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"Evaluación de la Actividad Anti-Inflamatoria de Flavonoides Recuperados con un Tratamiento Alcalino Presentes en Opuntia Ficus Indica Variedad Jalpa"-Edición Única

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Academic year: 2017

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INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY

PRESENTE.-Por medio de la presente hago constar que soy autor y titular de la obra denominada

, en los sucesivo LA OBRA, en virtud de lo cual autorizo a el Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey (EL INSTITUTO) para que efectúe la divulgación, publicación, comunicación pública, distribución, distribución pública y reproducción, así como la digitalización de la misma, con fines académicos o propios al objeto de EL INSTITUTO, dentro del círculo de la comunidad del Tecnológico de Monterrey.

El Instituto se compromete a respetar en todo momento mi autoría y a otorgarme el crédito correspondiente en todas las actividades mencionadas anteriormente de la obra.

De la misma manera, manifiesto que el contenido académico, literario, la edición y en general cualquier parte de LA OBRA son de mi entera responsabilidad, por lo que deslindo a EL INSTITUTO por cualquier violación a los derechos de autor y/o propiedad intelectual y/o cualquier responsabilidad relacionada con la OBRA que cometa el suscrito frente a terceros.

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"Evaluación de la Actividad Anti-Inflamatoria de Flavonoides

Recuperados con un Tratamiento Alcalino Presentes en Opuntia

Ficus Indica Variedad Jalpa"-Edición Única

Title

"Evaluación de la Actividad Anti-Inflamatoria de

Flavonoides Recuperados con un Tratamiento Alcalino

Presentes en Opuntia Ficus Indica Variedad Jalpa"-Edición

Única

Authors

Beatriz Eugenia Moreno García

Affiliation

Tecnológico de Monterrey, Campus Monterrey

Issue Date

2011-12-01

Item type

Tesis

Rights

Open Access

Downloaded

18-Jan-2017 13:13:17

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INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS

SUPERIORES DE MONTERREY

CAMPUS MONTERREY

ESCUELA DE BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTOS

PROGRAMA DE GRADUADOS EN BIOTECNOLOGÍA

TEC de Monterrey

DEL SISTEMA TECNOLÓGICO DE MONTERREY

"Evaluación de la actividad anti­inflamatoria de flavonoides

recuperados con un tratamiento alcalino presentes enzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA Opuntia ficus indica variedad Jalpa"

TESIS

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA

OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:

MAESTRA EN CIENCIAS CON

ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA

(5)

CAMPUS MONTERREY

ESCUELA DE BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTOS

PROGRAMA DE GRADUADOS EN BIOTECNOLOGÍA

TECde Monterrey

DEL SISTEMA TECNOLÓGICO DE MONTERREY

"Evaluación de la actividad anti-inflamatoria de flavonoides recuperados con un

tratamiento alcalino presentes enzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA Opuntia ficus indica variedad Jalpa"

TESIS

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:

MAESTRA EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGIA

POR:

BEATRIZ EUGENIA MORENO GARCÍA

(6)

INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY

CAMPUS MONTERREY

ESCUELA DE BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTOS PROGRAMA DE GRADUADOS EN BIOTECNOLOGÍA

Los miembros del comité de tesis recomendamos que el presente proyecto de tesis presentado por la Q.F.B. Beatriz Eugenia Moreno García, sea aceptado como requisito parcial para obtener el grado académico de:

Maestra en Ciencias con Especialidad En Biotecnología

Comité de Tesis:

Dra. Janet Alejandra Gutiérrez Uribe asesor

Dr. Sergio Román Othón Serna Saldívar Sinodal

Dr. Daniel Alberto Jacobo Velázquez Sinodal

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Resumen

El nopal Opuntia ficus indica es un vegetal que pertenece a la familia de las Cactaceae. Es considerado uno de los principales cultivos en México, y forma parte de las tradiciones religiosas, medicinales y alimentarias del país. Ancestralmente ha sido estudiado en el tratamiento de enfermedades crónico degenerativas, y dentro de sus principales propiedades se encuentra que posee actividad antioxidante, hipocolesterolemica, hipoglucemiante y antiinflamatoria. Se ha reportado que es un alimento con alto contenido en fibra dietética, lo que le brinda gran parte de sus propiedades. Sin embargo, también se ha reportado la presencia de compuestos fenólicos entre ellos, algunos flavonoides, principalmente la quercetina, el kaempferol y la isorhamnetina. Estos son compuestos antioxidantes que ayudan a la prevención de enfermedades, por ejemplo en la inhibición de la producción de óxido nítrico durante el proceso de inflamación crónica.

Es por ello, que uno de los principales objetivos de este trabajo fue determinar el perfil de compuestos fenólicos (flavonoides glicosilados) presentes en la harina de nopal mexicano Opuntia ficus indica variedad Jalpa, teniendo como hipótesis principal que una hidrólisis alcalina permitiría obtener mayor cantidad de flavonoides. Adicionalmente, a través de un estudio in vitro, se logró observar el efecto que tienen estos compuestos sobre la producción de óxido nítrico (NO). Para ello se utilizaron células de macrófago RAW 264.7 con el fin de determinar si los extractos poseen capacidad antiinflamatoria.

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'Evaluación de la act ividad ant iinflam at oria de flavonoides recuperados con un t rat am ient o alcalino p resent es en Opunt ia ficus indica variedad Jalp a"

una mayor liberación de flavonoides principalmente en forma glicosilada (90 %). El flavonoide isorhamnetina fue el que mostró mayor presencia, constituyendo junto con sus derivados glicosilados casi el 95 % del total de los flavonoides presentes, el resto fue debido a la presencia de kaempferol y sus derivados. Fue posible encontrar cuatro nuevos compuestos glicosilados que no habían sido reportados, los cuales fueron denominados KG1, KG2, KG3 E IG7, y correspondieron a moléculas di, tri, y tetraglicosiladas, lo que las convirtió en moléculas de gran tamaño y peso molecular.

Por otro lado, la cuantificación de fenólicos totales mostró que a los 60 y 150 minutos de tratamiento alcalino se obtuvieron los mayores valores (16.98 y 16.37 ugEAG/g de muestra, respectivamente), lo cual significó que la cantidad de fenólicos se vio incrementada conforme el tiempo de tratamiento alcalino, esto al compararlo con los valores que dio el extracto metanólico (9.16 ugEAG/g). Posterior a la hidrólisis ácida que recibieron éstos mismos extractos sometidos a 0, 60, 120 y 150 minutos de tratamiento alcalino, los valores de fenólicos totales incrementaron. En éste caso, el mayor incremento se dio en el extracto de 120 minutos, aumentando más del 100 % el valor obtenido de los fenólicos totales mientras que los presentes en el extracto metanólico sólo se vio incrementado un 65 %.

En cuanto a la actividad antioxidante, el extracto que recibió 120 minutos de tratamiento alcalino mostró los mayores valores (12.21 umolET/g de muestra) y contrario a lo que se ha reportado, los valores posteriores a la hidrólisis ácida disminuyeron. El flavonoide que mayor contribución tuvo en la actividad antioxidante fue el KG1 (R2 de 0.71, p < 0.05). Además, en general no se observó correlación entre fenólicos totales y actividad antioxidante.

(9)

que recibió 60 minutos de tratamiento alcalino (0.4 y 0.04 u.g/ml), se obtuvo una mejor inhibición de la producción de óxido nítrico (NO) (67 y 55.7 %,

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"Evaluación de la act ividad ant iinflam at oria de flavonoides recuperados con un t rat am ient o alcalino p resent es en Opunt ia ficus indica variedad Jalp a"

Agradecimientos

"El agradecimiento es la memoria del corazón" Lao-Tse

Primeramente a Dios, por permitirme llegar a este momento tan especial en mi vida. Por los triunfos y los momentos difíciles que me han enseñado a valorarte cada día más. Gracias por acompañarme todos los días.

A mis padres, que son mi mayor orgullo. Gracias por el apoyo, por sus consejos y motivación constante. Por confiar en mi (incluso cuando ni yo misma lo hago), pero sobre todo, gracias por su amor infinito. Les debo lo que soy, por lo tanto, este logro es de ustedes también. Los quiero mucho.

A Joako, gracias por ser mi sigiloso guardián y compañero, ¡eres el mejor hermano! Gracias por tu paciencia.

A Fá, porque desde que naciste me enseñaste el valor de un equipo, de la amistad y la complicidad. Gracias por compartir conmigo un sueño más.

A mis tíos y primos, que me han enseñado el valor de la familia. Por su apoyo constante e incondicional, pero sobre todo, por ser un ejemplo y un estímulo a querer vivir y sacarle todo el jugo a la vida. Gracias, porque no han dejado que el significado de familia se quede sólo en 4

personas.

A mis abuelos presentes y los que se adelantaron en el camino. Gracias especialmente a ti, porque dentro de una de tus sonrisas eternas, aprendí que la vida está llena de satisfacciones no materiales.

A ti, que a pesar de estar a 8000 km de distancia, te siento cerca. Gracias por esa alegría contagiante y la actitud positiva ante la vida que te caracteriza, Ich liebe dich.

Este documento es el resultado del trabajo realizado con ilusión y esfuerzo, un documento que nunca hubiera visto la luz sin el acompañamiento educativo, generoso y sin condiciones de mi asesora, la Dra. Janet Gutiérrez, y de todos aquellos compañeros y amigos que compartieron conocimientos, pláticas y diversión sin esperar nada a cambio. Especialmente Víctor, Marco, Daniel, Keila, Kike, Bertha, Lily, Marysol, Ulises, Chuy, Karla, Dulce y Lau. ¡Gracias a todos!

Al Dr. Sergio Serna, por permitirme formar parte de su equipo de trabajo y al Dr. Daniel Jacobo, por sus valiosas aportaciones.

(11)

índice general

Resumen I

Agradecimientos IV

índice general V

índice de tablas IX

índice de figuras X

Lista de Abreviaturas XII

Capítulo 1: Introducción 1

Capítulo 2: Antecedentes 3

2.1 Alimento funcional 3

2.2 Generalidades de Opuntia spp. 3

2.2.1 Descripción e información taxonómica de la planta 4

2.2.2 Composición química del nopal 7

2.3 Compuestos fenólicos 10

2.3.1 Flavonoides 11

2.3.2 Absorción y biodisponibilidad de flavonoides 13

2.3.3 Ingesta de flavonoides 17

2.3.4 Extracción de flavonoides ligados 18

2.3.5 Propiedades de los flavonoides 20

2.3.5.1 Capacidad antioxidante 21

2.3.6 Estudios previos que relacionan el nopal y los

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"Evaluación de la act ividad ant iinflam at oria de flavonoides recuperados con un t rat am ient o alcalino p resent es en Opunt ia ficus indica variedad Jalp a"

2.4 Inflamación 24

2.4.1 Óxido nítrico y su relación en la inflamación 25

2.4.2 Flavonoides e inflamación 26

2.4.3 Flavonoides y producción de óxido nítrico 27

2.5 Justificación 30

2.6 Objetivos 31

Capítulo 3: Materiales y métodos 32

3.1 Reactivos y materiales 32

3.2 Extracción de compuestos 33

3.2.1 Extracción de compuestos solubles en metanol 33 3.2.2 Optimización del procedimiento de extracción de

flavonoides totales 33

3.3 Extracción en fase sólida 34

3.3.1 Extracción en fase sólida de los extractos metanólicos 34 3.3.2 Extracción en fase sólida de los extractos alcalinos 35

3.4 Hidrólisis ácida de los extractos 36

3.5 Caracterización de los extractos de harina de nopal Opuntia ficus

Indica variedad Jalpa 36

3.5.1 Detección y cuantificación de los compuestos mediante

HPLC 36

3.5.2 Identificación de flavonoides glicosilados mediante

HPLC­MS­TOF 37

3.5.3 Cuantificación de fenólicos totales en los diferentes

(13)

3.6 Bioensayo de producción de óxido nítrico (NO) en la línea celular

Raw 264.7 de macrófagos de ratón 39

3.6.1 Mantenimiento de la línea celular 39

3.6.2 Bioensayo de producción de óxido nítrico (NO) 39

3.6.3 Ensayo de viabilidad celular 41

3.7 Análisis estadístico 42

Capítulo 4: Resultados y discusiones 43

4.1 Optimización del procedimiento de extracción de flavonoides totales 43

4.2 Identificación de flavonoides presentes en los extractos de harina

de nopal 45

4.2.1 Análisis de los espectros de absorción de los flavonoides

encontrados en los extractos de harina de nopal 45

4.2.2 Análisis de los espectros de masas de los flavonoides

encontrados en los extractos de harina de nopal 47

4.3 Cuantificación de flavonoides presentes en los extractos de harina

de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa 52

4.3.1 Cuantificación de flavonoides presentes en los extractos

alcalinos y metanólicos 52

4.3.2 Cuantificación de flavonoides presentes en los extractos de

harina de nopal, posterior a una hidrólisis ácida 55

4.4 Cuantificación de fenólicos y actividad antioxidante en los extractos

obtenidos de harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa 58

4.4.1 Cuantificación de fenólicos 58

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"Evaluación de la act ividad ant iinflam at oria de flavonoides recuperados con un t rat am ient o alcalino p resent es en Opunt ia ficus indica variedad Jalp a"

4.5 Evaluación in vitro de la capacidad antiinflamatoria de los compuestos presentes en los extractos alcalinos de la harina de nopal Opuntia

ficus indica variedad Jalpa 63

4.5.1 Viabilidad celular 63 4.5.2 Bioensayo de producción de óxido nítrico 64

Capítulo 5: Conclusiones 68

(15)

índice de tablas

Tabla 2.1zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA Información de la taxonomía del nopal 5

Tabla 2.2 Comparación física entre diferentes especies de Opuntia spp. 6

Tabla 2.3 Análisis bromatológico de cladodios de Opuntia spp. en tres especies

diferentes 8

Tabla 2.4 Clasificación de flavonoides en base a su estructura química

ejemplificado con el miembro más representativo de cada grupo 12 Tabla 2.5 Parámetros farmacocinéticos obtenidos después de la ingesta de

glicósidos de quercetina (311 uM) en 9 sujetos de estudio 16 Tabla 2.6 Concentración de flavonoles (ug/g de muestra en base seca) en frutos

de diferentes especies de Opuntia spp. 22

Tabla 3.1 Gradiente de solventes utilizado para la separación de compuestos

flavonoles mediante HPLC­PDA 37

Tabla 4.1 Características espectrales de los flavonoides identificados en el

extracto obtenido con un tratamiento alcalino durante 60 minutos 49 Tabla 4.2 Concentración de flavonoides de Opuntia ficus indica variedad Jalpa en

un extracto metanólico y en extractos obtenidos a diferentes tiempos de

tratamiento alcalino 53

Tabla 4.3 Concentración de flavonoides presentes en harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa posterior a una hidrólisis ácida, que recibieron los extractos metanólicos y los extractos alcalinos obtenidos a diferentes

tiempos 57

Tabla 4.4 Cuantificación de fenólicos y actividad antioxidante en los extractos

obtenidos de harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa 59

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"Evaluación de la act ividad ant iinflam at oria de flavonoides recuperados con un t rat am ient o alcalino p resent es en Opunt ia ficus indica variedad Jalp a"

Í

ndice de figuras

Figura 2.1zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA Estructura básica de los flavonoides 11 Figura 2.2 Estructuras químicas de los flavonoides más comunes en la dieta 12

Figura 2.3 Estructuras químicas presentes en los suplementos proporcionados en

el estudio. l)Estructura de quercetina aglicona, ll)quercetina­4­0­β­D­glucósido presente en cebollas, lll)estructura de quercetina­3­O­p­galactósido

presente en manzanas, IV)quercetina­3­0­p­rutinósido o rutina 15 Figura 2.4 Estructura de un flavonol glicósido de kaempferol identificado en cladodios

de Opuntia dillenii. (Kaempferol­7­O­p­glucopiranosil­p­D­glucopiranósido) 23 Figura 2.5 Efecto en la producción de óxido nítrico (NO) en células Raw 264.7

posterior a una Incubación con flavonoides activados con lipopolisacáridos

LPS (50ng/ml) 28

Figura 3.1 Procedimiento para enriquecer la fracción de flavonoides de interés obtenidos en los extractos de harina de nopal, mediante una extracción

en fase sólida 34

Figura 3.2 Procedimiento seguido para la preparación de placas con células

Raw 264.7 de macrófagos de ratón en el bioensayo de medición de NO 40 Figura 4,1 Cromatogramas de flavonoides obtenidos a 365 nm de los extractos de

harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa con diferentes tiempos

de tratamiento alcalino, a) 30 y 60 min b) 90,120 y 150 minutos 44 Figura 4.2 Espectros de absorción en el rango UV­Vis de: a) estándar de isorhamnetina

b) isorhamnetina presente en el extracto a los 60 minutos de tratamiento alcalino, c) estándar de kaempferol, d) kaempferol presente en el extracto

a los 60 minutos de tratamiento alcalino 46

Figura 4.3 Espectro de masas de isorhamnetin­glucosil­ramnosil­ramnósido

obtenido mediante LC­MS­TOF 47

Figura 4.4 Cromatograma típico obtenido mediante HPLC a 365 nm de los diversos flavonoides presentes en una muestra de harina de nopal Opuntia ficus

(17)

Figura 4.6zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA Contenido de flavonoides totales (cuantificados según su correspondiente aglicona) a diferentes tiempos de tratamiento alcalino en harina de Opuntia ficus indica variedad Jalpa, comparados con un extracto metanólico (E.M) 54 Figura 4.7 Contenido de flavonoides totales posterior a una hidrólisis ácida de los

extractos con diferentes tiempos de tratamiento alcalino de harina de Opuntia ficus indica variedad Jalpa comparados con los de un extracto

metanólico (E.M) 58

Figura 4.8 Porcentaje de viabilidad en células RAW 264.7 expuestas a diferentes con­ centraciones de extractos obtenidos de harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa. Los extractos fueron previamente obtenidos de la matriz

mediante un tratamiento alcalino a diferentes tiempos 64 Figura 4.9 Porcentaje de inhibición de la producción de óxido nítrico en células RAW

264.7 con flavonoles puros a 20 y con extractos alcalinos de Opuntia ficus indica variedad Jalpa obtenidos a diferentes tiempos y en 3 concentraciones

distintas 65

Figura A1 a) Cromatograma del extracto metanólico de harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa a 365nm. (K) Kaempferol, (KG3) Kaempferol­glucosil­ ramnosil­ramnosa + hexosa, (KG4) Kaempferol­glucosil­ramnósido, (IG1) Isorhamnetin­glucosil­ramnosil­ramnósido, (IG2) Isorhamnetin­ramnosil­

pentósido, (IG3) Isorhamnetin + 1 hexosa + 1 metilpentosa + 1 pentosa, (IG4) Isorhamnetin­glucosil­pentósido, (IG5) Isorhamnetin­glucosil­ramnósido. b)

Cromatograma del extracto metanólico posterior a la hidrólisis ácida. (I)

Isorhamnetina, (NI) Compuesto no identificado 80

Figura A2 Cromatogramas obtenidos de los extractos de harina Opuntia ficus indica variedad Jalpa. A) A los 0 min de tratamiento alcalino. B) A los 120 minutos

de tratamiento alcalino. 80

Figura A3 Cromatogramas obtenidos de los extractos de harina Opuntia ficus indica variedad Jalpa posteriores a una hidrólisis ácida, a) 120 minutos de

tratamiento alcalino previo, b) a los 60 min de tratamiento alcalino previo 81 Figura A4 Cromatograma obtenido mediante MS­TOF para el extracto de harina de

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Lista de abreviaturas

Abreviatura Significado

α

%

λ max

μ g μ L μm μM μmol AA AAPH AcOH bs cm Cmáx COX C 02

DNS EAG EM eNOS ET EtOH 9 h Ha H2O HCI HPLC Alfa Grados centígrados Porcentaje

Longitud de onda de máxima absorción Microgramo Microlitro Micrómetro Micromolar Micromol Ácido araquidónico 2,2'­Azobis (2­ metilpropionamidina)dihi drocloruro Ácido acético Base seca Centímetro Concentración máxima Ciclooxigenasa

Dióxido de Carbono Ácido dinitrosalicílico Equivalentes de ácido gálico

Extracto metanólico Óxido nítrico sintetasa endotelial

Equivalentes de Trolox Etanol Gramo Hora Hectáreas Agua Ácido clorhídrico High Performance/Pressure Liquid Chromatography I1 lsorhamnetina­3­O­ glucosil­rhamnosil­ rhamnósido

12 Isorhamnetina­glucosil­ rhamnosil­xilósido o arabinósido

13 Isorhamnetina­glucosil­ rhamnosil­rhamnosido

14 lsorhamnetina­3­O­ glucosil­rhamósido

IC50 Concentración inhibitoria del 50%

iNOS Óxido nítrico sintetasa inducida

K Kaempferol

K1 Kaempferol­glucosil­ xilósido o arabinósido

K2 Kaempferol­3­O­ glucosil­rhamnósido

kg Kilogramo

kPa Kilopascales

LDL Lipoproteína de baja densidad

L Litro

LOX Lipooxigenasa

LPS Lipopolisacárido

M Molar

MeOH Metanol

mg Miligramo

min Minutos

mL Mililitro

mm Milímetro

mM Milimolar

MS Espectrometría de masas

mta. Muestra

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Abreviatura Significado N NaOH NAD NADPH ND NED NF-KB ng nm nNOS NO NOS NSAID OFI-J ORAC PBS PDA PLA2 ppm Q ROS rpm SAID SBF Tmáx TMB Normalidad

Hidróxido de sodio Nicotinamida adenina dinucleótido

Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato Dato no disponible/no detectable

N­1­naftilendiamina Factor nuclear Kappa­β Nanogramo

Nanómetro

Óxido nítrico sintetasa neuronal

Óxido nítrico

Óxido nítrico sintetasa Antiinflamatorios no esteroideos

O. fícus-indica var. Jalpa Oxygen Radical

Absorbance Capacity Buffer de fosfatos Detector de arreglo de fotodiodos

FosfolipasazyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA A2

Partes por millón Quercetina

Especies reactivas de oxígeno

Revoluciones por minuto Anti­inflamatorios

esteroideos

Suero bovino fetal Tiempo máximo 3,3,5,5­

Tetrametilbenzidina

TNF Factor de necrosis tumoral

Ton Toneladas

UV-Vis Ultravioleta­visible

var. Variedad

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Capítulo 1: Introducción

Recientemente, el consumo de alimentos funcionales ha aumentado debido a que mejoran la salud humana. Se ha demostrado que estos alimentos ayudan en la prevención de enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo como el cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares e inflamación (Kim et al., 2006; Riezzo et al., 2005; Shi y Mazza, 2002).

México, cuenta con una amplia diversidad de especies de plantas y las cactáceas son del grupo más abundante. El cactus Opuntia ficus indica, vulgarmente llamado nopal, es una planta que se asocia a la cultura mexicana desde tiempos prehispánicos (Betancourt et al., 2006), y que ha sido utilizado con fines medicinales, alimentarios, ornamentales y de agricultura (Pimienta, 1994;

Ramírez et al., 2007; Stintzing y Carie, 2005).

Existen estudios relacionados con flavonoides que se encuentran en nopal y que le han atribuido por ejemplo, capacidad antioxidante (Lee et al., 2002) y anti­ inflamatoria (Cho et al., 2006). La inflamación es un proceso involucrado en el desarrollo de disturbios patológicos como aterosclerosis, diabetes, enfermedades neurodegenerativas y cáncer; y se han propuesto algunos mecanismos de cómo los flavonoides pueden afectar este proceso; destacando, la actividad antioxidante que poseen, o la inhibición de algunas enzimas pro­inflamatorias como el óxido nítrico (NO) (Moneada era/., 1991; Kroncke era/., 1998).

(21)

Sin embargo, estos métodos no extraen la mayor cantidad de flavonoides que pudieran existir en la matriz; ya que no son capaces de romper los enlaces de ligados a la pared celular y a su vez unidos covalentemente a otras moléculas como azúcares (Krygier et al., 1982; Bunzel etal., 2001; Nuutila et al., 2002).

La extracción de estos flavonoides glicosilados es importante, con el fin de conocer qué azúcares se encuentran unidos y de qué manera éstos pudieran modificar su biactividad. Por lo que se pensó que una forma de extracción diferente como lo es una hidrólisis alcalina permitiría extraer mayor cantidad de flavonoides en sus formas glicosiladas, y que a su vez, éstos serían capaces de inhibir la producción de óxido nítrico.

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"Evaluación de la act ividad ant iinflam at oria de flavonoides recuperados con un t rat am ient o alcalino p resent es en Opunt ia ficus indica variedad falpa"

Capítulo 2: Antecedentes

2.1 Alimento funcional

Los alimentos funcionales se definen como aquellos que en su estado natural o forma elaborada contienen, además de los componentes nutritivos, pequeñas cantidades de otros compuestos bioactivos que aportan más beneficios para la salud (Shi et al., 2002; Riezzo et al., 2005; Kim et al., 2006). Las plantas naturales se consideran una alternativa de fuente de alimento, ya que se ha demostrado que ayudan a mantener la salud de las personas. En las últimas décadas, numerosos estudios se han centrado principalmente en los alimentos ricos en fitoquímicos y propiedades funcionales.

Existe una relación positiva entre el consumo de alimentos de origen vegetal y la reducción del riesgo de padecer ciertas enfermedades; principalmente crónico degenerativas, como el cáncer, enfermedades cardiovasculares o diabetes (Block et al., 1992; Ness y Powles, 1997; Youdim y Joseph, 2001). En la mayoría de los casos ésta relación es atribuida a la presencia de compuestos con actividad antioxidante. El nopal es una planta natural considerada alimento funcional debido a su composición de fibra dietética y perfil fitoquímico.

2.2 Generalidades dezyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA Opuntia spp.

(23)

De todas las especies anteriores, el cactus más conocido y utilizado es Opuntia fícus-indica. Su uso se documenta desde los tiempos prehispánicos, donde los pueblos indígenas lo utilizaban principalmente como alimento o como remedio para enfermedades (Betancourt et al., 2006). Actualmente, también es utilizado como forraje para ganado (Ramírez eí al., 2007), materia prima en la elaboración de cosméticos (cremas, shampoo, jabones), y en la elaboración de productos para adelgazar (Stintzing y Carie, 2005).

El "nopal" (Opuntia ficus indica) es una planta que pertenece a la familia de las Cactaceae junto con la especie Nopalea. Su presencia se distribuye a lo largo del continente Americano; aunque también se pueden encontrar cultivos en lugares como África, Australia y el Mediterráneo (Piga, 2004; Sáenz eí al., 2006). En México, se localiza principalmente en las regiones semiáridas del centro del país (Pimienta, 1994), donde se observan menos de 250­450mm de precipitación al año (Stintzing eí al., 2005). Los estados de Guanajuato, Jalisco, Aguascalientes, San Luis Potosí, Zacatecas, Durango, Chihuahua, Coahuila, Nuevo León, Tamaulipas y Sonora son los que cuentan con mayor presencia de cactáceas; por lo que es considerada una planta que ha evolucionado en respuesta a la escasez de agua y a las variaciones extremas de temperatura.

2.2.1 Descripción e información taxonómica de la planta

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"Evaluación de la act ividad ant iinflam at oria de flavonoides recuperados con un t rat am ient o alcalino p resent es en Opunt ia flcus indica variedad Jalp a"

[image:24.612.153.438.264.410.2]

Los cladodios miden aproximadamente 30­60cm de largo, 20­40 cm de ancho y 1.9 a 2.8cm de ancho (Medina er a/., 2008). Se consideran jóvenes los que tienen de 3­4 semanas de edad y son utilizados principalmente como alimento; mientras que los que tienen entre 2­3 años de edad se consideran cladodios viejos y su uso es principalmente como forraje para rumiantes, especialmente en largas temporadas de sequía (LeHouerou, 1996). Su taxonomía se ilustra en la tabla 2.1.

Tabla 2.1 Información de la Taxonomía del Nopal

REINO Vegetal

SUBREINO Embryophíta

DIVISIÓN Angiospermae

CLASE Dycotyiedonea

SUBCLASE Dialipetalas

ORDEN Opuntiales

FAMILIA Cactaceae

SUBFAMILIA Opuntioideae

GÉNEROS Opuntia y Nopalea

Adaptado de Helia Bravo (1978).

(25)

Tabla 2.2 Comparación física entre diferentes especies de Opuntia spp. Característica 0. ficus-indica O. amyclae O. megacantha O. streptacantha

CLADODIO

Principalmente Oblongas a Obovados a

Forma elípticas elípticas Obovados circular

Largo (cm) 27 a 63 30 a 40 30 a 60 20 a 35

A n c h o (cm) 14 a 31 15 a 20 18 a 19.5 12 a 23

Grosor (cm) l a 3

1.5 a 2.5 2 a 4

AREOLAS

Longitud (mm) 2 a 8

2 a 4 3 a 5

ESPINAS Casi Ausente Presente Presente Presente

N ú m e r o por 0 a 1 l a 4 l a 7 l a 6

areola

Longitud (mm) 3 a 10 a 30 20 a 35 20 a 40

Color Blanco Blanco Blanco y café Blanco

FLOR

Longitud de 3.8-7.5 3 a 4 3 a 4

pericarpio (cm) . . .

FRUTO

Color de cascara Amarilla, Roja Amarilla-roja Amarilla o Roja-morada y Amarilla-roja a veces amarilla Longitud (cm) 5 a 10

4.5 a 11 4 a 6

Diámetro (cm) 4 a 7

3 a 4 4 a 5.5

Adaptado de Reyes (2005).

[image:25.612.95.533.118.488.2]
(26)

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Al ser uno de los principales cultivos en el país, su consumo es común entre los diferentes sectores de la población. El consumo per cepita diario de nopal en México es de aproximadamente (10­17 gramos) (Ávila er al., 2003).

2.2.2 Composición química del nopal

Se ha llegado a considerar que gran parte del efecto protector que proporcionan los vegetales y frutas puede ser atribuido principalmente a sus constituyentes antioxidantes, incluyendo vitamina C (ácido ascórbico), vitamina E (a­tocoferol), carotenoides, flavonoides y ácidos fenólicos (Sies y Stahl, 1995). Dentro de los compuestos bioactivos con los que cuenta el nopal se encuentran los compuestos fenólicos particularmente flavonoides, aunque también cuenta con carotenos, ácido ascórbico, fitoesteroles y clorofila (Gallegos er al., 2009).

Los nopalitos son considerados como una buena fuente de p­caroteno o provitamina A (11.3­53.5 u.g/100g de muestra fresca) y ácido ascórbico o vitamina C (7­22mg/ 100g de muestra fresca) (Rodríguez y Cantwell, 1988). Estas dos importantes vitaminas son conocidas por disminuir significativamente los riesgos de ciertos tipos de cáncer, enfermedades cardiovasculares y enfermedades crónico degenerativas asociadas con el envejecimiento (Ruíz er al., 2005; Rodríguez y Cantwell, 1988).

(27)
[image:27.612.119.481.263.370.2]

Rodríguez y Cantwell (1988), reportaron los constituyentes de los cladodios de tres diferentes especies de Opuntia; (Opuntia amyclaea, Opuntia ficus indica y Opuntia inermis). Los resultados se muestran en la tabla 2.3 y concuerdan con los de Feugang er al., (2006) que reportaron 88­95g de agua, 3­7g de carbohidratos, 1­2g de fibra, 0.5­1 g de proteína y 0.2g de lípidos /100 gramos de muestra fresca.

Tabla 2.3 Análisis bromatológico de cladodios Opuntia spp. en tres especies diferentes.

O. amyclaea O. ficus indica O. inermis

g/1 OOg muestra seca

Agua

92.0

a

91.5

a

91.7

a

Proteína

1.58

a

1.20

b

1.22

b

Lípidos

0.22

a

0.27

b

0.23

a

Fibra

1.43

a

1.29

c

1.38

b

Carbohidratos

5.26

c

5.81

a

5.55

b

Letra distinta por renglón indica diferencia estadísticamente significativa. Adaptado de Rodríguez y Cantwell (1998).

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Un estudio realizado por Hernández et al., (2010) en Opuntia ficus indica variedad Redonda mostró los contenidos de fibra a diferentes estados de madurez del cladodio; los resultados muestran un incremento de la fibra cruda de 11 g a 23.3g/100g de muestra seca en un periodo de 40 a 135 días de edad respectivamente. La fibra insoluble aumentó de 40.1g a 56.8g/100g de muestra en el mismo periodo; y la fibra soluble se disminuyó, de 25.5g (40 días) a 9.8g (135 días). Los resultados concuerdan con otro estudio conducido previamente por Ramírez eí al., (2007).

La fibra de nopal está integrada por diferentes componentes químicos que son resistentes a las enzimas digestivas como la celulosa, hemicelulosa, pectina, lignina, gomas, etc. (Periargo eí al., 1993). Se ha demostrado que el nopal tiene efectos anti­hiperlipidémicos, anti­hipocolesterolémicos, hipoglicémicos, así como efectos en el tratamiento de desórdenes gastrointestinales y enfermedades asociadas con baja ingesta de fibra dietética (Ayadi eí al., 2009; Feugang eí al., 2006; Gebremariam etal., 2006).

(29)

También se ha demostrado que el nopal tiene cantidades importantes de calcio, lo que le brinda un gran potencial para su uso en la prevención de enfermedades que se asocian con su deficiencia. Sin embargo, como ya se ha mencionado, el nopal sufre cambios en su composición química, dependiendo del estado de madurez, las condiciones climáticas y del suelo. Algunos estudios (Hernández er a/., 2011; Rodríguez et al., 2007; Sáenz, 2000) han demostrado que la presencia del calcio se ve incrementada conforme el cladodio tuvo una mayor madurez.

Por ejemplo, en el estudio realizado por Hernández er ai, (2010) se evaluó la presencia de calcio a diferentes estados de madurez utilizando Opuntia ficus indica variedad Redonda. Los resultados obtenidos mostraron que el contenido de calcio se incrementó cuando el estado de madurez cambió de 40 a 135 días de edad, aumentando de 17 a 35mg/g de muestra. Pero a su vez, otros minerales, como el potasio y el fósforo no mostraron cambios que sugieran que su contenido cambie significativamente dependiendo de la edad.

2.3 Compuestos fenólicos

En años recientes, los compuestos fenólicos pasaron a ser de atractivo interés para las investigaciones, principalmente por su poder antioxidante, que brinda protección al cuerpo humano de los radicales libres (Bors y Michel, 2002; Manach er al., 2004). Estos compuestos no pueden ser producidos por el cuerpo humano y por eso deben ser ingeridos en la dieta diaria o en forma de suplementos.

(30)

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2.3.1 Flavonoides

[image:30.612.146.434.297.476.2]

Los flavonoides están formados por un esqueleto común de difenilpiranos (C6­C3­C6), compuesto por dos anillos de fenilos (A y B) que se encuentran ligados a través de un anillo C de pirano (Figura 2.1), y se consideran compuestos de bajo peso molecular. Los flavonoides se clasifican de acuerdo a la posición de los grupos químicos en la molécula (Martínez etal., 2002). En la tabla 2.4, y en la figura 2.2 se representan las estructuras de los flavonoides más ingeridos en la dieta (Rui, 2004).

(31)
[image:31.612.104.502.167.612.2]

Tabla 2zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA.4 Clasificación de flavonoides en base a su estructura y miembros más representativos de cada grupo.

Clasificación Grupo y ubicación estudiado del grupo Compuesto más

Flavanos

Flavonoles

Flavonas

Antocianidinas

Un hidroxilo en la posición 3 del anillo C

Un carbonilo en la posición 4 y un hidroxilo en la posición 3 del anillo C

Un carbonilo en la posición 4 del anillo C

Un hidroxilo en la posición 3 y un doble enlace entre el carbono 3 y 4 del anillo C

Catequina

Quercetina Kaempferol

Diosmetina

Cianidina

Adaptado de Martínez (2002).

Diosmetina Cianidina

[image:31.612.105.482.385.625.2]
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Los flavonoides se sintetizan en el retículo endoplásmico y posteriormente son trasladados a diferentes sitios, principalmente a las vacuolas celulares. La solubilidad que tienen depende de la polaridad y la estructura química de la molécula (grado de hidroxilación, glicosilación, acetilación, etc.). Algunos de estos compuestos, pueden estar ligados a los componentes de la pared celular (polisacáridos, lignina) (Markham er al., 2000).

Las estructuras de flavonoles y flavonas normalmente tienen unidos azúcares, lo cual ocurre casi siempre en la posición C3 y raramente en la posición C7, por lo que éstos compuestos se encuentran en las plantas como O­ p­glicósidos (Kühnau, 1976; Hollman er al., 1999). El residuo de azúcar más frecuente es la D­glucosa, pero también pueden ser residuos de D­galactosa, L­ ramnosa, L­arabinosa o D­xilosa. La unión de azúcares puede modificar la hidrofobicidad de la molécula, sus propiedades biológicas e incrementar el peso molecular (McDonald et al., 1998). La parte sin azúcares de la molécula flavonoide se denomina aglicona. Los glicósidos son más solubles en agua y menos reactivos frente a radicales libres en comparación con su aglicona (Martínez er al., 2002).

2.3.2 Absorción y biodisponibilidad de flavonoides

(33)

Para determinar los porcentajes de absorción de quercetina; en el modelo incluyeron 100 mg de quercetina libre, quercetina glucosilada que se encuentra en cebollas (el equivalente a 89 mg de aglicona) y quercetina­rutinósido que se encuentra en el té negro (el equivalente a 100 mg de aglicona). Los nueve sujetos de estudio siguieron una dieta libre de quercetina durante 12 días; a los 4, 8 y 12 días recibieron los suplementos (como parte de un extracto) en orden aleatorio. Los resultados muestran que la quercetina aglicona tuvo una absorción de 24%, la quercetina glucosilada de las cebollas una absorción de 52% y la quercetina rutinosido de 17%. Sugiriendo con ello que los glucósidos de quercetina de las cebollas son mejor absorbidas que las agliconas, e incluso que la quercetina unida a un rutinosido (Hollman et al., 1995). Lo cual puede ser debido a la diferente estructura química entre los dos azúcares.

De Vries eí al., (1998) reportó resultados similares; el estudio constó de quince individuos saludables, los cuales recibieron té negro (1600 ml/día) o cebollas fritas (129 g/día) durante 3 días. El té proporcionó 49 mg de quercetina­ rutinósido y la cebolla 13 mg de quercetina­glucosilada. Los resultados reportaron que ambas quercetinas fueron absorbidas, pero que la quercetina­rutinósido del té fue menor absorbida que la quercetina­glucosilada. Y a que los datos de la excreción en orina después del consumo de cebollas fue de 1.1% y después de consumir el té fue de 0.5%. Por lo tanto se confirma que la quercetina de las cebollas es mejor absorbida.

(34)

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(35)

Hollman et al., (1999a) realizaron un estudio en humanos en el cual compararon la capacidad de absorción de la quercetina ligada a un glucósido y quercetina ligada a un rutinosido y concluyeron que la mejor tasa de absorción se observó con la quercetina­p­glucósido.

Por lo que sugieren que los azúcares son importantes determinantes en el proceso de absorción. En la tabla 2.5 se observan los resultados, que muestran el incremento de quercetina en plasma después de la ingesta de glucósido, comparándolo con el obtenido después de la ingesta del rutinosido. A su vez, la biodisponibilidad del rutinosido fue menor, aproximadamente 20% de la que se obtuvo con la forma glucosidada.

Tabla 2.5 Parámetros farmacocinéticos obtenidos después de la ingesta de glicosidos de quercetina (311 u.M) en 9 sujetos de estudio.

Parámetro Suplemento Suplemento

Quercetina­4 '­O­p­D­ Glucósido

Quercetina­3­O­p­ Rutinósido

Cmáx (uM) Tmáx (h)

VidazyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA V2 de eliminación

(h)

AUC (uM*h)

3.5 +/­ 0.6 <0.5 21.6 +/­1.9

18.8+/­2.4

0.18+/­0.04 6.0 +/­1.2 28.1 +/­6.4

3.7 +/­ 0.7 Adaptado de Hollman (1999)

Cmáx= Concentración máxima Tmáx= Tiempo máximo

(36)

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A partir de estos resultados, se comenzó a especular sobre cómo son éstos flavonoides absorbidos. El glucósido se absorbe en el intestino delgado mientras que el rutinósido puede transitar a través de él sin ser absorbido hasta llegar al colon y ahí absorberse. Esta forma debe previamente hidrolizarse en el intestino delgado a su forma aglicona (Manach et al., 1998). Los autores también mencionan que la naturaleza del azúcar es lo que puede influir más en el proceso de absorción y no la posición en la que se encuentre el azúcar unido.

Por lo tanto, las estructuras son las que determinan en qué lugar puede llevarse a cabo la absorción de los flavonoides. La cual puede ser en el intestino delgado o atravesar hasta el colon, donde los microorganismos rompen las moléculas de los flavonoides hasta formas agliconas y posteriormente se lleva a cabo la absorción. Se ha reportado que los glucósidos son los únicos glicosidos que pueden ser absorbidos directamente en el intestino delgado, y que éste tipo de absorción produce mayores concentraciones de los compuestos en plasma. Después de la absorción, los flavonoides son conjugados con ácido glucurónico, O­metilaciones o sulfataciones, es por ello, que las agliconas no pueden ser encontradas en plasma u orina. Las concentraciones plasmáticas debido a una dieta normal, pueden ser menores a 1 jaM (Hollman, 2004; Manach era/., 1998).

2.3.3 Ingesta de flavonoides

(37)

La ingesta de flavonoides en el mundo es muy diversa, ya que los hábitos alimenticios son muy diferentes entre países, por lo que se estima que el valor promedio es de 23 mg/día (Hertog eí a/., 1996). La ingesta de flavonoides excede a la de otros antioxidantes de la dieta, entre los que se encuentran el beta­ caroteno (2­3mg/día) y vitamina E (7­10mg/día) y es equivalente aproximadamente a un tercio del consumo de la vitamina C (70­100 mg/día) (Hertog eí a/., 1996). Por lo tanto, los flavonoides representan una contribución importante al potencial antioxidante de la dieta humana.

Cao eí a/., (2010), reportó el contenido de flavonoides totales en frutas, por ejemplo en las manzanas red delicious (344.4mg/kg de muestra), pina (66.9mg/kg), durazno (48.2mg/kg), pera sin cascara (26.4mg/kg), fresa (10.9mg/kg), naranja (20mg/kg) y plátano (16.9mg/kg). Los flavonoides que predominaron fueron la quercetina, kaempferol, isorhamnetina y luteolina. Para los vegetales reporta que la zanahoria sin cascara contuvo el mayor contenido de flavonoides (367.5mg/kg de muestra) seguido de la cebolla (93.2mg/kg), tomate (77.1mg/kg), coliflor (67.9mg/kg), espinaca (8.9mg/kg) y lechuga (46.6mg/kg).

Fernández eí al., (2010) y Kuti eí al., (2004) reportaron para la tuna Opuntia ficus indica valores de 155.6u.g/g y 69.5ug/g de muestra, respectivamente. En general éstos compuestos se localizan principalmente en las hojas, flores y partes externas de la planta como la cascara (Aherne eí al., 2002). En cuanto a cereales, Adom y Liu, (2002) reportaron los valores de flavonoides para trigo y avena, los cuales fueron de 1.24 y 1.16 umoles equivalentes de catequina/g de grano, respectivamente.

2.3.4. Extracción de flavonoides ligados

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como conjugados glucósidos, pero también una parte de ellos se pueden encontrar enlazados a la pared celular (Vinson et al., 1998; Vinson er al., 2001) y tampoco son cuantificados.

Por ejemplo, en arroz y maíz el 74 % y 69 %, respectivamente, del total de flavonoides se encuentran en formas ligadas insolubles. El material de las paredes celulares es difícil de digerir y la mayoría de los estudios previos han reportado los niveles de flavonoides usando soluciones acuosas de metanol, etanol y acetona logrando sólo la extracción de compuestos solubles. (Velioglu er al., 1998; Miller et al., 2000; Zielinski er al., 2000). Estos estudios muestran largos periodos de extracción y aún con esto, no es posible obtener los compuestos ligados.

Krygier et al., (1982) realizaron uno de los primeros trabajos con tratamientos alcalinos, con el fin de separar los fenólicos ligados­insolubles mediante un rompimiento del enlace de éster. Los autores reportaron un método eficiente, y obtuvieron mayores cantidades de fenólicos (768­1196 mg/100g de muestra) en semillas de colza. El tratamiento con hidróxido de sodio a diferentes tiempos y concentraciones ha demostrado ser eficaz en la liberación de estos compuestos (Adom er al., 2002; Barberousse et al., 2008).

(39)

La extracción de los compuestos bioactivos que se encuentran presentes en plantas es el primer paso para poder utilizarlos; ya sea para la preparación de suplementos dietarios, nutracéuticos, ingredientes de alimentos, productos farmacéuticos y productos cosméticos. Por lo tanto, para incrementar la liberación de fenólicos ligados, se han utilizado una serie de procedimientos, entre ellos la utilización de procesos enzimáticos, y actualmente los tratamientos alcalinos también se consideran eficaces para lograr la liberación de éstos compuestos (Arranz eí a/., 2009).

2.3.5 Propiedades de los flavonoides

El creciente interés en los flavonoides se debe a la apreciación de su amplia actividad farmacológica; ya que tienen excelentes propiedades de quelación del hierro (Hollman y Katan, 1999) y otros metales de transición como cobre y zinc (Martínez eí ai, 2002), que les aporta gran capacidad antioxidante. Estudios epidemiológicos han indicado los efectos benéficos de los compuestos antioxidantes en la prevención de múltiples enfermedades, incluyendo cáncer, enfermedades cardiovasculares, y desordenes neurodegenerativos (Hollman y Katan, 1999).

(40)

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2.3.5.1 Capacidad antioxidante

Los flavonoides son moléculas que poseen actividad antioxidante, ya que previenen del daño que provocan los radicales libres a las moléculas biológicas, como lípidos, proteínas y DNA, los cuales pueden provocar enfermedades neurodegenerativas. Los mecanismos involucrados, son la quelación de metales, la inhibición de enzimas que producen radicales libres y la capacidad de atrapar radicales libres; ya que los flavonoides estabilizan las especies reactivas de oxígeno (ROS) al reaccionar con el componente reactivo del radical haciéndolo más estable (Pietta et al., 2000).

Las estructuras que tienen los flavonoides han demostrado influir en la actividad antioxidante que presentan. Por ejemplo, la estructura plana, el número y la posición de los grupos hidroxilo, la presencia del doble enlace entre el C2=C3, así como la presencia de un grupo catecol han demostrado que le brindan una mayor actividad antioxidante a éstos compuestos. Por ejemplo, la quercetina es un flavonol que ha demostrado tener buena capacidad antioxidante y cumple con todas las características estructurales descritas anteriormente (Soobrattee er al., 2005; Heim et al., 2002). Wang et al., (2006) comparó los ICso de quercetina, kaempferol y mirecitina, mediante el método de 1,1­diphenyl­2­picryhydrazyl (DPPH), obteniendo 8.05u.M, 25.70uM y 12.29u.lv1 respectivamente. Lo cual indica, que la mirecitina y quercetina que contienen 3'­4'­di­OH en el anillo B (catecol), tuvieron mayor actividad que el kaemfperol (4'­OH).

(41)

y rutina (Noroozi eí al., 1998). loku etal., (1995) mostraron que la actividad de los glicósidos de quercetina era menor que los de la quercetina aglicona en un sistema de membrana artificial.

2.3.6 Estudios previos que relacionan el nopal y los flavonoides

[image:41.612.70.472.416.545.2]

Hay algunos estudios que indican que las plantas de la familia de las Cactaceae producen flavonoles 3­O­glicósidos (quercetina, kaempferol e isorhamnetina) (Burret eí al., 1982; Ginestra eí al., 2009; Kuti eí al., 2004; Qiu eí al., 2002; Santos­Zea eí al., 2010). Por ejemplo, el estudio realizado por Kuti eí al., (2004) realizado en frutos de cuatro diferentes variedades de cactus, mostró la presencia de flavonoides. La forma predominante., como puede observarse en la tabla 2.6 fue la quercetina, la cual es una de las más consumidas y estudiadas debido a sus probados beneficios en la salud (Kandaswami eí al., 1994).

Tabla 2.6. Concentración de flavonoles (uxj/g de muestra en base seca) en frutos de diferentes especies de Opuntia spp.

EspecieszyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA Opuntia Kaempferol" Quercetina" Isorhamnetina01 Total"

O. ficus-indica 2.2 +/- 0.3 43.2 +/- 2.5 24.1+/- 1.0 69.5

O. lindheim eri 1.1 +/- 0.4 9 0 . 5 + / - 1 1 . 5 1.9 +/- 0.5 93.5

O. st rept hacant ha 3.8 +/- 0.5 51 +/- 4.6 ND 3.8

O. st rict a ND 9.8 +/- 3.0 ND 9.8

a= Indica concentración (microgramo de flavonoide por gramo de muestra en base seca)

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Caí et al., (2010) hicieron la extracción, purificación y caracterización de flavonoides presentes en la cascara de Opuntia fícus indica variedad Milpa alta. Utilizaron varios métodos de extracción con solventes y el extracto etanólico a 90°C fue con el que lograron obtener la mayor cantidad de flavonoides (5.55 mg/g de peso seco); y los resultados de LC­MS indicaron que los principales compuestos del extracto fueron isorhamnetina 3­0­(2,6­dirhamnosil) glucósido e isorhamnetina 3­O­D­rutinósido.

En la especie dilleni de Opuntia, Qiu et al., 2002 identificaron la presencia de un flavonol glicósido de kaempferol, y lograron elucidar su estructura (Figura 2.4).

Fig. 2.4 Estructura de un flavonol glicósido de kaempferol identificado en cladodios de Opuntia dillenii. (Kaempferol 7­0­/?­D­glucopiranosil­/?­D­glucopiranosido) (Qiu er al., 2002)

[image:42.612.160.416.330.451.2]
(43)

Con la fracción de E70­I lograron obtener la mayor cantidad de flavonoides, de los cuales, el predominante fue isorhamnetina y sus derivados y en menor proporción kaempferol y quercetina. Dentro de los compuestos que identificaron destacan los glicósidos, entre ellos la isorhamnetina glucosil­ramnosil­ramnósido y una mezcla de dos flavonoides, isorhamnetina glucosil­ramnosil­xilosido o arabinósido. Realizaron una extracción etanólica extra a los residuos, lo que permitió observar que aún había presencia de flavonoides (72­85%). Por lo tanto, es posible decir que algunos componentes de la estructura de la pared celular de los cladodios afecta la solubilidad de estos compuestos de bajo peso molecular, y por lo tanto no se logre obtener la máxima cantidad de ellos con solventes polares.

Otro estudio del género Opuntia realizado por Santos­Zea eí al., (2011), con harina de nueve variedades de cactus mexicano, mostró resultados similares a los obtenidos previamente (Cai etal., 2010; Ginestra eí al., 2009); ya que el flavonoide predominante en los extractos metanólicos fue isorhamnetina. Los resultados mostraron que la variedad influye, ya que el rango de isorhamnetina fue de 99.58­ 762.2 ug/g. También se reporta la presencia de kaempferol, aunque en menores cantidades que la isorhamnetina con un rango de 12.9­119 u.g/g. En este estudio se identificaron seis formas glicosiladas del flavonol isorhamnetina y una de kaempferol las cuales concuerdan con las previamente reportadas por Ginestra eí al., (2009).

2.4 Inflamación

(44)

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La inflamación excesiva es considerada un factor crítico en muchos padecimientos, incluyendo cáncer, obesidad, diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas; por lo que la morbilidad y mortalidad a nivel mundial principalmente causada por enfermedades infecciosas ha sido reemplazada por este tipo de enfermedades crónicas (Benavente ef a/., 2008; Schewe et al., 2002). Actualmente, se conocen fármacos como los anti­ inflamatorios esteroideos (SAID) y no esteroideos (NSAID); pero aún y con éstos, se requiere de otros compuestos que puedan estar presentes por ejemplo en la dieta diaria y que ayuden a prevenir o mejorar las enfermedades provocadas por una inflamación crónica.

La inhibición de las enzimas involucradas en los procesos inflamatorios, como la óxido nítrico sintetasa (NOS), la ciclooxigenasa (COX), fosfolipasa A2 (PLA2) y lipooxigenasas (LOX) ayuda a disminuir la producción de ácido araquidónico, óxido nítrico, leucotrienos y prostaglandínas que son mediadores cruciales en mecanismos de inflamación (Kim et al., 2004).

2.4.1 Óxido nítrico y su relación en la inflamación

El óxido nítrico es uno de los implicados en procesos inflamatorios. Es un mediador celular de procesos fisiológicos y patológicos (Moneada er al., 1991; Nathan, 1992). Altos niveles de óxido nítrico (NO) han sido descritos por una variedad de procesos patológicos incluyendo varias formas de shock circulatorio (Kroncke et al., 1998), inflamación (MacMicking et al., 1997) y carcinogénesis (Oshima era/., 1994).

(45)

La isoforma inducible ¡NOS es responsable de la sobreproducción de NO en inflamación, expresada por estímulos inflamatorios en ciertas células como los macrófagos. El NO es bioquímicamente sintetizado de L­arginina por NOS. La óxido nítrico sintetasa juega un rol importante en la regulación del tono vascular, neurotransmisión, muerte de microorganismos, células tumorales y otros mecanismos homeostáticos (Mayer eí a/., 1997). Es importante mencionar que solo una pequeña cantidad de NO sintetizado por la eNOS y nNOS es esencial para mantener la función normal del cuerpo (homeostasis).

Un incremento significativo de NO sintetizado por la ¡NOS participa en el proceso de inflamación y actúa sinérgicamente con otros mediadores inflamatorios convirtiéndolo en un proceso crónico (Nathan, 1992). Es importante mencionar que ¡NOS no es detectable en tejidos saludables, se expresa después de lesiones en varios tipos celulares incluyendo células musculares, macrófagos, hepatocitos, y astrocitos solo después de estar expuestos a estimulantes específicos como citoquinas (Busse y Mulch, 1990; Zhang y Morrison, 1993).

Hay diferentes mecanismos que tienen los flavonoides para producir efectos antiinflamatorios. Entre ellos destacan la actividad antioxidante, modulación de células inflamatorias, modulación de enzimas y mediadores proinflamatorios y modulación de genes proinflamatorios (García eía/., 2009).

2.4.2 Flavonoides e Inflamación

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El primer inhibidor natural de PLA2 encontrado fue la quercetina el cual inhibía ésta enzima en neutrófilos humanos (Lee et al., 1982). Se encontró repetidamente que la quercetina inhibía esta enzima en un estudio donde se trabajó con neutrófilos peritoneales de ratón obteniendo un IC5o de 57­100 uM (Lanni y Becker, 1985). También los flavonoles como el kaempferol, quercetina y mirecitina inhiben considerablemente PLA2, moléculas que poseen un doble anillo entre el carbono 2 y 3 (Welton et al., 1986). Los valores de IC5 0 de estos flavonoles fueron de 75 a 115 pM.

Un estudio in vivo referente a los flavonoides y su capacidad antiinflamatoria fue realizado con el propósito de investigar la capacidad de la quercetina, rutina y hesperidina para inhibir la inflamación crónica y aguda en la artritis (Guardia et al., 2001). La rutina fue bastante efectiva en reducir los edemas y nodulos un 100 %, mientras que la quercetina 50 % y la hesperidina un 33 %. La rutina difiere de la quercetina solo en la presencia del azúcar rutinosa en la posición 3. En base a esto es posible que los factores farmacocinéticos contribuyan a mejorar la actividad de los glucósidos.

2.4.3 Flavonoides y producción de óxido nítrico

Las células fagocíticas, especialmente los macrófagos, están implicados en desordenes inmunopatológicos relacionados al estrés oxidativo, el cual se define como un desequilibrio entre la generación y eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS) derivados del metabolismo de oxígeno en sistemas aerobios), incluyendo inflamación y enfermedades. Por lo tanto, los macrófagos son considerados un excelente modelo para estudiar la inhibición de NO (Saha et al., 2004; So era/., 1999).

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concentración de 25 u.M y en ése orden disminuyeron la producción de nitritos. La mirecitina, en este estudio no demostró actividad inhibitoria.

Fig. 2.5: Efecto en la producción de óxido nítrico (NO) en células RAW 264.7 posterior a una incubación con flavonoides activados con lipopolisacáridos (LPS 50 ng/ml).

* Indica diferencias estadísticamente significativas. Adaptado de Liang Yu etal., (1999).

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Otro estudio realizado por Wang er al., (2006), utilizando la misma línea celular y estimuladas igualmente por LPS, reportó resultados sobre los flavonoides kaempferol, quercetina, firesetina, mirecitina, los cuales fueron dosis­dependiente y mostraron una inhibición de 72% y 71% a 10 u.M. En este estudio, la mirecitina y morina no mostraron efectos. También reportan que a esa concentración no mostraron citotoxicidad, incluso arriba de los 10 \iM.

Cheon ef al., (2000), reportó que la inhibición en células RAW 264.7 inducidas con L P S por algunos flavonoides se asocian con citotoxicidad en concentraciones mayores a 50 uM. Pero, las opiniones sobre esto difieren, ya que algunos trabajos reportan concentraciones mayores a 50 uM y no muestran citotoxicidad. Por ejemplo, en el estudio realizado por Sheu ef al., (2001), evaluaron isoflavonas genisteína, daidzeína y gliciteína, para evaluar los efectos en la producción de NO.

En éste estudio se observó un 67.7 % de reducción en la producción de nitritos debido al tratamiento de genisteína a una concentración de 100 uM. La

genisteína mostró unzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA IC50 de 50 uM, mientras que la daidzeína y la gliciteína mostraron unzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA IC50 de 100 uM. La viabilidad celular se mantuvo en 90%, por lo que

la inhibición de la producción de nitritos no fue por muerte celular, sino por el flavonoide en cuestión. Puede ser que los resultados también impliquen la estructura, ya que la genisteína a diferencia de las otras dos moléculas tiene un OH en el carbono 5; lo que le puede contribuir a su mayor actividad.

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menor capacidad inhibitoria, ya que, mientras para la quercetina a 250 uM el efecto inhibitorio fue de 63%, para la quercetina­3­glucósido y la quercetina­3­ rutinósido fue de 36 y 22%, respectivamente. La diferencia entre flavonoides glicosilados se observa en cuanto a tipo de azúcar unido a la molécula, ya que se presentó una mejor inhibición cuando se encontraban unidos a un glucósido que cuando se encontraban unidos a un rutinosido.

A la fecha, los mecanismos moleculares de los flavonoides en muchos efectos biológicos no han sido elucidado, pero las propiedades antioxidativas son consideradas como su mayor acción farmacológica. La estructura química (posiciones y números de grupos hidroxilos, los dobles enlaces, o el grupo catecol) pueden influir en el efecto inhibitorio en la producción de NO.

2.5 Justificación

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2.6 Objetivos

• Probar que con una hidrólisis alcalina se favorece la extracción de flavonoides en la matriz.

• Obtener el perfil de glicósidos en los extractos.

• Caracterizar los extractos de nopal en cuanto a contenido de compuestos fenólicos totales y su actividad antioxidante.

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Capítulo 3: Materiales y métodos

3.1 Reactivos y materiales

Reactivos

Grado Reactivo

Acetato de etilo, ácido clorhídrico, hexano, hidróxido de sodio, metanol. (DEQ, Monterrey, N.L., México)

Ácido gálico, reactivo Folin­Ciocalteau's, fluoresceína, fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio, sal sódica, 2,2'­ Azobis(2­metilpropionamidina), trolox (­6­hidróxi­2,5,7,8­tetrametilcromano­2­ácido carboxílico (Sigma­Aldrich, St. Louis, MO, USA).

Grado HPLC

Agua, metanol (Honeywell, Morristown, NJ, USA), ácido fórmico. Estándares: isorhamnetina, kaempferol y quercetina (Sigma­Aldrich, St. Louis, MO, USA).

Material biológico

Se utilizó una muestra de harina de nopal mexicano Opuntia ficus indica variedad Jalpa, cosechada a los 7 meses de edad en marzo del 2011, en el estado de Nuevo León, en la región conocida como "El Peñuelo".

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3.2 Extracción de compuestos

3.2.1 Extracción de compuestos solubles en metanol

La extracción de compuestos fitoquímicos del nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa se realizó en base al procedimiento reportado en un trabajo previo (Santos­Zea etal., 2011) con algunas modificaciones. Las muestras de harina (5g) se mezclaron con 50 mi de metanol al 80%. Se agitaron a 150 rpm (Innova 4000, New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA) durante un periodo de 3 horas.

Al finalizar, se realizó una centrifugación (Centra MP4R, International Equipment Company, Chattanooga, TN, USA) por 10 minutos a 3000 rpm y se recuperaron los sobrenadantes los cuales se mantuvieron en congelación a ­20°C hasta su uso y análisis. A éstos extractos se les denominó extractos metanólicos (E.M).

3.2.2 Optimización del procedimiento de extracción de flavonoides totales

El protocolo que se siguió para la extracción de los flavonoides totales de la harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa, es en base a una hidrólisis alcalina reportada anteriormente por Krygier et al., (1982). Dicha extracción fue empleada para extraer compuestos fenólicos libres, esterificados e insolubles en cereales y harinas de papa y colza. Por lo que para adaptarlo a los objetivos de la presente tesis, se realizaron algunas modificaciones.

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3.3 Extracciones en fase sólida

3.3.1 Extracción en fase sólida de los extractos metanólicos

[image:53.612.69.445.280.561.2]

A los sobrenadantes que se recuperaron de las extracciones metanólicas se les realizó por medio de un cartucho Cis­Aq (Grace­Davison, Deerfield, IL, USA) una extracción en fase sólida. El protocolo seguido se reportó anteriormente por Santos­Zea er a/., (2011). En la figura 3.1 se resume la metodología que se siguió y se indican los solventes utilizados.

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Básicamente el procedimiento inició con un acondicionamiento de la columna, primeramente se hizo pasar 5 mi de metanol seguido de 5 mi de agua destilada, ambos grado reactivo. Posteriormente, se pasaron los extractos metanólicos al 80 % a través de la columna (aproximadamente 50 mi), y se realizó un lavado con 5 mi de metanol al 40 %, ambas fracciones se desecharon.

La fracción de interés que se recuperó fue la elución de 5 mi de metanol al 100 % grado HPLC. Posteriormente, las fracciones obtenidas se llevaron a sequedad mediante un rotavapor a una temperatura de 65 °C (aproximadamente 45 min), y finalmente se resuspendieron en 500 ul de metanol grado HPLC. Se colocaron en un vial y se guardaron a ­20 °C para sus posteriores análisis.

3.3.2 Extracción en fase sólida de los extractos alcalinos

Los sobrenadantes recuperados de las hidrólisis alcalinas fueron lavados con hexano tres veces y de cada uno se desechó la parte lipofílica. Posteriormente, fueron lavados tres veces con acetato de etilo y se desechó. Las fracciones finales fueron puestas en relación 1:1 con agua destilada con el fin de diluir las muestras. El proceso se continuó con una extracción en fase sólida, con un cartucho Ci8­Aq (Grace­Davison, Deerfield, IL, USA.) de 6 mi, el proceso fue realizado en un colector de vacío conectado a una bomba (GE, Fairfield, EUA) con una presión de ­65 kPa.

Figure

Tabla 2.1 Información de la Taxonomía del Nopal
Tabla 2.2 Comparación física entre diferentes especies de Opuntia spp.
Tabla 2.3 Análisis bromatológico de cladodios Opuntia spp. en tres especies diferentes
figura 2.2 se representan las estructuras de los flavonoides más ingeridos en la
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Referencias

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