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Caracterización enzimática y molecular de cepas de Fusarium spp. aisladas de humanos, animales y plantas : aproximación al modelo multihospedero

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CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA Y MOLECULAR DE CEPAS DE

Fusarium

spp. AISLADAS DE HUMANOS, ANIMALES Y PLANTAS:

APROXIMACIÓN AL MODELO MULTIHOSPEDERO.

Angela María Alvarado Fernández

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar por el título de

MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL

DIRECTORA

María Ximena Rodríguez Ph.D.

CODIRECTORA

Balkys Esmeralda Quevedo M.Sc

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTADO DE CIENCIAS

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Bogotá, D.C.

(2)
[image:2.595.96.495.105.772.2]

TABLA DE CONTENIDO

1. RESUMEN ……… 1

2. INTRODUCCIÓN ………..1

3. JUSTIFICACIÓN – PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ……….. 2

4. MARCO TEÓRICO ………...2

5. OBJETIVOS ………. 4

5.1. Objetivo general ……….. 4

5.2. Objetivos específicos ………. 5

6. METODOLOGÍA ……….. 5

6.1. Recuperación de las cepas y establecimiento del banco de trabajo……….... 5

6.2. Caracterización enzimática ………5

6.2.1. Determinación indirecta de la actividad amilolítica, celulolítica y pectinolítica ………5

6.2.2. Determinación de la actividad proteolítica ………..6

6.3. Caracterización molecular ………...7

6.3.1. Extracción del ADN genómico de los aislamientos de Fusarium spp ……….7

6.3.2. Reacción RAPD – PCR ………..7

6.4. Análisis de resultados ……….8

6.4.1. Actividades enzimáticas ………. 8

6.4.2. Caracterización molecular ………..9

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ……….9

7.1. Caracterización enzimática ………..9

7.1.1. Determinación de la hidrólisis amilolítica ……….9

7.1.2. Determinación de la hidrólisis celulolítica ………11

7.1.3. Determinación de la hidrólisis pectinolítica ………..13

7.1.4. Determinación de la actividad proteolítica ………14

7.2. Caracterización molecular ……….16

7.3. Análisis comparativo de los resultados ………23

8. CONCLUSIONES ……….25

9. RECOMENDACIONES ………26

10. REFERENCIAS ……….27

(3)

RESUMEN

En las últimas décadas, el género Fusarium ha representado un gran impacto a nivel mundial ya que además de ser considerado como un agente fitopatógeno involucrando una amplia variedad de plantas, se comporta como un patógeno emergente, capaz de afectar tanto a humanos como animales, por lo que el estudio del mismo mediante diferentes técnicas se hace necesario para el entendimiento de su capacidad patogénica. El presente proyecto muestra una caracterización a nivel de perfiles enzimáticos asociados como factores de virulencia (producción de amilasas, celulasas, pectinasas y proteasas) en cepas aisladas de pacientes terminales con cáncer, así como una caracterización molecular mediante la técnica de RAPD – PCR para la evaluación de polimorfismos presentes en 40 cepas de Fusarium provenientes de diferentes orígenes de aislamiento. Los resultados obtenidos permitieron asociar las enzimas líticas evaluadas como un factor de virulencia importante en la patogenicidad del hongo, mientras que los RAPDs fueron indicativos de la alta variabilidad genética entre las especies evaluadas, encontrando que las agrupaciones obtenidas con el algoritmo UPGMA se formaron en función de las especies independientemente del origen de aislamiento; la determinación de estos dos perfiles permitieron llegar a una aproximación al modelo Fusarium multihospedero.

2. INTRODUCCIÓN

Actualmente los microorganismos están siendo ampliamente estudiados debido a las múltiples características que presentan y a la manera como se involucran en los campos relacionados con la salud, la agricultura y la industria. Dentro de este grupo, se encuentran los hongos, organismos eucariotas ampliamente distribuidos en la naturaleza y protagonistas importantes en las áreas anteriormente mencionadas.

Además de estar relacionados con procesos agroindustriales, algunos hongos poseen capacidades patogénicas que les permiten violar las defensas de hospederos específicos tales como plantas, humanos y animales, lo cual representa pérdidas económicas tanto a nivel agrícola, como en los campos relacionados con la salud, donde las tazas de mortalidad pueden llegar a ser hasta del 80%. Pero no siendo suficiente, algunos de ellos tienen la capacidad para afectar no solo a hospederos específicos, sino que también poseen las herramientas necesarias para hacer saltos entre reinos, actuando como patógenos emergentes.

Las especies pertenecientes al género Fusarium se presentan hoy en día como

patógenos emergentes. Aunque inicialmente se relacionaba al agente como el principal causal del marchitamiento vascular, los reportes señalan la capacidad de este hongo para causar enfermedades a animales y a humanos tanto inmunocompetentes como inmunocomprometidos, por lo que se hace necesario realizar una caracterización de dichas especies.

El presente proyecto se muestra como una aproximación al modelo Fusarium

(4)

resultados obtenidos se pretende mostrar como se relacionan los diferentes grupos estudiados, teniendo en cuenta las especies trabajadas y los orígenes de aislamiento de las mismas, llegando así a la aproximación al modelo multihospedero.

3. JUSTIFICACIÓN-PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Los patógenos emergentes son definidos como agentes causantes de enfermedades infecciosas cuya incidencia aumenta debido a la capacidad que tienen para aparecer en nuevos hospederos, o para incrementar su ocurrencia en un hospedero específico (1).

Fusarium spp. se presenta como un hongo fitopatógeno causante del marchitamiento

vascular en plantas, que tienen gran importancia económica (2). A pesar de ser un hongo comúnmente encontrado en el suelo, estudios recientes han reportado que el microorganismo se encuentra involucrado en el desarrollo infecciones sistémicas y cutáneas, causando un porcentaje significativo en los casos de onicomicosis (3).

La capacidad de este patógeno para hacer saltos entre reinos se debe a factores de virulencia como las enzimas líticas (celulasas, pectinasas, amilasas y xilanasas, entre otras), que permiten la penetración y colonización del hospedero mediante la degradación de las barreras y los constituyentes celulares de los mismos en el caso de las plantas (4), así como proteasas y enzimas queratínolíticas, que junto con toxinas,

alteran el funcionamiento normal de las células de humanos y animales. Estas últimas también se encuentran implicadas como factor de virulencia en plantas disminuyendo la calidad y el rendimiento de las mismas (5).

Las herramientas de identificación comúnmente utilizadas para la detección de los agentes etiológicos son los postulados de Koch, las pruebas bioquímicas que permiten caracterizar la batería enzimática de los microorganismos y finalmente las pruebas moleculares que permiten caracterizar genéticamente los aislamientos de estos patógenos (6). Las herramientas de biología molecular empleadas comúnmente son PCR, RFLPs (7)y RAPDs, siendo esta última una técnica rápida, de fácil ejecución y que solo requiere pequeñas cantidades del ADN a analizar (8).

Dada la importancia de Fusarium como patógeno emergente en humanos y animales, se hace necesario realizar una correcta caracterización del agente etiológico teniendo en cuenta sus perfiles enzimáticos y moleculares, de tal manera que se pueda informar y sensibilizar a la población, compartiendo los resultados obtenidos e impulsando la realización futuros estudios en el tema, de tal manera que se llegue a una aproximación al modelo multihospedero y al entendimiento de los patógenos emergentes.

4. MARCO TEÓRICO

(5)

así a plantas, humanos y animales causando grandes pérdidas económicas en producción agrícola y un impacto negativo en el campo de la salud humana y animal.

Teniendo en cuenta esto, se ha reportado que especies comúnmente encontradas en el suelo tienen la capacidad de colonizar diferentes hospederos; tal es el caso de

Aspergillus, Chaetomium, Chrysosporium, Scopulariopsis y Fusarium, a los cuales se

les ha atribuido una actividad queratinolítica asociada a dermatofitosis (10). Adicionalmente, estos microorganismos son oportunistas, por lo que causan infecciones diseminadas por vía sistémica en pacientes que tienen un inmunocompromiso severo (11).

A nivel agrícola, se considera a Fusarium como un hongo cosmopolita habitante normal del suelo, por lo que está asociado principalmente a plantas como agente causal del marchitamiento vascular (12), razón por la cual, junto con la diversidad de formas especiales que presenta el organismo, se le atribuyen grandes pérdidas económicas, teniendo así la capacidad de afectar cultivos de algodón, tomate, tabaco, melón, garbanzo, plátano, caña de azúcar y café, entre otros (13). Pero su importancia no se limita a este campo, ya que se ha reportado al hongo como un agente involucrado en el desarrollo enfermedades en pacientes tanto inmunocompetentes como inmunocomprometidos, tales como queratitis y onicomicosis e infecciones diseminadas por vía sistémica y neumonía (14). Adicionalmente el hongo produce toxinas que tienen efectos citotóxicos y neurotóxicos, tanto para humanos como para animales (15), y presenta enzimas líticas, a las cuales se les atribuye su capacidad para violar las defensas de hospederos tanto animales como vegetales (16; 17).

El ciclo infectivo del patógeno en las plantas comienza por el reconocimiento de señales provenientes de las raíces de las mismas, dando paso a la adherencia del hongo seguido por la diferenciación de las hifas de penetración, la invasión y la degradación de las barreras físicas. Posteriormente el hongo realiza una adaptación al nuevo entorno logrando violar las defensas de las plantas y la protección ante compuestos antifúngicos presentes en los cultivos, lo cual permite que este colonice el sistema vascular, transportándose por el xilema y secretando factores de virulencia que se verán reflejados en la aparición de síntomas como el marchitamiento vascular, la epinastia, el amarillamiento y la marchitez progresiva de hojas y tallo (13).

Dentro de los factores de virulencia implicados en la capacidad fitopatógena de

Fusarium se han considerado las enzimas líticas como amilasas, pectinasas, celulasas

y xilanasas, entre otras, las cuales permiten la depolimerización de los componentes vegetales dando paso al crecimiento del patógeno a partir de los monómeros liberados, y por tanto a la violación de las barreras físicas de las plantas (17). Adicionalmente, se han considerado algunas toxinas como los tricotecenos, que potencian la capacidad infectiva del hongo, llegando a inhibir la síntesis de proteínas e induciendo una pérdida de los pigmentos de los cloroplastos a concentraciones casi letales para las plantas (18).

En cuanto a la patogénesis en humanos, las infecciones causadas por el género

Fusarium pueden ser de dos tipos: localizadas o sistémicas. En el caso de las

(6)

Finalmente, otro de los aspectos a tener en cuenta y que ha atribuido a Fusarium parte de su capacidad patogénica es la secreción de toxinas como las fumonicinas, los tricotecenos y las zearalelonas, las cuales pueden tener efectos neurotóxicos y citotóxicos para la persona o el animal que los ingiere (15) y las monilimorfinas (por F.

moniliforme principalmente) que pueden causar problemas musculares, mialgias y por

tanto enfermedades cardiacas (21).

Referente a la caracterización del agente patogénico, esta se hace comúnmente por determinación de características morfológicas, bioquímicas (22) y los rangos de hospederos a los que afectan (23). Sin embargo, hay muchos patógenos de difícil identificación y caracterización por los métodos anteriormente mencionados, por lo que se han hecho necesarios estudios con marcadores moleculares como RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism), PFGE (pulsed field electrophoresis gel), ITS, factor de elongación y RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) (24; 25; 26).

Los RAPDs constituyen una técnica de análisis del ADN, la cual emplea oligonucleótidos de aproximadamente 10 pares de bases, que se unen de manera aleatoria al DNA genómico para amplificar fragmentos cortos mediante PCR (27). Estos tienen utilidad como marcadores moleculares para el mapeo genético, el estudio de genética de poblaciones y el análisis de polimorfismos lo que permiten la identificación de aislamientos que presenten fragmentos de DNA cromosómico específicos (28) y adicionalmente no requieren un conocimiento previo del genoma, por lo que constituyen una herramienta de fácil ejecución cuando se contemplan los factores que pueden afectar el desarrollo de la técnica, tales como las condiciones de la reacción, la longitud de los cebadores empleados, la concentración de ADN y otros factores básicos de las PCRs convencionales (29).

A pesar de que se conoce la importancia de Fusarium como patógeno emergente, son pocos los reportes en los que se evalúan los factores de virulencia del microorganismo como herramienta asociada a la capacidad multihospedera del mismo. Adicionalmente, las herramientas de biología molecular se han empleado para la identificación del agente etiológico como tal, pero no han sido relacionadas como técnicas para la caracterización de patógenos de tal manera que se puedan hacer aproximaciones a modelos multihospedero. En España se han realizado estudios de infección cruzada con el patógeno pero solo se realizó inoculando un aislamiento proveniente de plantas de tomate en un ratón (2) y en Argentina existe un reporte de un paciente con un caso de hialohifomicosis ocasionada por un traumatismo con una hoja de hierba infectada con el hongo (30). Para el caso de Colombia, no existen reportes de Fusarium como modelo multihospedero, aunque se han realizado estudios de identificación de especies de Fusarium aisladas de pacientes con onicomicosis, donde se reporta F. oxysporum f. sp. dianthi, determinado por pruebas moleculares (3).

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo general

(7)

5.2. Objetivos específicos

5.1.1 Determinar la producción de amilasas, celulasas, pectinasas y proteasas de 10 aislamientos de Fusarium spp. provenientes de pacientes terminales con cáncer mediante pruebas enzimáticas cuantitativas.

5.1.2. Realizar la caracterización molecular de 40 aislamientos de Fusarium spp., provenientes de diferentes tipos de hospederos mediante RAPD-PCR.

5.1.3. Realizar un análisis comparativo a partir de los perfiles enzimáticos y moleculares obtenidos que permitan llegar a la aproximación al modelo multihospedero.

6. METODOLOGÍA

6.1. Recuperación de las cepas y establecimiento del banco de trabajo

Las cepas trabajadas fueron recuperadas en medio PDA suplementado con cloranfenicol a partir de un banco de conservación en agua de cultivos monospóricos. Con estas siembras se realizó un nuevo banco de trabajo aplicando la técnica de discos de agar en agua destilada estéril (31). La información de las cepas, las cuales fueron identificadas previamente por sus características morfológicas y por secuenciación del factor de elongación 1 α (31) se presenta en el anexo 1.

6.2. Caracterización enzimática

6.2.1. Determinación indirecta de la actividad amilolítica, celulolítica y pectinolítica

Las caracterizaciones enzimáticas se realizaron con las 10 cepas provenientes de pacientes terminales con cáncer. Para la determinación de las actividades amilolítica, celulolítica y pectinolítica los aislamientos fueron reconstituidos en medio PDA suplementado con cloranfenicol. Posteriormente se realizó un pase a agar almidón, celulosa y pectina con en fin de inducir cada una de las actividades enzimáticas (anexo 2). A partir de estas siembras se inocularon los caldos almidón, celulosa y pectina respectivamente, con tres discos de agar-hongo por triplicado, incubando en agitación constante (150rpm) a 30°C durante 48 horas (shaker Ifalpac Ltda).

Teniendo en cuenta que los polímeros como la celulosa, pectina y almidón se hidrolizan gracias a la presencia de enzimas formando glucosa, ácido galacturónico y glucosa respectivamente, se miden estos azúcares como una medida indirecta de la actividad enzimática.

(8)

Las curvas de calibración se realizaron con soluciones de 0,5 a 2g/L de glucosa en el caso de las actividades amilolíticas y celulolíticas; para la actividad pectinolítica esta se realizó con soluciones de 0,5 a 2g/L de ácido galacturónico.

Los resultados fueron expresados como concentración en g/L de glucosa o ácido galacturónico liberados a las 48 horas. Adicionalmente se determinó el rendimiento neto de glucosa (%RNG) o ácido galacturónico (%RNAG) aplicando las ecuaciones 1, 2 y 3.

6.2.2. Determinación de la actividad proteolítica

Para la determinación de la actividad proteolítica se reconstituyeron los aislamientos en medio PDA suplementado con cloranfenicol a partir del cual se hizo un pase a agar leche descremada. Posteriormente se tomaron tres discos de agar con el hongo para inocular en caldo leche descremada por triplicado, incubando en agitación constante (150rpm) a 30°C durante 48 horas (shaker Ifalpac Ltda). Pasado el periodo de incubación se recuperó el extracto crudo por centrifugación (dos veces a 5000rpm durante 15 minutos) para realizar la prueba de actividad proteolítica. Para ello se tomó 1mL del extracto crudo enzimático y se mezcló con 1mL de solución de caseína (1% (p/v) en buffer fosfato 0,1M pH 7,0). La mezcla se incubó a 30°C por 60 minutos y se frenó la reacción con la adición de 1mL de ácido tricloroacético al 15%(p/v) y se centrifugó nuevamente a 5000 rpm durante 10 minutos (centrífuga Becton Dickinson (Dylanc III)).

Además de las cepas evaluadas se tuvo un control abiótico, sometido a las mismas condiciones de cultivo con el fin de evaluar la hidrólisis espontánea de la fuente de carbono, y un control positivo correspondiente al hongo Trichophyton mentagrophytes.

Previo a la lectura de los resultados se elaboraron dos blancos: un blanco muestra que contenía 1ml de la solución de caseína más 1ml de buffer fosfato 0,1M (pH 7,0) para verificar la interferencia del sustrato, y un blanco sustrato con 1ml de muestra y 1 ml de buffer fosfato 0,1M (pH 7,0) para verificar la presencia de otros compuestos en la muestra que pudieran tener interferencia con la lectura; estos blancos tuvieron el mismo tratamiento de las muestras, incluyendo la incubación y la precipitación con ácido tricloroacético.

Finalmente se leyeron las muestras a una absorbancia de 280nm, empleando el blanco muestra, y se leyeron los respectivos blancos sustrato empleando como blanco

Concentración glucosa x 176 x100

%RNAG =

Concentración pectina x 194

Concentración glucosa x 162 x100

%RNG =

Concentración celulosa x 180

%RNG =

Concentración almidón x 180

Concentración glucosa x 162 x100

Ecuación 1

Ecuación 2

(9)

buffer fosfato 0,1M (pH 7,0). Los resultados fueron expresados como unidades proteolíticas (UP), donde una UP se definió como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 µmol de tirosina por minuto a las condiciones de prueba.

La curva de calibración se realizó empleando soluciones de 0,1 a 1,3 µmol/mL de tirosina en buffer fosfato a una concentración de 0,1M pH 7,0.

6.3. Caracterización molecular

6.3.1. Extracción del ADN genómico de los aislamientos de Fusarium spp.

A partir del banco de trabajo previamente elaborado, se realizó una reconstitución de los aislamientos en medio PDA suplementado con cloramfenicol y se incubó a 25°C durante 8 días. Una vez crecido, se tomó el micelio del medio PDA para inocular en caldo extracto de malta y se dejó en agitación constante durante 8 días a 120 rpm; posteriormente se realizó una filtración al vacío en papel filtro, se colocó la biomasa obtenida en frascos para liofilización y se congeló durante un día a -20°C. Luego se realizó la liofilización durante 24 horas o hasta que el micelio se encontrara completamente seco, y se maceró hasta convertirlo en un polvo muy fino (liofilizador Labconco).

Para la extracción del ADN se transfirieron 100mg del polvo a un tubo eppendorf, al cual se le agregaron 1000µL de buffer de lisis (2% CTAB, 3% SDS, 250mM NaCl, 200mM Tris-HCl pH 8.5, 25mM EDTA pH 8.0). La mezcla fue homogenizada por inversión y por vortex. Posteriormente se agregaron 80µL de β – mercaptoetanol, se homogenizó por vortex y se llevó a incubación en baño termostatado a 65°C durante 2 horas, homogenizando suavemente por inversión cada diez minutos. Cumplido este tiempo, las muestras se centrifugaron a 13000 rpm durante 5 minutos y se dividió el sobrenadante obtenido en dos tubos eppendorf nuevos. Seguido a esto se agregó un volumen de fenol cloroformo isoamil alcohol (25:24:1) mezclando por inversión y vortex y se centrifugó nuevamente bajo las mismas condiciones, tomando el sobrenadante de los dos tubos eppendorf y colocándolos en un tubo nuevo, al cual se le agregó un volumen de cloroformo isoamil alcohol (24:1) y se centrifugó nuevamente. 

El sobrenadante fue recuperado y se le adicionó un volumen de isopropanol frío (-20°C), se mezcló suavemente por inversión hasta ver la aparición de una mota blanca y se dejó a -20°C toda la noche. Luego de este tiempo se centrifugó a 13000rpm durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante y se lavó el pellet con 200µL de etanol al 70% frío, se mezcló y se centrifugó a 13000rpm durante 5 minutos; nuevamente se descartó el sobrenadante y se agregaron 100µl de buffer TE (0.1mM Tris- HCl, 10mM EDTA); posterior a esto realizó un tratamiento con RNAsas agregando 2µL de la enzima (1µg/mL), con posterior incubación a 37°C en baño serológico por 2 horas para optimizar la actividad de la misma. Finalmente almacenó el ADN a -20°C.

6.3.2. Reacción RAPD – PCR

(10)

De acuerdo a los resultados obtenidos y a lo reportado en literatura se seleccionaron los cebadores mostrados en la tabla 1, y con estos se realizó la caracterización de los 40 aislamientos de Fusarium spp.: 10 provenientesde lesiones dérmicas de humanos, 10 aislados de vías sistémicas de pacientes terminales con cáncer, 10 de lesiones cutáneas en animales y 10 provenientes de plantas (anexo 1).

Para la reacción se emplearon 100 ng de ADN genómico en un volumen de reacción de 25µl, que contenía buffer 1X, MgCl2 2mM, 0,2mM de mix de dNTPs, 0,4mM del

primer evaluado y 0,5 unidades de Taq polimerasa. El ciclo de amplificación consistió en una denaturación incial a 94°C durante 3 minutos, seguida de 45 ciclos de 94°C 1 minuto, 36°C 1 minuto, 72°C 2 minutos, y una extensión final de 10 minutos a 72°C (33).

[image:10.595.187.408.332.458.2]

La separación de las bandas para cada producto de PCR se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (p/v) en buffer TAE 1X, y fueron reveladas posteriormente con bromuro de etidio (0,5µg/ml).

Tabla 1:Cebadores seleccionados par la caracterización molecular de los 40 aislamientos de Fusarium spp.

Primer Secuencia

OPA 2 TGCCGAGCTG

OPA 3 AGTCAGCCAC

OPA 4 AATCGGGCTG

OPA 9 GGGTAACGCC

OPA 11 CAATCGCCGT

OPA 13 CAGCACCCAC

OPA 14 TCTGTGCTGG

OPA 15 TTCCGAACCC

Fuente: Eurofins MWG operon. Acceso en: http://www.operon.com/default.aspx

6.4. Análisis de resultados

6.4.1. Actividades enzimáticas

Los resultados de actividad enzimática se analizaron por comparación de medias ANOVA, con un valor de significancia del 95%, incluyendo los datos de actividad enzimática de los aislamientos de origen animal, humano y vegetal reportados por Valencia, 2009 (4), y aplicando un análisis de varianza con la prueba de Duncan, empleando el programa SPSS versión 11.0. Adicionalmente se determinaron umbrales de valores de actividad enzimática para construir una matriz binaria, valor 1 para actividad enzimática positiva y valor 0 para actividad enzimática negativa. Dicha matriz se empleó en el programa NTSYS versión 2,0 para construir un dendrograma, usando el algoritmo UPGMA.

(11)

6.4.2. Caracterización molecular

Los resultados de caracterización molecular por RAPD-PCR fueron analizados para construir dendrogramas basados en índices de similitud. Para esto se construyeron matrices de presencia (1) y ausencia (0) de bandas que representaban polimorfismos con los 8 cebadores seleccionados, y se realizó el análisis con el programa NTSYS versión 2,0 empleando el algoritmo UPGMA.

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7.1. Caracterización enzimática

7.1.1. Determinación de la hidrólisis amilolítica

La caracterización enzimática cuantitativa para la actividad amilolítica se realizó de manera indirecta aplicando la técnica de DNS para evidenciar presencia de azúcares reductores en el caldo de cultivo, producto de la hidrólisis del almidón. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 1.

Cepas

401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 C. +

Co

ncentración azúcares r

eductores g/L

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

%

RNG

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

[image:11.595.129.470.350.624.2]

Figura 1: Determinación de la hidrólisis amilolítica. C.+: control positivo: Trichoderma harzianum

Estos resultados muestran una baja actividad amilolítica por parte de las cepas evaluadas respecto al control positivo, lo cual se evidencia en la baja concentración de azúcares reductores y por tanto, el bajo porcentaje de RNG, siendo las cepas 405 y 406 las más activas en el proceso de degradación del almidón, con una liberación de azúcares de 0,398 y 0,408 g/L respectivamente, concentraciones correspondientes al

(12)

3,5 y 3,6% de degradación del sustrato inicial, y las cepas 407 y 404 las cepas menos amilolíticas, ya que el porcentaje de degradación fue del 0,04 y el 0% para cada caso.

Adicionalmente, se realizó un análisis de varianza ANOVA incluyendo los aislamientos trabajados por Valencia 2009 (4), encontrando diferencias estadísticamente significativas entre las cepas (P=0,000), por lo que se aplicó la prueba de Duncan, con la que se obtuvieron 15 agrupaciones diferentes, siendo así los aislamientos provenientes de humanos (vía sistémica) los menos activos enzimáticamente, y los aislamientos provenientes de humanos (lesiones cutáneas) y de plantas los de mayor actividad amilolítica (anexo 4.1).

El almidón es un polímero de glucosa conformado por dos unidades básicas (amilosa y amilopectina), que constituye el principal polímero de reserva en las plantas jugando un papel esencial para el desarrollo de las mismas (34). Al ser un compuesto que se encuentra en las plantas, es una fuente nutricional para el crecimiento de microorganismos fitopatógenos que sean capaces de alimentarse del mismo.

Para el caso de las cepas de Fusarium spp. evaluadas, aunque solamente se buscaba presencia o no de la actividad enzimática, se esperaba obtener valores de hidrólisis del compuesto mayores a los obtenidos, debido a que el hongo se presenta como un agente fitopatógeno habitante común del suelo (12), sin embargo, se asume que las condiciones de cultivo no fueron las adecuadas para la producción de las amilasas.

A pesar de que se realizó una inducción previa de las enzimas con los componentes del medio de cultivo y el inóculo empleado, se ha confirmado que la producción de amilasas está altamente influenciada por la presencia de fuentes orgánicas de nitrógeno, tales como el extracto de levadura, el extracto de carne y las peptonas, así como la combinación de las mismas con fuentes inorgánicas como el sulfato de amonio (35). Adicionalmente, la concentración de fosfatos sugerida para la inducción de las enzimas amilolíticas es de 0,2M (35). En ese orden de ideas, el medio de cultivo empleado para el presente trabajo no fue del todo apropiado, ya que no poseía una fuente de nitrógeno orgánica, y adicionalmente las concentraciones de fosfato monobásico y dibásico empleadas fueron inferiores a las anteriormente mencionadas (0,7 y 0,5 mM, respectivamente).

Por otra parte es importante resaltar que el pH y la temperatura son factores que afectan directamente la producción de las enzimas; para el caso específico de F.

solani, se ha demostrado que las glucoamilasas son activas a pH alrededor de 4 a 6,

con un óptimo de producción a pH 5 (36; 37). Al no haber realizado un seguimiento al pH durante el tiempo de cultivo (48 horas), se podría decir que este fue un factor determinante para la baja producción de amilasas, ya que los cambios en el pH pueden afectar la ionización de los residuos de aminoácidos presentes en las enzimas y que son claves para el clivaje y la degradación del sustrato, y el pH final de las muestras trabajadas osciló entre 2,8 y 3, lo cual sería concordante con lo anteriormente dicho (36). Respecto a la temperatura, se han reportado cepas de F.

solani capaces de producir glucoamilasas en rangos de 25 a 45°C (37), sin embargo,

la temperatura óptima de las amilasas está relacionada con la temperatura de crecimiento del microorganismo (35), por lo que en este caso no sería un factor determinante en la falta de producción enzimática, ya que el hongo fue incubado siempre bajo las mismas condiciones (30°C).

(13)

concentraciones máximas de 1,4 g/L para las cepas provenientes de animales, 3,0 g/L para las cepas provenientes de humanos y 1,8 g/L para las cepas provenientes de plantas, todas tratadas bajo las mismas condiciones de prueba (4). Sin embargo, el hecho de que exista actividad en las cepas provenientes de los tres orígenes de aislamiento, incluyendo los provenientes de vía sistémica, podría ser un primer acercamiento al modelo Fusarium multihospedero, ya que indicaría que cepas que no son provenientes de plantas podrían degradar los polímeros de reserva de las mismas, recordando que muy posiblemente en un proceso infectivo el patógeno podría encontrar una mayor adaptación al entorno y por tanto una mejor expresión de las enzimas, que como se comprobó con el estudio de Valencia 2009 y el presente, las especies de Fusarium poseen.

Además de esto, los resultados obtenidos por Valencia 2009 (4), concuerdan con en análisis estadístico reportado en el presente estudio, y aunque no era de esperarse que los aislamientos de origen humano (lesiones cutáneas) fueran los más amilolíticos, estos resultados representan una interesante teoría acerca de la forma de adquisición del patógeno y de la posibilidad del mismo para tener enzimas que le permitan aumentar su agresividad como patógeno de plantas. Finalmente, en el anexo 4.1 se puede observar también como la agrupación de los aislamientos se dio en función de las especies, independientemente del origen de aislamiento, lo que nuevamente sería indicativo de la capacidad del hongo para hacer saltos entre reinos.

7.1.2. Determinación de la hidrólisis celulolítica

Cepas

401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 C. +

[image:13.595.140.454.406.636.2]

C onc ent ra ci ón az ú c ar es r educ to re s g/ L 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 % RNG 0 2 4 6 8

Figura 2: determinación de la hidrólisis celulolítica. C. +: control positivo: Trichoderma harzianum.

La figura 2 muestra los resultados obtenidos para la cuantificación de azúcares reductores presentes en el caldo celulosa luego del periodo de incubación, así como el %RNG correspondiente a la degradación del sustrato inicial. Como se puede observar, las cepas estudiadas superaron la concentración de azúcares reductores liberados por el control positivo (0,408 g/L), siendo nuevamente las cepas 405 y 406 las más activas

(14)

en el proceso de degradación del sustrato, con concentraciones de azúcares reductores de 0,598 y 0,658 g/L, correspondientes al 6,65 y 7,31% de RNG respectivamente. Las cepas que presentaron menor actividad fueron la 401 y la 408,

con un RNG de 5,40 y 5,39%, valores mayores al presentado por T. harzianum

(4,53%).

El análisis de varianza ANOVA mostró nuevamente diferencias estadísticamente significativas entre las 40 cepas analizadas (P= 0,000), y la prueba de Duncan mostró que en el grupo con mayor actividad hidrolítica se encontraban las cepas de origen sistémico, mientras que el grupo donde la libración de azúcares reductores fue menor se conformó por las cepas aisladas de animales y plantas (anexo 4,2), lo que platea un primer interrogante para la consideración de Fusarium como patógeno multihospedero.

Las enzimas celulolíticas producidas por hongos como Fusarium juegan un papel muy importante en el proceso infectivo de plantas, ya que permite la penetración e invasión de las mismas mediante la degradación de las barreras celulares (38).

Para el caso de cepas de Fusarium oxysporum se han realizado diversos estudios en los que se comprueba la capacidad del microorganismo para producir enzimas celulolíticas a partir de sustratos vegetales, tales como maíz y trigo (39; 40), por lo cual la degradación de la carboximetil celulosa (fuente de carbono trabajada en el proyecto) era de esperarse, y aunque nuevamente las condiciones de cultivo mencionadas con la producción de amilasas son indispensables para la inducción de las celulasas, para el caso particular de estas enzimas no se considera que dichas condiciones hayan afectado de manera negativa el cultivo, ya que se vio liberación de azúcares reductores, lo cual es indicativo de la presencia de las mismas.

Lo que no era de esperarse es que fueran precisamente las cepas de origen sistémico y no aquellas aisladas de plantas, las que presentaran la mayor actividad, lo cual pudo deberse a diferentes factores. En primer lugar se debe considerar que las cepas de origen sistémico corresponden en su gran mayoría a la especie Fusarium oxysporum,

la cual ha sido relacionada con enfermedades en plantas principalmente (41), por lo que se podría suponer que antes de llegar a su hospedero final, el hongo pudo haber estado en una planta o como habitante normal del suelo, y aunque las cepas aisladas de plantas pertenecen a la misma especie, estas pueden haber perdido su actividad enzimática durante el tiempo de conservación.

En segundo lugar, en el estudio de Valencia, 2009 (4), las cuantificaciones de azúcares reductores no solamente se hicieron a los 2 días de cultivo, sino que fueron evaluados también a los 4 días, cuantificación que dejó una mayor concentración de azúcares reductores, con un máximo de RNG de 6,14% para las cepas provenientes de animales, 6,0% para las cepas provenientes de humanos y 5,98% para las cepas provenientes de plantas, por lo que se podría asumir que el metabolismo de dichas cepas es más lento que las cepas evaluadas en el presente proyecto.

(15)

actividad celulolítica, son capaces de degradar el sustrato y posiblemente serían capaces de causar enfermedades en plantas susceptibles a los mismos.

7.1.3. Determinación de la hidrólisis pectinolítica

Para la actividad pectinolítica los aislamientos evaluados mostraron valores inferiores respecto al control positivo empleado. Las cepas que presentaron mayor actividad enzimática fueron la 401 (2,16 g/L y 19,6 % RNAG) y la 410 (1,55 g/L y 14,1% RNAG), mientras que la cepa 407 no presentó actividad. Los resultados se muestran en la figura 3.

Por su parte, el análisis de varianza de Duncan mostró que los aislamientos menos activos estaban distribuidos entre los tres orígenes de aislamiento, primando aquellos de procedencia humana (lesiones cutáneas), y los grupos de los aislamientos con mayor actividad enzimática estuvieron conformados igualmente por cepas de los tres orígenes (nivel de significancia del 95%); para los dos casos la especie sobresaliente

fue Fusarium oxysporum (anexo 4.3).

Cepas

401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 C. +

[image:15.595.115.485.324.623.2]

Co nc en tr a c ió n az úc ar e s r e du ctor e s g /L 0 1 2 3 4 5 6 %RNAG 0 10 20 30 40 50 60

Figura 3: determinación de la hidrólisis pectinolítica. C.+: control positivo: Cholletotrichum lindemuthianum

La producción de enzimas pectinolíticas es un factor de virulencia muy importante para patógenos fúngicos como las especies de Fusarium ya que no solamente permiten la penetración del tejido vegetal, sino que también están involucradas en la degradación de los componentes celulares y la colonización del hospedero (43).

(16)

Al ser considerado como un patógeno de plantas, los estudios reportados sobre

diversas especies de Fusarium permiten confirmar la presencia de enzimas

pectinolíticas asociadas a la patogenicidad del agente; por ejemplo, Wanjiru W. y colaboradores presentaron en el 2002 un estudio con F. graminearum para ver la degradación de componentes celulares presentes en espigas de trigo, tales como la pectina, el xilano y la celulosa, encontrando que efectivamente los sustratos eran depolimerizados y que esto facilitaba la colonización del hospedero (44). Niture y Pant en el 2007 reportaron la producción de enzimas degradadoras de pared de Fusarium

moniliforme, realizando un estudio de patogenicidad del hongo sobre plantas de

tomate y coliflor (45). Para el caso específico de F. oxysporum se ha reportado la presencia de la endopoligaracturonasa, enzima encargada de romper el enlace glucosídico entre las unidades de ácido galacturónico demetilado, demostrando la importancia de la enzima durante el proceso infectivo del tomate (46). Teniendo en cuenta lo anterior, los resultados obtenidos fueron los esperados para el 50% de las cepas de vía sistémica, las cuales corresponden en su mayoría a la especie de F.

oxysporum (cepas 401, 408 y 410).

Cuando se hace el análisis de los 40 aislamientos y se determina que las cepas provenientes de humanos (lesiones cutáneas) fueron las menos activas para la producción de pectinasas y que no todas las cepas de origen sistémico presentaron actividad, se podría decir que en este caso el origen de aislamiento puede influenciar la producción de las enzimas, haciendo que estas sean de lenta expresión in vitro ya que en los humanos de donde fueron aisladas inicialmente, no hay pectina y por tanto no hay inducción de dichas enzimas como factor de virulencia, sin embargo, si esta relación entre producción de enzimas – origen de aislamiento fuera obligatoria, para el caso de las cepas aisladas de plantas se esperaría obtener valores altos de actividad enzimática, sin embargo se presentaron cepas provenientes de dicho origen que no tuvieron actividad.

Las enzimas pectinolíticas pueden ser clasificadas en dos grupos: las esterasas, que liberan el grupo metilo presente en la molécula, y las enzimas de depolimerización, que actúan sobre los enlaces α – (1,4) de la siguiente manera: la endopectin liasa corta al interior de la molécula entre monómeros metilados, contrario a la endopoligalacturonasa (endoPG) que a pesar de que actúa también al interior de la molécula, esta solamente lo hace cuando el ácido galacturónico está demetilado, y finalmente la exopoligalacturonasa (exoPG) actúa bajo las mismas condiciones que la endoPG pero cortando por el extremo del polisacárido (47). Si se asocian las características de estas enzimas a lo ocurrido con las cepas que no presentaron actividad, se podría suponer la falta de enzimas como la pectin esterasa, que demetilaran el sustrato inicial para permitir la posterior acción de las otras enzimas, lo cual explicaría la falta de azúcares reductores. De ser cierta esta hipótesis, no se podría descartar el potencial pectinolítico de las cepas, ya que no se estaría realizando una caracterización a profundidad de las enzimas expresadas por los hongos bajo un sustrato consistente en pectina metilada (como el empleado en el presente estudio) y otro en pectina demetilada.

7.1.4. Determinación de la actividad proteolítica

(17)

fueron expresados como UP, como se muestra en la figura 4, siendo la cepa 404 la más activa (11,03 UP) y la cepa 409 la menos proteolítica (3,79 UP).

Cepas

401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 C. +

C

oncnt

ración tirosina liberada

µ

M

ol/

m

l

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

UP

[image:17.595.141.454.119.368.2]

0 2 4 6 8 10 12

Figura 4: determinación directa de la actividad proteolítica. C.+: control positivo: Trichophyton mentagrophytes

El análisis de varianza ANOVA mostró diferencias estadísticamente significativas entre las 40 especies evaluadas a un nivel de significancia del 95% (P=0,000), por lo que nuevamente se realizó la prueba de Duncan, la cual agrupó dentro de los aislamientos menos proteolíticos a la totalidad de las cepas de origen sistémico y el 90% de las cepas provenientes de plantas mientras que en el grupo con mayor actividad enzimática se ubicaron los aislamientos provenientes de humanos y animales (anexo 4.4).

Uno de los principales factores de virulencia más estudiados para las especies de

Fusarium es la producción de enzimas líticas que le permiten establecerse en un

hospedero, violar sus defensas y aprovechar los componentes celulares del mismo como fuentes alimenticias. Las proteasas han sido asociadas como un factor de virulencia tanto para plantas como para animales y humanos. En el caso de las plantas se ha dicho que el patógeno las expresa constitutivamente, participando en la degradación de proteínas secretadas por las plantas como mecanismos de defensa (17), mientras que en humanos y animales permiten la colonización de tejidos, lo cual ocasiona lesiones cutáneas en los dos tipos de hospedero (14; 17), por lo tanto, los resultados obtenidos en el presente estudio fueron los esperados.

Es claro que al haber trabajado con aislamientos sistémicos se esperaba obtener valores significativos de actividad proteolítica, ya que estos fueron capaces de desarrollarse en un sustrato complejo como es la sangre, en la que no solamente se encuentran proteínas provenientes de la nutrición del individuo, sino que también se encuentra la hemoglobina, una proteína compleja en su estructura y de gran estabilidad. Adicionalmente, los cultivos en agar leche descremada presentaron un

(18)

crecimiento rápido con halos de hidrólisis evidentes al día 2 de cultivo, lo cual fue un primer indicativo de la actividad proteolítica (figura 5).

Figura 5: Cepa 405 (F. oxysporum) en agar leche descremada. a.) día 3 de cultivo; b: día 4 de cultivo

Una vez comparados los datos del presente estudio con los reportados por Valencia 2009, se pudo encontrar que a pesar de que la actividad proteolítica de los aislamientos de vía sistémica fueron mayores en relación al control positivo empleado, se hizo evidente que las mejores actividades las presentaban las cepas de lesiones superficiales en humanos y animales con un máximo de de 27,5 y 26,12 UP respectivamente, lo cual concuerda con lo anteriormente dicho (4).

Los tejidos queratinizados tales como la piel, las uñas y el pelo se presentan como un blanco para las cepas de Fusarium, independientemente del estado inmunológico del hospedero; sin embargo, la patogenicidad de los mismos no depende enteramente de dichas enzimas, ya que los hongos quertatinofílicos producen complejos de enzimas proteolíticas involucradas en la hidrólisis de proteínas solubles como la caseína, la albúmina y la gelatina, e insolubles como la queratina, el colágeno y la fibronectina (48), lo cual permite afirmar que Fusarium se comporta como un patógeno emergente, capaz de expresar factores de virulencia que le permiten colonizar los tres tipos de hospederos.

Finalmente es importante recordar que las enfermedades causadas por el género

Fusarium pueden ser de 2 tipos: localizadas y sistémicas, estando estas últimas

íntimamente relacionadas con el estado de inmunocompromiso del paciente que adquiere al agente, siendo los pacientes con cáncer y aquellos expuestos a transfusiones sanguíneas, los más propensos a adquirir el patógeno, que puede llegar a causar enfermedades como neumonía y enfermedades diseminadas (49; 14), lo cual indica la agresividad de este patógeno de plantas y humanos.

7.2. Caracterización molecular

La caracterización molecular de los 40 aislamientos de Fusarium spp. se realizó mediante la técnica RAPD-PCR. Como se mencionó anteriormente en la metodología, se evaluaron 19 cebadores Operon tipo A con las cepas F. oxysporum (160, 208, 310), F. equiseti (111), F. verticillioides (156) y F. nelsonii (159), y teniendo en cuenta los polimorfismos mostrados y la reproducibilidad de los resultados se seleccionaron los 8 cebadores referenciados en la tabla 1. Una vez obtenidos los resultados, se realizaron matrices de presencia/ausencia (1/0) con las bandas polimórficas seleccionadas, y se determinó la talla molecular de las mismas. Adicionalmente, se elaboraron tres dendrogramas con las matrices generadas, tal como se muestra en las figuras 6, 7 y 8.

(19)

Los resultados obtenidos permitieron identificar que los cebadores OPA 2, 4 y 13, reportados en literatura (3;33), fueron los que generaron mayor número de polimorfismos, mientras que los cebadores OPA 14 y 15 mostraron un patrón de bandeo más limitado (anexo 5).

Figura 6: Caracterización molecular de 40 aislamientos de Fusarium spp. con los cebadores reportados en literatura (OPA 2, OPA 4 Y OPA 13).

La figura 6 muestra los clusters formados mediante la evaluación de las 40 cepas empleando los cebadores reportados por Castro N. 2008 (3) y Achenbach L. 1996 (33) y teniendo en cuenta una similitud del 70%. Como se puede observar, bajo este porcentaje se forman 10 clusters en los que los aislamientos se agrupan según la especie pero no de acuerdo al origen de aislamiento. Para el caso de F. verticillioides

(20)

solamente el cluster d presenta 2 cepas del mismo origen de aislamiento, mientras que en el resto (clusters a,b,c y e) se evidencia que hay reunión de diferentes orígenes. Para el caso de F. solani se observa que los 2 aislamientos provenientes de vía sistémica se agrupan en un cluster con el 100% de similitud, mientras que la cepa 108 se encuentra sola, sin embargo se relaciona en un 57% con la cepa 403 correspondiente a Fusarium sp.

Figura 7:Caracterización molecular de 40 aislamientos de Fusarium spp. con los cebadores seleccionados (OPA 3, OPA 9, OPA 11, OPA 14 y OPA 15).

Al comparar estos resultados anteriores con los obtenidos para el dendrograma generado con los cebadores seleccionados (OPA 3, OPA 9, OPA 11, OPA 14 y OPA 15) se puede decir que el comportamiento general es el mismo al anterior (cebadores OPA 2, OPA 4 Y OPA 13), ya que las agrupaciones se dan en función de las especies, sin embargo se presentan algunas variantes. A pesar de que el número total de bandas polimórficas evaluadas fue el mismo que el anterior (anexo 5), el número de clusters aumentó a 12. De las tres cepas de F. nelsonii que anteriormente presentaban el 100% de similitud, la 201 fue apartada para ubicarse en el mismo cluster pero con el 86%. La cepa 409 correspondiente a Fusarium sp. se ubicó sola en el cluster 5, sin embargo las otras cepas de Fusarium sp. se ubicaron en un mismo cluster junto con F.

verticillioides presentando un 100% de similitud con las mismas. Por otro lado, las

cepas de F. equiseti se agruparon en el cluster 4 con un 82% de similitud, y el cluster

que anteriormente mostraba un 77% de similitud y agrupaba a 23 cepas de F.

oxysporum cambió, ya que solamente se agruparon 17 de estas cepas

(21)

cepa 108 se ubicó nuevamente sola en un único cluster, sin embargo se asoció con las cepas 402 y 404 con un 48% de similitud, lo que no ocurrió con los cebadores OPA 2, 4 y 13 (figura 7).

Figura 8:Caracterización molecular de 40 aislamientos de Fusarium spp. con todos los cebadores evaluados.

Finalmente, el análisis de los resultados se realizó también con un dendrograma que involucró todos los cebadores evaluados en el estudio, y a pesar de que el número de bandas polimórficas fue mayor a los anteriores (26 bandas), se formaron nuevamente 12 clusters. Las cepas de F. nelsonii presentaron igual comportamiento al visto con los cebadores seleccionados, mientras que el porcentaje de similitud de las cepas de F.

equiseti disminuyó al 66% comparado con el caso anterior que era del 80%. El cluster

que agrupa a las cepas de F. oxysporum volvió nuevamente a abarcar las mismas 23 cepas que se habían agrupado con los cebadores reportados, manteniendo el cluster con 100% de similitud de las cepas 313 y 314 presente en los tres casos. Las cepas

de F. verticillioides fueron agrupadas con un 85% de similitud, siendo los aislamientos

155 y 156 idénticos para las bandas evaluadas. Por último, las cepas de Fusarium sp.

fueron nuevamente separadas cada una en un cluster, y las cepas de F. solani

presentaron el comportamiento ya visto, en donde el aislamiento 108 se encuentra solo en el cluster 1, mientras que las cepas 402 y 404 presentan el 100% de similitud (figura 8).

Una vez se compararon los tres dendrogramas y teniendo en cuenta que la especie F.

oxysporum fue las más representativa en el estudio, se generaron tres dendrogramas

(22)
[image:22.595.94.558.71.395.2]

Figura 9: dendrograma generado para la caracterización molecular de las cepas de F. oxysporum con los cebadores reportados (OPA 2, 4 y 13)

La figura 9 muestra el dendrograma generado con los cebadores reportados en literatura (OPA 2, 4 y 13) para las especies de F. oxysporum evaluadas en el estudio. Como se puede observar, la agrupación no se dio en un 100% para todas las cepas, lo cual indica alta variabilidad genética de los aislamientos ya que se trataba de la misma especie. El cluster 1, formado con un 77% de similitud abarca 23 cepas de F.

oxysporum de los tres orígenes de aislamiento y adicionalmente presenta 5

(23)
[image:23.595.93.536.71.382.2]

Figura 10: dendrograma generado para la caracterización molecular de las cepas de F. oxysporum con los cebadores seleccionados (OPA 3, 9, 11, 14 y 15)

(24)
[image:24.595.92.538.73.382.2]

Figura 11: dendrograma generado para la caracterización molecular de las cepas de F. oxysporum con los todos los cebadores

El último dendrograma correspondiente a las agrupaciones obtenidas con todos los cebadores evaluados. Se muestra nuevamente la formación de 5 clusters, pero diferentes a los anteriores: por una parte el cluster 1 solamente agrupó 12 cepas, de las cuales solo la 204 y la 407 presentaron un 100% de similaridad. Las cepas 303 y 311 fueron separadas nuevamente en un cluster cada una (clusters 4 y 5), y el aislamiento 302 se asoció, la igual que en el caso anterior, con las cepas 313 y 314 que muestran el 100% de similitud entre ellas (cluster 3). En el caso del cluster 2, las cepas provenientes de lesiones cutáneas de humanos, se relacionaron en un 73% con cuatro aislamientos de plantas (figura 11).

Con estos tres análisis se pudo observar adicionalmente, que las cepas provenientes de plantas tuvieron una tendencia a estar más separadas del grupo general, encontrando mayor número de asociaciones entre los aislamientos de origen humano sistémico, humano cutáneo y animal.

(25)

hongo que inicialmente se encuentra en una planta pueda causar enfermedad en un humano y viceversa.

Al comparar los resultados con los obtenidos por Vega, 2009, en el que se trabajan las mismas cepas de Fusarium a excepción de los aislamientos provenientes de vía sistémica, con una caracterización mediante secuencias consenso repetitivas intragénicas de enterobacterias (ERIC – PCR) y la amplificación de secuencias repetitivas palindrómicas extragénicas (REP-PCR), se puede confirmar lo anteriormente dicho, ya que la agrupación se dio igualmente a nivel de especie, confirmando la alta variabilidad y la posibilidad del hongo para hacer saltos entre reinos (31).

De la misma manera, Castro y colaboradores en el 2009, reportan alta variabilidad entre cepas pertenecientes a la especie F. oxysporum, encontrando 26 patrones de bandeo diferentes en 42 aislamientos evaluados con los mismos cebadores empleados en el presente estudio (OPA 2, 4 y 13), lo que sugiere que la técnica permite no solamente hacer diferenciación de especies, sino que posiblemente es útil para la identificación de formas especiales (3), o como en el caso planteado por Achenbach y colaboradores, permite distinguir entre cepas patógenas de aquellas que no lo son (33). Estos reportes concuerdan con los resultados obtenidos para las agrupaciones formadas con los tres dendrogramas generados con el análisis de las cepas de F. oxysporum, donde se evidencia que a pesar de ser aislamientos de la misma especie, no hay una asociación del 100% de similitud entre todos, resultado indicativo de una alta variabilidad genética y por tanto, un número de polimorfismos significativos, que permiten que dichas cepas sean separadas en clusters diferentes.

El -Fadly y colaboradores por otra parte, emplearon la técnica de RAPD para la identificación de 6 especies diferentes de Fusarium previamente identificadas por sus características morfológicas y patogénicas, encontrando que los resultados estaban sujetos a los cebadores empleados, ya que unos cebadores demostraban 100% de similitud entre los aislamientos, mientras que los otros los separaban en un cluster cada uno (50). Si se relaciona la utilidad de la técnica para la identificación de especie con los resultados obtenidos, se podría decir que las cepas que en el presente estudio se muestran como Fusarium sp., podrían ser F. verticilliodes, ya que en la figura 7 se muestra como estas se agrupan con las cepas de dicha especie en un cluster del 100% de similitud. Sin embargo, no es un resultado definitivo, ya que al igual que El- Fadly y colaboradores, las agrupaciones dependieron de los cebadores evaluados y este no fue repetitivo en los tres casos.

Finalmente, en todos los dendrogramas se observó que la especie F. solani se encontró siempre alejada de las demás especies. Al relacionar este fenómeno con estudios filogenéticos, se puede decir que dicho suceso era de esperarse ya que F.

solani ha sido catalogada como una especie divergente respecto a otras especies de

Fusarium, como F. graminareum, F. oxysporum y F. verticillioides, con las cuales

comparte una gran parte del genoma, pero difiere de ellos ya que posee regiones de linajes específicos en los que se han encontrado genes relacionados con interacciones patógeno – hospedero (51).

7.3. Análisis comparativo de los resultados

(26)
[image:26.595.94.551.122.427.2]

actividades en los que los datos se comportaban normalmente, y la mediana para aquellas actividades que presentaron datos no normales (anexo 6). El resultado obtenido se muestra en la figura 12.

Figura 12: Dendrograma obtenido con los perfiles amilolíticos, celulolíticos, pectinolíticos y proteolíticos para las 40 cepas de Fusarium spp.

El dendrograma generado muestra un patrón de agrupación diferente al presentado en la caracterización molecular, ya que en este caso las agrupaciones se dieron en función del origen de aislamiento en su mayoría. Como se puede observar, se originaron 10 clusters diferentes bajo un porcentaje de similitud del 70%. Para el caso del cluster 1 se evidencia que priman los aislamientos de procedencia animal, sin embargo hay una relación con cepas provenientes de humanos hasta del 100%, lo cual era de esperarse ya que los dos orígenes están relacionadas con lesiones cutáneas; además de esto se muestra la presencia de cinco especies diferentes (F.

solani, F. equiseti, F. oxysporum, F. nelsonii y F. verticillioides) en este mismo grupo.

Un cluster interesante para el fin del estudio es el número 2, en el que hay reunión tanto de especies diferentes como de orígenes de asilamientos diversos (humanos cutáneos, animales y plantas). Por último es importante resaltar que los aislamientos provenientes de vía sistémica se encuentran menos relacionados con los otros orígenes, formando agrupaciones con un 100% de similitud (clusters 7b y 9), mientras que para el caso de las plantas no se formó un cluster específico, sino que los aislamientos provenientes de este origen se distribuyeron en diferentes grupos.

En el 2004, Ortoneda y colaboradores plantearon el modelo multihospedero con una

cepa de F. oxysporum capaz de causar enfermedades tanto en plantas como en

animales. Para tal fin, realizaron una inoculación con una suspensión de conidios de F.

oxysporum f.sp. lycopersici (patógeno de tomate) en un ratón inmunosuprimido,

(27)

evidenciada en la presencia de los propágulos en órganos como vaso, riñones, hígado y pulmones, lo cual ocasionó la muerte del animal. Adicionalmente, complementaron su estudio evaluando genes involucrados en la patogenicidad del hongo, indicando que algunos genes como el Fmk1 son indispensables para la infección del patógeno en tomate, pero no son necesarios para causar enfermedad en el ratón (2). Este estudio representa el único reporte en el que se afirma que Fusarium es un patógeno multihospedero.

Los resultados obtenidos para las dos caracterizaciones realizadas en el presente estudio, se muestran como un soporte para el planteamiento de dicho modelo, ya que por un lado se evidenció la presencia de enzimas líticas en todas las cepas evaluadas, y por otra parte se mostró cómo cepas de la misma especie pueden provenir de diferentes orígenes de aislamiento, lo que es indicativo de la capacidad patogénica de las mismas y del amplio rango de hospederos que pueden ser afectados por este género. Adicionalmente, las dos pruebas realizadas fueron complementarias y aunque no se llevaron a cabo estudios de infección cruzada con las cepas evaluadas como en el estudio anteriormente mencionado, se pudo mostrar una relación entre la variabilidad genética de las cepas y los factores de virulencia presentes en las mismas, lo cual es de gran importancia para el entendimiento de este patógeno.

De igual manera, es importante resaltar que la asociación de especies provenientes de diferentes orígenes de aislamiento en un mismo cluster, así como las agrupaciones formadas en función de la especie independiente del origen, puede deberse a la capacidad de las cepas para adaptarse a diferentes condiciones, a mutaciones espontáneas, a procesos de selección natural o por procesos de reproducción sexual

o parasexual que permiten a algunas especies de Fusarium presentar mayor

variabilidad genética y adquirir de alguna manera genes que le confieran patogenicidad (41).

Para terminar, se han descubierto fenómenos aún más complejos implicados en la variabilidad genética de las especies de Fusarium, como el reportado en marzo del 2010 por Ma y colaboradores, quienes afirman la presencia de cromosomas móviles

en F. oxysporum f.sp lycopersici, que contienen genes relacionados con patogenicidad

tales como el gen SIX1 y SIX2, involucrados en la expresión de proteínas secretadas durante la colonización del xilema en plantas de tomate, y que además presentan una gran cantidad de elementos transponibles que están involucrados en la transferencia de dicho cromosoma a cepas no patógenas. Esta evidencia representa un avance para el entendimiento de los orígenes de la especificidad de hospederos, y que de ser estudiado más a fondo podría ser una clave importante para el seguimiento del modelo multihospedero planteado con el presente proyecto (51; 52).

8. CONCLUSIONES

• Se pudo demostrar la producción de enzimas líticas tales como amilasas, celulasas, pectinasas y proteasas por parte de las 10 cepas de Fusarium spp. aisladas de pacientes terminales con cáncer, lo cual es indicativo de que estas cepas patógenas poseen algunos factores de virulencia necesarios para la colonización de diferentes hospederos.

(28)

independientemente del origen de aislamiento o del tiempo de cultivo, lo que permitió asociar dichas enzimas como factores de virulencia importantes en el planteamiento del modelo Fusarium multihospedero.

• La caracterización molecular permitió evidenciar que con las tres formas planteadas para la construcción de los dendrogramas, las agrupaciones se generaron siempre a nivel de especie, involucrando diferentes orígenes de aislamientos, y que estos resultados están sujetos a los cebadores que se empleen.

• Se pudo encontrar relación entre los polimorfismos encontrados y las enzimas líticas como factores de virulencia, demostrando la variabilidad genética de las cepas evaluadas lo cual permitió realizar la aproximación del modelo multihospedero planteada con el proyecto.

9. RECOMENDACIONES

• Se sugiere realizar pruebas de actividad directa para el caso de las amilasas, celulasas y pectinasas con el fin de conocer las unidades enzimáticas expresadas en cada caso.

• Es importante considerar la optimización de medios de cultivo que permitan la obtención de las enzimas evaluadas para posibles aplicaciones industriales de las mismas.

• Se propone realizar estudios moleculares dirigidos a la identificación de genes relacionados con patogenicidad específicos para plantas, humanos y animales en los cuatro orígenes de aislamiento.

(29)

10. REFERENCIAS

1. Woolhouse MEJ., Haydon DT, Antia R. Emerging pathogens: the epidemiology and evolution of species jumps. TRENDS in Ecology and Evolution 2005; 20 (5): 238-244.

2. Ortoneda M, Guarro J, Madrid MP, Caracuel Z, Roncero MI, Mayayo E, Di Pietro A.

Fusarium oxysporum as a Multihost Model for the Genetic Dissection of Fungal

Virulence in Plants and Mammals. Infection and Immunity Mar. 2004; 72 (3): 1760– 1766.

3. Castro N, Casas C, Sopó L, Rojas A, Del Portillo P, Cepero de García MC, Restrepo

S. Fusarium species detected in onychomycosis in Colombia. Mycoses 2009; 52 (4):

350 – 356.

4. Valencia MF. Caracterización enzimática de cepas de Fusarium aisladas de

lesiones de animales, humanos y plantas. Trabajo de Grado de Pregrado. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, 2009, 152 p.

5. Glenn AE. Mycotoxigenic Fusarium species in animal feed. Animal Feed Science

and Technology 2007; 137: 213–240.

6. Godoy P, Cano J, Gené J, Guarro J, Höfling-Lima AL, Lopes A. Genotyping of 44 Isolates of Fusarium solani, the Main Agent of Fungal Keratitis in Brazil. Journal of

Microbiology. 2004; 42 (10):4494- 4497.

7. Edel V, Steinberg C, Avelange I, Laguerre G, Alabouvette C. Comparison of three

molecular methods for the caracterization of Fusarium oxysporum strain.

Phytopathology. 1995; 85 (5): 579-585.

8. Manulis S, Kogan N, Reuven M, Ben Yephet Y. Use of the RAPD technique for the identification of Fusarium oxysporum f. sp. Dianthi from carnation. Phytopathology. 1993; 84(1): 98 – 101.

9. Deacon, JW. Introducción a la Micología Moderna. Primera edición. Editorial Limusa, México, D.F. 1988; 350 págs.

10. Mitola G, Escalona F, Ledesma A. Queratinolisis causada por hongos no dermatofitos aislados de una tenería y un matadero en maracaibo-venezuela: revision de la expresión morfológica. Kasme 2001;29-2.

11. Bushelman SJ, Callen JP, Roth DN, Cohen LM. Disseminated Fusarium solani

infection. Journal of the American Academy of Dermatology. 1995; 32 (2): 346 – 351.

12. Agrios G. Plant pathology. Quinta edición. Editorial: Elsevier Academic. Ámsterdam. 2005; 922 págs.

13. Di Pietro A, González - Roncero MI. Fusarium oxysporum: un modelo para el análisis de la patogénesis fúngica en plantas y humanos. Temas de Actualidad SEM. 2004.; 37:6-13.

14. Nucci M, Anaissie E. Fusarium Infections in Immunocompromised Patients. Clinical

Microbiology Reviews 2007; 20 (4): 695–704.

15. Desjardins AE, Proctor RH. Molecular biology of Fusarium mycotoxins.

(30)

16. Prados-Rosales RC, Serena C, Delgado-Jarana J, Guarro J, Di Pietro A. Distinct signalling pathways coordinately contribute to virulence of Fusarium oxysporum on mammalian hosts. Microbes and Infection 2006; 8: 2825-2831.

17. Roncero MI, Di Pietro A, Ruiz-Roldán MC, Huertas-González MD, Garcia- Maceira FI, Méglecz E, et al. Papel de enzimas líticas de la pared celular en la patogenicidad

de Fusarium oxysporum. Revista Iberoamericana de Micología 2000; 17: S47-S53.

18. Wagacha JM, Muthomi JW. Fusarium culmorum: Infection process, mechanisms of mycotoxin production and their role in pathogenesis in wheat. Crop protection. 2007; 26: 877 – 885.

19. Negroni R, Martino O, Robles AM, Orduna T, Arechavala A, Brusca S, Helou S. Ulcera cutánea provocada por hongos del genero Fusarium. Revista da Sociedade

Brasileira de Medicina Tropical. 1997; 30(4):323-328.

20. Torres Rodríguez JM, Sellart – Altisent M. Celulitis y onicomicosis proximal de ambos ortejos mayores producidos por Fusarium solani. Revista Iberoamericana de

Micología. 2006; 23: 241 – 244.

21. Gutleb AC, Morrison E, Murk AJ. Cytotoxicity assays for mycotoxins produced by

Fusarium strains: a review. Environmental Toxicology and Pharmacology. 2002; 11:

309-/320.

22. Bridge PD, Hawksworth DL. The API-ZYM enzyme testing as an aid to the rapid identification of Penicillium isolates. Microbiological Sciences. 1984; 1(9): 185 – 189.

23. Wasfy EH, Bridge PD, Brayford D. Preliminary studies on the use of biochemical

uses and physiological tests for the caracterization of Fusarium isolates.

Mycopathologia. 1987; 99: 9-13.

24. Woo SL, Zoina A, Del Sorbo G, Lorito M, Nanni B, Scala F, Noviello C. Characterization of Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli by Pathogenic Races, VCGs, RFLPs, and RAPDs. Phytopathology. 1996; 86(9): 966-973.

25. Osborn AM, Smith CJ. Molecular Microbial Ecology. Taylor and Francis Group. United Kingdom, 2005, 373 p.

26. Suga H, Hyakumachi M. Genomics of Phytopathogenic Fusarium. Applied

Mycology & Biotechnology 2004; 4: 161-189.

27. Penner GA, Bush A, Wise R, Kim W, Domier L, Kasha K, Laroche A, Scoles G, Molnar SJ, Fedak G. Reproducibility of Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Analysis among Laboratories. Genome Research 1993; 2: 341-345.

28. Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski R, Tingey SV. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic acid research. 1990; 18(22):6531-6535.

29. Power EGM. RAPD typing in microbiology-a technical review Journal of Hospital

(31)

30. Chade ME, Mereles BE, Medvedeff MG, Vedota MC. Micosis subcutánea postraumática por Fusarium solani. Revista Iberoamericana de Micología. 2003; 20: 29-30.

31. Vega, DR. Identificación y caracterización enzimática y molecular de aislamientos

de Fusarium spp. de lesiones en animales, humanos y plantas Trabajo de grado de

Maestría. Facultad de Ciencias: Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, 2010. 149 p.

32. Miller G. Use of Dinitrosalicilic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar.

Analytical Chemistry 1959; 31 (3): 426-428.

33. Achenbach LA, Patrick J. Use of RAPD Markers as a Diagnostic Tool for the

Identification of Fusarium solani Isolates that Cause Soybean Sudden Death

Syndrome. Plant disease. 1996; 80(11): 1228-1232.

34. Zeeman SC, Kossmann J, Smith AM. Starch: Its Metabolism, Evolution, and Biotechnological Modification in Plants. Annual Reviews. 2010; 61: 209–34.

35. Gupta R, Gigras P, Mohapatra H, Goswami VK, Chauhan B. Microbial a-amylases: a biotechnological perspective. Process Biochemistry. 2003; 38: 1599_-1616.

36. Bhatti HN, Rashid MH, Nawaz R, Asgher M, Perveen R, Jabbar A. Purification and characterization of a novel glucoamylase from Fusarium solani. Food Chemistry. 2007; 103: 338–343.

37. Bhatti1 HN, Rashid MH, Nawaz R, Asgher M, Perveen R, Jabbar A. Optimization of Media for Enhanced Glucoamylase Production in Solid-State Fermentation by

Fusarium solani. Food Technology and Biotechnology. 2007; 45(1): 51–56.

38. Vázquez C, Sellek R, Fernández N. Enzimas que degradan paredes vegetales en

Fusarium oxysporum. Boletín Sanidad Vegetal Plagas. 1992; 18: 693-698.

39. Panagiotou G, Kekos D, Macris BJ, Christakopoulos P. Production of cellulolytic and xylanolytic enzymes by Fusarium oxysporum grown on corn stover in solid state fermentation. Industrial Crops and Products. 2003; 18: 37-/45.

40. Xiros C, Katapodis P, Christakopoulos P. Evaluation of Fusarium oxysporum

cellulolytic system for an efficient hydrolysis of hydrothermally treated wheat straw.

Bioresource Technology. 2009; 100 (21): 5362 – 5365.

41. Roncero MI, Hera C, Ruiz-Rubio M, García Maceira Fe I, Madrid MP, Caracuel Z,

et al. Fusarium as a model for studying virulence in soilborne plant pathogens.

Physiological and Molecular Plant Pathology. 2003; 62: 87–98.

42. Schumannn GL, D’Aray CJ. Essential Plant Pathology. APS Press. 2006.

43. Bonnin E, Goff AL, Körner R, Vigouroux J, Roepstorff P, Thibault JF. Hydrolysis of pectins with di¡erent degrees and patterns of methylation by the endopolygalacturonase of Fusarium moniliforme. Biochimica et Biophysica Acta. 2002; 1596: 83 – 94.

44. Wanjiru WM, Zhensheng K, Buchenauer H. Importance of cell wall degrading

enzymes produced by Fusarium graminearum during infection of wheat heads.

(32)

45. Niture SK, Pant A. Production of cell wall-degrading enzymes by a pH tolerant estuarine fungal isolate Fusarium moniliforme NCIM1276 in different culture conditions. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2007; 23: 1169–1177.

46. Di Pietro A, Roncero MI. Endopolygalacturonase form Fusarium oxysporum f. sp.

lycopersici: Purification, characterization, and production during infection of tomato

plants. Biochemestry and Cell Biology.1996; 86 (12): 1324 – 1330.

47. Jayani Rs, Saxena S, Gupta R. Microbial pectinolytic enzymes: A review. Process

Biochemistry. 2005; 40: 2931–2944.

48. Camacho Ramírez N, Gil Gómez JA. Evaluación preliminar de modelos de infección cruzada por Fusarium sp., aisladas de procesos patológicos en plantas, animales y humanos. Trabajo de Grado de Pregrado. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, 2008, 184 p.

49. Krcmery V, Jesenskat Z, Spanik S, Gyarfas J, Nogova J, Botek R, Mardiak J, Sufliarsky J, Sisolakova J, Vanickova M, Kunova A, Studena M, Trupl J. Fungaemia due to Fusarium spp. in cancer patients. Journal of Hospital Infection. 1997; 36: 223-228.

50. El-Fadly GB, El-Kazzaz MK, Hassan MAA, El-Kot GAN. Identification of some

Fusarium spp. using RAPD-PCR Technique. Egyptian Journal of Microbiology. 2008;

36 (1-2): 71-80.

51. Ma L-J, Van der Does HC, Borkovich KA, Coleman JJ, Daboussi MJ, Di Pietro A, et al. Comparative genomics reveals Mobile pathogenicity chromosomes in Fusarium. Nature. 2010; 464: 367 – 373.

Figure

TABLA DE CONTENIDO
Tabla 1: Cebadores seleccionados par la caracterización molecular de los 40 aislamientos de Fusarium spp
Figura 1:  Determinación de la hidrólisis amilolítica. C.+: control positivo: Trichoderma harzianum
Figura 2:  determinación de la hidrólisis  celulolítica. C. +: control positivo: Trichoderma harzianum
+7

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