquido del baño éste estaba claro nue- vamente. Agregó fenol “el fenol ataca a la proteína dejando
.-
solamente el ADN”; el fenol y
l a
proteína son más pesados y.se
irán
al fondo mientras que el ácido nucléico se mantiene enla
superficie acuosa.Tap6 el tubo y lo movid suavemente, se formó una espuma ligera tomando un color gris pálido y espeso y moviendo con la mano sua- vemente se evita que el AüN se rompa demasiado.
-
La
otra pasta que queda es proteína,.^ se separa por centrifu- gación. Pes6 el tubo, luego elevó otro que equilibraría el apa- rato. Al cerrar la tapa de la centrífuga, se inicia la rotación inclinando los tubos hacia arriba en forma horizontal. Se deja media hora.P
y se pone tan viscoso que nos costard trabajo sacarlo sin c
if
i
contaminarlo con l a proteína que está abajo. colocó e l tubo
en una cubeta con h i e l o raspado. Tom6 una probeta de v i d r i o
y t r a t ó de succionar l a capa superior d e l l í q u i d o pero se ca-
í a de nuevo a i tubo. Con nna pipeta a l a cia1 l e hizo una pe-
que* hendidura consiguió su objetivo. Añadió etanol en dobles
I
/
volíhenes. Lentamente vació e l alcohol por e l lado d e l tubo,
para que e l material viscoso quedara flotando en l a superficie. Mezcló agitando lentamente con un agitador de v i d r i o . E l alco-
/
t
I hol precipita al ADN. se jalaron l a s f i b r a s afuera de l a solu- L
cibn como desenrrollando un espagueti. Al torcer e l agitador,
i
i l a punta se empezó a cubrir como s i tuviera telarañas, mojadastraslúcidas, a l sacarlo l a f i b r a adherida se j a l 6 y form6 un filamento alargado. Este filamento s e podrá analizar su estruc- tura por medio de rayos X.
Actualmente se lucha por analizar e l ADN en procedimiento como l a cromatografía o e l e c t r o f o r e s i s , métodos mediante l o s cuales
una pequeñísima cantidad de sustancias biológicas pueden ser separadas para i d e n t i f i c a r l a s y medirlas mediante l a migración, sea en solución, en un f i l t r o de papel, o a través de una capa
de g e l en algunas v i a j a n más aprisa que otras debido a l a d i f e - rencia en e l peso y solubilidad o carga e l é c t r i c a de l a s molécu- II
2"'
.-.'
8I
1 2 , 3 i 6
--Células encapsuladas cultivadas en caldo.
Se concentran en centiífuga: resuspendidas en una solución de cloruro de sodio; calentadas
a
65'C para inactivar enzimas que destruyen l a actividad transforma-dora
Se lavan las células en solución de
cloruro de sodio; luego se mezclan
con
el solvente para lípidos desoxi- colato sódico, para extraer componen-tes celulares hidrosolubles.
Se separan las células por centrifuga-
ciÓn; al sobrenadante se agregan 3-4
volúmenes de etanol
.
Se separa y escurre el precipitado. E l desoxicolate permanece en sobrenadante. Se disuelve el precipitado en solución de c?oruro de sodio y se agita con clo-
roformo, para extraer proteínas.
Se elimina el cloroformo y l a solución de cloruro de sodio se reprecipita con
etanol. El precipitado se disuelve en una
solución de cloruro de sodio.
Se añaden enzimas para digerir pol isacáridos capsulares; se vuelven a precipitar con eta- nol; se disuelven en solución de cloruro de sodio.
Se agitan con cloroformo para separar las
enzimas añadidas.
fc
.si Se'añade etanol en gotas, agitnado hasta
que las fibras precipiten alrededor de la varilla.
Las fibras removidas de l a varilla y lavadas
en una solución de etanol cloruro de sodio. El producto es DNA químicamente puro.
/
I
1
4
5
/'- ,
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-
,
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I!
8
7
9
I
L a práctica fue r e a l i z a d a en un
60$,
ya que no s e obtuvo siem- preRNA
s i n o solamenteDNA.
Se r L a i i z 6en
4 s e s i o n e s mas tiem-
I PO e x t r a clase
I
Práctica 3.
. Análisis de l a comuosici6n de b a s e s de los á c i d o s n u c i e i c o s .
__
La
metodología l a resumimos a continuacibn:Se tomaron 0-5 m l de l a s&ución de
DNA
y s e c e r r ó en una ampo+l l e t a , antes s e agregó a l
D N A
0.1 mi de €IC1 al6N
Con l a s o l u c i ó n de RNA s e h i z o l o mismo, solamente s e tom6 0.4 m l de RNA con 0.2 m i de
NaüH 3N
Se i n t r o d u j e r o n en e l autoclave durante
3
h o r a s , para h i d r o l i -z a r l o s ácidos.
Se c o r t ó e l papel i'ihatman no. 1 de 23 x 57, dividiéndose e n t r e
7 pzra cada n u c i e 6 t i d o y
DNA, RNA.
Se colocaron 1 5 0 m i c r o l i t r o s de
DNA
y &VA en su l u g a r e n e l-
papel.
E1
cromatogrüma s e c o l o c 6 en l a cámara s a t u r a d a de isopropanolHCl2N
Despues de 3/4 p a r t e s de corrimiento se s a c a r o n l o s cromatogrs
mas a s e c a r 1 2 noras.
Se r e v e l a n l o s cromatogramas con l u z u l t r a v i o l e t a , s e sacan
-
l o s R f y Rv.OBSERVXIONES : /
-
En algunos equinos l o s r e s u l t d o c obtenidos e n e s t e análisisfueron muy buenos, por ejemplo
,,.
Bases Ev R f encontrado R f reportado en b i b l i g r a f .
í’
M e n i n a
97
.39
40
./ Guanina 96 31 . - 2 9
C i t o s i n a 1.01
.54
51Timina 99
84
a85
-
U r a c i l o093
979
.75
,
í
Por l o t a n t o , s e i d e n t i f i c a r o n todas las b a s e s-
Se d e j 6 v e r l a c a r e n c i a de cámaras de cromatogrdfía ( s o l o 2),para
5
g r u ~ o s matutinos y 1 vespertino e-
Debido a l a c a r e n c i a de cubetas, no s e h i z o cromatografia en formadescendente sino ascendente, obteniéndose me j o r e s r e c u l t a - dos que e n o t r o s grupos que l o r e a l i z a r o n en forma descendente. SUGERLNCIAS.-
Que s e hagan cromatogramas en forma ascendente.-
Que s e consigan l a s cámaras n e c e s a r i a s-
Que s e introduzca l a cromatografía en capa f i n a , ya que t i e n e l a s s i g u i e n t e s v e n t a j a s :a) Resolución d e l s o l u t o de buena a e x c e l e n t e
b) La ma;orfa de l a s preparaciones se l o g r a n dentro de
5
a 6h o r a s
c) Se pueden s e p a r a r casi todo t i p o de compuestos
d) No hay l í m i t e e n e l t i 3 0 de método de d e t e c c i ó n que puede
u s a r s e
I
-
Que se p i d a e n e l r e p o r t e Rf obtenido,Rf renortado yRv
( y nosolamente Rf obtenido, como s e hace normalmente), para que e l alumno s e de cuenta d e l
%
de e r r o r obtenido.L a práctica se l l e g 6 a r e a l i z a r en un loo$ en al,@.nos equipos,
un tieinPo de duración de 2 s e s i o n e s m a s tiempo e x t r a ,-.-.ace
\
.
elevada l o s resultados eran a a s i l e t a l e s y no había muchas c o l 2 nias.
-
Es
necesario hacer un cepario de b i o l o g í a molecular, ya que-
t r a s un f r o t i s que hice me d i cuenta de que l a s cepas que se t r a
-
~ - - - .. .
___
b a a b a n e st&iGSYtFZiüZdamente c ontmiXZdXs.
_ -
--
-
Se introdujo e l concepto de que se ha observado que cuando hayun
io$
de supervivencia a una dosis de U.V. se encuentra l a can-
t i d a d óptima de c é l u l a s mutadas a una d i l u c i ó n dada. A conti--
,
nuación presento l o s resultados acompañados de g r á f i c a que se-
encontró en una de e s t a s mutaciones, donde se observa que a un tiempo de r s d i a c i ó n de 90' en una dilucibn se encuentra dl
10% de supervivencia de c é l u l a s expuestas a l a U.V.
Se obtuvieron l o s resultados siguientes:
t = 10 seg.
t o
D i l .
#
de colonias$
D i l .#
de c o l o n i a sP
10-4 57 100 10-4 4 7.01 10-5 20 10-5 1 17.543
10-6 11 10-6 3 52.63
I t= 20seg.
t=
60 seg.10-3
4 50 78.94 incantable10-4
51
89.47 210 36 e84
10-5 no se observó
10-4
34
59.65t = 90 seg. 1
0 '
2 281 4.92
1.0-3 62
io.
a77
?f/$b/%Fwb5w.d
b/é
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.
10-4 18 31-58I
SUGERENCIAS.
I
.
elevada l o s resultados eran e a s i 1 t a l e s y no había muchas c o l o nias.
-
Es
necesario hacer un cepario de b i o l o g i a molecular, ya que-
tras un f r o t i s que h i c e me d i cuenta de que l a s cepas que se t r a bajaban está? extremadamente contaminadas.
-
Se introdujo e l concepto ide que se ha observado que cuando hay un 10% de supervivencia a una d o s i s deU.V.
se encuentra l a can-
t i d a d dptima de c é l u l a s mutadas a una d i l u c i ó n dada. A conti-
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nuación presento l o s resuitzdos acompañados de g r á f i c a que se
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Iencontró en una de e s t a s mutaciones, donde se observa que a un tiempo de rediación de 90’ en una d i l u c i ó n
loL3,
se encuentra d10% de supervivencia de c é i u i a s expuestas a l a
U.V.
Se obtuvieron l o s resultados siguientes:
.
t o
D i l .
#
de colonias 10-4 5710-5 20 10-6 11
t=
20seg.10-3
4 5010-4 51
10-5 no se observó
t = 90 seg.
10-2 281 10-3 62 10-4 18
t = 10 seg.
%
D i l .#
de c o l o n i a s%
100 10-4 4 7.01
10-5, 1 15‘7.543 10-6
3
52-63t= 60 seg.
78.94 incontable
89.47
21036
*84
10-4
34
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,
4.92 10.877
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b/f?
SUGERENCIAS.
. .
.
. ,
organismos, balanzas a n a l l t i c a s , etc.
-
Hacer cepareo para l a s bacterias puras y controlarlas.-
Atender a l a propuesta de elaborar curva de l e t t i l i d a d g r a f i - cando$
de sobrevivencia contra tiemoo de radiación, para-
.
que e l alumno aprecie como v a r i a l a población se&de U.V. y l a dilucibn.
-
/--
L a p r á c t i c a se l l e v ó a cabo en un 80% de l o esperado,
dos sesiones mas tiempo e x t r a clase
durante
I -
He llamado "tiemno extrti clasei* a l a preparaci6n de nedios de c u l t i v o , inoculaciones, conteo de colonias y revelado de croma-
togramas, princinalmente
.
---.-.-Siendo un _ t o t a l de_alumnos.en la. seccion a-mi cargo:
__
3 B 5 1 80 O 20 alumnos BE5181,
I 24 alumnos BB05 81 I 21 alumnos,. " 65 alumnos
Por tanto, se revisaron y c o r r i g i e r o n 325 r e p o r t e s y se c a l i f i - caron 195 examenes, a s i p e s se u t i l i z a r o n 132 hs. de c l a s e ,
33
hs. de preparación de c l z s e s , 66 hs. de preparación de solucio-
nes, r e a c t i v o s y equino den general, 60 hs. de asesoriás y horas e x t r a c l a s e y 32 hs. emclezdas para r e v i s a r y c o r r e g i r e x h e n e s ~
y reportes; todo é s t o hace un t o t a l de 423 hs. dedicEdas a In
-
docencia en 3 cursos de Laboratorio de Biologia Uolecualr; por
bitimo, propongo que en v e z de ser
4
p r á c t i c a s se den 6 prácti-cas, introduciendo dos de adiestramiento d e l zlumno, zcortznao
a s € a dos sesiones ( e n vez de 4) ia p r á c t i c a de obtención de 3:i-i
y RNA siguiendo e l métocio que ya mencioné propuesto por Sidney. Altman
I'