FORMATO 1 (Anexo No.2)
CARTA DE AUTORIZACiÓN DE LOS AUTORES PARA LA CONSULTA, LA REPRODUCCiÓN PARCIAL O TOTAL, Y PUBLICACiÓN ELECTRÓNICA DEL TEXTO
COMPLETO. (OPCIONAL)
Bogotá. D.C .. Fecha
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D
Tesis doctoral Trabajo de Grado Señores
BIBLIOTECA GENERAL Cuidad
Estimados Señores:
El suscrito Jesús Arnoldo Daza Figueredo, con C.C. No. 6763394, autor del trabajo de grado titulado Diseño e implementación de un método de procesamiento y reconstrucción tridimensional de imágenes para microscopia presentado y aprobado en el año 2009 como requisito para optar al título de Magister en Ciencias Biologicas; autorizo a la Biblioteca General de la Universidad javeriana para que con fines académicos, muestre al mundo la producción intelectual de la Universidad javeriana, a través de la visibilidad de su contenido de la siguiente manera:
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irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables.
Firma, nombre completo y documento de identificación del estudiante
Jesús Anoldo Daza Figueredo
c. c. &763394
NOTA IMPORTANTE: El autor y o autores certifican que conocen las derivadas jurídicas que se generan en aplicación de los principios del derecho de autor.
---FORMATO 2 {Anexo No.3}
FORMULARIO DE LA DESCRIPCiÓN DE LA TESIS DOCTORAL O DEL TRABAJO DE GRADO
TíTULO COMPLETO DEL TRABAJO DE GRADO: "Diseño e implementación de
un método de procesamiento y reconstrucción tridimensional de
imágenes para microscopia".
letos Nombres Com letos
esús Arnoldo
DIRECTOR (ES) TESIS DOCTORAL O DEL TRABAJO DE GRADO
Apellidos Completos Nombres Completos
Corredor Pereira Carlos Francisco
ASESOR (ES) O CODIRECTOR
Apellidos Completos Nombres Completos
lareo Leonardo Rene
TRABAJO PARA OPTAR Al TíTULO DE: Magister FACULTAD:
PROGRAMA: Carrera _ Licenciatura _ Especialización
Doctorado
NOMBRE DEL PROGRAMA: Maestria En Ciencias Biologicas
NOMBRES y APELLIDOS DEL DIRECTOR DEL PROGRAMA:
Manuel Franco
Maestría x
DISEÑO E IMPLEMENTACIÓN DE UN MÉTODO DE
PROCESAMIENTO Y RECONSTRUCCIÓN TRIDIMENSIONAL DE
IMÁGENES PARA MICROSCOPÍA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE POSGRADO
DISEÑO E IMPLEMENTACIÓN DE UN MÉTODO DE
PROCE-SAMIENTO Y RECONSTRUCCIÓN TRIDIMENSIONAL DE
IMÁGE-NES PARA MICROSCOPÍA
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por los alumnos en sus trabajos de tesis. sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna� antes bien se vea en ellas el anhelo
DISEÑO E IMPLEMENTACIÓN DE UN MÉTODO DE PROCESAMIENTO Y RECONSTRUCCIÓN
TRIDIMENSIONAL DE IMÁGENES PARA MICROSCOPÍA
Decana Académica
JESÚS ARNOLDO DAZA Fl7 UERED AP . ,ADO ¿l
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carlOS,OlTedor7"
PDi rec tor
& E, f,JJ
Leo nardo Lareo., PhD
Tutor
Jurado 1
.l urado 2
Jurado 3
Índice general
Introducción 1
Justificación 5
Objetivos 7
1. Estado del Arte 9
1.1. Trabajos biología celular . . . 9
1.1.1. Descubrimiento de la célula animal y los microorganismos 10 1.1.2. Reconocimiento de la sinapsis neuronal . . . 10
1.1.3. Primeras imágenes tridimensionales reales. . . 12
1.2. Microscopia electrónica . . . 13
1.3. Microscopía confocal . . . 14
1.4. Otras técnicas. . . 18
1.4.1. Ecografía Doppler transcraneal: . . . 18
1.4.2. Doppler Carotídeo: . . . 18
1.4.2.1. Tomografía axial computarizada: . . . 19
1.4.2.2. Resonancia magnética de imágenes: . . . 20
1.4.2.3. Tomografía por emisión de positrones: . . . 20
1.4.2.4. Angiograma coronario. . . 20
2. Metodología. 23 2.1. Diagnóstico y tipo de investigación. . . 23
2.2. Diseño metodológico . . . 24
ÍNDICE GENERAL ÍNDICE GENERAL
3. Resultados 29
3.1. De los equipos. . . 29
3.2. De las muestras. . . 31
3.3. De la cámara fotográfica. . . 34
3.4. Sobre la cámara . . . 36
3.5. Interferencias ópticas . . . 39
3.6. Validación de la membrana . . . 41
3.7. Hojuelas seriadas . . . 43
3.8. De la fijación de la membrana. . . 44
3.9. Arhivo y captura de imágenes . . . 49
3.10. Reconstrucción 3D. . . 50
3.11. Validación R 3D. . . 53
3.12. Cualidades Vitral . . . 54
4. Conclusiones. 59
5. Impacto del trabajo investigativo. 61
Índice de figuras
1.1. Red Neuronal Dirección del impulso nervioso: . . . 11
1.2. Neuronas Piramidales: . . . 11
1.3. Oocitos tecnología DIC: . . . 13
1.4. Sinapsis Neuronal. . . 15
1.5. Ecografia:. . . 18
1.6. Eco Doppler Carotideo: . . . 19
1.7. Tomografía axial computarizada: . . . 19
1.8. Imagenes de Resonancia Magnetica (IRM): . . . 20
1.9. Tomografía por emisión de positrones: . . . 21
1.10.Angiograma coronario: . . . 21
2.1. Diagrama de flujo . . . 25
2.2. Diagrama causa efecto . . . 26
2.3. Mapa conceptual de correlación . . . 28
3.1. Guia preparación de muestras . . . 32
3.2. Obtención cortes . . . 33
3.3. Piezas sistema de adaptación óptica . . . 35
3.4. Ensamble sistema de adaptación óptica. . . . 37
3.5. Pantalla fosforescente. . . . 37
3.6. Sistema de adquisición de imágenes digitales para MET. . . . 38
3.7. Imáges de Tardigrados observados en microscopía confocal . 40 3.8. Efecto del aceite de inmersión en la interfase óptica . . . 41
3.9. Escaneo Laser del vidrio cubreobjetos. . . . 42
3.10. Interfase con membrana. . . 42
3.11. Caracterización espectral de la membrana: . . . 43
ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE FIGURAS
3.13. Membrana Polimérica (Formvar). . . . 46
3.14. Aplicación de la membrana con un espécimen biológico. . . 46
3.15. Citoesqueleto de astrocitos. . . . 47
3.16. Diseño y elaboración de rejillas. . . . 48
3.17. Porta rejillas para microscopía óptica. . . . 48
3.18. Reconstrucción en Z de un artrópodo. . . . 50
3.19. Raconstrucción tridimensional de ganglios . . . 55
3.20. Recostrucción 3D con MET . . . 57
INTRODUCCIÓN
¿Es posible construir un método de procesamiento y reconstrucción tridi-mensional de imágenes para la visualización de una sinapsis neuronal apli-cando la microscopía electrónica de transmisión (MET)?
La microscopía electrónica de transmisión permite obtener imágenes bidi-mensionales con marcadores de metales pesados posibilitando hacer tinciones para mejorar la definición de membranas y otros organelos celulares. Aunque el tamaño individual de los átomos metálicos utilizados no es detectable por MET ni por la microscopía de luz, su asociación con otros átomos sí brinda la posibilidad de visualizar una estructura completa. Esta propiedad manifiesta en el microscopio de transmisión nos permite aprovechar la herramienta para visualizar estructuras diferenciadas a partir de las cuales es posible obtener una reconstrucción tridimensional.
Este principio óptico es la base para obtener información en primera instan-cia de la muestra en estudio. Si la misma información es obtenida en diferentes cortes consecutivos de la muestra, es de esperar que también se pueda hacer un seguimiento de la morfología estructural de la muestra en un tercer eje dimensional.
Los trabajos realizados hasta ahora se habían centrado en emplear el mi-croscopio electrónico de transmisión para obtener imágenes bidimensionales. Sin embargo, esta metodología no permite observar la estructura tridimen-sional de la muestra. Ante esta limitación, decidimos buscar un método para aprovechar la MET para lograr construir imagenes tridimensionales a nivel ultra estructural.
El procedimiento seguido para la captura de la imagen de una muestra
biológica se inicia seleccionando una sección del orden de 1cm2 de superficie y
Reconstrucción 3D Introducción
inicial, conocida como panorámica, la cual nos permite seleccionar y orientar el área de interés, es decir, aquella zona de mayor probabilidad de presencia de botones sinápticos.
Una vez ubicada la zona de interés de un área cuadrada de 3mm de lado
aproximadamente, se procede a realizar una segunda imbibición en resina poliéster para dotarla de un soporte que facilite su manejo y corte.
Hecho esto, con ayuda de un bisturí o cuchilla, procedemos a delimitar la sección de trabajo definiendo una pirámide trapezoidal donde la base inferior
tiene lados paralelos de 600 y 1000µm (≈ 1mm) de longitud
aproximadamen-te y con área mucho mayor que la base superior. A esta muestra con forma piramidal de sección trapezoidal se le hace un corte en secciones
transversa-les muy delgadas de modo que se obtengan películas con espesores entre 60 y
80ηm. Este tipo de corte es el que denominamos corte seriado y es también el
procedimiento que más tarde permitirá hacer la reconstrucción tridimensional de la muestra.
Para el montaje de la muestra se utilizan membranas poliméricas de
form-var con espesor de 60nm que resultan resistentes al impacto de un haz de
electrones. Esta propiedad fue aprovechada en el trabajo montando los cortes, tanto para microscopia de luz como para MET, sobre las membranas formvar con lo cual se logró eliminar totalmente el vidrio del porta objeto que genera refracción al hacer la lectura de la muestra.
Existen equipos que pueden efectuar cortes seriados, a partir de los cuales también se puede realizar la reconstrucción tridimensional de la muestra, sólo que este proceso está limitado a muestras de tamaños grandes, del orden de milímetros, con lecturas por métodos ecográficos o de resonancia de rayos X. Otros equipos pueden realizar esta misma tarea con la ayuda del rayo laser
para muestras de tamaño muy superior, del orden de350nm, a los obtenidos y
analizados por microscopía electrónica de transmisión.
En el mercado nacional existen sistemas de montaje de rejillas para mi-croscopía electrónica de transmisión caracterizado por su mesh, número de
cuadros por unidad de área, usualmente entre 100 y 400 cuadros por cm2.
Introducción Reconstrucción 3D
fía y fotomecánica de modo que la muestra pudiera ser sostenida tan sólo por los extremos y el montaje no afectara la lectura de la muestra. Este sistema tiene la virtud adicional de poderse multiplicar continuamente formando un porta-rejillas de hasta 56 muestras simultáneas, de modo que hace posible la visualización, continuada e independiente, de una muestra con cualquier tipo de técnica de microscopía de luz.
La irregularidad en los cortes, tanto en espesor como en uniformidad del área, hizo que se diseñara y construyera un sistema electrónico de corte el cual contó con un software de alta confiabilidad y precisión que permitió obtener un sistema controlado en los cortes requeridos.
Las hojuelas obtenidas por cortes de la cuchilla de vidrio o diamante quedan suspendidas en la poceta llena de agua con que cuenta en la parte superior la misma cuchilla. Esto hace posible que se puedan recuperar las hojuelas. Ellas se mantienen unidas una tras otra en forma de cadena de películas trapezoida-les. Al parecer, por razones electrostáticas, los trapecios se van organizando de modo que cada lado paralelo mayor busca uno menor y tienen un color platea-do debiplatea-do al mínimo espesor que estas alturas poseen; el color de las hojuelas son una manifestación del espesor que tiene la muestra en cada caso.
Paralelamente se realizó la preparación de la rejilla de único orificio, mesh 1, colocando sobre su superficie una membrana de soporte que es la encarga-da de recoger la cadena de películas trapezoiencarga-dales obteniencarga-das. Así, las hojuelas organizadas que están flotando en agua, por efecto de la tensión superficial, son recogidas por la rejilla tapizada con membrana, que en este momento se encuentra sumergida. Con ello, ahora se puede secar la muestra para ser fi-nalmente introducida en el MET para su observación.
Una de las exigencias primarias para la obtención de buenas imágenes es el estado de la pantalla fosforescente, la cual debe ser muy uniforme y no presentar problemas de densidad o de intensidad de la película fotosensible. En el caso de este trabajo, una de las acciones que hubo necesidad de realizar fue la adecuación de la pantalla, por cuanto su estado inicial no permitía la obtención de buenas imágenes debido al maltrato mecánico al que había sido sometida.
comenza-Reconstrucción 3D Introducción
mos a realizar la captura de las imágenes sucesivas del mismo sector en cada una de las hojuelas. Para la obtención de las microfotografías, cuadrados del
orden de 6a20µm de lado con un aumento de 50000X, se emplea una cámara
CMOS que ofrece igual o mejor resolución que las fotografías obtenidas por re-velado, las cuales dependen de la granulosidad y homogenización de la película fotosensible.
La cámara CMOS (Metal oxido semiconductor complementario) posee un fotodetector formado por tres capas de oxido de silicio sensible a las longitudes de onda rojo, verde y azul (Sistema RGB de su abreviatura en ingles) que están dispuestas una bajo la otra, de tal modo que un haz incidente es capturado por una unidad fotosensible de la capa correspondiente. El dispositivo sensor de las camaras CCD (Dispositivo de carga complementaria) está organizado por triadas de tres tipos de fosforo (RGB), en el mismo plano, Luego un rayo de luz incidente es capturado por el punto de la triada correspondiente, lo que implica la perdida de información de los dos puntos restantes.
Para evitar que la luz proveniente del exterior interfiera con el haz de elec-trones que incide sobre la pantalla fluorescente del microscopio, adaptamos una camara digital acoplada al microscopio en forma tal que se mantuviera la oscuridad necesaria exclusivamente al interior del mismo y que facilitara su monitoreo exterior mediante sistemas computarizados dotados con tarjetas de video. Esto se realizó adaptando un vidrio protector perforado de modo que el objetivo óptico diseñado se constituyera en el contacto directo con la pantalla. En la última etapa del proceso se diseño, elaboró, desarrolló e implementó un software para realizar la reconstrucción tridimensional de imágenes prove-nientes de las micrografías electrónicas de las hojuelas seriadas ya tratadas.
Justificación
En la Facultad de Ciencias de la PUJ se contaba con equipos que pre-sentaban grandes deficiencias al momento de pretender realizar una imagen microscópica de alguna muestra. Esto se veía reflejado tanto en el alcance de los equipos como en el estado técnico de los mismos.
Por otro lado, el protocolo empleado para realizar el examen de las mues-tras era muy limitado tanto en las posibilidades de su análisis, como en la información que se podía extraer a partir de su implementación.
Un tercer elemento motivador para la realización del trabajo de investiga-ción fue el alto costo en que se incurría cuando se trataba de obtener una sencilla imagen de alguna de las muestras: a los altos costos de los reacti-vos utilizados había que sumarle el costo de funcionamiento de los equipos, el costo intrínseco por la exigencia de un ”software” propio y especializado, y el costo implícito por la necesidad de contratar expertos externos para realizar cualquiera de las pruebas.
Objetivos
General:
Diseñar y evaluar un método de procesamiento y reconstrucción tridimen-sional de imágenes para microscopía electrónica de transmisión, con desarro-llos propios, a partir de los recursos existentes en el Laboratorio de Microscopía Electrónica de la Pontificia Universidad Javeriana.
Específicos:
Identificar las caracterísiticas de los equipos existentes en el Laboratorio de Microscopía Electrónica de la PUJ y analizar su potencial aplicación en el proceso de reconstrucción tridimensional de imágenes, 3D.
Identificar las características de los procesos estandarizados de prepara-ción de muestras, procesos ópticos, captura de imágenes y manejo de la información.
Optimizar el proceso técnico de adquisición de imágenes digitales para los diferentes equipos de microscopía.
Optimizar un sistema de realización de cortes sucesivos y obtención de hojuelas seriadas ultrafinas.
Capítulo 1
Estado del Arte
1.1. Primeros aportes de la óptica a la biología
ce-lular.
1.1. TRABAJOS BIOLOGÍA CELULAR CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
1.1.1. Descubrimiento de la célula animal y los
microorga-nismos
El médico inglesRobert Hookda a conocer, en 1665 en su obra
-MICROGRAFÍA-1, la estructura celular de los seres vivos.
En 1773, el microscopista danés Otto Mullerconsiguió distinguir
suficien-temente bacterias, microorganismos que clasificó en dos tipos: bacilos (que significa “pequeños vástagos”) y espirilos (por su forma espiral).[11]. Las ob-servaciones las realizó con microscopia en dos dimensiones.
Es en 1875, cuando el anatomista italiano Camillo Golgi, logró establecer
el método de tinción para neuronas completas y especificas[15].
Con un método que permitió contar y diferenciar los tipos de células del
te-jido nervioso, el contemporáneo de Golgi, el médico Santiago Ramón y Cajal
fué quien reveló que se trataba de un aparente sistema nervioso organizado por células separadas bien definidas. (Ver la figura 1.1 en la página siguien-te). Describió cuidadosamente la morfología de las diferentes estructuras del cerebro y como se interconectan entre ellas.[14].
“En 1887 Ramón y Cajal quedó fascinado por las técnicas de coloración his-tológicas puestas a punto por Golgi y emprendió una serie de investigaciones sobre el sistema nervioso que le condujeron a establecer que las neuronas son células independientes que se comunican entre sí por contacto en contra de la teoría establecida del reticularismo.” [15]. Figura ( 1.2 en la página siguiente).
1.1.2. Reconocimiento de la sinapsis neuronal
Los procesos iniciales para entender la conducción del impulso nervioso y la comunicación entre neuronas, se basan en modelos experimentales con preparaciones histológicas de fibras simples aisladas del nervio ciático del
es-pecimen de rana adultaR. temporaria yR. Esculenta y el axón gigante de
cala-marLoligo forbesi practicados por Huxley y Stämpfly en 1949. Son modelos de
nervio animal con diametros entre 450 y 550 µm, condición que facilitó su
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE 1.1. TRABAJOS BIOLOGÍA CELULAR
Figura 1.1: Red Neuronal Dirección del impulso nervioso:
Revisión de Ramón y Cajal sobre la dirección del impulso nervioso, señalado con flechas, y modelo axón-dendrítico de conexiones de células en la corteza cerebral. El detalle morfológico de la neurona es representado, incluyendo ramas dendríticas y espinas, el cuerpo y el árbol-axonal. Dendritas y cuerpo reciben entradas de muchas células vía terminal de arborización de axones colaterales. Imagen obtenida del artículo .... la revista “Single neurone models: Oversimple, complex and reduced Ivan Seveg Dept of Neurobiology institute of life sciences, Hebrew University, Jerusalen.1992. Vol 15, pg 414.
Figura 1.2: Neuronas piramidales sometidas a tres ticiones diferentes:
a)Neurona teñida con H-E. 400X, b)La misma neurona con la Técnica de Cajal. 100x.
Ob-serve la compleja ramificación dendrítica. C)La misma neurona con la técnica de Golgi. 100X
[image:24.612.174.514.479.624.2]1.1. TRABAJOS BIOLOGÍA CELULAR CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
de dos celulas diferentes, en las fibras múscular y neural y muestran resul-tados de conducción eléctrica causadas por liberaciones de acetil colina en el sitio de union. Se comprobó entonces la transmisión neuromuscular,[16], y fué la primera aproximación de la sinapsis neural a partir de mediciones electro-fisiológicas con participación de sustancias químicas. Por consiguiente en el sitio de union se presentan dos tipos de comunicaciones del impulso nervioso, una electrica y otra química, siendo esta última la de nuestro interes.
Hacia 1950, se mostró la óptica con imágenes bidimensionales provenientes
de microscopios compuestos que alcanzaron los 2000 aumentos.2 A causa de
los limites de longitud de onda puestos por la luz , no fue posible realizar profundizaciones en alta resolución.
1.1.3. Primeras imágenes tridimensionales reales.
El desarrollo de la microscopía de luz o de campo claro, que se habia es-tancado desde 1875, recuperó su dinamismo hacia 1930 con los trabajos de diferentes investigadores quienes utilizaron las propiedades de los objetos tras-lucidos. Estos materiales, al ser estimulados, generan respuestas detectables en el microscopio.
La actividad paralela de disciplinas físicas y biológicas contribuyó a la crea-ción de herramientas para el trabajo de los investigadores, en su tarea de reconocimiento, tanto de las estructuras translucidas como de las opacas. Es-to se puso de manifiesEs-to en la observación de la sinapsis de la placa moEs-tora y en la detección otros niveles de organización biológica, desde asociaciones moleculares hasta relaciones de tejidos, sistemas y órganos [2].
Fue Fritz Zernike, profesor de física de la Universidad de Groningen, quien sentó las posibilidades de aplicación de la investigación básica en óptica teó-rica con respuestas prácticas a la observación de espécimenes traslucidos al microscopio de luz sin utilizar métodos de tinción. La información de la imágen que es captada por el ojo humano es la información proveniente de la ampli-tud de la onda luminosa; en la misma onda existe informacion del especimen que no puede ser vista directamente: es la información presente en la fase de
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE 1.2. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA
Figura 1.3: Oocitos tecnología DIC:
Oocitos primarios de almeja de olas,Spissuela Solidissima, en óptica Contrast diferencia de interferencia (DIC). Los
gradientes de sombra en la imagen indican las regiones de rápido cambio del camino óptico en la célula. Foto tomada de (Murphy 2002).
las ondas luminosas. Para capturar la información presente en la fase de las ondas de luz cuando éstas atraviesan una muestra, se introdujo el concepto de objetos de amplitud, los que permiten el paso directo de luz, y objetos de fase los que retienen parte del haz incidente al variar la frecuencia. Al detectar ambas informaciones, no solo se contaba con la información de la amplitud de la onda sino también de la fase de la onda.
Para obtener la información de fase, trabajos ópticos desarrollados por el grupo de colaboradores del laboratorio de Karl Zeiss en Jena 1942, en los que aplicaron esta teoría, obtuvieron un microscopio de contraste de fase (FCM), primera aproximación a una imagen tridimensional bajo la apariencia de relie-ve. Los trabajos realizados con esta tecnología transformaron la investigación de la biología y medicina. Aún con esta técnica, los avances sobre resolución no son los mas deseados. Entre los principales exponentes de la técnica te-nemos a: Benett et al (1951), Francon (1961), Slayter (1976), Slayter y Slayter (1992) y Pluta(1989). [12].
1.2. Aparición de la microscopía electrónica.
1.3. MICROSCOPÍA CONFOCAL CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
embargo, este esfuerzo con el que se pretendía explicar el microcosmos desde la intimidad del átomo, sirvió para alcanzar tres logros importantes:
El primero fué el perfeccionamiento de equipos de microscopía electrónica de transmisión (MET), con robustas fuentes de poder (alta tensión); con ellos se gana en amplificación de las imágenes, puesto que la longitud de onda del haz de electrones depende de la diferencia de potencial aplicada al equipo y, adicionalmente, se dotan los equipos con mejores componentes electrónicos de control y se obtienen las lecturas deseadas con mayor resolución (Agar, A. W., 1991).
Un segundo aporte fué el desarrollo de técnicas y protocolos químicos que contribuirían a la preparación de muestras, específicamente en procesos de fijación, tinción y contrastación.
Y el tercer aporte fue la identificación de ultra estructuras y seguimiento de cadenas de señalización de rutas metabólicas, por métodos de marcacio-nes inmunocitoquímicas, los cuales sólo se presentan en forma estandarizada hasta el año de 1977 [9]. Sin embargo, aún con la eficiencia de los marcadores
metalicos y los logros obtenidos en resolución inferiores a 1nm, unicamente
fué posible obtener imagenes bidimensionales.
1.3. Usos de la microscopia láser confocal.
Más adelante, hacia 1980, con el mejoramiento de la óptica de confocalidad se consiguieron aumentos del orden de 4000 o 5000 veces. A este punto de magnificación, las condiciones internas del instrumento ponen el limite a su avance, esto debido a las características físicas de funcionamiento generadas
por la longitud de onda del espectro visible, 350 a 750nm.
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE 1.3. MICROSCOPÍA CONFOCAL
Figura 1.4: Microfotografía electrónica de la sinapsis neuronal:
1.3. MICROSCOPÍA CONFOCAL CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
en los que se ha aplicado la microscopia confocal al estudio de las neuronas impregnadas por la técnica de Golgi para su reconstrucción tridimensional, esta tecnología ha sido poco explotada aún para este propósito”.[15]
Aunque el principio de la microscopía confocal surgió hace varias décadas (Minsk, 1957) los primeros microscopios basados en esta técnica mostraron su validez en 1968, con trabajos descritos por (Petran., et al). Y su aceptación con avanzados desarrollos ha tenido lugar solo hasta hace unos pocos años con la inclusión de los láseres y de los mini computadores.
La mayor parte de las muestras observadas con microscopía óptica conven-cional son traslúcidas. Si una muestra es opaca o si la superficie de reflexión no se encuentra perfectamente pulida, para ambos casos, la luz interaccio-na con la muestra a varias profundidades por lo que la imagen que llega al observador presenta áreas borrosas. Debido a que la luz reflejada procedente de zonas fuera del plano de enfoque, produce un efecto de degradación con perdida de contraste y resolución de la imagen.
El principio de la microscopía confocal consiste en eliminar la luz reflejada o fluorescente que proviene de los planos fuera de foco. Para ello se ilumina una pequeña zona de la muestra y únicamente se deja pasar el haz luminoso que proviene del plano focal, eliminándose los haces procedentes de los planos inferiores y superiores mediante una apertura conocida como pinhole (Boyde, 1988).
En la microscopía electrónica de transmisión, el análisis también se realiza sobre un plano focalizado, que a diferencia del plano explorado con el micros-copio confocal, se obtiene por medio de un corte físico con cuchilla y no por el metodo de escaneo láser como lo hace el microscopio confocal.
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE 1.3. MICROSCOPÍA CONFOCAL
al sistema. Especificamente para el microscopio de barrido SEM, se llegó
obte-ner aumentos hasta 30000X y resoluciones de 100 a 200 nm. Para la misma
época el desarrollo del MET permitió resoluciones inferiores a1nmy aumentos
superiores a106. Esta ventaja del microscopio de transmisión brindó una
opor-tunidad para ser aprovechada en este trabajo de reconstrucción tridimensional de una sinapsis neural.
Últimamente, el desarrollo tecnológico ha permitido tener resoluciones del orden de 1 Å para equipos de microscopía de fuerza atómica y microscopios de efecto túnel. Equipos que condicionan su actividad unicamente en adquirir la información superficial de la muestra. [4][6]
La aplicación de estos avances en la tecnologia de instrumentos y equipos ópticos, se ha conjugado con un desarrollo paralelo en tecnicas para la inves-tigacion de la biología celular, hasta llegar a reconocer ultraestructuras.
Contribuciones adicionales provenientes de los desarrollos de la biología celular y que tambien son de interes para nuestro estudio, son las reconstruc-ciones volumétricas de un espécimen. En 1968, se logró reconstruir tridimen-sionalmente una imagen a partir de algorítmos matemáticos, [3]. Trabajo que dió aportes significativos para que posteriormente fueran utilizados en proce-sos de adquisición y analisis de imágenes mediante fotografías, inicialmente analógicas y posteriormente digitales, con captura directa de imágenes pro-ducto de un mejor ensamble de los equipos de microscopía.
Paralelamente con el desarrollo de los equipos, también se ha mejorado en el proceso mismo de tratamiento de muestras, objeto de estudio, que impulsa el desarrollo de múltiples técnicas de adquisición y análisis de imágenes.
1.4. OTRAS TÉCNICAS. CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
A) B)
Figura 1.5: Ecografia:
A) ventana sónica transcraneal, Según la ventana utilizada se van a poder registrar diferentes arterias cerebrales. B) Corresponde a la distancia entre la superficie del transductor o sonda y la arteria localizada, midiéndose esta en milímetros y se determina al chocar el ultrasonido mandado por la sonda desde la superficie con los hematíes del flujo sanguíneo del vaso, siendo este el punto o area donde se origina la señal doppler denominado “Volumen de muestra”. En la mayoria de los aparatos la insonación es registrada desde el punto medio del volumen de muestra. http://www.eccpn.aibarra.org/temario/seccion7/capitulo127/capitulo127.htm, Consulta: Junio 05 de 2009, 5:00 p.m.
1.4. Otras técnicas para obtener imágenes
tridi-mensionales
1.4.1. Ecografía Doppler transcraneal:
Es un exámen de diagnóstico seguro que proporciona una visión interior del cerebro, no visible directamente. Produce imágenes de dos o tres dimensio-nes usando ondas electromagneticas y ultrasónicas, emitidas en ecos hacia la fuente que los produjo.
Apareció en 1982 y muestra la hemodinámica y la velocidad de del flujo
sanguíneo intracerebral.3
1.4.2. Doppler Carotídeo:
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE 1.4. OTRAS TÉCNICAS.
Figura 1.6: Eco Doppler Carotideo:
Un estudio indoloro con Eco Doppler Preventivo puede identificar esta amenaza y permitir actuar a su médico. http.//www.cardiomedic.com.pe/01_arteriografiacarotidea.html., consulta, junio 05 de 2009, 5:00 p.m.
[image:32.612.228.464.77.213.2]A) B)
Figura 1.7: Tomografía axial computarizada:
A) Infarto de la arteria cerebral media como forma de presentación de la tuberculosis miliar (Middle cerebral artery ischemic stroke presentation of miliar tuberculosis B. Zalba Etayo, B. Obón Azuara, I. Gutiérrez Cía, B. Villanueva Anadón, R. Ridruejo Sáez Servicio de Medicina Intensiva. Hospital Clínico Universitario. Zaragoza B)Exámen nor-mal de TAC de cabeza con medio de contraste intravenoso. Las imágenes no son comparables, No es posible sacar conclusiones por comparación de las imágenes. Solamente los radiólogos calificados deben interpretar las imágenes. http://www.radiologyinfo.org/sp/info.cfm?pg=headct, consulta: junio 26 de 2009, 10:00 a.m.
una arteria cerebral causando un accidente cerebro vascular de diverso grado. Esta complicación es actualmente la tercera causa de muerte en países como
Estados Unidos de América.4
1.4.2.1. Tomografía axial computarizada:
Son diagnisticos que combinan un equipo de rayos x especial con compu-tadoras sofisticadas para producir múltiples imágenes o visualizaciones del
interior del cuerpo.5
1.4. OTRAS TÉCNICAS. CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE
Figura 1.8: Imagenes de Resonancia Magnetica (IRM):
IRM significa imágenes por resonancia magnética. La IRM es un procedimiento indoloro que usa imanes potentes y ondas radiales para construir imágenes del cuerpo. Se crea un campo magnético alrededor, enviando ondas que forman una imagen de la región específica. http://www.neurochirurgie-zwolle.nl/grap/MRI_fMRI.jpg
1.4.2.2. Resonancia magnética de imágenes:
La resonancia magnética (IRM) es un procedimiento que combina imanes grandes con radiofrecuencias y usa una computadora para producir imágenes detalladas de los órganos y las estructuras internas del cuerpo. La IRM se utiliza a menudo: para examinar tejidos blandos como el corazón, el cerebro,
el hígado, entre otros.6
1.4.2.3. Tomografía por emisión de positrones:
La tomografía por emisión de positrones (PET) es un tipo de procedimiento de medicina nuclear que mide la actividad metabólica de las células de los teji-dos del cuerpo. Es utilizada frecuentemente por los oncólogos, los neurólogos,
los neurocirujanos, y los cardiólogos.7
1.4.2.4. Angiograma coronario.
CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE 1.4. OTRAS TÉCNICAS.
Figura 1.9: Tomografía por emisión de positrones:
Con 2-(18F)-fluro-2-deoxi-D-glucosa (FDG-PET) que detecta una imagen tumoral en el páncreas en un paciente con pancreatitis cronica (PC). (http://www.intramed.net/contenidover.asp?contenidoID=40537) ¡Revisión! Pancrea-titis crónica: diagnóstico y tratamiento, 28 MAY 08 Dres. DiMagno MJ, DiMagno EP. Angiografia: Es una técnica radiográfica que inspecciona cavidades internas del corazón y arterias usando un colorante para medir el flujo y pre-sión en las arterias coronarias. http://www.texasheartinstitute.org/HIC/Topics_Esp/Diag/diangio_sp.cfm, Consulta: junio 08 de 2009, 8:00 a.m.
Figura 1.10: Angiograma coronario:
La flecha indica una obstrucción en la arteria coronaria derecha.
http://www.texasheartinstitute.org/HIC/Topics_Esp/Diag/diangio_sp.cfm, Consulta: junio 06 de 2009, 8:00 a.m.
coronarias.8
De la discusión anterior se desprende que, los procesos desarrollados hasta ahora han posibilitado la reconstrucción tridimensional de macro estructu-ras,y de manera muy tímida, y menor a la posibilidad de reconstrucción de imágenes en el orden de la resolución permitida por el MET, [3],como lo hemos aplicado para la reconstrucción tridimensional de la sinapsis neuronal.
Capítulo 2
Metodología.
2.1. Diagnóstico y tipo de investigación.
2.2. DISEÑO METODOLÓGICO CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA.
procesos de corte y presión.
Finalmente, se realizó también una revisión bibliográfica encaminada a la obtención de información sobre los programas de computador empleados para la reconstrucción de volúmenes a partir de la captura de imágenes bidimen-sionales obtenidas en cada hojuela. Este proceso llevó a la construcción de un programa propio obtenido a partir de la utilización de diferentes programas de software libre con el cual se logró la reconstrucción final.
Todo este proceso exigió también su convalidación; ésta se llevó a cabo desarrollando inicialmente un entrenamiento sobre el proceso de captura de imágenes de especímenes conocidos para luego ser comparadas con las obte-nidas a partir del proyecto de investigación. También al final, para comprobar la validez del software de reconstrucción tridimensional elaborado a través del proyecto, se editaron las imágenes obtenidas de las hojuelas para formar un archivo en columna (stack) de imágenes para posteriormente aplicarle el programa VITRAL, producto del grupo de trabajo, y así obtener una imagen tridimensional animada, proceso conocido como renderización. Para posibili-tar la comparación de reconstrucciones tridimensionales se optó por recuperar imágenes individuales a partir de una animación creada desde un microscopio confocal. Estas imágenes individuales, que no requieren edición porque ya sa-len formando un archivo en columna de imágenes, fueron sometidas al mismo programa VITRAL obteniéndose la reconstrucción tridimensional idéntica a la reportada por el fabricante. Este proceso fue aplicado a diferentes muestras corroborando las bondades y efectividad del software creado.
2.2. Diseño metodológico
Las actividades planteadas en el numeral anterior condujeron a la elabo-ración de un diagrama de flujo que nos permitiera visualizar el proyecto en conjunto y separar cada una de las actividades y proyectos a desarrollar en cada etapa del proceso. Esta forma de trabajo tuvo como resultado la elabora-ción de una lista de chequeo para verificaelabora-ción.
CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA. 2.2. DISEÑO METODOLÓGICO
Figura 2.1: Diagrama de flujo
El diagrama señala los pasos a seguir en el reconocimiento del estado de los equipos y el recorrido que debe tener una muestra, para que apartir de la misma sea posible extraer hojuelas seriadas con sus respectivas imagenes para la posterior recontrucción tridimensional.
el 100 % de problemas existentes dependen de un 20 % de las causas posibles que los originan; a partir de aquí lo que se busca es identificar aquellas cau-sas efectivas que impiden la solución de los problemas, con lo cual podemos dar solución a una situación. Esto nos lleva a la generación de una lista de chequeo que verifique la superación de los problemas identificados.
Como resultado de este diseño metodológico se encontró que las dificulta-des para el dificulta-desarrollo del proyecto se manifestaban en las condiciones huma-nas presentes en el momento, en las adaptaciones locativas, en el estado de los equipos y en los procedimientos de preparación de muestras y carencia de software para captura y análisis de imágenes, además de los problemas económicos.
Luego de secuenciar jerárquicamente las situaciones problema sobre equi-pos, muestras, camaras y software ellos se transformaron en el eje conductor y metodologico para desarrollar esta investigación. El diagnóstico así realizado facilitó la elaboración de un diagrama de flujo con el cual se visualizara todo el proceso y sirviera de guía de análisis de las etapas del proceso.
inci-2.3. LISTA DE CHEQUEO CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA.
Figura 2.2: Diagrama causa efecto:
El diagrama causa efecto es el resultado del diagnostico para conseguir la reconstrucción tridimensional de imagenes a diferentes niveles con los instrumentos existentes en el Centro de Microscopía Electrónica de la Pontificia Universidad Javeriana.
dencia que la solución de cada problema pueda tener sobre la solución total de la situación. Al aplicar este método al proyecto de investigación se obtuvie-ron resultados muy similares y complementarios a los obtenidos mediante el método de Pareto.
Cabe anotar que este trabajo de investigación tiene como fundamento un ti-po de investigación experimental centrada en conceptos básicos de la óptica, el desarrollo tecnológico y aportes pedagógicos visualizados en las diferentes eta-pas de investigación. Esto permite definirlo como un trabajo de investigación básico experimental (Zorrilla, 1993).
2.3. Lista de chequeo
Los resultados de la etapa de diagnóstico se resumen con la siguiente lista
de chequeo1:
1. Identificar el tipo de equipo existente en el laboratorio y evaluar su posible aplicación en la reconstrucción tridimensional, 3D.
prepa-CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA. 2.3. LISTA DE CHEQUEO
pueden tratar a lo largo del trabajo de investigación.
3. Identificar el tipo de cámara fotográfica de mayor resolución y que mejor se adecuara al presupuesto para la captura de imágenes.
4. Evaluar la posibilidad de adecuar la cámara obtenida en los microscopios de MET y de Campo Claro o de luz.
5. Buscar generar alternativas que permitan la eliminación de interferencias ópticas debidas a elementos diferentes al espécimen.
6. Realizar pruebas de captura de imágenes con microscopio confocal bus-cando mejorar la resolución y fidelidad de la imágen para validar el méto-do propuesto en el numeral anterior.
7. Desarrollar un método para mejorar el proceso de corte de muestras para obtener hojuelas más delgadas con el mismo espesor y ángulo de corte. Evaluar la posibilidad de realizar estos cortes con ayuda de controladores electrónicos para mejorar la calidad de los cortes.
8. Determinar el método más apropiado para fijar la membrana en el sopor-te, de modo que ella pueda sostener la hojuela en estudio.
9. Identificar el proceso más adecuado para la captura de imágenes y la formación del archivo en columna o stack de fotografías. Determinar la necesidad de emplear un marcador para fijar un sistema de referencia.
10. Desarrollar el software para acoplar el stack de fotografías como una re-construcción tridimensional.
11. Validar el proceso de reconstrucción tridimensional desarrollado compa-rando sus resultados obtenidos con procesos ya reconocidos.procesa
2.3. LISTA DE CHEQUEO CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA.
Figura 2.3: Mapa conceptual de correlación
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Capítulo 3
ANALISIS Y RESULTADOS
Como ya se anotó anteriormente, la reconstrucción tridimensional de imá-genes a partir de MET, objetivo central del presente trabajo de investigación, exigió la elaboración de un Mapa Conceptual y, con él, la construcción de un Diagrama de Flujo de las actividades a realizar; posteriormente, fue elaborada una lista de chequeo pormenorizada de estas actividades permitiendo así la organización de las tareas a desarrollar ya comentadas en la metodología.
Como resultado del plan de trabajo establecido también cada una de éstas etapas del proyecto fueron generando unos resultados parciales que, aunque no eran el núcleo central del trabajo, sí se constituyeron en parte integral del mismo.
3.1. De los equipos.
Como ya se mencionó, la primera labor consistió en la evaluación de los equipos disponibles, su funcionamiento, alcances y limitaciones. Como resul-tado de este proceso se obtuvo:
3.1. DE LOS EQUIPOS. CAPÍTULO 3. RESULTADOS
epiluminiscentes; sin embargo, este equipo carece de cámara fotográfica. Este microscopio sirvió como instrumento esencial en el diagnóstico del camino óptico, identificando con él las partes más vulnerables a las inter-ferencias ópticas; además se identificaron las principales características de cada procedimiento de captura de imágenes a partir de un campo os-curo o de un contraste de fase, los proceso de calibración Köelher y el análisis de las posibles adaptaciones. Posteriormente, este mismo equi-po sirvió de soequi-porte de inspección de muestras, es decir que, sobre él se construyeron los soportes que contenían la membrana con el propósito de tener las primeras imágenes que nos permitieran hacer seguimiento de las panorámicas de los tejidos que se utilizarían posteriormente. Como puede verse, este equipo fue esencial dentro del desarrollo del trabajo de investigación. Una vez se puso en marcha, se realizaron pruebas para de-purar la magnificación y el contraste. Con la adaptación de una cámara a un microcopio de luz.
También se contaba con un microscopio electrónico de transmisión, MET, marca JEOL 100B, en pésimo estado, dado que este equipo durante va-rios años permaneció fuera de servicio ; por ello fue necesario efectuar trabajos de róeparación del sistema hidráulico, de la detección de vacío y del sistema de regulación de alto voltaje; además, se implementó un siste-ma de recirculación de agua para mejorar la refrigeración necesario para conseguir baja presión y con ella un alto vacío. Este trabajo fue necesario hacerlo en virtud del alto poder de resolución del equipo indispensable para nuestra investigación, por cuanto ella, la resolución, depende solo de la alta diferencia de potencial en la columna del microscopio, es decir, de la energía de los electrones. Este microscopio sirvió como instrumento para capturar imágenes de ultraestructuras a magnificaciones de 50000X y resoluciones del orden de 5nm. Recordemos que estas imágenes de ca-da hojuela de la muestra se constituyeron en una parte funca-damental del stack hacia la reconstrucción tridimensional de la muestra.
CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.2. DE LAS MUESTRAS.
completa del organismo, un escorpión, una libélula y diversos insectos. Dentro de las modificaciones realizadas se le eliminó todo el sistema de captura de imágenes y se reemplazó por el sistema de lentes oculares; se le adaptó un soporte para fijar la cámara CMOS con la cual poder tomar una serie de fotografías en secuencia fija y con orientación esta-ble. Este equipo se empleó para obtener el primer nivel de acercamiento de una muestra, con la cual se obtenían imágenes que, posteriormente, iban a ser empleadas como elemento de verificación de la reconstruc-ción tridimensional obtenida. El esteroscopio también sirvió, más tarde, como soporte de la cámara que fue adaptada al microscopio de luz LEICA ORTOPLAN; este último montaje requirió el diseño de un sistema óptico adecuado para la captura de imágenes a través del microscopio de luz.
3.2. De las muestras.
Para insertarnos en el manejo de muestras se hizo necesario el estudio pormenorizado de los diferentes protocolos de manejo[5] y se reprodujeron al-gunos de ellos en la adecuación y procesamiento de las muestras para micros-copía electrónica de transmisión. Esto nos llevo a los siguientes resultados:
El estudio inicial de las diferentes metodologías de trabajo de las muestras nos llevó a determinar los procesos mas ádecuados en el alistamiento de una determinada muestra, figura( 3.1 en la página siguiente). Aquí se tuvo en cuenta el tamaño, el origen, la textura, la dureza, la adherencia y la densidad de las muestras para seleccionar el tipo de preparación más adecuada a las necesidades. Tambien se propuso la metodología de proporcionar reactivos por gotas y no por mililitros como se ha venido haciendo en los diferentes laboratorios y se propone como estandar en la literatura.[3].
3.2. DE LAS MUESTRAS. CAPÍTULO 3. RESUL T ADOS Figura 3.1: Guia para la pr eparación de muestras de micr oscopía electrónica : La or ganización conceptual, muestra en la figura la integración de pr ocesos sobr e la pr eparación de muestras micr oscopía electrónica de transmisión[5], relaciona globalmente las actividades y per mite visualizar o hacer ajustes para un pr oceso específico durante la mar cha. Pr opuesta metodológica elaborada en el Centr o de Micr oscopia de PUJ. 32
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Solución amortiguadora
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[image:45.792.126.743.66.497.2]CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.2. DE LAS MUESTRAS.
íí
[image:46.612.268.416.85.335.2]í
Figura 3.2: Procesos de cortes para obtener imágenes:
Las imagenes indican las diferentes técnicas de obtención de cortes: A, B y C. Preparación de muestras para obtener superficies por el método de raspado; en C, se incluyen las guias para orientación de las superficies. D. Corte de
diente realizado con disco diamatado de espesor0,3mm. a 2500 r.p.m y refrigeración por agua. E. corte de diente
utilizando criostato posterior a la descalcificación con acido nitrico al 5 % y coloración con hematoxilina de Mayers.
F. Sección de corte con microtomo de espesor de25µm, observado en el microscopio confocal FV1000 de Olympus a
40X. G y H. Metodo de crifractura para observar tubos dentinarios, micrografia a 4000X obtenida en el SEM Quanta 200 de la Universidad Nacional de Colombia y posterior análisis de imagenes con el software libre Image J. I, J y K.
Cortes seriados de sinapsis interneural realizados con el ultramicrotomo sorval MT-1, de espesor de60nmvistos al
microscopio electrónico de transmisión a 50000X. Procesos desarrollados en el Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
otro método, utilizando el sistema de raspado con el objeto de conseguir superficies más delgadas. Estos cortes son posibles sobre muestras con-tinuas o discretas (colonias de bacterias), sobre muestras sólidas, como minerales (vidrio), oseas (dientes), queratinizadas (caparasones) y en ve-getales; y también, sobre muestras de cultivos celulares.
3.3. DE LA CÁMARA FOTOGRÁFICA. CAPÍTULO 3. RESULTADOS
que nos facilitara este proceso. Esto se logró incluyendo guías de orien-tación como puntos, círculos, líneas, barras u otras señales externas y distintas al espécimen, figura( 3.2 en la página anterior).í
La importancia de desarrollar estos procesos radica en la necesidad de pre-servar la morfología e histología de la muestra de modo que no se altere su biometría y composición. Adicionalmente, la estandarización de estos procesos permite caracterizar muchos materiales de la naturaleza. Además, la introduc-ción de guías de referencia ahorra posterior trabajo de ajuste de las imágenes mediante el sotware de alistamiento.
3.3. De la cámara fotográfica.
La captura de imágenes procedentes de los microscopios hizo necesario el análisis, evaluación, ajuste al presupuesto, implementación de un proyecto y, finalmente, compra de este equipo. Con ello se obtuvieron los siguientes resultados:
Después de un proceso como el ya narrado se logró la adquisición de la cámara digital Sony SR-1 de 10.3 megapixeles con tecnología CMOS. Este tipo de cámara resultó favorecida en el proceso de selección porque su tecnología permite la captura completa de cada pixel de color[1].
CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.3. DE LA CÁMARA FOTOGRÁFICA.
Figura 3.3: Piezas sistema de adaptación óptica:
Sistema óptico diseñado para la adquisición de imágenes en el microscopio de transmisión JEOL 100B. Cuenta con un vidrio de agujero central para acoplar el objetivo de la cámara formado por 4 lentes , dos de enfoque y dos de corrección cromática. Diseñado y contruido en el Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
A pesar de ser una actividad distinta a la óptica asociada a la cámara foto-gráfica, sí está relacionada con ella, por la necesidad de diseñar, construir e implementar todo un sistema de ensamblaje del conjunto de lentes de la cámara. Inicialmente se realizó un diseño que luego fue moldeado con re-sinas sintéticas de tipo poliester; más tarde, fueron pulidas las roscas de giro requeridas y las guías de ajuste y separación de lentes y, finalmente, las lentes fueron ajustadas a presión, garantizando la invariabilidad de los centros ópticos y su posible desarme para ser implementado en otros microscopios, si así fuera requerido.
3.4. SOBRE LA CÁMARA CAPÍTULO 3. RESULTADOS
3.4. De la adecuación de la cámara a los
micros-copíos.
Una vez capturadas las imágenes procedentes de los microscopios se hizo necesario el procesamiento de la información digital proveniente de la cámara fotográfica. El alto costo asociado con el proceso de revelado y al tiempo reque-rido para ello, exigieron el manejo de un software comercial para recolección, orientación y almacenamiento en formato de datos de las diferentes fotogra-fías. Una muestra procesada puede contener más de 200 fotografías y podría llegar a un número cercano a las 1000. Con este proceso se obtuvieron los siguientes resultados:
Para evitar la oscuridad externa requerida en el MET, generadas por re-flexiones que alteraban la información proveniente de la pantalla, se en-sambló el sistema óptico incrustándolo en una placa maciza y opaca del tamaño de la ventana del microscopio sellando toda posibilidad de ingre-so de rayos de luz al interior de la zona de trabajo, (figura 3.4 en la página siguiente).
Para evitar efectos de dispersión, difracción y reflexión al interior del mi-croscopio, generados por la luz emitida por la fluorescencia de la pantalla se cambió el vidrio principal y original por otro de idénticas características pero con un agujero en la zona de ubicación del sistema óptico (figura 3.3 en la página anterior). Sin embargo, las bajas presiones a la que queda-ba expuesta la lente delgada debido a las condiciones de vacío obligaron a adaptarle una lente adicional concavo-convexa, de identica curvatura asegurando la conservación de la distancia focal. Esto premitió soportar, con seguridad, las bajas presiones del interior del microscopio.
CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.4. SOBRE LA CÁMARA
Figura 3.4: Ensamble sistema de adaptación óptica:
La figura muestra los pasos para el montaje de los lentes que arman el objetivo de la cámara y la asegura en el vidrio de la ventana del microscopio mediante el adaptador cilindrico que aparece en la imagen F. Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana
Figura 3.5: Testigos de ancho de banda fosforescente para haz de electrónes.
[image:50.612.168.520.449.584.2]3.4. SOBRE LA CÁMARA CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Figura 3.6: Sistema de adquisición de imágenes digitales para MET:
Cámara digital adaptada al microscopio electrónico de transmisión JEOL 100B. Monitorea la imagen sobre la pantalla fosforescente en el microscopio y evita cualquier incidencia de luz de exterior hacia el interior. Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
Los procesos de adaptación de la cámara nos eliminaron la posibilidad de observar la muestra por el aislamiento de todo el montaje. Esto hizo necesario implementar un sistema de seguimiento y selección de la zona de interés. Para ello se adquirió una tarjeta capturadora de video que, introducida en un computador, permitiera, a través de la misma cámara, monitorear la ubicación del haz de electrones sobre el espécimen y así delimitar la ultraestructura de interes. (Figura 3.6).
Esta adaptación de la cámara digital al MET aportó al proyecto los siguientes beneficios: se posibilitó obtener imágenes de alta calidad en formato digital, se logró disminuir el tiempo de procesamiento al evitar el revelado de las imáge-nes y su consiguiente escaneo, se pudo aumentar el número de exposicioimáge-nes fotográficas y, a partir de ellas, determinar aquella o aquellas que nos entre-garan la imágen más definida, lo cual significó un ahorro efectivo en tiempo y material.
CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.5. INTERFERENCIAS ÓPTICAS
de oscuridad total en el lugar de trabajo del MET y se hicieron más eficientes las condiciones de oscuridad al interior del microscopio.
Un aporte adicional de la adecuación de la cámara y su ensamblaje al mi-croscopio fue la posibilidad de emplear todo el sistema óptico diseñado[10], tanto en el MET como en el microscopio de luz y en el esteroscopio.
3.5. De la eliminación de interferencias ópticas
indeseadas.
Una dificultad adicional que se presentó en el proceso de observación de muestras inmersas en el microscopio de luz, debido a la necesidad de acercar el lente objetivo a la muestra y que se puede convertir en una seria dificultad en la reconstrucción tridimensional de una muestra, consiste en la presencia de elementos de interferencia óptica ajenos a los provenientes de la muestra. Estos elementos hacen referencia a una posible suciedad en alguna zona del espacio de trabajo, a la presencia de imperfecciones sobre la superficie de los materiales utilizados o de contaminaciones provenientes del medio. También a fenómenos ópticos, reflexión, refracción, difracción, presentes en los vidrios porta y cubre-objetos. Para solucionar estos impases se desarrolló un proceso de detección que condujo a los siguientes resultados:
Se elaboró un protocolo de detección y seguimiento de posibles fuentes de suciedad y su tratamiento posterior. Las fuentes así estudiadas provenían de falta de homogeneidad del rayo luminoso, de falta de homogeneidad en el aceite de inmersión, de impurezas en la composición del vidrio porta y cubre-objetos o de contaminación de las lentes condensadoras o de los lentes objetivo.
3.5. INTERFERENCIAS ÓPTICAS CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Figura 3.7: Imáges de Tardigrados observados en microscopía confocal:
Observación a 20X de una muestra viva del tardigrado (osito de agua) en montajes diferentes con el microscopio confocal FV1000 de Olympus. La imagen A es el resultado del montaje sobre vidrio cubre-objetos. El montaje B. muestra la uniformidad y finos detalles de éste espécimen animal al ser observado en un montaje sobre la membrana polimérica. Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
El beneficio de este protocolo para el proyecto de investigación radicó en ase-guramiento de limpieza de la fuente de iluminación y del camino óptico con sus elementos asociados. Además se garantiza la distribución homogenea del área iluminada; este proceso se conoce como “Proceso de alineación Köheller”. [13]. Otro beneficio obtenido para el trabajo fue el conocimiento acerca del adecua-do uso del aceite de inmersión en el momento de su aplicación: su agitación remueve las partículas sedimentadas en el fondo generando difracción del rayo de luz incidente.
CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.6. VALIDACIÓN DE LA MEMBRANA
Figura 3.8: Efecto del aceite de inmersión en la interfase óptica:
Los aceites de inmersión en el laboratorio presentan indices de refraccion aproximados a 1.6, que se ve afectado cuando este se agita y las partículas sedimentadas se interponen en la trayectoria del rayo laser, la imágen muestra puntos brillantes donde se aprecia la difracción del haz.
3.6. De la validación del protocolo anterior.
El hecho de haber limpiado de impurezas el camino óptico y sus elementos y el haber sustituido el vidrio porta-objetos por una membrana nos debería dar como resultado imágenes de mejor calidad. Sin embargo, fue necesario corroborar los resultados esperados del proceso anterior. Para esto se procedió a realizar un escaneo laser para un análisis espectral del aceite de inmersión y del vidrio porta-objetos en el microscopio confocal. (Figuras 3.8, 3.9 en la página siguiente) y para la membrana (figura 3.10 en la página siguiente). Como resultado del espectro obtenido se observa una distribución no regular del recorrido del haz laser dentro del aceite y aparecen visos de puntos de mayor intensidad, causados por partículas de diferente transparencia, ya sea en el vidrio o en el aceite. Al realizar el cambio del vidrio por la membrana y someterla al mismo proceso anterior, escaneo laser espectral, se apreció la distribución normal del rayo laser y la eliminación de las interferencia por partículas extrañas. Como resultado de este proceso se puede señalar:
Se consiguió validar el proceso de limpieza y eliminación de interferencia óptica.
3.6. VALIDACIÓN DE LA MEMBRANA CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Figura 3.9: Escaneo Laser del vidrio cubreobjetos:
La linea amarilla representa la respuesta en fluorescencia del material de vidrio, los visos perpendiculares sobre el vidrio son efectos de difracción por irregularidades en su superficie, componentes que hace que se comporte como heterogeneo. Las bandas vistas en tonalidades son causadas por la reflexión del rayo laser sobre la superficie del vidrio. Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
Figura 3.10: Interfase con membrana:
[image:55.612.194.381.456.588.2]CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.7. HOJUELAS SERIADAS
Figura 3.11: Caracterización espectral de la membrana polimerica de formvar:
En el equipo de escaneo laser confocal FV1000 de Olympus, la figura muestra el pico de emisión en 543nm. y un
ancho de banda aproximado30nm. Trabajo realizado en el Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad
Javeriana.
543±1 nm. Con esto se posibilita encontrar aplicaciones adicionales
pa-ra la membpa-rana como el marcaje con fluorocromos en pa-rangos espectpa-rales distintos al pico gaussiano. (Figura 3.11).
La incidencia de estos resultados en el trabajo de investigación consistió en conseguir la garantía que la información proveniente de la muestra pertenecía a ella misma y estaba libre de impurezas ajenas a la estructura.
3.7. De la obtención de hojuelas por cortes
seria-dos.
Los cortes realizados a las muestras usando ultramicrótomos se realizaban de manera manual y los buenos resultados en los cortes semifinos y ultrafinos sólo dependían de la habilidad del instrumentador y se obtenían secuencias de un número pequeño de cortes. Para mejorar este proceso se buscó imple-mentar un sistema motorizado de corte con control electrónico de modo que mantuviera constante la velocidad de corte y la presión sobre la muestra; esto exigió el manejo de motores paso a paso y el diseño de circuitos electrónicos de control. Adicionalmente, para regular los cortes se elaboró un software para el control de motores a través de los puertos seriados RS-232 y paralelo del computador. Como resultado de estos procesos se logró:
3.8. DE LA FIJACIÓN DE LA MEMBRANA. CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Figura 3.12: Cortes seriados para microscopía de luz y electrónica:
En la obtención de cortes seriados, el control del espesor es relacionado con el color del corte como una respuesta de interferometría. Los cortes gruesos y semifinos son multicolores en (C). Los cortes delgados ultrafinos son plateados en (D). Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
Este diseño tuvo su incidencia en el trabajo de investigación garantizando la
uniformidad de los cortes, con un espesor constante, del orden de 60nm.
(Fi-gura 3.12).
Es importante resaltar que la tecnologia ópticas de MET y de microscopia de luz son sistemas que hasta este trabajo de investigación exigian prepara-ciones y montajes de muestras independientes y diferentes. A partir de esta innovación los dos sistemas ópticos se complementan, es decir, que la mis-ma muestra que se prepara para el MET también se puede inspeccionar en el microscopio de luz. Esta situación ahora nos permite realizar observaciones complementarias, independientes o de validación al emplear alternativamente los equipos.
3.8. De la fijación de la membrana.
CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.8. DE LA FIJACIÓN DE LA MEMBRANA.
La primera dificultad se corregió probando diferentes posibilidades de so-lución, colodión, alcohol polivinílico, polietileno y formvar, hasta conseguir el tipo de membrana apropiada como portamuestra. Es de notar que, se buscaba un material que pudiera sostener muestras de diferentes tamaños, pesos, con-sistencias, estados y la membrana desarrollada cumplió con estas exigencias. La membrana elegida fue la de formvar, (figura 3.13 en la página siguiente), una de las membranas empleadas en los procesos regulares de microscopía. Adicionalmente, se probó la consistencia y degradación de la membrana man-teniéndola inmersa en agua durante un período de tres meses. La membrana así probada mantuvo sus características inalteradas, confirmando su calidad. El problema de sostener y tensionar la membrana se podría haber solucio-nado con la adquisición de una rejilla única que soportara a la membrana en sus extremos pero, dado los costos y demora en ingresar al país, la hizo poco viable como solución. En vista de esto, se optó por diseñar rejillas de cobre con características similares a las comerciales y que fueran intercambiables en los dos tipos de microscopios. El resultado fue la elaboración de un varia-do número de clases de rejillas y su posterior montaje en grupos de 60 rejillas independientes en el mismo soporte portamuestras, ver (figura 3.17 en la pági-na 48), con lo que se podía realizar varias observaciones en forma consecutiva en el microscopio.
Se pueden sintetizar los resultados finales de este proceso así:
Se cuenta con una membrana portamuestras que posee una perfecta adeherencia a plásticos y metales condición ésta que permite su tensión sin deformarse; la posibilidad de elaborarla con mayor o menor espesor lo cual implica mayores posibilidades de trabajo con diferentes tipos de muestra; la alta cohesión molecular de esta membrana permite espesores
muy pequeños (±60nm) sin deformaciones o perforaciones, incluso
cuan-do es atacada por un haz de electrones.
3.8. DE LA FIJACIÓN DE LA MEMBRANA. CAPÍTULO 3. RESULTADOS
Figura 3.13: Membrana Polimérica (Formvar):
El aspecto rugoso de la membrana es eliminado con vapores de xilol de ser necesario. También por la tensión ejercida por el soporte o por entrar en contacto con la cara frontal del objetivo. Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.
Figura 3.14: Aplicación de la membrana con un espécimen biológico.
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