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3
ADVERTENCIA
La Facultad de Ciencias de la Universidad del Tolima, el director del trabajo y el jurado calificador, no son responsables de los conceptos ni de las ideas expuestas por el autor del presente trabajo.
4
5
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Dios por estar conmigo en cada momento, especialmente en los difíciles.
A Diana Marcela Beltrán, directora de este trabajo por haberme brindado todas las facilidades necesarias para realizar este trabajo en el laboratorio de protección de plantas y en especial por su constante impulso y colaboración en el desarrollo del mismo.
Al profesor Neftalí Mesa por su apoyo en el desarrollo y finalización de este trabajo.
6
GLOSARIO
ANTIOXIDANTE: es una molécula capaz de retardar o prevenir la oxidación de otras
moléculas.
ASÉPTICO: libre de patógenos contaminantes.
AUXINAS: grupo de fitohormonas que funcionan como reguladoras del crecimiento
vegetal. Esencialmente provocan la elongación de las células.
CALLOGENESIS: proceso en el que a partir de un explante se genera una masa
amorfa de células llamadas callo.
DESINFECTANTE: sustancia que neutraliza y controla el proceso de contaminación
y actúa sobre esta química o mecánicamente
EXPLANTE: el explanto es un pequeño fragmento de una planta que se escinde y
se prepara de forma aséptica para su cultivo en un medio nutritivo y que, por ende, funciona como generadora de nuevas plantas a través de cultivo de tejidosin vitro.
MEDIO DE CULTIVO: un medio de cultivo puede ser definido como una formulación
de sales inorgánicas y compuestos orgánicos requeridos para la nutrición y manipulación de las plantas a multiplicarse por cultivo in vitro.
ORGANOGENESIS: proceso de diferenciación por el cual órganos de las plantas
son formados de nuevo o desde estructuras preexistentes.
OXIDACIÓN DE EXPLANTES: ennegrecimiento de los explantes debido a la
exudación de productos químicos tales como fenoles y taninos.
PLANTULAS: plantas pequeñas en proceso de desarrollo.
REGULADOR DE CRECIMIENTO: sustancias organicas sintetizadas por la planta
que intervienen en diversos procesos fisiologicos.
TOTIPOTENTE: una característica celular, en la cual se conserva la potencialidad de
7
RESUMEN
Aporocactus flagelliformis L, es un cactus epifítico perteneciente a la familia Cactaceae, proveniente del norte de México. Puede encontrarse tanto en zonas desérticas como semidesérticas, soportando temperaturas extremas, es de uso potencial en la industria medicinal, en el forrajeo, en la industria cosmetológica, entre otras. Dentro del diario oficial de la federación Mexicana está considerada como una especie endémica; es atractiva a nivel ornamental por su forma de crecimiento, consistencia y belleza de sus flores. La dificultad en la adquisición de sus semillas y su alto costo condujo a la implementación de técnicas de cultivo de tejidos in vitro para una propagación más eficiente.
En este proyecto se plantearon protocolos que permitieron el establecimiento del cultivo in vitro de la especie. Se evaluó el tipo de explante, agentes desinfectantes, antioxidantes y reguladores de crecimiento vegetal. Cortes transversales del domo apical central de tallo, con longitud mayor a 1 cm sin espinas, fue seleccionado como el explante óptimo para la propagación; para control de la contaminación se seleccionó una mezcla de yodo + antifúngico (Benomil, 3 gr/500 ml) en la etapa de acondicionamiento de plantas madres y el dicloruro de mercurio (HgCl2) al 0,2 %
por 20 minutos, en la camara de flujo laminar. Como medio de cultivo se recomienda el MS básico, adicionado con 3 gr/L de carbón activado, BAP 3ml/L y ANA 1 ml/L. Con este protocolo se logró el control de la contaminación, la reducción en el porcentaje de oxidación de explantes, el establecimiento y propagación in vitro de A. flagelliformis L mediante organogénesis directa.
Palabras clave: Aporocactus flagelliformis, oxidación, bencilaminopurina, ácido
naftalenacético, organogénesis directa, carbón activado.
8
ABSTRACT
Aporocactus flagelliformis L, is a cactus owned to the family Cactaceae, from northern México. It can be found both desert as semi-desert areas, withstanding extreme temperatures, is of potential use in the medical industry, the foraging, in the cosmetics industry, inter alia. Within the official journal of the Mexican federation is considered as a specie endemic; is attractive at level ornamental by his form of growth, consistency and beauty of its flowers; the difficulty in the acquisition of seeds and its high cost, make necessary the implementation of techniques of cultivation in vitro for a propagation more efficient.
In this project were raised protocols which allowed the establishment of cultivation in vitro of the specie. Was evaluated the kind of explant, disinfectant agents, antioxidants and growth regulators. cross sections of dome central apical of stalk, with length higher of 1 cm boneless, was selected as the explant optimal for the propagation; for the control of the contamination, we selected a mixture of iodine + antifungal (Benomyl, 3 gr/500 ml) in the phase of conditioning of Mother plants and the mercury dichloride (HgCl2) to 0.2% for 20 minutes in the laminar flow chamber. was used as culture medium basic MS, suplemented with 3g/L of activated charcoal, 3 ml/L of benzyl aminopurine (BAP) and naphthaleneacetic acid 1ml/L. With this protocol was achieved the control of the contamination, the reduction in the percent of oxidation of explants, the establishment and propagation in vitro of A. flagelliformis L by direct organogenesis.
Keywords: Aporocactus flagelliformis, oxidation, benzyl Aminopurine,
9
CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN ... 14
1.OBJETIVOS ... 16
1.1 GENERAL ... 16
1.2 ESPECIFICOS ... 16
2. MARCO REFERENCIAL ... 17
2.1 ANTECEDENTES ... 17
2.1.1 Familia Cactaceae ... 17
2.2 MARCO TEORICO ... 18
2.2.1 Características de familia Cactaceae ... 18
2.2.1.1 Origen y evolución ... 18
2.2.1.2 Distribución de las Cactáceas ... 18
2.2.1.3 Clasificación Botánica ... 18
2.2.1.4 Morfología de las Cactáceas ... 19
2.2.1.5 Fisiología de las Cactáceas ... 22
2.2.1.6 Métodos de propagación... 23
10
2.3 DESCRIPCIÓN DE LA ESPECIE EN ESTUDIO ... 24
2.3.1 Aporocactus flagelliformis L ... 24
2.3.1.1 Clasificación ... 24
2.3.1.2 Descripción morfológica ... 25
2.3.1.3 Distribución en México ... 26
2.3.1.4 propagación de A. flagelliformis L ... 26
2.3.1.5 Conservación y factores de riesgo ... 26
2.4 CULTIVO in vitro DE TEJIDOS VEGETALES ... 27
2.4.1 etapas del cultivo in vitro ... 27
2.4.2 Medios de cultivo ... 28
2.5 CULTIVO in vitro DE CACTACEAS ... 28
2.5.1 Medios de cultivo y fitohormonas en Cactáceas ... 28
2.5.2 Origen y tipos de explantes de la familia Cactaceae ... 29
2.5.3 Inducción de callo en la familia Cactaceae ... 29
2.5.4 Ventajas del cultivo in vitro en Cactáceas ... 30
2.5.5 Factores que afectan el cultivo in vitro de Cactáceas ... 30
3. METODOLOGIA ... 32
3.1 AREA DE ESTUDIO ... 32
11
3.2.1 Etapa 0 ... 32
3.2.2 Etapa I ... 32
3.2.3 Obtención de explantes ... 32
3.2.3.1 Monitoreo de desinfección ... 33
3.2.3.2 Control de la oxidación ... 33
3.2.3 Etapa II... 35
3.2.3.1 Evaluación de reguladores de crecimiento ... 35
3.3 ANALISIS ESTADÍSTICO ... 36
4. RESULTDOS Y DISCUSIÓN ... 37
4.1 ETAPAI ... 37
4.1.1 Obtención de explantes de A. flagelliformis ... 37
4.1.2 Monitoreo de la desinfección ... 38
4.1.3 Control de la oxidación ... 39
4.2 ETAPA II ... 41
5. CONCLUSIONES ... 45
6. RECOMENDACIONES ... 46
REFERENCIAS ... 47
12
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Hábitos de crecimiento de la familia Cactaceae. 19
Figura 2. Tipos de raíces presentes en la familia Cactaceae. 20
Figura 3. Tipos de tallos de la familia Cactaceae. 21
Figura 4. Areolas presentes en la familia Cactaceae. 21
Figura 5. Tipos de flores presentes en la familia Cactaceae. 22
Figura 6. Aporocactusflagelliformis(L) 25
Figura 7. Distribución en México de A. flagelliformis(L) 26
Figura 8. Agentes antioxidantes empleados para evaluación de la 33
oxidación de los explantes de cactus cola de rata (A. Flagelliformis). Figura 9. Evaluación de reguladores de crecimiento en la 35
micropropagación de cactus cola de rata (A. flagelliformisL.) Figura 10. Plantas madre (A) y Explantes (B)de A. flagelliformis. 38
Figura 11porcentaje de contaminación en los tratamientos 39
de desinfección evaluados para el cultivo in vitro de A. flagelliformis (L) FIGURA 12. Explantes de A. flagelliformis (L). A. sano B. oxidado. 40
Figura13. Porcentaje de oxidación en explantes de A. flagelliformis(L). 41
Figura 14.Porcentaje de brotación en explantes de A. flagelliformis(L). 42
13
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo A. Prueba de regresión logística binaria para la evaluación 55
de los tratamientos de desinfección.
Anexo B. Prueba de regresión logística binaria para tratamientos 57
con antioxidantes.
Anexo C. Prueba de regresión logística binaria para la evaluación 59
14
INTRODUCCIÓN
La familia Cactaceae es endémica del continente americano (Peña, 1942), con una distribución que va desde el norte de Canadá hasta la Patagonia Argentina, encontrándose inclusive en las islas Galápagos y las Antillas (Hoffmann,1989). México tiene dentro de su territorio a un gran número de especies de cactáceas. No sólo es de llamar la atención la gran biodiversidad presente, sino también el alto índice de endemismos (Strasburger, 1994).
Aporocactus flagelliformis es una planta epifita que pertenece a la familia de las cactáceas, pueden encontrarse tanto en zonas desérticas como semidesérticas, soportando temperaturas extremas, son usadas en la industria medicinal, en el forrajeo, en la industria cosmetológica, entre otras. Es una especie que dentro del Diario oficial de la Federación está considerada como una especie rara y endémica, posee además importancia médica ya que sus flores en infusión sirven para tratar padecimientos cardíacos. (Bravo, 1978). Es atractiva a nivel ornamental por su forma de crecimiento, consistencia y belleza de sus flores; pero la dificultad en la adquisición de sus semillas y su alto costo hace necesario la implementación de técnicas de cultivo de tejidos in vitro para una propagación más eficiente. Durante el siglo XX, la aplicación de biotecnología en la floricultura ha permitido el uso de herramientas como la técnica de propagación in vitro, con la cual se ha multiplicado muchas especies, con el fin de conservar estos recursos genéticos, diversificar el inventario de plantas ornamentales y así abrir nuevas alternativas de comercialización. La versatilidad de las técnicas de propagación in vitro ha favorecido la micropropagación de especies de zonas áridas y semiáridas. En la actualidad las poblaciones de cactus han mermado considerablemente en su hábitat natural, debido fundamentalmente a la colecta excesiva y a las dificultades que presentan algunas de ellas en su propagación, haciéndose necesario implementar técnicas, como lo es la técnica del cultivo in vitro de tejidos vegetales, para su rescate y conservación.
La propagación de cactáceas por semilla o por propagación vegetativaconvencional es insuficiente para cubrir la demanda debido a su limitada producción, disponibilidad y viabilidad (Soltero-Quintana 1996), por ello es necesario establecer métodos más eficientes como lo es el proceso de micropropagación in vitroque ofrece una mejor alternativa para la multiplicación debido a su capacidad de producir más plantas en un corto tiempo comparado con el cultivo ex vitro.
15
16
1. OBJETIVOS
1.1 GENERAL
Evaluar la respuesta organogénica en el cultivo in vitrode Aporocactus flagelliformis L. en la etapa de inducción.
1.2 ESPECIFICOS
Establecer el protocolo de desinfección para el establecimiento in vitro deA. flagelliformis.
Evaluar el efecto de antioxidantes en el logro del establecimiento in vitro de los explantes de A. flagelliformis
17
2. MARCO REFERENCIAL
2.1 ANTECEDENTES
2.1.1 Familia Cactaceae: La familia Cactaceae es un importante elemento
fitogeográfico de los desiertos de América y representa la segunda familia más numerosa en término de especies (ca. 1500) restringida al Nuevo Mundo, detrás de la familia Bromeliaceae. Las cactáceas exhiben una amplia distribución geográfica desde el sur de Canadá en la región de BeatonRiver, al suroeste del Lago Cecile, Alberta, hasta el sur de la región de la Patagonia, Argentina (Cota-Sánchez, 2002).
Las cactáceas se adaptan muy bien a un clima de tipo mediterráneo. Las temperaturas ideales para su desarrollo oscilan entre 10ºC y 25ºC; sin
embargo,existen especies, como por ejemplo
Tephrocactuslagopus(Schumann)Backeberg., que vive a 4.000 m.s.n.m en la Cordillera de los Andes, tolerandotemperaturas de 20ºC bajo cero. Otra excepción, son los cactus tropicales queno toleran temperaturas inferiores a 10ºC, por ejemplo RhipsalishoulletianaLem. (Cullmann, 1976).
La humedad del aire y del suelo son factores climáticos importantes parasu desarrollo. Por ello, presentan diversas adaptaciones morfológicas yfisiológicas para aprovechar con mayor eficiencia el recurso hídrico. En cuantoa los requerimientos edáficos, las cactáceas son más bien rústicas, solonecesitan un sustrato o suelo libre de acidez y humedad excesiva. (Cullmann, 1976).
En la actualidad las poblaciones de cactus han mermado considerablemente en su hábitat natural, debido fundamentalmente a la colecta excesiva y a las dificultades en su propagación.
Según Narayanaswamy (1977) citado por Martínez – Vázquez Y Rubluo (1989), durante la primera mitad del siglo XX, la familia Cactaceae,en comparación con otros grupos taxonómicos, no captó la atención de las entidades involucradas con el cultivo in vitrode tejidos vegetales. Sin embargo, a partir de 1962 se han realizado muchas investigaciones con distintos grados de éxito (Johnson &Emino, 1979), registrándose resultados muy satisfactorios (Starling, 1985).
18
No obstante, el objetivo principal de muchos de estos estudios iniciales, fue la propagación in vitroa través de la inducción de callo (Johnson &Emino, 1979). Sin embargo, en investigaciones más recientes, se ha logrado la formación de brotes, a través de la activación hormonal de yemas axilares o areolas (Pérez et al., 2002). De esta manera se evita la variación somaclonal, asociada a la formación de callo (Maldaet al., 1999 a).
2.2 MARCO TEORICO
2.2.1 Características generales de la familia Cactaceae: Los miembros de la
Familia Cactaceae, comúnmente se conocen como cactus; son nativos del continente Americano y se encuentran desde Canadá hasta el sur de Argentina., desde el litoral hasta los 4000 metros de altura (Ríha, 1991).
2.2.1.1 Origen y Evolución: Los cactus evolucionaron en los últimos 80 millones de
años, a partir de plantas no suculentas con hojas desarrolladas, con fotosíntesis C3 que vivieron en territorios emergidos del Caribe. El origen filogenético de estas formas ancestrales se encuentra entre las antiguas dicotiledóneas del orden Caryophyllales. De dichos ancestros se originaron las primeras Pereskioideas, Opuntioideas y Cactoideas, que constituyen, en orden evolutivo, las subfamilias de las cactáceas, que migraron hacia el sur y hacia el norte a lo largo del continente; alcanzando regiones donde la mayoría se diferenció en géneros que alcanzaron un endemismo muy notable (Bravo,1978).
2.2.1.2 Distribución de las cactáceas: Peña (1942), señala que las cactáceas son
de origen americano. Según Strasburger (1994), se ubican principalmente en México y el suroeste de los Estados Unidos. Por su parte, Hoffmann (1989) afirma que el centro de origen es México, ya que es la zona con mayor densidad y diversidad de cactus.
De acuerdo con Hoffmann (1989), la distribución se extiende desde Canadá hasta la Patagonia, desde las costas del océano Pacífico hasta las costas del océano Atlántico, abarcando gran parte del continente americano. Además, se pueden encontrar ejemplares de cactáceas hasta los 4.500 m.s.n.m, en la cordillera de los Andes o en otros cordones montañosos continentales.
2.2.1.3Clasificación botánica de las cactáceas: Según Marsden (1960) y Hoffmann
19
La familia botánica Cactaceae pertenece a la división Spermatophyta, subdivisión Angiospermae, clase Dicotiledonea, subclase Caryophyllidae y orden Caryophyllales(Strasburger, 1994). Está compuesta por alrededor de 86 géneros y más de 2.000 especies conocidas (Hoffmann, 1989).
2.2.1.4 Morfología de las cactáceas: los cactus se describen como plantas
simples, arborescentes, de crecimiento alargado que a veces alcanzan unos metros de altura, arbustivas, esféricas o cilíndricas, siendo esta última la más difundida (Hoffmann, 1989).Figura 1.
Estas plantas tienen una amplia ramificación ya sea a nivel del suelo como bajo él, existen además formaciones en cojinetes con ramificaciones abundantes, enredaderas y formas epífitas representadas por los géneros Ephiphyllumy Rhysalis. Esta última forma de vida no la presentan especies autóctonas chilenas, siendo característica de la flora tropical, todas ellas con hábito xerófito en su gran mayoría (Strasburger, 1994).
Los cactus presentan cuerpos suculentos, los cuales pueden estar segmentado constituyendo cada segmento un cladodio, el cual, al igual que el cuerpo de la planta, puede ser plano, como en la tuna (Opuntia ficus – indica Mill.), cilíndricas, como los quiscos (Neoporteriaspp) o globosos, como la mayoría de cactus. Además presentan costillas longitudinales o esféricas con protuberancias, poseen casi siempre espinas foliares y a menudo fascículos de las mismas, denominadas areolas que presentan vástagos axilares y primordios foliares transformados (Hoffmann, 1989 &Strasburger, 1994).
Según Hoffmann (1989), el sistema radical en general es superficial y ramificado. Sin embargo, algunas especies desarrollan una raíz principal napiforme o tuberosa y muy engrosada con algo de ramificación y a menudo estas son de mayor tamaño que el tallo principal y visible de los cactus, como se muestra en la Figura 2 (Marsden, 1960).
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24
La selección de la vía metabólica a seguir se realiza según lascondiciones ambientales imperantes, como escasez de agua, alta temperaturao elevada salinidad, siendo más eficientes en el uso de la humedad disponible(Sivori, 1980). Durante el metabolismo CAM el CO2 captado durante la noche activa la carboxilasa en los tejidos vegetales, la cual es transformada en ácidos orgánicos, durante el día y cuando los estomas aún se encuentran cerrados,finalmente el CO2 es trasferido a la ruta normal C3 para ser utilizado en el restode la planta (Kimbal, 1986; Villalobos, 1999 &Garcés, 2003).
En la práctica, la vía metabólica tiene relación con la competencia vegetal, ya que indica la jerarquía de las plantas en el ambiente árido (Kimball, 1986). Por ello, donde las condiciones son normales y en particular con un nivel regular de precipitaciones, las plantas C3 son las más abundantes, a medida que las precipitaciones se hacen más irregulares, las plantas C4 se asientan en los espacios abiertos (Villalobos, 1999 ; Garcés, 2003). Es así como, las plantas CAM aparecen cuándo las condiciones de aridez aumentan (Kimball, 1986). Sin embargo, aunque las plantas C4 y CAM son más evolucionadas, tradicionalmente sólo han tenido un valor especial y limitado en tierras áridas (Villalobos, 1999 ; Garcés, 2003).El metabolismo ácido crasuláceo de las cactáceas puede ser alterado en condiciones de cultivo artificiales, especialmente en el cultivo in vitro. Se modifica el patrón de absorción de carbono, afectando el crecimiento de las plantas. La alta humedad en los frascos de cultivo, permite que los estomas permanezcan abiertos durante el período de luz, realizándose una continua fijación de CO2 durante ambos períodos, de luz y oscuridad. Finalmente las plantas presentan un crecimiento continuo y rápido (Maldaet al., 1999b), por ello Claytonet al. (1990), señalan que las cactáceas micropropagadas son comparables en tamaño y madurez con cactus producidos desde semillas de varios años de edad.
2.2.1.6 Métodos de propagación de la familia Cactaceae: Los cactus se propagan
mediante la reproducción sexual a través de semillas o en forma asexual a partir de esquejes, cladodios individuales o brazos, trozos de tallos, etc. (Hoffmann 1989). Por otra parte es importante considerar que la mayoría de las especies de cactus son alógamas o autoestériles, debiendo contar con dos plantas que florezcan al mismo tiempo, por lo que se hace difícil su reproducción por semillas (Marsden, 1960).
Las semillas no presentan latencia, es decir tienen plena capacidad germinativa después de la cosecha, aunque se prefiere guardarlas hasta primavera para que en los invernaderos alcancen temperaturas de 20ºC a 27°C óptimas para la germinación (Marsden, 1960 ;Hoffmann, 1989).
25
La propagación por medio de esquejes y rebrotes, es muy sencillo, hay que obtener los esquejes en primavera – verano, ya que el crecimiento es más vigoroso, la localización del corte va a depender de la especie. Las precauciones que se deben tomar con esta práctica cultural son las mismas que para cualquier método de propagación vegetativa; se deben desinfectar los implementos de trabajo y aplicar desinfectantes en las heridas, luego se procede a enraizar el material en un sustrato con buen drenaje, entre los que se nombran a la vermiculita y la arena gruesa (Marsden, 1960).
2.2.1.7 Amenaza y conservación: El área donde se encuentran los cactussufre de
varias amenazas, entre las cuales está la agricultura y el pastoreo. El ecosistema es destruido por la necesidad de tierras que forza a los campesinos a deforestar para establecer monocultivos estacionales de autoconsumo, la construcción de carreteras y el avance urbano. De esta manera desaparece la diversidad biológica, perdiéndose flora y fauna probablemente no descrita o endémicas del lugar (Bravo, 1991; Castañeda, 1996).
La deforestación y la sobrecolecta de especies de cactus para su uso comercial, más que todo como ornamentales, contribuye no sólo a la pérdida de este recurso natural, sino también a la desertificación del suelo alterando las comunidades y su regeneración (Castañeda, 1996).
2.2 DESCRIPCIÓN DE LA ESPECIE EN ESTUDIO
2.3.1 Aporocactus flagelliformis L
2.3.1.1 Clasificación.
Cuadro1. Clasificación taxonómica de A. flagelliformis L
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Caryophyllales
Familia Cactaceae
Especie Aporocactus flagelliformis (L.) Lem.,
1860
Fuente: Luna Vega, M. I. 2003.
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27 Fuente: Luna Vega, M. I. 2003.
2.3.1.4 Propagación de A. flagelliformis L: Su propagación se hace por la
multiplicación de esqueje de extremos de tallos en verano o mediante semilla, en primavera, a 20ºC, de los pequeños frutos formados tras lo floración. También se puede injertar utilizando como porta injertos plantas de cierta altura. Aunque estos métodos de propagación no son eficientes debido a su limitada producción, disponibilidad y viabilidad.
2.3.1.5 Conservación y factores de riesgo: En cuanto a su conservación no se
conoce ningún plan de manejo para la especie, sin embargo se sabe que es una planta muy cultivada desde los tiempos precolombinos y actualmente extensamente cultivada en las regiones tropicales de América (Bravo, 1978). Entre sus factores de riesgo el mas reelevante es la presión del desarrollo humano, principalmente debido a la conversión de terrenos para la agricultura y/o actividades pecuarias y a las actividades de extracción de plantas de su hábitat, para su venta con fines ornamentales (Jarvis, 1979).
2.4 CULTIVO in vitro DE TEJIDOS VEGÉTALES: El cultivo de tejidos vegetales in
28
Hoy en día, se reconoce una amplia gama de usos en relación a la aplicación de las técnicas de cultivo in vitrode tejidos vegetales, que incluye desde el mejoramiento genético y manipulación de células, obtención de material vegetal libre de virus y patógenos, preservar material genético deseable (germoplasma) y micropropagación de una especie (Botti, 1987)
En la actualidad la micropropagación está siendo aplicada con fines comerciales, con gran éxito en muchas especies vegetales, algunas de las cuales juegan un rol importante en la economía de países en desarrollo, abarcando cultivos hortícolas, ornamentales, frutales y forestales. Además, es una técnica que ha cobrado importancia en la conservación de la flora en peligro de extinción (Muñoz, 1989). Este sistema presenta numerosas ventajas frente a un proceso de propagación tradicional, como por ejemplo: rapidez en la multiplicación, obtención de gran número de plantas a partir de un genotipo específico, control fitosanitario, reducción del espacio de almacenamiento, definición de programas de producción durante todo el año sin problemas estacionales, entre otras (Botti, 1989).
2.4.1 Etapas del cultivo in vitro. Murashige (1962) y otros encontraron que era útil
destacarla secuencia de eventos asociados con la multiplicación de plantas madre mediante las técnicas de cultivo aséptico, de la siguiente manera:
Etapa 0: mantenimiento y preparación de las planta madres.Esta etapa inicial comprende la selección de la planta madre y la selección de una modalidad de pretratamiento para volver funcional la estrategia que se adopte.
EtapaI:es la etapa de iniciación o de establecimiento, en el cual se establece el cultivo inicial o primario.
Etapa II: es la fase de multiplicación de brotes, es decir tiene como objetivo la producción del mayor número de plantas, a partir de explantes ya establecidos en la fase anterior. Esta es la fase más importante de la micropropagación ya que en ella se realiza la verdadera multiplicación o micropropagación de una especie o variedad definiéndose tanto el número de plantas a obtener por su calidad genética.
Etapa III: Esta etapa corresponde al enraizamiento o etapa de pretransplante; tiene como objetivo producir una planta autótrofa que pueda sobrevivir en las condiciones del trasplante al suelo.
Etapa IV: esta etapa tiene como objetivo el adaptar las plántulas de las condiciones in vitro a condiciones de campo.
2.4.2 Medios de Cultivo: El éxito del cultivo de tejidos de plantas está muy
29
absorber del suelo cantidades importantes de macronutrientes como las sales de nitrógeno, potasio, calcio, fósforo, magnesio y azufre y micronutrientes como sales de hierro, manganeso, zinc, boro, cobre, molibdeno y cobalto. El medio de cultivo contiene estos elementos además de carbohidratos, usualmente la sacarosa, para reemplazar el carbono que la planta fija normalmente de la atmósfera por medio de la fotosíntesis. También contiene compuestos orgánicos en pequeñas cantidades como vitaminas, aminoácidos y reguladores del crecimiento (Rosell, 1990).
Existen diversos medios que se emplean en el cultivo de tejidos vegetales. Un medio básico es generalmente referido como aquel que no contiene reguladores de crecimiento y se le denomina con frecuencia con el apellido de la persona o personas que lo elaboraron por primera vez; uno de los medio más utilizados en la actualidad es el de Murashige y Skoog (1962) (MS).
Los medios son modificados cuando se les agrega reguladores de crecimiento en diferentes concentraciones, determinadas principalmente por los requerimientos de los explantes en forma específica (Amador, 1999).
2.5 CULTIVO IN VITRO DE CACTÁCEAS
2.5.1 Medios de cultivo y concentración de fitohormonas en cactáceas: El medio MS
ha sido utilizado ampliamente en el cultivo in vitrode cactus con excelentes resultados (Lazarteet al., 1982; Starling, 1985; Claytonet al. 1990). Por otro lado, se ha probado un amplio rango de concentraciones y tipos de fitohormonas; entre lasauxinas se pueden mencionar ácido indolacético (AIA), ácido naftalenacético(ANA), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y ácido indolbutírico (AIB) y entrelas citoquininas se tiene la benzilaminopurina (BAP) y 6-furfurilaminopurina okinetina (KIN).
Sin embargo, se han documentado resultados muy exitosos con la acción combinada de las fitohormonas BAP y ANA, sobre la formación de nuevas plantas en miembros de la familia Cactaceae (Lazarteet al, 1982; Starling y Dodds, 1983; Vyskot y Jára, 1984; Starling, 1985;Martínez – Vázquez y Rubluo, 1989). No obstante, sólo en pocas ocasiones una misma concentración y combinación de fitohormonas han demostrado ser exitosa para más de una especie (Claytonet al., 1990;Giustiet al., 2002). Al respecto Johnson y Emino (1979) señala que cada especie de cactus podría requerir una combinación única de reguladores de crecimiento vegetal.
2.5.2 Origen y tipo de explantes en la familia Cactaceae: Los explantes utilizados en
30
Cactaceae, mediante la formación de brotes axilares y adventicios (Maldaet al., 1999), utilizando diferentes tipos de explantes (Clayton et al., 1990), entre los cuales se mencionan: ápices de brotes (Maldaet al., 1999), segmentos de cotiledones (Llamocaet al., 1999), o de epicotilos (Giustiet al., 2002), segmentos de tallos o cladodios (Pérez & Dávila, 2002), microexplantes de plantas silvestres (Havel &Kolar, 1983), órganos florales (Minocha&Mehra, 1974) y segmentos radicales de plantas cultivadas in vitro(Bhau, 1999), entre otros.
2.5.3 Inducción de callo en la familia Cactaceae: Según Maldaet al. (1999a), el
cultivo de tejido mediante la inducción de callo se ha desarrollado con gran éxito en muchas especies de cactus. Entre las que se incluyen Neomammillaria prolifera (Minocha&Mehra, 1974), Opuntia polycanthaHaw. P. e Hylocereuscalcaratus(A. Berger) Brito & Ros. (Johnson&Emino, 1979) y Mammillariaelongata(Johnson &Emino, 1979), entre otras.Sin embargo, la formación de brotes a partir de tejido calloso es considerado genéticamente inestable (Maldaet al., 1999a), ya que en este tipo de tejido genera algún grado de variación somaclonal, la cual origina anormalidades morfológicas (Claytonet al., 1990; Machado &Prioli, 1996).Al respecto, algunos autores señalan que la formación de brotes a partir de callo permite rangos de proliferación más rápidos y la variabilidad genética es beneficiosa para especies en peligro, ya que favorece su sobrevivencia y restauración en el medio ambiente natural (Starling, 1985;Rubluoet al., 1993).
2.5.4. Ventajas del cultivo in vitro en cactáceas: Los métodos de propagación
convencionales son inadecuados para la mayoría de las cactáceas, debido a que presentan baja geminación en sus semillas, lento crecimiento y escasa producción de ramificaciones (Claytonet al. 1990). No obstante, el cultivo in vitroofrece alternativas útiles para su multiplicación y conservación, debido a su capacidad para producir muchas plantas a corto plazo y en un espacio mínimo.
Una ventaja adicional es que el desarrollo in vitro de cactus puede ser extremadamente rápido en comparación con el cultivo ex vitro de estos(Minocha y Mehra, 1974; Maldaet al., 1999a; Perezet al., 2002; Perez& Dávila, 2002).Estemayor crecimiento se debe a la alta humedad, la presencia de reguladores decrecimientos vegetales, y la alta concentración de azúcar en el medio de cultivo (Maldaet al. 1999a; Perezet al. 2002).Estas características, pondrían provocarun incremento de la absorción neta de dióxido de carbono (CO2), la cual está asociada con la actividad de crecimiento de las plantas desarrolladas in vitro (Maldaet al. 1999a).
31
especies en peligro, ya que las investigaciones sobre polinización cruzada in vitrose podrían considerar un avance de gran relevancia. En la especie Coryphanthaminimase logró floración en plantas menores de un año bajo condiciones in vitro, en presencia de BAP. Normalmente la floración ocurre en plantas de tres a cuatro años de edad. Mediante este método se puede llegar a obtener un pool de genes silvestres sin la destrucción de poblaciones naturales, lo que permitiría recuperar especies amenazadas o en peligro de extinción, con una diversidad genética adecuada para su restablecimiento en el medio ambiente natural (Maldaet al., 1999a).
2.5.5. Factores que afectan del cultivo in vitro de cactáceas: La micropropagación
presenta en general problemas durante el establecimiento in vitro de los cultivos y en su posterior propagación clonal, disminuyendo considerablemente en algunos casos las posibilidades de éxito de los ensayos. Entre estos problemas se mencionan: la contaminación, la oxidación y la hiperhidricidad de explantes, entre otros.
En la propagación in vitrode cactus los explantes provenientes de plantas silvestres o desarrolladas en invernaderos, presentan serios problemas de contaminación debido a la presencia de patógenos que no pueden ser controlados fácilmente con una desinfección superficial. Además la estructura morfológica de muchas de estas plantas dificulta aún más su desinfección superficial y de esta manera el control de los patógenos exógenos que puedan estar presentes (Havel&Kolar, 1983; Johnson &Emino, 1979).
La oxidación del cultivo in vitro de cactus no es un problema frecuente; Este puede ser controlado adicionando algunos compuestos como carbón activado, polivinilpirrolidona (PVP), agua o leche de coco, etc. (Minocha&Mehra, 1974; Oliveiraet al., 1995; Perezet al., 2002).
La hiperhidricidad es un desorden fisiológico, queproduce tejidos translúcidos, hiperhidratados y suculentos en algunas especiespropagadas in vitro(Ziv, 1991).Este fenómeno es un serio problema para el cultivo in vitrode cactus(GIUSTI et al. 2002). Aunque la hiperhidricidad no reduce el número de brotesproducidos, puede impedir su enraizamiento y sobrevivencia ex vitro (Perezetal., 2002). Este desorden fisiológico se debe a condiciones propias del cultivo in vitro, por ejemplo; alta humedad, exceso de carbohidratos y minerales, altosniveles de reguladores de crecimiento vegetales, y baja intensidad luminosa(Ziv, 1991).
32
33
3. METODOLOGÍA 3.1 AREA DE ESTUDIO
Este proyecto se desarrolló durante el semestre B-2010 y A-2012, en el Laboratorio de protección de plantas y cultivo de tejidos vegetales de la Universidad del Tolima, situado a 1150 m.s.n.m., con una temperatura promedio de 20-23°C.
El material biológico inicial estuvo constituido por 6 ejemplares de la especie Aporocactus flagelliformis L,los cuales fueron comprados en el vivero Miraflores ubicado en el sur de la ciudad de Ibagué.
3.2 DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO.
Esta investigación se dividió en tres etapas, en donde se evaluaron distintos parámetros tales como, control de la desinfección, control de oxidación, tipo de explantes, medio de cultivo y reguladores de crecimiento.
3.2.1 Etapa cero : En esta etapa las plantas que se obtuvieron del vivero Miraflores,
se llevaron al invernadero (casa de cristal) del laboratorio de Protección de plantas de la Universidad del Tolima, a las cuales se les aplico un pretratamiento el cual consta de una mezcla de yodo + antifúngico (Benomil, 3grs/500 ml), para el control de contaminaciónasegurando asíun buen vigor y estado fitosanitario de las mismas.
3.2.2 Etapa I : Esta etapa comprende la inducción y desinfección del explante en el
cultivo in vitro; En esta etapa se eligió el mejor explante y el mejor protocolo de desinfección para poder establecer el cultivo.
3.2.2.1 Obtención de explantes: El material biológico inicial correspondió a explantes
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1 mg/L
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ácido 2,4-diclorofenoxiacético
1 mg/L
36
3.3 ANALISIS ESTADISTICO
La validez estadística de los resultados se comprobó realizando una regresión logística binaria por medio del programa estadístico IBM SPSS Statistics. Para el análisis de los resultados estadísticos por regresión logística binaria se tienen en cuenta los siguientes parámetros:
a. Las variables que no se encuentran en la ecuación : Nivel de significancia (Sig) ≤ 0,05 significativo.
b. Prueba ómnibus sobre el coeficiente del modelo (chicuadrado): Nivel de significancia del modelo (Sig) ≤ 0,05 significativo. c. Variables en la ecuación :
Medidas de riesgo:
sig ≤ 0,05 mayor medida de riesgo es decir, aporta significativamente al modelo.
37
4 RESULTADOS Y DISCUSION 4.1 ETAPA I
Esta etapa comprendió la desinfección e inducción de los explantes de cactus cola de rata, permitiendo seleccionar el tipo de explante, el antioxidante y tratamiento de desinfección óptimo para la micropropagación del mismo y el paso a la siguiente etapa del cultivo in vitro.
4.1.1 Obtención de los explantes de A. flagelliformis L: Los explantes se obtuvieron
de material biológico sano, preparado previamente en la casa de cristal (invernadero) del laboratorio del grupo GEBIUT de la universidad del Tolima (figura 10); inicialmente se utilizaron como explantes, discos en cortes transversales del domo apical central,de 0.5 cm de longitud con espinas, mostrando resultados negativos al presentarse una clorosis de los explantes; esto, puede adjudicarse a los procesos de desinfección en los cuales los porcentajes de los agentes desinfectantes aplicados tienen un efecto corrosivo frente a este tipo de explante, ocasionando por ende un daño en el tejido.Posteriormente se utilizócomo explantes discos de 0.5 cm de longitud sin espinas, los cuales no sobrevivieron al tratamiento, debido, probablemente, a que la longitud del explante no era el adecuado y los agentes desinfectantes y antioxidantes alcanzaban a lesionar el tejido, produciéndose una necrosis en todo el explante.
38
Figura 10.Plantas madre (A) y Explantes (B)de A. flagelliformis.
Fuente: autor
4.1.2 Monitoreo de desinfección : Para el control de la contaminaciónse utilizaron domos apicales de 7 a 10 cm de longitud a los cuales se les aplicó cuatro tratamientos, dos de ellos (T1y T2) con hipoclorito de sodio (NaClO)al 1%,diferenciándose uno del otro por una segunda inmersión en una solución de Dithane 0.6 g + gentamicina 160 mg/ 2 ml, en 500 ml de agua destilada por 10 minutos. Para los otros dos tratamientos (T3 y T4) se utilizó dicloruro de mercurio (HgCl2) al 0.15 Y 0.20 % respectivamente; obteniendo más del 60% de
contaminación, cuando el agente desinfectante fué el Hipoclorito de Sodio (Figura 11); Esto,debido a que el agente desinfectante a concentraciones bajas (1%), no es efectivo para contrarrestar la contaminación ocasionada por hongos y bacterias, en este tipo de plantas con estructura suculenta; ratificando así, lo descrito por Havel y Kolar, (1983) quienes mencionan que “en la propagación in vitro de cactus los explantes provenientes de plantas silvestres o desarrolladas en invernaderos, presentan serios problemas de contaminación debido a la presencia de patógenos que no pueden ser controlados fácilmente con una desinfección superficial, gracias a la estructura morfológica de muchas de estas plantas, lo que dificulta aun mas dicho proceso”.
Como se evidencia en la figura 11, el tratamiento con un menor porcentaje de contaminación, es decir que presentó mayor éxito en el proceso de desinfección, fue el tratamiento número 4 (HgCl2 al 0.2% por 20´), influenciado posiblemente al cambio
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M1 M2 M3
43
inducción en la micropropagación de dicha especie; se obtienen brotes sanos y vigoroso(figura15); además, es importante resaltar que los explantes que tuvieron un mayor éxito en el proceso de brotación fueron aquellos obtenidos de plántulas madre jóvenes y que se desinfectaron con el tratamiento 4 en la etapa inicial, que además tenían en el medio de cultivo la combinación de los reguladores de crecimiento BAP y ANA y presentaban carbón activado en el medio de cultivo como agente antioxidante.
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45
5. CONCLUSIONES
El tratamiento en el cual se aplicó dicloruro de mercurio (HgCl2) a una concentración
de 0.2 % por 20 minutos de inmersión y alcohol al 70% durante 1 minuto,arrojó la mayor efectividad enel control de la contaminación de hongos y bacterias en explantes de A. flagelliformis (L)
El mejor explante para la micropropagación de A. flagelliformis (L) es el obtenido de plantas madres jóvenes, con una longitud mayor a 1 cm sin espinas, el cual permite una mejor desinfección, disminución de la oxidación y obtención de plántulas.
El carbón activado, entre las sustancias antioxidantes evaluadas para la propagaciónin vitro de A. flagelliformis (L), fue el que arrojó los mejores resultados.
No se lograron resultados de callogenesis con los tratamientos evaluados.
En la fase de establecimiento del cultivo in vitro de A. flagelliformis (L), el mayor numero de brotes por explante, organogénesis directa, se logró con la concentración 3ml/L de BAP y 1 ml/L de ANA( tratamiento M3) mediante la activación areolar.
46
6.
RECOMENDACIONESSe recomienda continuar con los ensayos en las demás etapas del cultivo in vitro de A. flagelliformis (L) hasta obtener plantas totalmente adaptadas al medio ambiente.
Se sugiere realizar estudioscon otros tipos de explantes que se pudieran utilizar para el establecimiento del cultivo in vitro de A. flagelliformis.
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