El objetivo del presente trabajo es el de contribuir con

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(1)e. .. UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA IZTAPALAPA 'División: Ciencias Biológicas y de la Salud /Alumno: Leticia Buendía González Matrlcula: 92233575 JLicenciatura en Biología Proyecto de servicio social: JDeterminación de las concentraciones de f itoreguladores que inducen organogénesis en peyote ( L o p h o p h wiJfiamsit). & s o r e s : Dr. Francisco Cruz Sosa y M. en. B. E. José Angel Lechuga Corchado, Área de Productos Naturales del Departamento de Biotecnología.. h u l i o de 1 9 5. Dr.Francisco Cruz Sosa. M: en B.E.J. Angel Lechuga Corchado.

(2) -*--... DETERMINACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES FITOREGULADORES QUE INDUCEN ORGANOG~NESIS PEYOTE (Lophophora williamsit). DE EN. N ITRODUCC Ó IN México es un país rico en recursos naturales tanto energéticos como de flora y fauna, contando incluso con especies silvestres que únicamente crecen en nuestro país. Dentro de la flora mexicana algunos de los grupos más numerosos son las palmas, los cactus y las orquídeas, muchos de los cuales están en peligro de desaparecer de su ambiente natural. De estas especies muy pocas han sido sujetas a análisis que permitan conocer su utilidad y los compuestos que las constituyen (Granillo, 1987). Las cactáceas son una de las familias mejor representadas de la flora mexicana, ya que gran parte de nuestro territorio está formado por zonas áridas y semiáridas, lugares donde estas plantas son abundantes, existiendo además una gran diversidad de estas especies, siendo aproximadamente ochocientas (Bravo, 1978; Boke, 1980; Corona ¿I Chávez, 1982). Lophophora williarnsii por su aspecto peculiar ha sido motivo de atención en nuestro país desde tiempos remotos, teniendo valor no únicamente como plantas ornamentales (ya que presentan un crecimiento vegetativo que va desde simétrico, hasta adoptar formas grotescas y flores de extraordinaria belleza y rareza), como plantas medicinales, con fines religiosos y como curiosidades botánicas, sino también por las características fisiológicas que les permiten vivir en condiciones de aridez, lo que ha motivado algunas investigaciones a nivel farmacológico y fisiológico (Bravo, 1978; Vyscot d~Jara, 1984). Actualmente nuestro pals enfrenta una extinción de gran número de especies vegetales, entre las cuales se incluyen muchas cactáceas. Ellas se enfrentan al tráfico indiscriminado y al deterioro de su hábitat; Lophophora williamsii es una especie.

(3) singular porque posee un carácter alucinógeno y por ello ha sido explotada irracionalmente, lo que ha provocado una reducción considerable de las poblaciones silvestres y hoy en día está bajo protección especial de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-059-€COI-1994. El objetivo del presente trabajo es el de contribuir con información para facilitar la micropropagación efectiva de L. wdkamsi, con ello evitar el saqueo de las poblaciones silvestres y al mismo tiempo contar con material para conocer todos los aspectos biológicos de esta especie. Por lo que se pretende establecer las concentraciones de reguladores de crecimiento vegetal para inducir organogénesis. Características del peyote La palabra peyote se remonta a tiempos muy lejanos y su origen lo encontramos en la lengua náhuatl; aunque según sean las tribus que lo utilizan, le dan distintas denominaciones. Peyote es en realidad una denominación genérica, por ejemplo, los tepehuanes lo llaman "camaba", los huicholes "jiculi", los tarahumaras lo nombran "bunami" que quiere decir "El üios Superior", y los mezcaleros cuando lo encuentran hablan del "jo". Estudiando la etimologla de la palabra peyote en náhuatl, sabemos que se deriva de "Peyon-alic", que significa estimular, aguijonear, activar, lo cual quiere decir que las funciones peculiares del cactus le han atribuido el nombre a la planta, porque justamente ella estimula, aguijonea actividades (Gandola, 1965). El peyote es una planta globosa, con frecuencia aplanada en el ápice de 2 a 6 cm. de altura y de 4 a 11 cm. de diámetro, generalmente de color verde azulado, en ocasiones verde amarillento, a veces con tinte rojizo. Costillas desde 4 a 14, casi siempre presentes, bien definidas de altura variable, y a veces formando tubérculos más o menos altos. Areolas distantes entre sí 0.9 a 1.5 cm., circulares, de 2 a 4 mm. de diámetro. Flores de 1.

(4) a 2.4 cm. de longitud y de 1 a 2.2 cm. de diámetro; segmentos interiores del perianto de 2.5 a 4 mm. de anchura, casi siempre de. color rosa con tinte amarillento, a veces de color carmín; polen de 14.9 a 63 micras de diámetro, granos esferoidales, pocas veces policolpados (O-18), tricolpados o bicolpados (Bravo, 1978). Clasificación botánica El peyote pertenece a la familia de las cactáceas que se caracterizan por tener hábitos y estructuras anatómicas de adaptación altamente especializados que les imparten una fisonomla particular. De estas estructuras especializadas se consideran responsables: el medio árido y desértico en que la mayoría crece; la adaptación posterior de otras a la vida eplfita o trepadora en las selvas tropicales húmedas, y posiblemente también los diversos tipos de polinización que experimentan, principalmente por medio de los insectos, aves y quirópteros (Bravo, 1978). La ubicación taxonómica del peyote corresponde como en seguida se enuncia: Reino Plantae División Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Subclase Caryophyllidae Orden Caryophyllales Familia Cactaceae Género Lophophora Especie williamsii Entre las adaptaciones más notables que el tallo adquiere en relación con la aridez, hay que mencionar aquellas que les permiten almacenar y conservar el agua en sus tejidos, como son entre otras: el gran desarrollo de los parénquimas, responsables de la suculencia, la reducción de la superficie transpiratoria al.

(5) adquirir formas globosas; la atrofia hasta estados vestigiales del limbo de las hojas o su transformación en escamas, espinas y glóquidas; el engrosamiento de la cutícula y de las membranas celulósicas de los tegumentos, etc. El género Lophophora comprende dos especies: L. williamii que es el objeto de estudio del presente trabqjo y L. diffusa (figura 1). Estas especies difieren morfológica y químicamente; ambas especies de Lophophora son plantas peque-íí, sin espinas, verde-grisáceas o verde-azulosas, con apariencia de cabeza. La parte superior o corona es suculenta clorofílica y mide más de 8 cm de diámetro; está dividida radialmente por 5-13 costillas redondeadas. Cada tubérculo tiene una pequeña areola plana, y de su punta surge un mechón de pelo de 2 cm de largo. Las flores campanuladas, blanquecinas o rosadas, generalmente solitarias, son de 1.5-2.5 cm de largo y nacen en el centro umbilicado de la corona. Los indígenas cortan la corona y la secan para ingerirla como alucinógeno. Esta cabeza seca, a manera de disco, se conoce como botón de mezcal de peyote.. a. b Figuro 1. (a) Lophophoro wifhamsii#(b)Lophophoro diffuro (a. htto://www2.aros.net/-lambo/~e~ote/~e~ote/htm di b. http://web.iet.es/zaratrusta/pictures.htmI). Lophophora williamsh' generalmente es azul-verde, con 5-13 costillas y surcos normalmente definidos tiene más de 30.

(6) L. 1 -. & -. alcaloides, incluyendo la mezcalina sobre todo feniletilaminas e isoquinolinas. L. diffusu tiene una corona verde-gris, algunas veces más bien verde-amarillenta, con costillas indefinidas y surcos sinuosos. Las flores son mucho más grandes que en L. williarnsii. La constitución química de esta planta es mucho más simple. Ambas especies de Lophophoru habitan las regiones desérticas secas y pedregosas, generalmente sobre suelos calcáreos. Cuando se le quita la corona, la planta desarrolla nuevas coronas, y así se han visto comúnmente peyotes con múltiples cabezas. Los efectos alucinógenos son fuertes, con visiones caleidoscópicas ricamente coloreadas. También provocan alucinaciones en otros sentidos: oído, gusto y tacto. Se han registrado dos estados en la intoxicación: al principio, un periodo de satisfacción y sensibilidad, luego una fase de gran calma y pesadez muscular, con un cambio en la atención de estímulos externos hacia la introspección y meditación. Alcaloides del Peyote Este cactus es muy rico en alcaloides (tabla I), tiene dos grupos, denominados Grupo A y Grupo B. AI grupo A pertenecen los alcaloides solubles en éter, y está formado por anhalonina, peyotina y lophophorina. Estos tres alcaloides están representados en un veinte por mil del producto. En el grupo 8, formados por los que son poco solubles en éter, y muy solubles en cloroformo están la mezcalina que se presenta en una proporción de noventa por mil; la anhalonidina y la anahaiamina, cada una con veinte por mil del producto. Analizando los alcaloides del peyote en realidad lo que podemos destacar es que la mezcalina ocupa el lugar más predominante, los otros elementos tienen una proporción de veinte a veinticinco por mil, en tanto que la mezcalina tiene un noventa por mil, casi cuadruplica la de los otros, es justamente.

(7) 7~7. Q --,. ,7. aqui que radica la causa de los efectos que produce ( úandola, 1965). ". .. cH30wNH cH30wN, CH30-. CH,O. CH,O. bH. LH,. C H , O Y. CH3. bH. &I3. I I. &'Oo. CH,O. TNH2 cH30qN cH30p Anhalonidina. Peyonina. Peyotina. CH,O. CH,O. CH,O. ,. Mezulina. CH,O. . .. CH,. 1 0 H.. I '. CH,. CH,O. OH. CH3. CH,O. OH. c CH,OH. 3 CH,O. ~ . . I. CH,O. Anhalamina. Anhalidina. Lofoforina. 0. ~. N. H. HO. CH3. Anhalonina. Anhalina. Succinimida de mszcalina. Tabla I. Estructura de los alcaloides representativos del peyote. (Evans, 1982) . . .~... ,. .... . .. :. .. Los alcaloides por su carácter de alucindgenos han cobrado gran importancia en la farmacologia ya que se buscan nuevas drogas con posibles aplicaciones a la medicina, o incluso como modelo para que la química sintética las mejore. Algunos de estos son la mezcalina y la macromerina, que ya están siendo utilizados para estos fines (Bruhn, 1971; McLaughlin, 1966). El peyote por sus propiedades y por su falta de toxicidad verdadera, ha sido prescrito para usarse en investigaciones psicofisioldgicas y también en psiquiatría, para el estudio del subconsciente (Bravo, 1978).

(8) Efectos del peyote. El peyote es inofensivo para la salud, no provoca habito; como no hay acostumbramiento, no hay vicio. La gente de las tribus que lo consume todo el año, no percibe efectos orgánicos especiales; el empleo intermitente entre los indígenas no se debe a hábito sino que está en relación con sus ritos religiosos (figura 2).. Figura 2. Representación del r i t o delpeyote (http://web.jet.es/zaratrusto/pbotany.htmI). El primer efecto que se siente cuando se ingiere peyote es entrar en un estado de euforia muy particular; hay una exaltación sensorial, sobre todo de orden nervioso; un estado hiperestésico de alegrla, felicidad y locuacidad. La segunda etapa se caracteriza por depresión, pereza flsica, hipocerebralidad, cierta inseguridad motriz, tendencia a perder el equilibrio, y facilidad para el sueño. Es durante este proceso que aparecen las imágenes coloreadas, observándose cuatro etapas. En la primera se ven puntos luminosos de colores que toman formas geométricas semejantes a los que se ven por un caleidoscopio; son de corta duración y a veces se presentan nebulosas. La segunda etapa sobre representaciones más concretas. A veces no son formas muy comunes, pueden ser bellas y poéticas; pertenecen en cierto modo al fondo de la memoria consciente. A medida que se va.

(9) intensificando el efecto del producto aparecen las imágenes del tercer tipo, que pueden obedecer a la consciencia o a la inconsciencia; pero lo que las caracteriza es que su agrupación linda en lo fantástico: paisajes desconocidos, seres fabulosos, etc. Las del cuarto tipo se presentan en organismos muy sensibles y producen la disociación de la personalidad. No hay aumento de temperatura y jamas se presentan formas obscenas. Los efectos duran desde dos hasta seis y siete horas, para luego desaparecer rápidamente (Gandolu, 1965). Zonas geográficas de distribución El género f ophophora tiene una distribución latitudinal de 20' 54' a 29" 47' latitud norte (figura 3). Dentro de los Estados Unidos Lophophora williams¡¡ se encuentra en la región de Río Grande, Texas. Esta es una pequeña población en el oeste de Texas próximo a Shafter, en la región de Big Bend, y también se encuentra en el Valle de Río Grande al este de Laredo. El peyote se extiende en México entre la Sierra Madre Occidental y la Sierra Madre Oriental hasta Saltillo, Coahuila; ésta es una región extensa del Desierto de Chihuahua en el norte de México cubre cerca de 150,OOO kilómetros cuadrados. Justo al sur de Saltillo el rango del peyote se estrecha, se interrumpe por montañas, y se expande nuevamente al este, dentro de las estribaciones de la Sierra Madre Oriental y al oeste del estado de Zacatecas, extendiéndose al sur de San Luís Potosí donde su distribución termina. fophophora áiffusa está restringida a la gran región desértica en el estado de Querétaro. Esta área de cerca de 775 km2está aislada de la gran población de fophophora williams¡¡,por altas y escarpadas montañas..

(10) (http://wcb.jet.es/zarotrustcijpbotany.htmI). Tres factores aparentemente son responsables de la discontinua distribución de fophophora entre la gran población norteña y la pequeña población sureña: (1) la gran salinidad de los valles en la región de Río Verde al este de la Ciudad de San Luís Potosí, (2) montañas formidables: la Sierra Gorda, extensión de la Sierra Madre Oriental, y (2) grandes elevaciones en los extensos valles. La relativa gran área desértica en Querétaro aparentemente es una parte aislada del Desierto de Chihuahua..

(11) Propagación Tradicionalmente estas plantas pueden ser propagadas por semillas o fracciones, sin embargo esto presenta varias dificultades, ya que las semillas tienen un crecimiento muy lento y deben pasar varios años antes de que alcancen su estado reproductivo y las plantas maduras pueden ser estériles o producir pocos o ningún brote. Por lo que este método de propagación no es muy satisfactorio (Anult, 1987; Mauseth, 1977, 1979; Starling, 1985). El cultivo de tejidos vegetales es una técnica que se ha venido desarrollando y que brinda la posibilidad de preservar un gran número de recursos vegetales (Corona & Chávez, 1982; Kolar, 1976). La micropropagación permite el desarrollo de plantas nuevas en condiciones asépticas y artificiales. Esta técnica ofrece la posibilidad de obtener un gran número de plantas en poco tiempo, permitiendo además que su crecimiento se acelere, lo cual es importante para las especies vegetales que presentan un crecimiento lento. Contribuye a la preservación de plantas que se encuentran en peligro de desaparecer, así como la micropropagación de especies raras o de genotipo que tengan una característica de importancia especial (Corona di Chávez, 1982; Johnson & Emino, 1979b; Mauseth, 1977; Vyskot, etal1984). Este trabajo pretende contribuir a la micropropagación de lophophora wilkamsii, dado que permitiría la realización de diferentes estudios taxonómi cos, fisiológicos, químicos, botánicos, etc., a partir de plantas donadas in vitro manteniéndose de esta forma intactas las poblaciones naturales que aún existen, y al mismo tiempo se ampliarían los conocimientos acerca de esta especie..

(12) METODOLOGI A Para la realización del presente proyecto se utilizaron explantes tomados de plantas de peyote (lophophora williamit) colectadas en Río Verde, San Luis Potosí. Laboratorio Se emplearon fotoperiodos de 16 h luz / 8 h oscuridad y la temperatura se mantuvo en el laboratorio a 29 2 1 OC. Es importante el mantener libre de contaminación por bacterias u otros patógenos a las plantas propagadas vegetativamente. La micropropagación se realizó según las técnicas propuestas para el cultivo de células y tejidos vegetales en los que se emplean medios de cultivo que contienen los nutrimentos necesarios para su buen desarrollo y crecimiento. Las técnicas de cultivo de tejidos que se emplearon son: explante cultivado asépticamente, inducción de callo, mantenimiento de callo, organogénesis (enrai zamiento), inducción de brotes directa. Cada una de éstas técnicas requiere de medios de cultivo específicos, con proporciones de sales minerales, vitaminas, fuente de carbono como sacarosa, f itoreguladores de crecimiento (principalmente auxinas y citocininas) agar, variando las concentraciones de dichos elementos y de acuerdo a la literatura sobre cactáceas (Murashige & Skoog, 1962, 1974; Colomas, 1971; Minocha, 1974; Mauseth & Halperin, 1975,1976, 1977,1979,1984;Kolar et al, 1976;Johnson & Emino 1977 a, b y 1979 a, b; Mehra & Cheema, 1980;Vyskot & Jara, 1984;Ault & Blackmon, 1985 y 1987;Díaz, 1985;Escobar e t a l , 1986;Martínez et al, 1989;Clayton et al, 1990;Corneanu et al, 1990;Gratton & Fay 1990;Alcántara, 1991;Phillips & Hubstenberger, 1995). El laboratorio R-003 cuenta con un área estéril aislada para siembra, un cuarto de cultivo y un área de trabajo para lavado y esterilización de material. En equipo tiene refrigerador, balanza.

(13) analltica, parrilla de calentamiento y agitación, autoclave, horno de microondas y equipo de computo. Cristaleria adecuada y reactivos: agar, medio MS (Murashige & Skoog), fitoreguiadores: ANA (ácido naftalenacktico), A I A (ácido indolacético), BAP (bencilaminopurina), 2-ip (2-isopenteniladenina), KIN (cinetina) y giberelinas. Etapas del desarrollo del proyecto: Etapa I. Elaboración del anteproyecto. Recopilación y revisión de información bibliográfica. Etapa 11.Preparación de medios de cultivo 1.Preparación de soluciones stock a) Pesar 0.010 g de ANA, diluirlo en 10 mL de agua destilada (1.0. mg/L) b) Pesar 0.010 g de BAP, diluirlo en 10 mL de agua destilada (1.0 mg/L) c)Pesar 0.040 g de KIN, diluirlo en 10 mL de agua destilada (4.0 mdL) d) Pesar 0.020 g de A I A , diluirlo en 10 mL de agua destilada (2.0 m9W e ) Pesar 0.050 g de 24p, diluirlo en 10 ml de agua destilada (5.0 mg/L) f) Mantener en refrigeración 2. Preparación de medios de cultivo. Se preparó el medio de. cultivo Murashige di Skoog (MS, Sigma 5519), adicionado con sacarosa al 3%y como gelificante Agar (Sigma) 8g/L.. Una vez preparado el medio de cultivo, antes de que solidifique, se agregaron los. 3. Suplementación de medios de cultivo..

(14) -. u. p. fitoreguladores según se muestra en la tabla 2, y se esterilizaran a 15 Ib por 15 min. Tabla 2. Concentraciones en mg/L TRATAMIENTO A I A 2-IP BAP ANA 1 2 5 2 1 1 3 Testigo O O O O. KIN 4. O. Nota: a todos los medios se les adicionó ácido ascórbico (50 mg/L) y ácido cítrico (100 mg/L) como una mezcla antioxidante. Además de los cultivos con reguladores de crecimiento se realizó un lote testigo. Etapa 111.Limpieza de tejido a)Se prepara alcohol al 70 % + agua destilada esterilizada, solución donde se sumerge la planta durante 2 min. b) Se pasa el cacto a una solución de hipoclorito de sodio al 10% y dos gotas de tween 20 durante diez min. c)Se elimina la solución anterior con cinco lavados de agua destilada esterilizada. Etapa I V . Siembra de los explantes (segmentos de costilla) a) Se procede a sembrar en área estéril b) Se decanta al agua desti lada estéri I c) Se termina de cortar el cacto (todos los explantes) f) Se procede a sembrar con pinzas flameadas (uno por uno de aproximadamente un cm2) ACTIVIDADES REALIZADAS Durante el desarrollo del proyecto se revisaron bancos de datos, buscadores en internet, tales como Altavista, yahoo!,.

(15) Netscape, por lo que aumento el número de reguladores del crecimiento vegetal a utilizar y con ello los tratamientos dados a f. wi/fiamiicon el fin de comparar y verificar los resultados en el peyote. OBJETIVOS Y METAS ALCANZAOOS. El presente trabajo logró llegar a la segunda fase de la micropropagación de 1. williamii, es decir se establecieron las concentraciones de los reguladores que favorecen la formación de callo y brotes en el explante y su mantenimiento, por lo que contribuye en la información de la micropropagación del peyote. Debido a su lento crecimiento no se llegó a la obtención de nuevas plantas capaces de subsistir en suelo para que sean susceptibles de análisis y, establecer la homologla con las plantas propagadas naturalmente; con el fin de determinar posibles alteraciones en los cultivos in vitro. RESULTADOS Y CONCLUSIONES En la tabla 3 se muestran los resultados obtenidos bajo los distintos tratamientos y el lote testigo. Tabla 3. Respuestas de segmentos de costilla de L. williamsiicultivados en medio MS.. TRATAMIENTO RCV 1 2-ip 2 A I A , KIN 3 BAP, ANA Testigo +. OBSERVACIONES Callo+ Brotes++ Callo ++ Brotes Callo- Brotes Callo- Brotes -. respuesta positiva; - respuesta negativa. Los tratamientos se hicieron por duplicado y en todos ellos se observo un porcentaje ¿e contaminación muy alto, superior al.

(16) 50 % en la mayoría de los casos, lo cual era esperado ya que los cultivos fueron iniciados de plantas provenientes del campo, incluso antes de la siembra estaban infestadas por una plaga de apariencia blanca algodonosa. De los tratamientos utilizados sólo el que contenía 2-ip promovió la formación de brotes. En este mismo tratamiento se desarrollo callo, aunque fue poco frecuente, mientras que la presencia de KIN y AIA increment¿ su presencia (figura 4). Los reguladores BAP y ANA aparentemente no ejercen ningún efecto morfogénico.. Figuro 4. Cultivo in. vitro&. a b L. wi//iamii. a) Gallos obtenidos en presencia de Kin y A I A : b) Brotes. generados en presenciade 2iP.. Los brotes obtenidos se desarrollaron a partir de la areola, mientras que en el extremo opuesto, donde abunda el tejido parenquimatoso se dio el incremento del callo. La formación de brotes por organogénesis somática se llevó a cabo en cortes de costilla de L. williamsii. Hasta el momento se ha llegado al establecimiento de las fases I y I1 de la micropropagación. La propagación por cultivo de tejidos vegetales es una herramienta biotecnológica para la conservación de las especies vegetales. RECOMENDACIONES. El peyote de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana NOM059-Ecol-1994 es una planta sujeta a protección especial, debido.

(17) a lo restringido de su hábitat y a su carácter alucinógeno por su alto contenido de alcaloides, siendo la mezcalina la más importante, se usa en actividades rituales, por lo que sus poblaciones silvestres se ven seriamente amenazadas; así, con la ayuda de herramientas como el cultivo de tejidos vegetales es factible su propagación para el uso en estudios o investigación sin tener que mermar las poblaciones silvestres. Es necesario continuar estas investigaciones ampliando el intervalo de concentraciones de los reguladores del crecimiento vegetal y probando diversas combinaciones de estas sustancias para lograr una definición precisa del método de micropropagación de í.williamii.. Alcántara, G.R. 1991.Propagación vegetativa in vitro de Peyote (íophophora williarnsii) Coulter. Tesis de licenciatura. UNAM. ENEP Iztacala. Los Reyes Iztacala. Estado de México. Ault, J.R. & Blackmon, W.J. 1985. i n vitro propagation of selected native cacti species. HortScience 20:143-541 -& 1987. i n vitro propagation o f Ferocactus acanthodes (cactaceae) HortScience 22: 126-127 - & Sharma, G.C. 1983. Picloram indeced somatic embryogenesis in Gasteria and Haworthia. Plant Cell, Tissue an Organ Culture 2: 123-132 Boke, H.N. 1980. Developmente morphology and anatomy in cactaceae. Bio Science. 30:605-610 Bravo, H.H. 1937.Las cactáceas de México. Vol. I UNAM. México . 1978. Las cactáceas de México. Vol. I UNAM México . 1991. Las cactáceas de México. Vol. I1 UNAM México.

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