Evaluación de la actividad antimicrobiana de los metabolítos secundarios obtenidos por fermentación en medio sólido de Penicillium roseopurpureum nativo del páramo de Guasca, Cundinamarca

PONTIFICIA UNIVERISAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS OBTENIDOS POR FERMENTACIÓN EN MEDIO SÓLIDO DE Penicillium roseopurpureum NATIVO DEL PÁRAMO DE GUASCA, CUNDINAMARCA

LINA MARÍA SEGURA CELY

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar al título de

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

Director

JORGE ROBLES CAMARGO PhD.

Codirectora

ANDREA GARCÍA CAYCEDO

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS OBTENIDOS POR FERMENTACIÓN EN MEDIO SÓLIDO DE Penicillium roseopurpureum NATIVO DEL PÁRAMO DE GUASCA, CUNDINAMARCA

LINA MARÍA SEGURA CELY

APROBADO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C.

2010 Dra. INGRIDSCHULER GARCÍA PhD

Decana académica

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS OBTENIDOS POR FERMENTACIÓN EN MEDIO SÓLIDO DE Penicillium roseopurpureum NATIVO DEL PÁRAMO DE GUASCA, CUNDINAMARCA

LINA MARÍA SEGURA CELY

JORGE ROBLES CAMARGO PhD Director

ANDREA GARCÍA CAYCEDO Codirectora

LUIS DAVID GÓMEZ M.Sc Jurado

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C.

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus

trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral

católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien

se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

TABLA DE CONTENIDO

1. RESUMEN ... 1

2. INTRODUCCIÓN ... 2

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ... 3

4. MARCO TEÓRICO ... 4

5. OBJETIVOS ... 6

5.1. Objetivo General ... 6

5.2. Objetivos Específicos ... 6

6. METODOLOGÍA ... 6

6.1.Reactivación de la cepa SPG 91 ... 6

6.2. Elaboración del banco de trabajo ... 7

6.3. Pruebas preliminares ... 7

6.4. Cinética de crecimiento ... 8

6.5. Obtención de metabolitos ... 8

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 9

8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...17

9. REFERENCIAS ...18

LISTA DE ANEXOS

10.1. METABOLITOS DEL GÉNERO Penicillium sp. ………..…………22

10.2. MEDIOS DE CULTIVO PARA LA FERMENTACIÓN SÓLIDA………23

10.3. PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN MACROSCÓPICA……….………24

10.4. SUSTRATOS EMPLEADOS EN FERMENTACIÓN SÓLIDA……….……25

10.5. MONTAJES DE FERMENTACIÓN……….…26

10. 6. RENDIMIENTO DE LAS FERMENTACIONES………27

10. 7. PRUEBAS DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA………28

10. 8. CROMATOGRAFÍAS EN CAPA FINA ………31

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS OBTENIDOS POR FERMENTACIÓN EN MEDIO SÓLIDO DE Penicillium roseopurpureum NATIVO DEL PÁRAMO DE GUASCA, CUNDINAMARCA

Grupo de investigación en Fitoquímica Universidad Javeriana (GIFUJ)- COLCIENCIAS

Metabolitos de cepas nativas colombianas de hongos filamentosos y evaluación de su actividad biológica III

1. RESUMEN

Los metabolitos secundarios, o compuestos naturales son sustancias que han reportado gran cantidad de utilidades por su actividad biológica; debido a la amplia biodiversidad colombiana, existe gran interés en la investigación de sustancias activas de origen natural. Las cepas nativas de Penicillium roseopurpureum aisladas del suelos paramunos en Guasca, (Cundinamarca) han sido objeto de estudios en los que se ha demostrado la producción de sustancias con actividad antimicrobiana por fermentación líquida en batch; numerosos estudios demuestran que para la producción de metabolitos bioactivos, el rendimiento de las fermentaciones, la actividad biológica y la estabilidad de compuestos como antibióticos y alcaloides ha incrementado cuando se emplea fermentación sólida. Debido a esto, en el presente trabajo se propone detectar si los metabolitos de Penicillium roseopurpureum nativo del páramo de Guasca (Cundinamarca) obtenidos por fermentación en medio sólido tienen actividad antimicrobiana.

Para esto, se realizó la selección de tres sustratos reportados en la bibliografía (arroz, avena y cebada), suplementados con solución de microelementos y se desarrolló un trabajo pre-experimental montando fermentaciones de 100g durante 13 días; se realizó la extracción de los metabolitos mediante el lavado de biomasa con Tween 80 al 0,1% (v/v) en agua destilada y posterior extracción líquido- liquido en embudo de decantación de la solución de lavado obtenida, la biomasa seca fue extraída mediante soxleth con acetato de etilo y éter de petróleo como solventes; el sustrato avena fue descartado con base en cantidad de pruebas antimicrobianas positivas y la cantidad de extracto obtenido frente a los demás sustratos.

dimetilsulfóxido (DMSO), y actividad antifúngica mediante difusión en placa de agar suplementando cada medio con 50mg de extracto en 7mL de agar PDA (7,1mg/mL).

Las fracciones con marcada actividad antimicrobiana (mayor cantidad de microorganismos inhibidos), fueron corridas en cromatografía de gases y comparadas con base de datos, donde se encontraron tres sustancias comunes en los extractos: Tetrametilpirazina, Pyrrolo [1,2-α]pirazina-1,4-diona, y 1,3-butanodiol. Es posible que las pirazinas sean las moléculas responsables de la actividad antimicrobiana, debido a que ya existen reportes al respecto. Las cromatografías en capa fina de la curva de crecimiento permitieron detectar la producción de sustancias en el transcurso de la fermentación, de acuerdo a los valores de factor de retención (Rf) de las sustancias comunes en los extractos que reportaron actividad, se evaluaron las bandas obtenidas en las fracciones de la curva; las bandas con los valores de Rf comunes y comportamiento similar frente a la luz ultravioleta, visible y al revelador ácido sulfúrico-vainillina, comenzaron aparecer entre los días 9 y 15, lo que indica la producción de sustancias propias del metabolismo secundario. No se detectó el compuesto metil-(2-oxo-3,4-dihidro-2H-chromen-6-il)-acetato, al cual se le atribuye la actividad antimicrobiana en medio líquido.

2. INTRODUCCIÓN

Los metabolitos secundarios de origen fúngico, han sido objeto de estudio desde 1942 cuando se industrializó la producción de penicilina, antibiótico obtenido a partir del hongo Penicillium nonatum, desde entonces, se han desarrollado una enorme cantidad de estudios que buscan aislar cepas productores de toda clase de metabolitos que puedan ser empleados a nivel industrial como enzimas, antibióticos, sustancias con actividad farmacológica, biocontroladores y pigmentos, entre otros (1).

Como consecuencia del clima frio propio de los páramos, los microorganismos nativos de estas zonas se encuentran adaptados a las bajas temperaturas y a las condiciones agrestes que con ella vienen, entre los mecanismos de adaptación que se conocen se encuentran: función de enzimas, función de transporte de nutrientes y función de la membrana celular; según Arias y Piñeros, 2008 (2), estos organismos especialmente adaptados producen sustancias metabólicas que pueden llegar a tener interés industrial.

griseofulvina, ocratoxina A, patulina, y penitrem A (3). Los metabolitos secundarios tienen diversa estructura química, su peso molecular es relativamente bajo, se producen en medianas y bajas concentraciones y se difunden en el medio. (4,5). El género Penicillium se destaca como productor de una gran cantidad de metabolitos secundarios de importancia industrial, la tabla 1 describe algunas sustancias de importancia biológica aisladas a partir de este género (Anexo1).

Durante la biosíntesis de metabolitos secundarios, la cantidad y el tipo de sustancias producidas depende tanto de condiciones nutricionales y ambientales, como de de la historia previa del desarrollo del hongo; la formación de metabolitos refleja que el hongo ha alcanzado cierto grado de diferenciación bioquímica, fisiológica y a veces morfológica; es así como, cuanto más compleja es la ruta biosintética de estos metabolitos secundarios más restringido es el número de especies de hongos productores de estas sustancias (4). La producción de sustancias a partir de biomasa fúngica se ha desarrollado habitualmente mediante procesos de fermentación en medio líquido en batch; sin embargo, la fermentación en medios sólidos se presenta como una alternativa viable para la producción de metabolitos secundarios con actividad biológica (6).

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Los metabolitos secundarios son utilizados como agentes antibacterianos, antifúngicos, antitumorales, antioxidantes, citotóxicos, antiparasitarios y antivirales; estos compuestos, se aplican principalmente en farmacología clínica para la terapia humana, pero también son utilizados en la terapia animal y en la agricultura como plaguicidas (7). Debido a la amplia biodiversidad colombiana, la investigación que apunta hacia la separación de nuevas moléculas activas, o a las nuevas aplicaciones de sustancias ya reportadas, es de gran importancia e interés (8).

a la producción de este tipo de compuestos (10); las condiciones de humedad, aireación y soporte que proporciona la fermentación en medio sólido han sido vistas como ventajosas en la obtención de metabolitos secundarios a partir de hongos filamentosos (9). Numerosos estudios demuestran que para la producción de enzimas, antibióticos, alcaloides, aceites esenciales y pigmentos entre otros, el rendimiento de las fermentaciones ha aumentado cuando esta se realiza en medio sólido; así mismo, la actividad biológica y la estabilidad de compuestos como antibióticos y alcaloides a incrementado también con este tipo de fermentación (11)

Como consecuencia de todo lo anteriormente señalado, el presente trabajo pretende detectar si los metabolitos de Penicillium roseopurpureum nativo del páramo de Guasca (Cundinamarca) obtenidos por fermentación en medio sólido tienen actividad antimicrobiana como la obtenida por fermentación líquida en trabajos anteriores.

4. MARCO TEÓRICO

Colombia posee el 60% de los páramos del mundo, esta es una ventaja no solamente hidrológica dado que en los páramos se da el nacimiento de las fuentes de agua, sino también biológica debido a que son una importante reserva de biodiversidad, en el que se alojan numerosas especies de plantas, animales y microorganismos nativos (12,13). El paramo de Guasca se ubica en el municipio de Guasca, departamento de Cundinamarca a 53 Km de Bogotá, posee una altura de 3000-3250m, y una temperatura de 10°C a 13°C. El clima del páramo se caracteriza por el frió- húmedo dónde la cantidad de lluvia alcanza 3000mm anuales. El suelo posee textura tipo franco-arenoso orgánico, de estructura granular fina, consistencia en húmedo friable; permeabilidad rápida, reacción de ácida a muy ácida, que se compone principalmente por: arena 63% limo 18% arcilla 19%, posee porcentajes de humedad de 19,36%, y pH de hasta 4,7; el porcentaje de carbono orgánico y de nitrógeno total es de 1,73 y 10,8 respectivamente (13).

Debido a la amplia diversidad biológica de los páramos Colombianos, se han desarrollado varias investigaciones con el fin de aislar hongos filamentosos de los suelos paramunos, Romero, Et al. 2004 reporta haber aislado 12 cepas de los géneros Absidia sp., Alternaria sp.,

Las especies del género Penicillium están ampliamente distribuidas en la naturaleza formando parte de los microorganismos del suelo y del aire (14). Dado que la clasificación taxonómica de los microorganismos pertenecientes a esta especie se encuentra establecida principalmente con base en su morfología, cabe resaltar que microscópicamente las especies de este género poseen micelio hialino que produce conidióforos largos, erectos y simples, los cuales se ramifican en dos o tres veces en los extremos; poseen además una célula conidiogénica en forma de botella, denominada fiálide que produce conidios ovalados, generalmente hialinos de arreglo basipétalo u acropétalo; la fiálide se encuentra sostenida sobre un conidióforo denominado penicilio (14).

Penicillium roseopurpureum es un hongo filamentoso con una temperatura óptima de crecimiento de 25°C, y como característica distintiva no presenta crecimiento a 37°C. Microscópicamente posee conidióforos usualmente con pared lisa en hifas hialinas, mono verticilado, estipos no ramificados de pared lisa que terminan en un verticilio de 3-5 fiálides. Las fiálides con forma de botella de 5,6-7,8 x 1.5-1-8 µm, conidios producidos en columnas, esferoidales, globosas y ornamentadas con diámetros menores de 3 micras (9).

Los metabolitos secundarios de P. roseopurpureum obtenidos por fermentación en medio líquido han demostrado interesantes actividades antimicrobianas; García (2009) reporta la presencia de metil-(2-oxo-3,4-dihidro-2H-chromen-6-il)-acetato aislado del micelio del hongo como sustancia activa contra E. coli y especialmente contra S. aureus con concentraciones mínimas inhibitorias de 125-250µg/mL. Adicionalmente, sustancias aisladas del extracto crudo demostraron tener actividad anti fúngica contra Fusarium oxysporum, con un porcentaje de inhibición del 73% (9).

solución de sales y una suspensión de esporas de hongos como inoculante (15). Para medir el crecimiento de los microorganismos en (FMS), se puede recurrir a la respirometría, análisis de la biomasa con diferentes métodos directos como el recuento de conidios o esporas al microscopio y a métodos indirectos como la cuantificación de proteínas, quitina, y ácidos nucléicos o por la producción de diferentes metabolitos (15). Algunas ventajas que presenta la fermentación en medio sólido con respecto a otros métodos es que los medios de cultivo que se emplean son simples, al final del proceso el producto de interés se concentra, lo que facilita su purificación; El bajo contenido de humedad de los sustratos y del medio en general reducen la posibilidad de contaminación y se presenta una menor cantidad de residuos metabólicos lo que disminuye la represión por catabolito que se pueda generar (1).

5. OBJETIVOS

5.1. Objetivo General

Determinar la actividad antimicrobiana de metabolitos secundarios obtenidos por fermentación en medio sólido de Penicillium roseopurpureum.

5.2. Objetivos Específicos

 Determinar la cepa SPG91 conservada en el cepario del laboratorio de química microbiológica de la Pontificia Universidad Javeriana.

 Elaborar un banco de trabajo a partir de un cultivo monospórico de la cepa SPG91  Realizar una evaluación preliminar de la actividad antimicrobiana de los metabolitos

obtenidos por fermentación en medio sólido en tres sustratos diferentes.

 Realizar curva de crecimiento del microorganismo en el/ los sustratos seleccionados  Realizar pruebas de actividad antimicrobiana.

6. METODOLOGÍA

6.1.Reactivación de la cepa SPG 91

gránulos de suelo, por lo que fue reactivada mediante repique en agar PDA e incubación a 25°C durante 7 días (16). Una vez obtenido el microorganismo axénico y viable, se realizó la determinación a partir de repiques realizados en los medios Czapeck, saboureaud, extracto de malta, extracto de levadura, y PDA, empleando las claves taxonómicas de Pitt (1990), y Samson (2000) (16,2).

6.2. Elaboración del banco de trabajo

Se realizó un cultivo monospórico mediante la técnica descrita por García (2010) a partir del cual se elaboró un banco de primario conservando el microorganismo en discos de agar con aceite mineral, gránulos de suelo, discos de papel, agua destilada y tubo inclinado, se elaboró además, un banco de trabajo mediante discos de agar en aceite mineral conservado-20°C empleando la metodología utilizada por Alarcón, A., Irney, D. en 2006 (9).

6.3. Pruebas preliminares

Para la selección del sustrato se realizaron nueve fermentaciones de 100g durante 13 días a 25°C en bandejas de aluminio 15cm x 10cm x 4cm correspondientes a los triplicados de las pruebas para los sustratos arroz, avena y cebada (90g) suplementados (anexo 2). Para lo cual, se elaboró un inoculo correspondiente a 90mL de una suspensión de conidios de concentración 107 _{Células/mL , a partir del cual se transfirieron 10mL a cada bandeja de} fermentación que posteriormente se llevaron a incubación bajo las ya mencionadas condiciones (9,17). Finalizado el tiempo de fermentación, se realizó el recuento de conidios y la extracción de metabolitos.

actividad antimicrobiana mediante la técnica de pozos a concentraciones de 10mg/50µL en dimetilsulfóxido (DMSO) contra Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas aeureginosa ATCC 9027, Escherichia coli ATCC 8739 y Staphylococcus aureus ATCC 6535 obteniéndose así un total de 16 ensayos por sustrato. Se emplearon como controles DMSO puro, y gentamicina solución 10mg/mL. La selección de los sustratos para el estudio se decidió de acuerdo al número de ensayos positivos y el peso de los extractos obtenidos.

6.4. Cinética de crecimiento

La curva de crecimiento se realizó en los sustratos arroz y cebada suplementados de la misma forma que en las pruebas preliminares, se emplearon bandejas de aluminio rectangulares de 9cm x 7cm x 3cm, y bandejas cilíndricas de 11,5cm de diámetro y 3 cm de altura, con 30g de medio como lo muestra la figura 1 (anexo 4); la preparación de inoculo se realizó teniendo en cuenta los mismos criterios establecidos en el numeral anterior. Los muestreos se realizaron cada 24 horas durante quince días, la cuantificación de biomasa se llevó a cabo mediante recuento en cámara; adicionalmente se realizó extracción de los metabolitos y cromatografía en capa fina por la metodología ya mencionada, para los días 0, 3, 6, 9, 12 y 15, todo el procedimiento se realizó por triplicado para cada sustrato (15,17).

6.5. Obtención de metabolitos

con 50mg de extracto (7.1mg/mL) de acuerdo a Steven y Rusell (2007) (18), el porcentaje de inhibición se calculó de acuerdo a la fórmula:

A las fracciones activas se les realizó cromatografía de gases con detector de masas para realizar la comparación de las sustancias con las de la base de datos del equipo (9,13).

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se realizó la recuperación del microorganismo SPG91 del cepario del laboratorio de química microbiológica de la Pontificia Universidad javeriana, a partir del cual se realizaron repiques para las pruebas de identificación macroscópicas y microscópicas en los medios de cultivo saboureaud, extracto de malta, extracto de levadura, Czapeck y PDA obteniendo colonias características macroscópicas descritas en la tabla 4 (anexo3); la microscopía se determinó empleando el sistema Motic images plus®, donde se evidenciaron conidióforos de pared lisa, hialinos monoverticilados, estipos no ramificados de pared lisa terminados en un verticilio de 3-5 fiálides con forma de botella de 3-5,6-7,8 x 1.3-5-1-8 µm, conidios producidas en columnas, esferoidales, ornamentados con un diámetro de 2.0 – 2.5 µm (figura 2); Con esta información y mediante el uso de claves taxonómicas de Pitt (1990) y Samson (2000), se confirmó la identificación del microorganismo como Penicillium roseopurpureum (16,2).

Figura 2. Identificación microscópica de P. roseopurpureum.

Una vez identificado el microorganismo, se elaboró un cultivo monospórico a partir del cual, se realizó el banco celular; el cultivo monospórico, consiste en la obtención de biomasa fúngica a partir de un único propágulo, en este caso conidio, lo que garantiza que toda la biomasa del estudio sea genotípicamente homogénea (16).

Se realizó un banco primario mediante conservación en discos de agar, papel de filtro, gránulos de suelo y tubo inclinado; adicionalmente, se desarrolló un banco de trabajo donde se eligió como método de conservación la técnica de discos de agar en aceite mineral a -20°C, lo cual garantiza la estabilidad de la cepa de estudio durante el desarrollo de la investigación (mediano plazo), debido a que el aceite mineral disminuye la transferencia de oxígeno y la temperatura detiene el metabolismo fúngico (9). Una de las principales ventajas de la fermentación en medio sólido, es el uso de sustratos complejos de origen agrícola, la literatura reporta diversos sustratos empleados para la producción de metabolitos mediante fermentación sólida (tabla 4, anexo 3). Para la selección de los sustratos en el presente estudio, se seleccionaron los de mayor reporte en la literatura para el género Penicillium sp. y de mayor accesibilidad: Arroz, avena y cebada; igualmente la revisión bibliográfica permitió establecer los suplementos y definir la composición de los medios de cultivo (Anexo 2).

Se desarrolló una investigación de tipo pre-experimental para determinar el sustrato a emplear; las fermentaciones tuvieron una duración de 13 días debido a que este fue el tiempo reportado por García, en 2010, en el que se completa la cinética de crecimiento para P. roseopurpureum (9); se obtuvo un rendimiento promedio de 1,04mg extracto/g arroz, 0,4mg extracto/g avena y 1,1mg extracto/g cebada (anexo 5, tabla 6).

Figura 3. Pruebas preliminares de selección de sustrato. Fuente: Elaboración propia

Las cinéticas de crecimiento obtenidas (figura 4), poseen el comportamiento típico de una curva de crecimiento de hongo filamentoso, que en cuanto a la producción de biomasa es similar a la de una bacteria, es decir posee cuatro fases: fase de adaptación, fase de crecimiento exponencial, fase estacionaria y fase de muerte, aunque los hongos filamentosos poseen duración de fase estacionaria mucho más corta (19). sin embargo, la producción de metabolitos se caracteriza en una curva con dos fases: tropofase donde ocurre la mayor producción de biomasa y las sustancias producidas se encuentran asociadas al crecimiento e ideofase donde se generan una serie de compuestos secundarios que no son esenciales para la célula pero, están asociadas a la supervivencia del microorganismo (20,21).

En la primera fase ocurre la germinación de propágulos, por lo que se observa una disminución de la concentración de conidios inoculada hacia el día uno, y un crecimiento lento hasta el día 3, a continuación ocurre un rápido desarrollo del micelio en los extremos periféricos de este, aquí, el micelio más senecente no crece, sino que se encarga de obtener los nutrientes que requiere el micelio nuevo para desarrollarse, por lo que ocurre la utilización de la mayor cantidad de los nutrientes (carbohidratos, nitrógeno, y fosforo entre otros).

En este punto de máximo crecimiento, metabólicamente hablando ocurriría el inicio de la ideofase (21); para los sustratos evaluados este punto se alcanzó entre los días 7 y 8 para cebada y arroz respectivamente, resultados que coherentes con lo reportado por García en

0 20 40 60 80 100 120 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Arroz Avena Cebada

E xtrac to (mg /10 0g sust rato ) E nsa yos po sitiv os Sustratos evaluados

Pruebas preliminares de selección de sustrato

2010, donde la ideofase se alcanza más rápidamente (día 6) (9), debido a la dificultad en el transporte de nutrientes propia de la fermentación sólida, lo que ocasiona una tasa de crecimiento menor (22).

Finalmente ocurre la pérdida de peso por autolisis del micelio ocasionada por el rompimiento de la quitina, polisacáridos y proteínas, esta lisis genera amoniaco, aminoácidos y compuestos de fósforo orgánico y moléculas azufradas. La disminución del crecimiento se debe principalmente a la acumulación de metabolitos tóxicos (ácidos orgánicos y amoniaco), y el agotamiento de los nutrientes (19,21).

Ci ética de creci ie to de

Penicillium roseopurpureum

por fer e tació e edio sólido

Tie po días

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Lo

g c

o

idios

c

élulas/

l

0 2 4 6 8 10

Arroz Cebada

Figura 4. Cinética de crecimiento de Penicillium roseopurpureum por fermentación en medio sólido. Fuente: elaboración propia

gaseosos (23). Aunque una humedad elevada en el sustrato causa un aumento de la tasa del crecimiento de la producción de biomasa y de la biosíntesis de enzimas, también puede generar una disminución de la porosidad del sustrato, una baja difusión de oxígeno y aumenta la probabilidad de contaminación, si la cantidad del agua se vuelve insuficiente y no permite una buena difusión de solutos y el gas, el metabolismo celular se desacelera o se detiene, debido a la falta de sustratos o por la concentración demasiado alta de metabolitos inhibitorios, así mismo, si la cantidad intracelular o extracelular de agua no permite el mantenimiento de las propiedades funcionales de algunas enzimas, su inactividad crea un desequilibrio en la cadena metabólica de las células. De la misma manera, si la transferencia de agua inducida por el estrés hídrico conduce a una desnaturalización de la estructura mecánica de la membrana plasmática, todas las propiedades de permeabilidad y transporte a través de la membrana se ven afectados y la célula es entonces perturbado, adicionalmente, el exceso de humedad puede inducir el desarrollo de vías metabólicas anaerobias (24); Por otro lado, una baja humedad conduce a un crecimiento limitado y disminuye la disponibilidad del sustrato (15, 23). En general, los procesos de fermentación en medio sólido con hongos filamentosos se desarrolla con humedades entre el 20 y el 60%, por lo que el valor empleado para el estudio, se considera apropiado (25).

De la misma manera, La aireación de los medios de cultivo es de gran interés para el desarrollo de fermentaciones con microorganismos, aerobios ya que permite realizar diferentes funciones: abastecimiento en oxígeno para los cultivos, regulación de la humedad, regulación de la temperatura eliminación de metabolitos volátiles (CO2, alcoholes), en procesos tecnificados la aireación se controla inyectando aire estéril a concentraciones adecuadas a los biorreactores (25), en el desarrollo de este trabajo se desarrollaron condiciones aerobio mediante el llenado con el sustrato del 50% del volumen las bandejas de fermentación, con una profundidad aproximada de 2cm.

La actividad antibacteriana fue evaluada mediante la técnica de pozos a una concentración de 20mg/50µL en DMSO y la actividad antifúngica mediante difusión en placa de agar suplementando los medios con 50mg de cada extracto, los resultados obtenidos se representan en las figuras 5 y 6.

Figura 5. Resultado de pruebas de actividad antibacteriana de las fracciones obtenidas: ATe: arroz, tween, éter; ABe: Arroz, biomasa, éter; ABd: arroz, biomasa, diclorometano; ABa: Arroz,

biomasa, acetato; CTa: cebada, tween, acetato; CBe: cebada, biomasa, éter; CBd: cebada, biomasa, diclorometano, CBa: cebada, biomasa, acetato.

Fuente: Elaboración propia

Figura 6. Resultado de pruebas de actividad antifúngica de las fracciones obtenidas: ATe: arroz, tween, éter; ATd: arroz, Tween, diclorometano; ATa: arroz, tween, acetato; ABe: Arroz,

biomasa, éter; ABd: arroz, biomasa, diclorometano; ABa: arroz, biomasa, acetato; CTe: cebada, tween, éter; CTd: cebada, Tween, diclorometano; CTa: cebada, tween, acetato; CBe: cebada, biomasa, éter; CBd: cebada, biomasa, diclorometano, CBa: cebada, biomasa, acetato.

Fuente: Elaboración propia.

La actividad antifúngica obtenida es mayor a la reportada por García para el mismo microorganismo por fermentación en medio líquido quien reporta una inhibición del 73% a concentración de 2mg/mL de extracto obtenido a partir de 20L de fermentación, frente a una inhibición del 100% a una concentración de 7,1mg/mL de extracto obtenido a partir de 3 kg de medio (9). Adicionalmente, se le realizó cromatografía de gases a los extractos que mostraron actividad antimicrobiana, mediante el software del equipo, los cromatogramas obtenidos fueron comparados con una base de datos en la que se obtuvieron los compuestos descritos en la tabla 5 (anexo 6); los compuestos comunes para las fracciones con actividad fueron Tetrametilpirazina, Pyrrolo [1,2-α]pirazina-1,4-diona, y 1,3-butanodiol (figura 8). El compuesto al que se le atribuye la actividad antimicrobiana obtenido en medio líquido no se reportó en las fracciones del medio sólido, esto puede ser resultado de que el cambio de sustrato inhiba la síntesis de ciertos compuestos, o que la molécula de interés no se encuentre en la base de datos del cromatografo.

0 20 40 60 80 100 con tr ol A T e A T d A T a

ABe ABd ABa CT

e CT d CT a CB e CB d CB a % de inh ibición Extractos evaluados

Pruebas de actividad antifúngica

A. B. C.

Figura 8. Compuestos comunes en las fracciones activas.

A. Pyrrolo [1,2-α]pirazina-1,4-diona, B. Tetrametilpirazina, C. y 1,3-butanodiol. Fuente: elaboración propia

La actividad antimicrobiana obtenida, podría ser atribuida a la presencia de pirazinas, ya que las alquilpirazinas y pirrolpirazinas son derivados del pirazol, con actividad biológica demostrada (26), estas sustancias son precursores y forman parte del sitio activo de antibióticos del tipo quinolonas, que actúan sobre las bacterias bloqueando la enzima ADN girasa, inhibiendo la replicación (26). FoKs, Et al (2005), reportan actividad de 1H-pyrazolo[3,4-b]pyrazine contra las bacterias Staphylococcus aureus, Corynbacterium spp. , Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ,y Pseudomonas stutzeri, algunas especies de micobacterias y de hongos filamentosos, para los cuales las pirrol pirazinas poseen mayor efecto inhibitorio como 7-(1,2,3,4-tetrahydropyrrolo[1,2-a]- pyrazin-7-yl) quinolones (27). Las pirazinas pueden ser producidas por microorganismos mediante fermentación sólida, como B. subtilis y Aspergillus oryzae, las pirazinas de B. subtilis deben ser modíficadas por síntesis química para alcanzar efecto antibacterial, mientras que las de A. oryzae son por sí mismas, fuertes antimicrobianos, por ejemplo, el flavocol (28,29). Sin embargo, la actividad antimicrobiana no se podría atribuír a una única sustancia, es posible que la mezcla de dos o más sustancias en una fracción posean un efecto sinérgico sobre la inhibición de los microorganismos. El butoanodiol en sus isómeros 1,3 y 2, 3 es un comprobado agente antimicrobiano, aunque con reducido efecto empleado como excipiente en algunas preparaciones cosméticas, junto con sustancias de mayor actividad (19); Este diol, hace parte del metabolismo primario derivando de la condensación de dos moléculas de piruvaro provenientes del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en una molécula de acetoína que es reducida a butanodiol (5).

bandas con los valores de Rf comunes y comportamiento similar frente a la luz ultravioleta, visible y al revelador ácido sulfúrico-vainillina, comenzaron aparecer entre los días 9 y 15, lo que indica la producción de sustancias propias del metabolismo secundario, sin embargo, para algunas fracciones de diclorometano y éter, las bandas comunes aparecieron desde el día 6, característica de metabolitos parcialmente asociados al crecimiento, estos datos concuerdan con lo reportado por FoKs, Et al (2005) y Yoshihito, S. Et al (2008). Los resultados obtenidos, corresponden a datos cualitativos que pueden dar una idea del comportamiento del metabolismo del microorganismo durante la fermentación, sin embargo, para detectar con seguridad la producción de pirazinas, sería necesario realizar pruebas cromatográficas como la de gases ya empleada a cada una de las fracciones de la cinética.

8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Se obtuvo actividad antibaceriana contra Bacillus subtilis, Pseudomonas areuginosa, Escherichia coli y Sthaphylococcus aureus en las fracciones de de tween-éter, arroz-biomasa-acetato, y cebada-biomasa-diclorometano, y actividad antifúngica frente a F. oxysporum, las fracciones Arroz-biomasa-éter y cebada-biomasa-acetato presentaron inhibición del 100% frente a F. oxysporum valor mayor que el alcanzado por los metabolitos obtenidos mediante fermentación liquida. No se detectó el compuesto metil-(2-oxo-3,4-dihidro-2H-chromen-6-il)-acetato, al cual se le atribuye la actividad antimicrobiana en medio líquido, sin embargo se detectó la presencia de pirazinas en las fracciones de mayor actividad antimicrobiana, compuestos con actividad antimicrobiana reportada, que son precursores y forman parte del sitio activo de las quinolonas.

9. REFERENCIAS

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10. ANEXOS

10. 1 Metabolitos del género Penicillium sp.

Tabla 1. Metabolitos secundarios del género Penicillium sp. de importancia biológica

Fuente: Carrillo, 2003

Metabolito Microorganismo Productor Características

OCRATOXINA A P. verrucosum y P. nordicum son sustancias liposolubles de difícil excreción que se acumulan en forma de depósitos lipídicos

PATULINA

P. griseofulvum, P. expansum, P. gladioli, P. sclerotigenum , P. claverigenum, P. vulpinum, P. concentricum, P. coprobium, P. glandicola, P. formosanum

y P. carneum.

Es una lactona tóxica, estable en medio ácido Esta toxina inhibe el desarrollo de los cultivos de Bacillus subtilis

CITRININA P. citrinu, P. verrucosum y P. expansum

Toxina letal para algunas aves de corral.

ÁCIDO

PENICÍLICO P. aurantiogriseum, P. notattum y P. simplicissimum

Lactona mutagénica que produce fluoresencia celeste con vapores de amoniaco

CITROVIRIDINA P. citreonigrum y Eupenicillium ochrosalmoneum

Neurotoxina consistente en un anillo lactona conjugado con un furano

CICLOCLOROTINA P. islandicum. Péptido cíclico que contiene _{cloro, hepatotóxico}

PENITREMA P. crustosum,P. glandicola y P. janczewskii

Neurotoxinas productoras de temblores que pueden causar la muerte de los animales

ÁCIDO

SECALÓNICO D mononematosum P. oxalicum y P.

Xantona dimérica, que constituye un compuesto teratogénico

GRISEOFULVINA aethiopicum, P. coprophilum, P. griseofulvum, P. P. janczewskii, P. raistrickii

Neurotóxina que sido

considerada más bien un antibiótico tóxico que una micotoxina

VIOMELEÍNA Y XANTOMEGNINA

P. viridicatum, P.

aurantiogriseum Son naftoquinónicos pigmentos de tipo

10.2 Medios de cultivo para la fermentación sólida

Tabla 2. Composición de los medios de cultivo para la fermentación en medio sólido.

Fuente: Elaboración propia

Composición de los medios de cultivo (para 300g)

sustrato 100g

Agua destilada 180ml

Solución de extracto de levadura (6% (p/v)) 10ml

Solución de elementos traza (*) 2ml

Solución buffer (**) 4ml

Solución de sales (***) 4ml

Tabla 3.Suplementos de los medios de cultivo para la fermentación en medio sólido.

Fuente: Elaboración propia

Solución Componente Concentración

g/L

*Elementos traza Sulfato ferroso 5g

Sulfato cúprico 0,075

Molibdato de amonio 5

**Solución Buffer Fosfato dibásico de potasio 2,5 Fosfato monobásico de potasio 15,25 ***Solución de sales Sulfato de magnesio 0,25

10. 3. Pruebas de identificación macroscópica

Tabla 4. Identificación macroscópica de la cepa SPG91. Fuente: Elaboración propia

Medio de Cultivo Características Macroscópicas Imagen

Czapeck

Colonias de 10-12 mm de diámetro, textura aterciopelada, color verde grisácea con margen blanca, bordes regulares; exudado ligeramente amarillo; reverso amarillo ocre.

PDA

Colonias de 15-20 mm de diámetro, textura aterciopelada, color rosado con margen blanca de 5 mm, acanalada, ligeramente elevada en el centro, bordes irregulares; reverso rosado.

SAboureud

Colonias de 15-20 mm de diámetro, textura aterciopelada, color rosado con margen blanca de 5 mm, acanalada, ligeramente elevada en el centro, bordes irregulares; reverso rosado.

Extracto de malta

Colonias de 12-15 mm de diámetro, textura típicamente aterciopelada, elevada en el centro, color blanco con bordes irregulares; exudado transparente; reverso amarillo ocre.

Extracto de levadura

10.4. Sustratos empleados en fermentación sólida

Tabla 5. Producción de compuestos bioactivos mediante fermentación en medio sólido.

10.5. Montajes de fermentación

Figura 1. Montajes de fermentación en medio sólido: A. Cinética de crecimiento en arroz (30g), B.

cinética de crecimiento en cebada (30g), C. Fermentación de 300g en arroz, D. Fermentación de 300g en cebada.

Fuente: elaboración propia.

A B

C

10.6. Rendimiento de las fermentaciones

Tabla 6.Rendimiento de las fermentaciones de las pruebas preliminares. 100g de fermentación

Fracción _{obtenido (g)} Extracto Rendimiento _(mg/g)

Arroz

biomasa éter de petróleo 113.20 1.13

acetato de etilo 105.10 1.05

lavado tween éter de petróleo 87.70 0.88

acetato de etilo 95.50 0.96

Rendimiento promedio mg/g 1.00

Avena

biomasa éter de petróleo 49.20 0.49

acetato de etilo 56.10 0.56

lavado tween éter de petróleo 38.10 0.38

acetato de etilo 39.60 0.40

Rendimiento promedio mg/g 0.46

Cebada

biomasa éter de petróleo 119.90 1.20

acetato de etilo 123.80 1.24

lavado tween éter de petróleo 102.90 1.03

acetato de etilo 96.18 0.96

Rendimiento promedio mg/g 1.11

Tabla 7.Rendimiento de las fermentaciones 3000g de fermentación

Fracción _{obtenido (g)} Extracto Rendimiento _(mg/g)

A

rr

o

z

Eter de petróleo 5.29 1.762

Diclorometano 3.22 1.072

acetato de etilo 5.32 1.774

lavado de tween

Eter de petróleo 2.86 0.952

Diclorometano 0.43 0.144

acetato de etilo 1.00 0.334

Rendimiento promedio mg extracto/g arroz 1.006

C

eb

ad

a

Eter de petróleo 5.33 1.776

Diclorometano 3.83 1.275

acetato de etilo 5.67 1.891

Lavado de tween

Eter de petróleo 2.54 0.848

Diclorometano 0.32 0.108

acetato de etilo 1.73 0.576

10.7. Pruebas de actividad antimicrobiana

1ª

_1B

_1C

1D

1E

_1F

2ª

_2B

_2C

2D

_2E

_2F

Figura 7. Pruebas de actividad antimicrobiana. 1. Contra P. aureginosa, 2. Comtra E. coli.

Fracciones probadas de izquierda a derecha: A. Arroz, biomasa, acetato –Arroz, biomasa, éter. B. Arroz, biomsa, diclorometano- Arroz, Tween, éter. C Cebada, Tween, acetato- Cebada, biomoasa, éter D.

1ª

_1B

_1C

1D

_1E

_1F

2ª

_2B

2C

2D

_2E

_2F

Figura 8. Pruebas de actividad antimicrobiana. 1. Contra S. aureus, 2. Contra B. subtilis.

Fracciones probadas de izquierda a derecha: A. Arroz, biomasa, acetato –Arroz, biomasa, éter. B. Arroz, biomsa, diclorometano- Arroz, Tween, éter. C Cebada, Tween, acetato- Cebada, biomoasa, éter D.

1 2 3

4 5 6

7 8 9

10 _{11 12}

Figura 9 Pruebas de actividad antimicrobiana contra F. oxysporum .Difusión en placa de agar (7mg/ml)

A. Arroz, biomasa, acetato – 1. Arroz biomasa éter. 2 cebada biomasa acetato, 3. Cebada Tween acetato, 4. Arroz biomasa acetato, 5. Arroz biomasa diclorometano, 6. Cebada biomasa diclorometano,

10.8. Cromatografías en capa fina

1A 1B 1C

2A 2B 2C

3A 3B 3C

Figura 10.Cromatografía en capa fina de los extractos obtenidos de la fermentación en medio sólido.

Carril 1: arroz-tween; Carril 2. Arroz-biomasa; Carril 3: Cebada-tween; Carril 4:Cebada biomasa. 1. Fracción de éter de petróleo; 2. Fracción de diclorometano; 3. Fracción de acetato de etilo;

1A 1B

2A 2B

3A 3B

Figura 11.Cromatografía en capa fina de las curvas de crecimiento.

Imágenes: de izquierda a derecha: curva en arroz, curva en cebada. Carriles: de izquierda a derechas:

1

2

3

Figura 12.Cromatografía en capa fina de las curvas de crecimiento reveladas con vainillina.

Imágenes: de izquierda a derecha: curva en arroz, curva en cebada. Carriles: de izquierda a derechas:

10.9. Cromatografía de gases

Tabla 9.Relación de los compuestos encontrados por cromatografía de gases. Fuente: Elaboración

propia

Fracción

Compuestos encontrados _%

coincidenci a

Abundancia en la fracción

(%) Tiempo de

retención

(min) Compuesto

Arroz biomasa

acetato

5,919 tetramethyl pyrazine 94 11,5

2,442 2,3-Butanediol 91 2,5

2,331 n-Butyl acetate 86 9,65

2,439 1,3-Butanediol 91 2,5

Arroz biomasa éter

5,915 tetramethyl pyrazine 94 5,318

15,525 Ethyl palmitate 99 2,152

15,710 Hexadecanoic acid 99 15,342

17,580 Ethyl linoleate 93 3.008

17,918 9, 12-Octadecadienoic acid 99 41,709

Arroz tween éter

12,649 5-hydroxy-2-

(hydroxymethyl)- 4H-Pyran-4-one

90 2,045

17,591 Ácido oléico 99 2,70

Arroz biomasa Diclorometano

15,623 n-Hexadecanoic acid 98 3,43

17,780 9,17-Octadecadienal 90 2,4

20,996 9,12-Octadecadienoic acid 99 5,012

Cebada

tween Acetato 15,353 17,648 Hexadecanoic acid 9-Octadecenoic acid 99 99 11,953 11,38 Cebada

Biomasa éter

20,996 9,12-Octadecadienoic acid 95 23,097

22,437 Testosterone 95 6,969

Cebada biomasa diclorometano

2,543 2,3-Butanediol 91 7,361

5,922 Tetramethylpyrazin 94 2,83

15,653 Hexadecanoic acid 99 10,388

17,840 9,12-Octadecadienoic acid 99 31,66

23,403 Pyrrolo[1,2-a]pyrazine -1,4-

dione 97 1,853

Cebada biomasa

acetato

2,459 2,3-Butanediol 91 1,233

5.992 Tetramethylpyrazin 92 2,817

15,649 Hexadecanoic acid 99 1,320

17,573 9,12-Octadecadienoic acid 98 1,002

23,399 Pyrrolo[1,2-a]pyrazine -

Figura 13.Cromatograma general fracción arroz, biomasa, acetato

Figura 15.Cromatograma general fracción arroz, tween, éter