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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD LIPOLÍTICA DE MICROORGANISMOS AISLADOS DE SUELOS DEL PARQUE NATURAL NACIONAL (PNN) LOS NEVADOS.
LIZA MARÍA FRANCO GONZÁLEZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar por el título de
MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD LIPOLÍTICA DE MICROORGANISMOS AISLADOS DE SUELOS DEL PARQUE NATURAL NACIONAL (PNN) LOS NEVADOS.
LIZA MARÍA FRANCO GONZÁLEZ
APROBADO
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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD LIPOLÍTICA DE MICROORGANISMOS AISLADOS DE SUELOS DEL PARQUE NATURAL NACIONAL (PNN) LOS NEVADOS.
LIZA MARÍA FRANCO GONZÁLEZ
APROBADO
SANDRA BAENA, Ph.D Bióloga
Directora
BALKYS QUEVEDO, M.Sc Ingeniera Química
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AGRADECIMIENTOS
A la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) en especial a mi directora Sandra Baena por darme la oportunidad de entrar a este grupo de investigación y realizar mi trabajo de grado.
Al Centro Colombiano de Genómica y Bioinformática de ambientes extremos (GeBiX) por el financiamiento de este proyecto de grado.
A José Montana, Diego Jiménez y Daniel Borda por ser los responsables del aislamiento de algunas cepas estudiadas durante este proyecto de grado.
A mi codirectora Gina López por guiarme en este camino y enseñarme muchos conceptos.
A Ángela Mantilla, por su ayuda incondicional, aporte de conocimiento y apoyo.
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NOTA DE ADVERTENCIA “La Universidad no se hace responsable por lo conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales contra persona alguna, antes bien se ve en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
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TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN ... 1
1. INTRODUCCIÓN ... 2
2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ... 3
3. MARCO TEÓRICO ... 3
3.1 Microorganismos del suelo productores de enzimas lipolíticas ... 3
3.2 Carboxil éster hidrolasas ... 3
3.3 Factores que influyen en la producción de lipasas ... 4
3.4 Detección de la actividad lipolítica ... 4
3.4.1 Evaluación de la actividad lipolítica por medio de técnicas cualitativas ... 4
3.4.2 Evaluacion de la actividad lipolítica por el método colorimétrico con pnitrofenil éster ………..…………5
4. OBJETIVOS ... 5
4.1 Objetivo general ... 5
4.2 Objetivos específicos ... 5
5. METODOLOGÍA ... 6
51 Población de estudio ... 7
5.2 Medio de cultivo y condiciones de cultivo ... 7
5.3 Selección de cepas lipolíticas ... 7
5.4 Características morfológicas y fisiológicas de las cepas ... 8
5.5 Determinación de las condiciones óptimas de crecimiento ... 8
5.5.1 Determinación de la temperatura óptima de crecimiento ... 8
5.5.2 Determinación del pH óptimo de crecimiento ... 8
5.6 Evaluación de crecimiento en diferentes sustratos lipídicos ... 8
5.7 Evaluación de la actividad lipolítica por medio de técnicas cuantitativas ... 9
5.7.1 Cuantificación de la actividad lipolítica por medio de la técnica del pnitrofenil éster ……….9
6. RESULTADOS/ DISCUSIÓN ... 10
6.1 Selección de las cepas ... 10
6.2 Características fenotípicas ... 10
6.3 Determinación de las condiciones óptimas de crecimiento ... 11
6.3.1 Serratia USBA-GBX-513 ... 11
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6.3.3 P.oleovorans USBA-GBX 828 ... 13
6.4 Evaluación de crecimiento en sustratos lipídicos ... 14
6.5 Evaluación de la actividad lipolítica por pnitrofenil éster ... 14
6.5.1 Serratia USBA-GBX 513 ... 14
6.5.2 P.brenneri USBA-GBX 514... 15
6.5.3 P.extremaustralis USBA-GBX 515 ... 16
6.5.4 P.oleovorans USBA-GBX 828 ... 17
7. CONCLUSIONES ... 18
8. RECOMENDACIONES ... 19
9. BIBLIOGRAFÍA ... 19
1 RESUMEN
Dentro de la colección de microorganismos de la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) de la Pontificia Universidad Javeriana, se encuentran 43 cepas bacterianas aisladas de suelos del Parque Nacional Natural (PNN) Los Nevados. Estas cepas fueron evaluadas para determinar su actividad lipolítica, inicialmente realizando un tamizaje en medio sólido Luria Bertani (LB) suplementado con sustratos lipídicos como Tween 80, Aceite de oliva, Gliceril tributirato y Gliceril trioleato al 1%v/v, para seleccionar aquellas cepas que presentaran una mayor actividad al formar halos de hidrólisis iguales o superiores a 5mm de diámetro en más de un sustrato. Las cepas USBA-GBX-513, con similitud del 99% con el género Serratia, USBA-GBX-514 y USBA-GBX-515, con similitud
del 99% con el género Pseudomonas y USBA-GBX-828 con similitud del 99% con el
género Paenibacillus (99%), fueron seleccionadas para evaluar la actividad lipolitica
cuantitativa. Las condiciones óptimas de crecimiento de estas cuatro cepas fueron evaluadas, evidenciándose un pH óptimo de crecimiento de 6.0 en las cuatro cepas. La temperatura óptima de crecimiento para la cepa USBA-GBX-513 fue de 25°C, para la cepa USBA-GBX- 828 fue de 35°C, y para las cepas USBA-GBX-514 y 515 fue de 30°C. La evaluación cualitativa de la actividad lipolítica se realizó bajo el mismo esquema del tamizaje, teniendo en cuenta las condiciones óptimas de crecimiento de estos microorganismos. Paralelamente se evaluó el crecimiento en medio líquido suplementado con diferentes sustratos lipídicos. A partir de los resultados obtenidos se escogió el sustrato donde se presentó la mayor actividad lipolítica e igualmente favoreció el crecimiento de las cepas. El Aceite de oliva se escogió para las cepas USBA-GBX-513 y 828, el Tween 80 para la cepa GBX-514 y el Gliceril tributirato para la cepa USBA-GBX-515, con estos sustratos se cuantificó la actividad lipolítica con el substrato p
Nitrofenil (pNP) butirato tomando muestras en diferentes tiempos durante la curva de crecimiento de los microorganismos. Finalmente, se determinó que la actividad lipolítica (unidades lipolíticas –U-), para la cepa USBA-GBX-513 fue de 336.32 U/L, similar a la cepa USBA-GBX-828, 393U/L, para la cepa USBA-GBX-515 fue de 255.1U/L, en último lugar la cepa USBA-GBX-514 obtuvo la menor actividad con 73,50 U/L. Las cuatro cepas trabajadas presentaron actividad lipolítica en diferentes sustratos lipídicos con ácidos grasos tanto de cadena larga como de cadena corta; la cepa USBA-GBX-515 fue la única que produjo la enzima lipolítica en la fase exponencial mientras que las demás cepas produjeron la enzima en la fase estacionaria como se ha reportado en la mayoría de los
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1. INTRODUCCIÓN
Las enzimas lipolíticas tienen importancia a nivel industrial, ya que forman parte en procesos como la fabricación de detergentes, industria láctea, la bioconversión de residuos de aceites para la producción de biodiesel como nueva fuente de biocombustible1, y fabricación de productos químicos de alta pureza como el ibuprofeno
en el sector farmaceutico2.
En la naturaleza las enzimas lipolíticas están presentes en mohos, levaduras, bacterias, y organismos como plantas y animales, sin embargo, se están utilizando en mayor proporción las enzimas producidas por bacterias debido a que el crecimiento de estas es más rápido, la producción se da en tiempos más cortos, son biodegradables y se pueden escalar fácilmente en la industria ayudando así a reducir los costos de producción 3,4.
Estas enzimas se pueden encontrar en microorganismos mesófilos y psicrótrofos pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Serratia, Paenibacillus, Achromobacter, Alcaligenes, Bacillus, Burkholderia, Chromobacterium, entre otros5. Algunas de estas
enzimas lipolíticas pueden actuar en condiciones extremas, como a altas temperaturas, donde pueden ser altamente termoestables en solventes orgánicos, se emplean en la producción de fármacos, cosméticos y síntesis orgánica, mientras que las enzimas que operan a bajas temperaturas son estables en solventes orgánicos y se utilizan mucho en las industrias por su estereoespecificidad, actúan en la producción de aditivos para detergentes y en la biotransformación de compuestos termolábiles2,4,6.
Algunos de los organismos pertenecientes al género Pseudomonas son utilizados en
diferentes industrias debido a la aplicabilidad de sus lipasas, algunas ya se encuentran en el mercado como es el caso de Lumafast nombre comercial de una enzima lipolítica producida por Pseudomonas mendocina, Lipomax producida por Pseudomonas alcaligenes, estas dos utilizadas para la producción de detergentes, y Lipasa AK, YS de Pseudomonas fluorenscens utilizada para la síntesis de ácidos grasos5.
Debido a la importancia que tienen las enzimas lipolíticas por sus características, y a uno de los objetivos del proyecto GeBiX, el objetivo de éste trabajo es determinar la actividad lipolítica de cepas aisladas de suelos del PNN Los Nevados de la colección de microorganismos de la USBA.
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2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Actualmente se estima que menos del 1% de los microorganismos ha logrado ser aislado de sus ambientes naturales, debido a que los métodos de aislamiento tienen dificultad de simular las mismas condiciones ambientales en las que se encuentran las poblaciones naturales7. A pesar de la baja recuperación de microorganismos por métodos
dependientes de cultivo, sus caracterizaciones morfológicas, fisiológicas, y metabólicas han permitido desarrollar más de 500 productos comerciales a partir de sus enzimas 8.
Dentro de las enzimas secretadas por los microorganismos se encuentran las lipasas, que tienen importantes características como ser estables en solventes orgánicos, no necesitar cofactores, presentar alta regioselectividad, quimioselectividad, y estereoselectividad9,10,
por ello se consideran biocatalizadores de alta versatilidad.
Como parte de los estudios que se llevan a cabo en el Centro colombiano de excelencia en Genómica y Bioinformática de Ambientes Extremos (GeBiX), que pretende explorar, aprovechar y valorar la diversidad microbiana de estos ambientes se aislaron microorganismos de suelos del PNN Los Nevados. Estos aislamientos se realizaron a partir de cultivos enriquecidos con sustratos lipídicos. Debido a las características y aplicaciones que poseen las enzimas lipolíticas, es relevante adelantar estudios donde se determine si los microorganismos aislados y cultivados pueden presentar actividad lipolítica.
3. MARCO TEÓRICO
3.1 Microorganismos del suelo productores de enzimas lipolíticas
Algunas de las bacterias ampliamente estudiadas por poseer actividad lipolítica pertenecen a los géneros Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Paenibacillus,Achromobacter,
Alcaligenes, Arthrobacter, Burkholderia, Chromobacterium y Streptomyces5. También se
ha encontrado dicha actividad en mohos de los géneros Penicillium, Aspergillus,
Geotricum, Rhizopus2 y levaduras como Candida, Rhodotorula, Saccharomyces y Yarrowia5.
3.2 Carboxil éster hidrolasas
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presencia de solventes orgánicos6. Estas enzimas se dividen en diferentes grupos, dos de
estos grupos son las denominadas lipasas verdaderas (EC 3.1.1.3), que catalizan la hidrólisis, en la interfase lípido-agua de triacilgliceroles de cadenas largas (C>10) a monoacilgliceroles o diacilgliceroles, ácidos grasos y glicerol11, mientras que el otro grupo
de enzimas son las llamadas carboxilesterasas (EC 3.1.1.1) las cuales hidrolizan los enlaces éster de ácidos grasos de cadenas cortas (C<10) solubles en agua 4,6. También
pueden ser regioselectivas cortando el sustrato en diferentes posiciones del enlace éster dentro del triacilglicerol.
3.3 Factores que influyen en la producción de lipasas
Existen diferentes factores que pueden tanto inhibir como inducir la producción de lipasas, los cuales pueden variar según el microorganismo, entre estos factores se encuentra la fuente de nitrógeno, que generalmente es de tipo orgánico como extracto de levadura, peptona y triptona, o de tipo inorgánico como el cloruro de amonio y fosfato hidrógeno diamonio. Entre los factores inhibitorios más comunes se encuentran la presencia de azúcares, iones metálicos y sales, por su parte algunos sustratos lipídicos pueden inducir dicha producción5,12.
Otro tipo de factores que influyen son el pH y la temperatura. Se ha reportado que la mayoría de los microorganismos presentan una mayor producción de enzima a pH 7.0, mientras que aunque la temperatura puede o no estar relacionada, se ha observado que estas enzimas generalmente están activas en un rango entre 20-45°C12.
3.4 Detección de la actividad lipolítica
La actividad lipolítica se puede determinar por la generación de los ácidos grasos libres, triglicéridos y desaparición del sustrato. Para ello, existen diferentes métodos que permiten evaluar esta actividad, ya sean cuantitativos como los colorimétricos, fluorimétricos, y de titulación, y cualitativos como la formación de halos de hidrólisis en medio sólido, entre otros13.
3.4.1 Evaluación de la actividad lipolítica por medio de técnicas cualitativas
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3.4.2 Evaluación de la actividad lipolítica por el método colorimétrico con p- nitrofenil éster
Uno de los métodos colorimétricos más empleados en la detección de la actividad lipolítica es el uso del p-nitrofenil éster, el cual es hidrolizado por la enzima al romperse el
enlace éster generando un producto coloreado llamado p-nitrofenol. Se utilizan diferentes
p-nitrofenil ésteres, de cadena larga como el palmitato (ácido hexadecanoico) y ácido
oléico (ácido 9-octadecanoico) que se emplean para medir la actividad de lipasas siendo estos más específicos y estables en presencia de agua15, y de cadena corta como el
butirato y el acetato que se emplean para medir la actividad esterasa. Sin embargo, esta técnica presenta desventajas ya que los sustratos de cadenas cortas poseen poca estabilidad debido a que pueden hidrolizarse espontáneamente16.
4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo general
Determinar la actividad lipolítica de microorganismos seleccionados de la colección de microorganismos de la USBA aislados suelos del PNN los Nevados.
4.2 Objetivos específicos
Seleccionar cepas de la colección de microorganismos de la USBA aislados de suelos del PNN Los Nevados, que presenten la mayor actividad lipolítica.
Determinar las condiciones óptimas de crecimiento (temperatura y pH) de las cepas seleccionadas.
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5. METODOLOGÍA
Este estudio se llevó a cabo en la USBA del Departamento de Biología de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana, vinculado al proyecto del Centro de Excelencia en Genómica y Bioinformática de Ambientes Extremos (GeBiX).
Todos los ensayos evaluados se realizaron por triplicado luego de hacer subcultivos consecutivos a cada cepa, subcultivo1 y subcultivo 2, y a partir de este último se trabajaron todas las pruebas.
Se inoculó el 10% del volumen final del subcultivo 1 al subcultivo 2 para la determinación de las condiciones óptimas de crecimiento de los microorganismos y para las pruebas enzimáticas.
5.1 Población de estudio
[image:13.612.76.548.438.738.2]En la colección de microorganismos de la USBA se encuentran 43 cepas aerobias aisladas de suelos del PNN los Nevados las cuales crecen sobre sustratos lipídicos, estas cepas provienen de ecosistemas como páramos, superpáramos y Bosque Alto Andino, los cuales presentan temperaturas entre 4.4°C y 9.8 °C y pH entre 4.6 a 6.2.
Tabla 1. Características del ambiente de los microorganismos aislados de suelos del PNN Los Nevados
Muestra Ecosistema T° Suelo pH Microorganismos aislados
M5 Páramo 5.2 5.3 1 Serratia 99%
M6 Páramo 4.4 5.3 4 Serratia 99%
M7 Super páramo 13.5 4.9 2 Pseudomonas brenneri 98%
M8 Super páramo 9.9 5.2 1 Pseudomonas extremaustralis 99%
M14 Bosque Alto Andino 9.8 5.4
6 Paenibacillus 100%
1 Staphylococcus 100%
1 Pseudomonas 100%
3 Cupriavidus 100%
3 Bacillus 100%
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Estos microorganismos se encuentran preservados en glicerol al 20% a -80°C en medio mineral M9 (anexo 1) con y sin sustrato lipídico.
5.2 Medio de cultivo y condiciones de cultivo
El medio M9 fue empleado para la determinación de las condiciones óptimas de crecimiento y pruebas enzimáticas. El medio de cultivo escogido para hacer la selección de la cepas fue el medio LB (anexo 2), suplementado con los sustratos lipídicos a evaluar como Gliceril tributirato, Gliceril trioleato, Tween 80 y Aceite de oliva (1%v/v) (anexo 3). Inicialmente las condiciones del cultivo fueron aquellas en las que se aislaron las cepas, (pH 6.0 y/o 7.0, T° 30 y/o 35°C).
5.3 Selección de cepas lipolíticas
Se realizó un tamizaje de 43 cepas en el medio de cultivo LB con agar 10g/L, el pH del medio estaba en 6.0 o 7.0 dependiendo de las cepas, a cada medio se le adicionó un sustrato lipídico como el Gliceril trioleato, Gliceril tributirato, Tween 80 y Aceite de oliva (1% v/v), posteriormente se añadió Triton X-100 al 0.1% (v/v); luego de esterilizar se sonicó por 20 minutos a 75°C hasta lograr que el sustrato se homogenizara en el medio, consecutivamente se agregó Rodamina B (0.01% p/v). Las cepas se sembraron de dos formas 1) inoculando 1µl del cultivo en un disco de papel y 2) sembrando por agotamiento. Finalmente se incubaron por 5 días a 30°C y/o a 35°c dependiendo de la cepa. Se utilizó Pseudomonas aeruginosa del cepario de USBA, como control positivo,
reportado en la literatura como organismo lipolítico5.
A partir del tamizaje en medio sólido, se escogieron cuatro cepas que generaron el mayor halo de hidrólisis en más de un sustrato con un diámetro igual o superior a 5mm (anexo 4). Estas fueron USBA-GBX- 513, 514, 515, y 828.
Posteriormente a las cepas seleccionadas se las realizó una nueva evaluación cualitativa empleando los mismos sustratos anteriormente mencionados, bajo sus condiciones óptimas crecimiento.
5.4 Características fenotípicas de las cepas
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5.5 Determinación de condiciones óptimas de crecimiento
Para determinar las condiciones óptimas de crecimiento de las cepas USBA-GBX- 513, 514, 515, y 828, se usó medio M9 con peptona 0,4% (p/v). Se realizó el seguimiento del crecimiento y verificación de las cepas por densidad óptica a 580nm y microscopía. Los valores obtenidos de absorbancia a 580nm fueron transformados a concentración (µg de biomasa seca/ml) por medio de la curva de peso seco17.
5.5.1 Determinación de la temperatura óptima de crecimiento
Para determinar la temperatura óptima de crecimiento de las cepas seleccionadas, se evaluó la producción de biomasa en el medio de cultivo M9 a diferentes temperaturas desde 4 hasta 45°C con intervalos de 5°C. La temperatura óptima fue aquella donde la cepa presentó el valor más alto de velocidad específica de crecimiento (µx) y menor
tiempo de duplicación (td).
5.5.2 Determinación del pH óptimo de crecimiento
Para determinar el pH óptimo de crecimiento de las cepas seleccionadas, se evaluó la producción de biomasa en el medio M9 a diferentes pH entre 3.0 y 9.0 con intervalos de 0.5, los cuales se ajustaron con HCl 0,1M y 1M, y NaOH 0,1M y 1M. El pH óptimo de crecimiento fue aquel donde la cepa presentó el valor más alto de la velocidad específica de crecimiento (µx) y el menor tiempo de duplicación (td).
5.6 Evaluación de crecimiento en diferentes sustratos lipídicos
Las cepas se sembraron en el medio básico M9 suplementado con los sustratos lipídicos Etil oleato, Tween 80, Gliceril tributirato, Gliceril trioleato, Aceite de Oliva, y Aceite de Palma (1% v/v) (anexo 4), estos cultivos fueron comparados microscópicamente con su respectivo control (la cepa sembrada en el medio sin ninguna fuente de carbono adicional).
Todos los ensayos fueron considerados positivos si se observaba aumento en la concentración celular respecto a su control.
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5.7 Evaluación de la actividad lipolítica por medio de técnicas cuantitativas
Una vez determinadas las condiciones óptimas de crecimiento de las cepas, se realizó una fermentación discontinua utilizando el sustrato lipídico escogido en el ítem 5.6, con agitación de 120 rpm. Se tomaron muestras de las 0 a las 24 h con intervalos de 2h, para la evaluación de crecimiento por recuento en caja y para la evaluación cuantitativa utilizando el pNP éster (anexo 4).
El recuento en caja se realizó mediante diluciones de 10-1 a 10-7, las últimas tres
diluciones se sembraron en superficie en medio M9 suplementado con peptona al 0.4% p/v. Los resultados obtenidos fueron en UFC/ml, y transformados a Log10 UFC/ml.
5.7.1 Cuantificación de la actividad lipolítica por medio de la técnica del p- nitrofenil éster.
Se realizó la curva patrón del p-nitrofenol tomando concentraciones conocidas entre
0.6µM y 25µM, diluidas en buffer HEPES (concentración final de 50mM pH 7.5), posteriormente se midió la absorbancia de cada concentración por espectrofotometría a 410nm. Se tomó como blanco el buffer HEPES.
La cuantificación de la actividad lipolítica se llevó a cabo adicionando 100µL del extracto crudo y 50 µL de Triton X-100 al 0,5%, en el buffer HEPES (concentración final 50mM pH 7,5), esta mezcla se preincubó por 10 minutos a 30°C; posteriormente se adicionó el sustrato p-nitrofenil butirato o p-nitrofenil palmitato (a una concentración final de 0,5mM
diluido en acetonitrilo) obteniéndose un volumen final de reacción de 2,5ml, se incubó aproximadamente 25 minutos; luego se midió la absorbancia a una longitud de onda de 410nm. Se tomó como blanco el buffer HEPES, Triton X-100 y el sustrato p-nitrofenil éster
evaluado. Los controles fueron Pseudomonas aeruginosa del cepario de USBA, el medio
básico y el medio suplementado con el sustrato lipídico.
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6. RESULTADOS /DISCUSIÓN 6.1 Selección de las cepas
En estudios anteriores por medio del análisis de la secuencia del gen 16S rRNA, se determinó la posición taxonómica de las 43 cepas aisladas del PNN Los Nevados. Las cepas seleccionadas luego del Tamizaje inicial fueron, la cepa USBA-GBX-513 que presentó una similitud del 99% con el género Serratia, USBA-GBX-514 que presentó una
similitud del 98% con el género P. brenneri, USBA-GBX-515 con un porcentaje de
similitud del 99% con P. extremaustralis y USBA-GBX-828 con un porcentaje de similitud
del 99% con Paenobacillus, los cualespresentaron halos iguales y/o superiores a 5mm de
diámetro en más de un sustrato (tabla 2). Se puede resaltar que la cepa Serratia
USBA-GBX-513 presentó una mayor actividad al obtenerse halos de 12mm, a diferencia de las otras cepas donde el halo fue menor (<7 mm). Por otro lado, P. brenneri USBA-GBX-514
[image:17.612.79.541.409.515.2]presentó actividad en todos los sustratos evaluados. Cabe señalar que los halos producidos por las cepas USBA-GBX-513, 514, 515 y 828 fueron mayores que los producidos por la cepa control.
Tabla 2. Cepas seleccionadas a partir de la formación de halos de hidrólisis en medio sólido con diferentes sustratos lipídicos
Sustrato*
Serratia USBA-GBX-513 (mm) P. brenneri USBA-GBX-514 (mm) P.extramaustralis USBA-GBX-515 (mm) Paenibacillus USBA-GBX-828 (mm) Control positivo (Pseudomonas aeruginosa)
Aceite de Oliva 12 7 5 6 4
Gliceril tributirato 11 4 6 4 3
Gliceril trioleato Negativo 4 Negativo 4 3
Tween 80 Negativo 7 Negativo Negativo Negativo
*Ensayos realizados por triplicado en medio LB suplementado con el sustrato al 1% v/v. Después de 5 días de incubación.
6.2 Características fenotípicas
Se observaron algunas de las características fenotípicas como tinción Gram, movilidad, forma de la colonia, y prueba de la catalasa, presentadas por P.brenneri USBA-GBX-514,
P.extremaustralis USBA-GBX-515, Serratia USBA-GBX-513, y Paenibacillus
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Tabla 3. Características generales de las cepas seleccionadas.
Cepas Microscopía- Gram Macroscopía Catalasa Movilidad
Serratia USBA-GBX-513
Bc gruesos largos Gram negativos
Colonia blanca opaca, cremosa, con borde irregular ligeramente ovalada
positivo positiva
P.brenneri USBA-GBX-514
Bc medianos gruesos Gram negativos
Colonia cremosa, redonda, grande, borde irregular, blanca brillante con centro café
positivo positiva
P.extremaustralis USBA-GBX-515
Bc pequeños ligeramente gruesos Gram negativos
Colonia cremosa, redonda, pequeña, borde irregular, blanca opaca, centro café,
positivo positiva
Paenibacillus USBA-GBX-828
Bacilos pequeños gruesos Gram negativos.
Colonia cremosa, grande, borde regular, beige opaca.
positivo positiva
6.3 Determinación de condiciones óptimas de crecimiento
Las cepas seleccionadas presentaron un pH óptimo cercano a la neutralidad. Por otro lado las cepas Serratia USBA-GBX-513, P. brenneri USBA-GBX-514 y P. extremaustralis
USBA-GBX-515 presentaron una temperatura óptima entre 25-30°C considerándose bacterias psicrótrofas18, que crecen en un rango de temperatura entre 5 y 35°C con su
óptima entre 25 y 30°C, la cepa restante Paenibacillus USBA-GBX-828 se considera
mesófila debido a que al igual que estas crece entre 5 y 47°C con un óptimo entre 30 y 45°C.
6.3.1 Serratia USBA-GBX-513
La cepa Serratia USBA-GBX- 513 presentó una temperatura óptima de 25°C con una
velocidad específica de crecimiento de 0,12h-1, y un tiempo de duplicación de 5,7h, a su
vez su pH óptimo fue de 6,0 con una velocidad específica de crecimiento de 0,14h-1 y
tiempo de duplicación de 5h(Figura. 1). De 14 especies reportadas del género Serratia19,
Fu, et al. (2008) aislaron una cepa de Serratia sp. xjF1, la cual creció desde 4°C hasta
37°C con un óptimo de 20°C, comparando con los resultados obtenidos en este trabajo, se observó que Serratia USBA-GBX- 513 presentó un comportamiento similar ya que
12
Figura 1. Determinación de la temperatura óptima de crecimiento de Serratia USBA-GBX-513. a.) Temperatura b.) pH
6.3.2 P. brenneri USBA-GBX-514 y P. extremaustralis USBA-GBX-515
P. brenneri USBA-GBX-514 al igual que P. extremaustralis USBA-GBX-515 presentaron
un rango de crecimiento de pH entre 4,5 y 8,5 teniendo un mejor crecimiento en los pH cercanos a la neutralidad (Figura. 2 y 3), por otro lado P. brenneri USBA-GBX-514 tuvo un
rango amplio de crecimiento de 4°C a 35°C, similar a P. extremaustralis USBA-GBX-515,
sin embargo esta última disminuía su crecimiento considerablemente a temperaturas inferiores a 20°C (Figura.3), mientras que P. brenneri USBA-GBX-514 a temperaturas
inferiores a 20°C fue estable (Figura.2).
La temperatura óptima de P. brenneri USBA-GBX-514 fue 30°C, donde se presentó la
mayor velocidad específica de crecimiento de 0,26h-1 y tiempo de duplicación de 2,62h, a
su vez su pH óptimo fue de 6,0 con una velocidad específica de crecimiento de 0, 262h-1 y
tiempo de duplicación de 2,65h (Figura.2). Según lo reportado por Baïda, et al. (2001) P.
[image:19.612.86.522.515.641.2]brenneri es capaz de crecer en un rango entre 4°C y35°C pero no a 41°C.
13
A su vez P.extremaustralis USBA-GBX-515 presentó una temperatura óptima de 30°C,
con una velocidad específica de crecimiento 0,33h-1, y tiempo de duplicación de 2.04h y
un pH óptimo de 7,0 con una velocidad específica de crecimiento de 0,31h-1, y tiempo de
duplicación de 2.1h(Figura 3), estos resultados son congruentes con los reportados por López, et al. (2009), donde la temperatura de crecimiento de P. extremaustralis está entre
4°C y 35°C y no es capaz de crecer a 42°C.
[image:20.612.90.499.192.308.2]
Figura 3. Determinación de la temperatura óptima de crecimiento de P. extremaustralis USBA-GBX-515.a.) Temperatura b) pH
6.3.3 Paenibacillus USBA-GBX- 828
Paenibacillus USBA-GBX-828 creció en un rango de temperatura entre 8 y 35°C, y una
temperatura óptima de 35°C (Figura.4), con una velocidad específica de crecimiento de 0,29h-1 y un tiempo de duplicación de 2,3h, a su vez su pH óptimo fue de 7,0 con una
velocidad específica de crecimiento de 0,23h-1 y un tiempo de duplicación de 2,9h. Los
organismos del género Paenibacillus tienen temperatura óptima de 30°C y pH óptimo de
7,0 sin embargo Paenibacillus USBA-GBX-828 tuvo una temperatura óptima mayor que
las reportadas para este género23.
[image:20.612.86.496.539.662.2]14
6.4 Evaluación de crecimiento en sustratos lipídicos
A partir del crecimiento en sustratos lipídicos por observación al microscopio, se evidenció que todas las cepas crecieron abundantemente en Aceite de palma, Serratia USBA-GBX-
513 tuvo un buen crecimiento tanto en Aceite de oliva como en Tween 80, P. brenneri
USBA-GBX-514 creció bien en los sustratos Tween 80, Etil oleato y Gliceril trioleato, en cambio P. extremaustralis USBA-GBX-515 creció en todos los sustratos evaluados, por
último, Paenibacillus USBA-GBX-828 creció en Aceite de oliva, Tween 80 y Gliceril
[image:21.612.112.499.276.411.2]tributirato (tabla 4).
Tabla 4.Crecimiento de las cuatro cepas en diferentes sustratos lipídicos
USBA-GBX-513 USBA-GBX-514 USBA-GBX-515 USBA-GBX-828
Etil oleato ** **** *** **
Gliceril trioleato ** *** *** **
Gliceril tributirato *** ** **** ***
Aceite oliva **** *** **** ****
Aceite palma *** *** **** ***
Tween 80 **** **** *** ***
Control sin sustrato ** ** ** **
*Se mantiene, ** poco crecimiento, *** buen crecimiento, **** abundante crecimiento.
Para realizar la cuantificación de la actividad lipolítica se escogió el sustrato donde mejor creció el microorganismo comparado con su control y a la vez el que haya presentado mayor halo de hidrólisis. Por lo tanto, para Serratia USBA-GBX-513 y Paenibacillus
USBA-GBX-828 se escogió Aceite de oliva, mientras que para P.brenneri USBA-GBX-514
fue Tween 80 y para P.extremaustralis USBA-GBX-515 fue Gliceril tributirato.
6.5 Evaluación de la actividad lipolítica por p-nitrofenil (p-NP) éster
La cuantificación de la actividad lipolítica se realizó con el pNP butirato y pNP palmitato, sin embargo para éste último, se obtuvieron lecturas de falsos positivos y no hubo reproducibilidad en la prueba, por lo tanto éste sustrato no se reportó en este estudio.
6.5.1 Serratia USBA-GBX-513
Durante su crecimiento en Aceite de oliva, Serratia USBA-GBX-513 presentó actividad
15
et al. (2008) donde obtuvieron una actividad lipolítica de 33.9 U/L utilizando S. marcescens creciendo en Tween 80, a partir del extracto crudo, el cual fue evaluado con
el sustrato pNP butirato. Sin embargo, al ensayar con otros pNP éster con ácidos grasos de cadena larga como el pNP miristato (C14), encontraron una mayor actividad lipolítica;
concluyeron que la enzima es una lipasa verdadera que puede cortar tanto sustratos con ácidos grasos de cadena corta como ácidos grasos de cadena larga. De acuerdo con los resultados obtenidos, Serratia USBA-GBX-513 posee una enzima lipolítica capaz de
[image:22.612.114.502.231.418.2]hidrolizar ácidos grasos de cadena tanto larga como corta (tablas 1 y 3).
Figura 5. Cuantificación de la actividad lipolítica y crecimiento en sustrato Aceite de oliva de Serratia USBA-GBX-513, bajo las condiciones óptimas de crecimiento de la cepa.
6.5.2 P. brenneri USBA-GBX-514
A partir del crecimiento de P. brenneri USBA-GBX-514 en Tween 80 (Figura. 6), se
observó la mayor actividad a la hora 15, cuando el microorganismo probablemente se encontraba en fase de adaptación al sustrato lipídico, luego de esta fase el microorganismo empezó a crecer nuevamente posiblemente a partir del ácido oleico, producto de la hidrólisis del Tween 80, como se observó en otros ensayos (no mostrados), donde P. brenneri USBA-GBX-514 tuvo la capacidad de crecer en éste ácido graso.
La actividad lipolítica presentada por P. brenneri USBA-GBX-514 fue de 73,50 U/L mucho
menor que lo reportado por Hong- wei, et al. (2009) y Ruchi, et al. (2007), donde
obtuvieron a partir de P. aeruginosa valores de actividad de 58,9 U/ml (58900 U/L)12 y de
4580 U/ml (4580*103 U/L)10, respectivamente; sin embargo, el valor tan bajo de esta
cuantificación, pudo deberse a que no se empleó el pNP éster indicado ya que se 0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00
0 5 10 15 20 25 30
16
cuantificó con pNP butirato, que es apropiado para medir actividad esterasa, y de acuerdo con los resultados mostrados en las tablas 2 y 4 y el tipo de sustrato (Tween 80) utilizado en esta fermentación, la enzima lipolítica producida por P. brenneri USBA-GBX-514 puede
[image:23.612.86.534.193.376.2]cortar sustratos complejos, por ende este valor puede mejorar, al evaluar con pNP ésteres de ácidos grasos de cadena larga como el pNP palmitato como lo reportaron los autores anteriormente mencionados.
Figura 6. Cuantificación de la actividad lipolítica y crecimiento en sustrato Tween 80 de P. brenneri 514 bajo las condiciones óptimas de crecimiento de la cepa.
6.5.3 P. extremaustralis USBA-GBX-515
A partir del crecimiento de P. extremaustralis USBA-GBX-515 en Gliceril tributirato, se
observó que la producción de la enzima lipolítica estaba ligada al crecimiento, donde se obtuvo la mayor actividad a la hora 15 (finalizando la fase exponencial), con una actividad de 255,1U/L (Figura.7). Aunque no se ha reportado actividad lipolítica en la cepa P.
extremaustralis, se ha encontrado que P.veronni, que tiene similitud del 99.7% con P. extremaustralis25, posee una esterasa22, comparando estas dos cepas se podría llegar a
pensar que P. extremaustralis USBA-GBX-515 puede llegar a poseer también una
esterasa debido a que crece abundantemente en sustratos con ácidos grasos de cadena corta y cuantifica utilizando pNP butirato.
0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
0 10 20 30 40
17
Figura 7. Cuantificación de la actividad lipolítica y crecimiento en sustrato Gliceril tributirato de P.extremaustralis USBA-GBX-515 bajo las condiciones óptimas de crecimiento de la cepa.
Las cepas P. brenneri USBA-GBX-514 y P. extremaustralis USBA-GBX-515, presentaron
diferencias en las enzimas que expresan, ya que la enzima producida por P. brenneri
USBA-GBX-514 (Figura. 6) tuvo su mayor actividad en la fase de adaptación al sustrato lipídico, mientras que la producida por P. extremaustralis USBA-GBX-515 (Figura.7) la
presentó en la fase exponencial. Esto pudo deberse al tipo de sustrato en que están creciendo, ya que P. brenneri USBA-GBX-514 creció en un sustrato complejo como
Tween 80 a diferencia P. extremaustralis USBA-GBX-515 quien creció en Gliceril
tributirato.
6.5.4 Paenibacillus USBA-GBX-828
A partir del crecimiento de Paenibacillus USBA-GBX-828 en aceite de oliva, se observó
que la producción de la enzima estaba asociada al crecimiento, sin embargo la mayor actividad lipolítica se presentó a la hora 12 en fase estacionaria, con una cuantificación de 393 U/L (Figura. 8), esta actividad fue mayor que lo reportado por Prim, et al. (2000)
donde obtuvieron una cuantificación de 0,2 U/L en la fracción del sobrenadante en
Paenibacillus BP-33, sin embargo cabe resaltar que la enzima producida por Paenibacillus
USBA-GBX-828 probablemente posee dos enzimas lipolíticas y por esta razón pueden cortar sustratos con ácidos grasos tanto de cadena larga como de cadena corta (tabla 2 y 4), mientras que la enzima del Paenibacillus trabajado por Prim, et al. (2000) fue una
esterasa. 0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0 350,0 400,0 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900
0 5 10 15 20 25 30
Log 10 UF C/ m l Tiempo (h)
Curva de crecimiento
Actividad lipolítica
18
Figura 8. Cuantificación de la actividad lipolítica y crecimiento en sustrato Aceite de oliva de la cepa Paenibacillus USBA-GBX-828 bajo las condiciones óptimas de crecimiento de la cepa.
Según las condiciones de crecimiento de Serratia USBA-GBX-513, P. brenneri
USBA-GBX-514, P.extremaustralis USBA-GBX-515, probablemente sus enzimas pueden actuar
a temperaturas bajas, mientras que la enzima producida por Paenibacillus
USBA-GBX-828 probablemente actúa a temperaturas entre 20 y 45°C como se ha observado en la mayoría de las enzimas producidas por mesófilos12, sin embargo hay que estudiar más a
fondo su comportamiento a diferentes temperaturas para llegar a concluir cual es la temperatura ideal, para que se presente la mayor actividad.
7. CONCLUSIONES
Se seleccionaron cuatro cepas que presentaron la mayor actividad lipolítica.
Serratia USBA-GBX-513, P. brenneri USBA-GBX-514 y P.extremaustralis
USBA-GBX-515 son microorganismos psicrótrofos con una temperatura óptima entre 25 y 30°C, mientras que la Paenibacillus USBA-GBX-828 es un microorganismo mesófilo con una
temperatura óptima de 35°C, todos son organismos neutrófilos ya que presentaron pH óptimos entre 6.0 y 7,0.
Serratia USBA-GBX-513 y Paenibacillus USBA-GBX-828 presentaron la mayor actividad
lipolítica en la fase estacionaria con una cuantificación en pNP butirato de 393 U/L y 336.32 U/L respectivamente. P. extremaustralis USBA-GBX-515 fue en la fase
exponencial, con una cuantificación de 255.1 U/L y P. brenneri USBA-GBX-514, presentó
una cuantificación de 73.5 U/L.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200
0 5 10 15 20 25 30
Log 10 UF C/ m l Tiempo (h)
Curva de crecimiento
Actividad lipolítica
U/
19
Todas las cepas produjeron una enzima lipolítica asociada al crecimiento del microorganismo y con capacidad de cortar sustratos de cadenas largas como cortas.
8. RECOMENDACIONES
Evaluar diferentes sustratos de cadenas largas para cuantificar lipasas verdaderas y así corroborar el tipo de enzima que produce cada cepa.
Evaluar diferentes factores que influyen en la actividad enzimática como la relación carbono nitrógeno, concentración de sales, iones metálicos y la aireación, y la temperatura y pH en los cuales se presente la mayor actividad de esta.
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22 10. Anexos
Anexo 1 Composición del Medio de Sales Minerales (M9)25.
Componente g/L
NaCl 0.5
KH2PO4 3
Na2HPO4 6
NH4Cl 1
Extracto de levadura 0.05
Agar 10
Anexo 2. Composición del Luria Bertani (LB)13.
Componente g/L
Digerido pancreático de caseína 10
Extracto de levadura 5
NaCl 0,5
Agar 10
Anexo 3. Medición de halos de hidrólisis27.
La medición de los halos se realiza teniendo en cuenta la siguiente fórmula: C=A-B
C: Diámetro del halo de hidrólisis. A: Diámetro de la colonia en mm. B: Diámetro de la colonia.
Anexo 4. Sustratos lipídicos
Sustrato Concentración inicial Concentración final
Gliceril Trioleato 0.25M 10mM
Gliceril tributirato 1M 10mM
Aceite de palma 0.25M 10mM
Etil Oleato 0,25M 10mM
Tween 80 No aplica 1µl/ml
23 Anexo 5. Obtención del extracto crudo 28
Obtención del extracto crudo para enzimas extracelulares.
