Estrés oxidativo, actividad antioxidante y senescencia celular en fibroblastos con trisomía del cromosoma 21

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(1).  . . Estrés oxidativo, actividad antioxidante y senescencia celular en fibroblastos con trisomía del cromosoma 21 Ángel Vilches García.   . ADVERTIMENT. La consulta d’aquesta tesi queda condicionada a l’acceptació de les següents condicions d'ús: La difusió d’aquesta tesi per mitjà del servei TDX (www.tdx.cat) i a través del Dipòsit Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha estat autoritzada pels titulars dels drets de propietat intel·lectual únicament per a usos privats emmarcats en activitats d’investigació i docència. No s’autoritza la seva reproducció amb finalitats de lucre ni la seva difusió i posada a disposició des d’un lloc aliè al servei TDX ni al Dipòsit Digital de la UB. No s’autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX o al Dipòsit Digital de la UB (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentació de la tesi com als seus continguts. En la utilització o cita de parts de  la tesi és obligat indicar el nom de la persona autora. ADVERTENCIA. La consulta de esta tesis queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso: La difusión de esta tesis por medio del servicio TDR (www.tdx.cat) y a través del Repositorio Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha sido autorizada por los titulares de los derechos de propiedad intelectual únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro ni su difusión y puesta a disposición desde un sitio ajeno al servicio TDR o al Repositorio Digital de la UB. No se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR o al Repositorio Digital de la UB (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al resumen de presentación de la tesis como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes de la tesis es obligado indicar el nombre de la persona autora. WARNING. On having consulted this thesis you’re accepting the following use conditions: Spreading this thesis by the TDX (www.tdx.cat) service and by the UB Digital Repository (diposit.ub.edu) has been authorized by the titular of the intellectual property rights only for private uses placed in investigation and teaching activities. Reproduction with lucrative aims is not authorized nor its spreading and availability from a site foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository. Introducing its content in a window or frame foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository is not authorized (framing). Those rights affect to the presentation summary of the thesis as well as to its contents. In the using or citation of parts of the thesis it’s obliged to indicate the name of the author..

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(21) $'##6$ #   .    ,'    . .      .   >     .    .   .   .   >  K . .  .   ($  . K          K  .       .     O '99.     . .  .     : A . .   .  "   .  .  . K .   4. .  X3K 5Y( D .  K .  .   .  . . K   K.  .     6   X8Y( /A         :.          .           .  K  4.   . .    ,3    39 < ( @.    !    7    : .    O  !    . !    . .    . . :  .   .  . .  .   A    :      O   > K A     . (  .   7 .  .   6  +9 < K.   <       * K       .  . "       .    %  . N    A ?  " 4     .  .    K   4    .  A   2( @ % . K    K .  =   .       4 . :    A    O          . 1 N.  !    .     %    >   K   .   A     N.  K   .  .  2 A .    ! )"1  \+0 < 2      .   .  A . . .       !.  ! . K. 4.    %. .  O  !.  1 ,0[      . ( % :    .   !. !   X0Y( ) 7. .  .       %K.  .   4  .      :'P599 'P',99.   .  .   . . . . . . .  7   :. K  A 7 <  7   .  :   7   . > A . K .  .   . . %   .  7.    .  .    .   .  . "         (.  *1) - - -. . . .          %. C  .    !    .     K ! 4    A : N! XBY(#  !      !.      "   .   . .  A   .  . . 4  A.   1C. +9A592.   7  . C   < . .  ( @                   7  .  .    N. 4  "  . .  .   () K A7 <  O K  4   .        !  . )"    >     7 A  7 :  4     .  A      >  X'9Y(!4 .    4 :    %     X''YK          . .  . K   7  .  <A  .     : X',Y     .

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(24) $'##6$ %  O   " ! .   :  .      .            /%),'K A. .  ! .       :4   7   ^+3-    .  .    !   .   (@      K.    1; +2K. .      '3 1'32 7   ,+K+ :K    . 4  '51'527  'K':A 6      '91'927   .  4 .        /%),'K     :        . ^,+0   +   4 4  .      .      .  4 . ,K,:X+5Y(. . Figura 3. Cromosoma 21 humano (HSA21) con los cromosomas ortólogos de ratón (MMU10, MMU16 y MMU17). Esquema de los segmentos génicos involucrados en la llamada “región crítica del síndrome de Down” (DSCR) en HSA21 y diferentes modelos trisómicos de ratón. El ratón Ts65Dn (trisómico para MMU16) contiene todos los genes de la DSCR y otros como el de la SOD1 y APP. Figura modificada procedente de la referencia [7]..  *191*#.  E  =F  . #     4  :4     :  %     A !    .     .             /%),' =  K . !       %(@=    4      4          >  WK    " O          4     . .   A .  K   .   K   . :.  .     V .      .     =    !     % .     :=  4  .      .   /%),'(# .  .

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(29) $'##6$ )1 ! @ > V > = V . WK   "  / % X0005YK ! .    4  : .  =.     :  <  :>.        NK         .  "       . P. =. W(#  <    !      <   .      A      .     $#. =  7 !             !    =   K. .  . K  O  :   .   ).   .     .  :>. :A   N. .  >.  . .    > . ( @. K 7  . .    .    !   . X38Y(   : N.   :O  ?   > A        . = 4   $#( %  : K   .      :a  .    89K    > =     <       O   $#  6.    O.   %. @      K   7   N  . =. >   6    !   A.  X3-33Y( %6    V- . ,W X35YK   . :4.  !. .      4  A.  X053+Y( @  >  =. =       :  1$#2K    4         N.  !    K.   >  =   .  :a    A .   .  < KO :  .     $#  !     K . . 1 : +2 . 7 .   A         4 X3B5,Y(.  Tabla 3. Múltiples patologías en las que se observa la implicación, en mayor o menor medida de radicales libres. Infarto agudo de miocardio Artritis reumatoide Enfermedad granulomatosa crónica Fibrinolisis. Shock. Síndrome de Batten. Angioplastia coronoraria (ACTP). Diabetes. Tumores. Deficiencias inmunitarias. Ateriosclerosis. Síndrome de Down. Arteriosclerosis. Esofagitis. Envejecimiento. Deficiencia de mieloperoxidasa. Enfisema pulmonar. @ > = K:  !   $#K      = .  .  (  . . .    >  =.  K     =.   <= .     .    4         .    . .  4  7    !. .  .    .  . . .    . . .   .          :   =        !. A   4  N. 4 (.      4   . .     .  1 = 4    K = 4   D)K = 4    .  :  2K   =. = . K  .  : .    4    .   7   .

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Figura 1. Cariotipo de una niña con síndrome de Down, se aprecian 3 copias del cromosoma 21

Figura 1.

Cariotipo de una niña con síndrome de Down, se aprecian 3 copias del cromosoma 21 p.20
Figura 2. (A) Gráfica resumida de los genes conocidos, repeticiones y variaciones del crosomosoma 21 humano (HSA21)

Figura 2.

(A) Gráfica resumida de los genes conocidos, repeticiones y variaciones del crosomosoma 21 humano (HSA21) p.23
Figura 3. Cromosoma 21 humano (HSA21) con los cromosomas ortólogos de ratón (MMU10, MMU16 y MMU17)

Figura 3.

Cromosoma 21 humano (HSA21) con los cromosomas ortólogos de ratón (MMU10, MMU16 y MMU17) p.24
Figura 6. Presunta adaptación del síndrome de Down al estrés oxidativo. El estrés oxidativo se relaciona con la patogénesis y progresión del SD

Figura 6.

Presunta adaptación del síndrome de Down al estrés oxidativo. El estrés oxidativo se relaciona con la patogénesis y progresión del SD p.44
Figura 7. Sobreexpresión del gen SOD1 y síndrome de Down. Las condiciones incrementadas del estrés oxidativo están causadas por la sobreexpresión de algunos genes codificados en el HSA21

Figura 7.

Sobreexpresión del gen SOD1 y síndrome de Down. Las condiciones incrementadas del estrés oxidativo están causadas por la sobreexpresión de algunos genes codificados en el HSA21 p.45
Figura 8. Eventos moleculares relacionados con el estrés oxidativo y la senescencia celular

Figura 8.

Eventos moleculares relacionados con el estrés oxidativo y la senescencia celular p.50
Figura 9. Múltiples factores inducen senescencia. Diferentes tipos de estrés pueden provocar la activación de la senescencia

Figura 9.

Múltiples factores inducen senescencia. Diferentes tipos de estrés pueden provocar la activación de la senescencia p.51
Figura 10. Control de la senescencia por las vías de p53 y p16/RB. Las señales inductoras de senescencia, incluyendo daño en el DNA o activación de oncogenes, activan la vía de p53 o la de p16/RB

Figura 10.

Control de la senescencia por las vías de p53 y p16/RB. Las señales inductoras de senescencia, incluyendo daño en el DNA o activación de oncogenes, activan la vía de p53 o la de p16/RB p.53
Figura 11. Fenotipo senescente inducido por estrés oxidativo. Cuando una célula normal está expuesta a un estímulo como el estrés oxidativo, entra en senescencia adquiriendo un fenotipo senescente determinado con unas características reconocibles in vitro

Figura 11.

Fenotipo senescente inducido por estrés oxidativo. Cuando una célula normal está expuesta a un estímulo como el estrés oxidativo, entra en senescencia adquiriendo un fenotipo senescente determinado con unas características reconocibles in vitro p.54
Figura 12. La disfunión mitocondrial como un mecanismo efector de la senescencia celular

Figura 12.

La disfunión mitocondrial como un mecanismo efector de la senescencia celular p.58
Figura 13. ((ROOA) AAPH 2,2'-azo-bis(2-amidino-propano) dihidrocloruro se somete a termolisis, generando nitrogeno (N2) y dos radicales alquilo (basados en el carbono), los cuales reaccionan con el O2 para dar radicales alcoxilo (RO•) y peroxilo •)

Figura 13.

((ROOA) AAPH 2,2'-azo-bis(2-amidino-propano) dihidrocloruro se somete a termolisis, generando nitrogeno (N2) y dos radicales alquilo (basados en el carbono), los cuales reaccionan con el O2 para dar radicales alcoxilo (RO•) y peroxilo •) p.70
Figura 14. Método para determinar la cantidad de ATP por medio de la luciferina y midiendo la cantidad de luz emitida

Figura 14.

Método para determinar la cantidad de ATP por medio de la luciferina y midiendo la cantidad de luz emitida p.73
Figura 15. Fotografía de una electroforesis en condiciones desnaturalizantes, en la primera columna se muestra el marcador, en la segunda el RNA degradado y en la tercera el RNA intacto.

Figura 15.

Fotografía de una electroforesis en condiciones desnaturalizantes, en la primera columna se muestra el marcador, en la segunda el RNA degradado y en la tercera el RNA intacto. p.76
Figura 16. Esquema con las etapas de la PCR a tiempo real y el principio que permite relacionar la emisión de florescencia con la cantidad de producto amplificado

Figura 16.

Esquema con las etapas de la PCR a tiempo real y el principio que permite relacionar la emisión de florescencia con la cantidad de producto amplificado p.78
Figura 17. Método de Andersen para determinar la actividad superóxido dismutasa (SOD)

Figura 17.

Método de Andersen para determinar la actividad superóxido dismutasa (SOD) p.79
Figura 18. Método de Plagia y Valentine para determinar la actividad glutatión peroxidasa (GPx)

Figura 18.

Método de Plagia y Valentine para determinar la actividad glutatión peroxidasa (GPx) p.80
Figura 19. Producción intracelular de ROS en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC)

Figura 19.

Producción intracelular de ROS en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC) p.92
Figura 20. Detección de peróxidos intracelulares por medio de la sonda DCFH-DA a través de microscopía de fluorescencia en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC)

Figura 20.

Detección de peróxidos intracelulares por medio de la sonda DCFH-DA a través de microscopía de fluorescencia en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC) p.94
Figura 21. Determinación proteica de los complejos de la cadena de transporte de electrones mitocondrial y de la enzima antioxidante mitocondrial SOD2 en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC)

Figura 21.

Determinación proteica de los complejos de la cadena de transporte de electrones mitocondrial y de la enzima antioxidante mitocondrial SOD2 en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC) p.95
Figura 23. Detección del anión superóxido (O2tratadas), tanto a pases bajos sonda .-) mitocondrial y de la red o masa mitocondrial por medio de las sondas fluorescente MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator y MitoTracker® Green FM,respectivamente,

Figura 23.

Detección del anión superóxido (O2tratadas), tanto a pases bajos sonda .-) mitocondrial y de la red o masa mitocondrial por medio de las sondas fluorescente MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator y MitoTracker® Green FM,respectivamente, p.99
Figura 24. Determinación de los niveles de expresión a nivel de mRNA de los genes que codifican las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa citosólica (SOD1), superóxido dismutasa mitocondrial (SOD2), glutatión peroxidasa dependiente de Se (GPx1) y cata

Figura 24.

Determinación de los niveles de expresión a nivel de mRNA de los genes que codifican las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa citosólica (SOD1), superóxido dismutasa mitocondrial (SOD2), glutatión peroxidasa dependiente de Se (GPx1) y cata p.100
Figura 25. Efecto de los pases celulares en la expresión proteica de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa citosólica (SOD1) y mitocondrial (SOD2) en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC).altos (8-12) en lisados celulares de fibroblas

Figura 25.

Efecto de los pases celulares en la expresión proteica de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa citosólica (SOD1) y mitocondrial (SOD2) en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC).altos (8-12) en lisados celulares de fibroblas p.101
Figura 26. Actividad enzimática antioxidante de la superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPx) y catalasa (CAT) en lisados celulares de fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y controles (FC)

Figura 26.

Actividad enzimática antioxidante de la superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPx) y catalasa (CAT) en lisados celulares de fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y controles (FC) p.103
Figura 27. Valores de las ratios enzimáticas antioxidantes (SOD/GPx, SOD/CAT y SOD/GPx+CAT) en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC).relativizados

Figura 27.

Valores de las ratios enzimáticas antioxidantes (SOD/GPx, SOD/CAT y SOD/GPx+CAT) en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC).relativizados p.104
Figura 28. Contenido de malondialdehído (MDA) en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC)

Figura 28.

Contenido de malondialdehído (MDA) en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC) p.105
Figura 30. Determinación de las expresiones proteicas de p21 y de p53 mediante Western Blot en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC)

Figura 30.

Determinación de las expresiones proteicas de p21 y de p53 mediante Western Blot en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC) p.108
Figura 32. Detección de la actividad SA-ß-Galactosidasa por microscopía de contraste de fases y contaje de las células SA-ß-Gal positivas en los fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC).al azar y de 50-100 células por campo, a continuación se cal

Figura 32.

Detección de la actividad SA-ß-Galactosidasa por microscopía de contraste de fases y contaje de las células SA-ß-Gal positivas en los fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC).al azar y de 50-100 células por campo, a continuación se cal p.110
Figura 33. Determinación de la concentración de citocromo C mediante ELISA en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC)

Figura 33.

Determinación de la concentración de citocromo C mediante ELISA en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC) p.112
Figura 34. Determinación de los niveles de expresión proteica del citocromo C y caspasa 9 activada en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC)

Figura 34.

Determinación de los niveles de expresión proteica del citocromo C y caspasa 9 activada en fibroblastos con trisomía 21 (FT21) y control (FC) p.113

Referencias

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