Sin otro particular. aprovechamos la oportunidad para reiterar a usted nuestra más atenta

[JNIVERSIDAD

AUTÓNOMA

METROPOLITANA

Unidad Iztapalapa

/Nombre: Acevedo HernBnda Ma Cristina Gnadalupe

Matrícula: 93328499

/~icencianii-a: Ingeniería de los .iiimenior. Unidad Iztapalapa.

/División: Ciencias Biológicas y de la Salud

Teléfono: 6-12-49-57

Trimestre lectivo: 9% P

Horas a la semana: 4 horas diarias

/Tínilo del Proyecto: Recuperación de p(ptidos a partir de subproductos de pesedo mediante In prote6lbis controlada de la enzima F l o v o ~ m e para dietas destinadas a acuacultura.

Nombre de ios asesores:

/ _{Dra. Lilia Arely Prado Barragán}

Puesto: Profesor titular B Dr. Sergio Huerta Ochoa Puesto: Profesor titular C

Adscripción: Biotecnologia

Lugar donde se realiza el Servicio: Universidad Autónoma Metropolitana Unidad iztapaiapa, Ciencias Biológicas y de la Salud, Departamento de '

Biotecaologia

.

Fecha de inicio: 18 de julio de 1997 J Fecha de terminación: 1 de julio de 1998

J

Clave: lA.046.97

Nombre del Proyecto: Introducción, adaptación y desarrollo de la tecnología del cultivo de la langosta de agua dulce (Cherat quadricurinalus)

.

Firmadel Alumno

.

Acevedo Hernlndez MnaiC&?t$j Guadalupe A

Gasa abierta al tiempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

3

de julio, 1998

DR. JOSE LUIS ARREDONDO FIGUEROA PRESIDENTE,

CONSEJO

DIVISIONAL Q

P R E S E N T E

Por medio de la presente le informamos a usted que la alumna MA. CRISTINA GUADALL'PE ACEVEDO

HERNANDEZ,

matricula 9332849 de la licenciatura de Ingeniería de los Alientos desarrollo y concluyó satisfactoriamente el proyecto y reporte final del servicio social titulado "RECUPERACION DE PEPTiDOS A PARTIR DE SC%PRODUCTOS DE PESCADO MEDIANIT LA PROTEOLISIS CONTROLADA DE LA ENZIMA FLAVOURZYME" PARA DIETAS DESTINADAS A ACUICULTURA".

Asimismo, hacemos de su conocimiento que el retraso en la entrega del reporte final se debió a

problemas de estandarización de las rnetodologias aplicadas.

Sin

otro particular. aprovechamos la oportunidad para reiterar a usted nuestra más atenta

consideración.

A T E N T A I\f E N T E

.

"CASA ABIERTA

AL

TIEMPO"

DRA. L.ARELY

PRADO

BARRAGÁN

PROFESOR TITCZAR PROFESOR TITULAR DR. SERGIO HUXRTA OCHOA

UNIDAD IZTAPALAPA

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

SECRETARIA ACADEMICA

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que el (la): DR. SERGIO HUERTA OCHOA. del Departamento de BIOTECNOLOGíA.

de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:

TITULO Recuperación de péptidos a partir de subproductos de pescado mediante la proteólisis controlada de la enzima

Flavorzyme para dietas destinadas a acuacultura ALUMNO Acevedo Hernandez María Cristina.

MATRICULA 93328499

LICENCIATURA Ingeniería de los Alimentos. PERIODO

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a veintiuno de Julio de mil novecientos noventa y ocho.

Julio 18, 1997 a Julio 7, 1998.

A T E N T A M E N T E "Casa Abierta al Tiempo"

SECRETARIO ACADÉMICO

(

UNIDAD ETAPALAPA

Jombre: Acevedo Hernández Ma. Cristina Guadalupe 4atrícula: 93328499

kenciatura: ingeniería de los Alimentos

%ECUPERACIÓN DE PÉPTIDOS A PARTIR DE SUBPRODUCTOS DE

PESCADO MEDIAYTE LA PROTEÓI W S CONTROLADh DE LA EYZIMh

FLAVOlJRZYME PARA DIEI'AS DESTINADAS A ACUACULTLRA".

Legistro del Servicio Social: 18 de julio de 1997 'echa de entrega: de julio de 1998

Iombre y adscripción de los asesores: ira. Lilia Arely Prado Barragán

'rofesor titular B, Biotecnología Profesor titular Dr Sergio Huerta C, Ochoa Biotecnología

RESUMEN

OBJETIVOS

*

Optimizar el método enzimático, caracterizando la enzima Flavourqme Tu

*

Caracterizar el desecho de pescado bromatológicamente

Caracterizar los hidrolizados obtenidos de acuerdo a su peso molecular

*

Proponer usos alternativos para los péptidos obtenidos

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Se utilizó desecho de atíui cuya composición bromatológica fue de 22.83% de proteína en base húmeda, 2.89% de grasa, 71.79% de humedad y 2.48% de cenizas.

Se determinó pH (7)temperatura (55"C),

Km

(0.0086 mg/mi) y Vmáx (226.86 mgímlmin) , sobre proteína de desecho de atún. Posteriormente se

procedió a determinar el grado de hidrólisis a diferentes tiempos y se determinó el rango de pesos moleculares de las fracciones obtenidas:

A los 40 minutos péptidos menores de 129 Kdaltons, a 80 y120 minutos

menores de 33 y 25 Kdaltons respectivamente.

En base a las referencias bibliográficas se propone que a grado de

hidrólisis de 13.96% las fracciones obtenidas pueden utilizarse cjlho

emulsificantes. A los grados de hisrólisis de 15.29 y 15.87%, lospéptidos son solubles y se pueden usar para enriquecer bebidas y para dietas de ancianos y niños hipoalergénicos.

En el mundo actual existe una deficiencia importante en proteína alimentaria que se convierte en desnutrición en muchos países. Un aprovechamiento adecuado de los productos de origen animal (los cuales contienen la proteína de mejor calidad) y una mejor valoración de sus subproductos y desechos podría, en parte, ayudar a mejorar esta situación. El c ~ s u n i o dz pescado

i x

si.&) íi trlv.3 de ! t i : s i g h LGI fi.ieiiir tr:xkio:ul de

proteínas, sin embargo, a pesar de que Mkxico cuenta con 10,000

km

de litorales con una plataforma continental de 500,000

km2

y 1.5 millones de hectáreas de lagos, presas y

bordes, en los cuales existe una gran riqueza ictiológica, el consumo de pescado no es muy

popular y por 1.0 tanto esta distorsionado, estancado, o mal aprovechado (Morales, 1986). No

obstante que la captura pesquera ha ido. en aumento (lo que sitúa a México entre los 15 primeros p&es pesqueros del mundo), el consumo de pescado promedio por persona apenas alcanza 4 kg anual, lo que resulta bajo si se compara con el consumos de otros

países (Mackie, 1982). De esta forma la utilización de una fuente abundante y originalmente

barata de proteínas como es el pescado queda fuera del alcance de las zonas y grupos que,

desafortunadamente, tienen los mayores problemas de desnutrición (Morales; 1982) y más aún

si se toma en cuenta todos los desperdicios de las industrias procesadoras de pescado y de la

flora de acompañamiento de especies de mayor valor comercial, podemos afirmar que se está perdiendo una cantidad importante de proteína de origen animal de alta calidad.

Por lo anterior, en los últimos años se ha iniciado una serie de investigaciones enfocadas

a

recuperar la proteína desechada a partir de subproductos de pescado, entendiéndose como subproducto a los restos después del fileteo, procesamiento de pescado (enlatado), así como la flora de acompañamiento de importantes especies marinas. Esta

recuperación de proteína puede realizarse mediante la obtención de hidrolizados.

El

objetivo buscado en los hidrolizados es, en general, obtener productos solubles, pero el aumento en la solubilidad significa pérdida de otras propiedades funcionales. Características de los hidrolizados:

Se distinguen en forma clásica dos grandes categorías de hidrolizados:

*

Hidrolizados químicos.- Se efectúa en medio ácido (HCI o HzS04) o en medio alcalino

(NaOH). Las condiciones son drásticas, temperaturas de 100°C y bajo presión. La

.

hidrólisis ticida tiene la desventaja de descomponer en forma parcial algunos aminoácidos y destruir por completo el triptofano. Es necesario suplementar al hidrolizado con estos aminoácidos, por otro lado, la hidrólisis alcalina con sosa provoca la destrucciijn de las cisteína, cistina, arginina y metionha.

*

En conrraste con:

*

Hidrofizudos enlimáticos: Que por medio del control del proceso, se pueden obtener

hidrolizados de mejor valor nutritivo que por los métodos químicos. Dentro de los

hidrolizados enzimáticos se encuentran dos categorías principales:

I Auto1izados.- Obtenidos por la acción de enzimas proteolíticas endógenas del

pescado, localizadas en el sistema digestivo y en las vísceras (tripsina,

quimiotnpsina y pepsina), así como en tejidos musculares (catepsina).

Heterolizados.- Productos obtenidos por la acción de una enzima (o mezcla de exzimas) obtenida en forma comercial y se adicionan al medio. Se busca

obtener productos proteínicos solubles, de adecuado valor biológico capaces de

sei'

tiiipleados C:I la aliri::;~:tzcio-:

..

b!:,:,xa n > . i i h d .

La coniposición química del hidrolizado depende de la enzima seleccionada. Cada enzima hidroliza la cadena polipeptídica en sitios más o menos específicos. Algunas enzimas degra.dan con más intensidad la molécula de proteína que otras y conducen a un producto más abundante en aminoácidos.

Un fa&& importante a considerar es la actividad de la enzima a fin de examinar los criterios econ6micos que condicionan el costo del hidrolizado; para ello se necesita caracterizar la enzima.

Las enzimas proteolíticas o proteasas comerciales hidrolizan _los enlaces peptídicos con diferentes grados de intensidad y de selectividad; Fluvourzyme es una

proteasdpeptidasa compleja que hidroliza las proteínas en condiciones neutras o

ligeramente ácidas, además, es utilizada para obtener hidrolizados no amargos.

Flavourqme es obtenida por fermentación con una cepa seleccionada de

Aspergillus

oryzae y produce tanto endoproteasas como exopeptidasas; las endopeptidasas trabajan

rompiendo los enlaces peptídicos en el interior del polipéptido mientras que la

exopeptidasas van separando los aminoácidos terminales en la cadena, originando aminoácidos libres. (Novo Nordisk)

Influencia del

pH:

La actividad de las enzimas depende mucho de la concentración de

iones hidrógeno del medio, ya que esto afecta el grado de ionización de los aminoácidos del sitio activo del sustrato; esto llega a influir en la afinidad que tenga la enzima por el sustrato. Por ello es necesario conocer el

pH

al cual la enzima está trabajando

a

su máxima

capacidad. La solución enzimática se acondiciona por medio de una solución amortiguadora ajustada al pH.óptimo para obtener una máxima-actividad.

Para

conocer este pH, se somete la enzima a diferentes pH's pero bajo condiciones de temperatura y sustrato óptimas.

Al

graficar la actividad a los diferentes pH's se puede saber el pH al que presenta la actividad

Influencia de la Temperatura:

Al

igud que el pH, cada enzima posee una temperatura óptima de actividad. Más allá de esta temperatura, la activi enzimática disminuye en

fenómeno es ampliamente, utilizado para detener la reacción de hidrólisis por la elevación de la temperatura al fmal del tratamiento. Por lo general, existen ventajas ai efectuar la hidrólisis a una temperatura cercana a la óptima, de tal forma que la velocidad de hidrólisis sea la más alta posible. Por otra parte, una temperatura elevada reduce la contaminación de microorganisrnos indeseables. Sin embargo. para tiempos de hidrólisis prolongados, es

necesario a veces disminuir la temperatura para evitar el fenómeno de autodigestión de la Otros factores importantes a analizar durante el proceso de obtención son:

* máxima (Badul, 1995).

forma rápida y termina por anularse debido a la desnatur

f

ización de la enzima. Este

enzima y conservar su estabilidad. De la misma manera que con el pH, experimentalmente se sabe, fijando la variables pH y concentración de sustrato y se varía la temperatura.

Concentración de Sustrato: Todas las enzimas muestran un efecto de saturación de

sustrato, por lo cual muestran una cinética caractenstica. _{L a} vzlociclad inicial (V) de la reacción enzimática es proporcional a la velocidad de desaparición del complejo Enzima- Sustrato. La Velocidad máxima (Vmáx) se obtiene cuando la enzima está saturada de sustrato.

L a eupreri0n de Michdic-Mentm

permite

:,sti!diar la variación

dsl

ordec dz

reacción en función de la concentración de sustrato:

V= Vmáx

rsl

Km

+ [SI

Dopde

Km

es un índice de afinidad que tiene una enzima por un determinado sustrato: los valores bajos indican que la enzima requiere de bajas concentraciones de sustrato para alcanzar la mitad de la velocidad máxima; por el contrario; los valores altos representan enzimas con poca afinidad hacia el sustrato, ya que es necesaria una elevada concentración de sustrato para lograra la mitad de la velocidad máxima. En condiciones de saturación [SI> >

Km,

la ecuación de Michaelis-Menten se transforma en V=Vmáx, que representa una cinética de orden cero; por otra parte, si [SI< <

Km,

entonces V= Vmáx [SI/

Km

y es una reacción de primer orden; el comportamiento intermedio está representado

por la ecuación de Michaelis-Menten

Al

dividir la ecuación entre Vmáx y arreglarla adecuadamente, se obtiene que Km=[S]; es decir

Km

es igual

a

la concentración de sustrato cuando la velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima.

La

ecuación de Michaelis-Menten puede reagruparse matemáticamente al tomar su inverso, para obtener una nueva expresión llamada de Lineweaver-Burk:

1=

K m +

-

1

V

V m á x [ ~ ] vmáx

Con esta ecuación se obtiene una línea recta cuando se grafica

l

i

en función 1/S cuya pendiente y ordenada al origen son W m á x y INmáx respectivamente.

Esta gráfica se usa para facilitar la interpretación de la información, aunque tiene el inconveniente de que requiere el inverso de la velocidad, lo que incrementa el error experimental (Badui, 1995).

También influye la concentraci&de la enzima, ya que la velocidad de hidrólisis es, como en toda reacción enzimática, proporcional la concentraclón de enzima. Sin embargo, a partir de cierto valor en la concentración, se puede efectuar una autodigestión de la proteasa provocando un efecto antagonista. En la práctica con frecuencia se trata de no sobrepasar una relación enzimw’sustrato superior ai 1% (Bwgueois. i986).

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e.

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I

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L

c

L

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-.._

r . . .

L

c

c

se puedan incorporar a dietas destinadas a la acuicultura, al pan o a

las

pastas y pueda

reemplazar a otea proteínas funcionales más costosas en diversos alimentos.

Es por ello que en este proyecto, mediante un método biotecnológico, se obtienen péptidos que pucdccn ser dirigidos a la acuicultua o consunio humano, además esta área no esta explotada icomercialmente aún, ya que ha resultado dificil introducir este tipo de producto por su amargor, olor y color (Sur6wka1994), y que con el debido control enzimático se puede eliminar estos problemas en el uso y tener una ventaja sobre los concentrados de harim de pescailu que adcmás de s a rxn.:~ nutriti:os it! accptabili*.:;ld por 21 consumidor

no es muy buena ya que posee un fuerte sabor y olor a pescado y no tiene la versatilidad de

uso que el hidrolizado (Burgeois.1986 y Moraies,i986).

Sven Fr~kjaer (1 994) en Dinamarca, encontró algunas aplicaciones de hidrolizados proteicos en alimentos de uso medicinal, como suplementos de proteína en alimentos para deportistas, dietas de control de peso, etc. En la actualidad la hidrólisis enzimática de proteína a partir de pescado se ha estado utilizando satisfactoriamente en Francia como ingredientes básicos en substitutos comerciales de leche y han resultado ser fácilmente dispersos o disueltos en agua y tiene

un

alto valor nutritivo (Mahamoud,1994).

OBJETIVOS.

General.

Recuperación de proteína a partir de subproductos de pescado mediante un proceso enzimático.

Específicos

1.

Optimización del método enzimático para la obtención de péptidos en

2. Caracterización bromatológica del homogeneizado de pescado.

3. Caracterización de los diferentes péptidos obtenidos en términos de peso

4. CaracterizacióI&romatológica de los péptidos obtenidos.

5. Proponer usos alternativos de los péptidos obtenidos en base a pesos términos de pH, temperatura y tiempo, usando la enzima Flavourryme.

.)

molecular.

moleculares.

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F

L

F

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TEULES

Y

MÉTODOS

Enzima: Fluvourzyme TU de Novo Nordisk, (Ver Apéndice A para ficha técnica y cálculos de unidades)

Desecho de atún adquirido en el mercado de La Nueva Viga del Distrito Federal el día 7 de enero y posteriormente empacado (200g por lote) al vacío y congelado a -20°C.

Reactivos: Ácido acético, ácido fosfórico, ácido bórico, Hemoglobina de bovino, Urea, ácido clorhídrico di:itiibuidc.; por SIC%!.\; hidróxido de sodio, áci.do tnc!oroacetico (TCA),

Reactivo de Folín Cicloauteu, fenol del distribuidor J.T.Beker; 2-b-mercaptoetanol, Dodesil sulfato de sodio (SDS), Acrilamidahis, Tris-HCI, Glicerol, Azul de bromofenol, Persulfato de amonio, y TEMED del proveedor Bio Rad.

Hidrólisis Enzimática:, Un mililitro de la solución de enzima Fluvourzyme a 10 AUikg. fue puesta bajo condiciones óptimas, se le adicionó 1 ml. de mezcla de desecho de atún y buffer (MDA) a razón de 1:4 (w/v). La mezcla se incubó el tiempo necesario y a la

temperatura requerida (Apéndice B ver para cada prueba). Después de la reacción se adicionó 2nd. de TCA 0.3 M para parar la actividad. Los aminoácidos obtenidos fueron expresados como miligramos de Tirosina empleando el método modificado de Broudrant y Chefiel (1976); usando 25p1 del sobrenadante del hidrolizado, (previamente centrifugado

10 min. en una centrifugadora BRABENDER), se le añadió 0.22Sm1 de agua destilada,

i

.25ml

de NaOH al 0.5N y 0.2Sml del reactivo de Folín, se incubi, durante I S min. a 30°C

y se leyó absorbancia en un Espectrofotómetro BECKMAN a h=S78nm y los resultados se extrapolaron a una curva patrón realizada con Tirosina (apéndice B). Además el Grado de Hidrólisis fue determinado mediante la ecuación propuesta por Beak y Cadwallader (1995) que dice:

_ .

GH = G r - G o

x 100

Gmav - Go

Donde Gt es la cantidad de Tirosina ai tiempo _t, Go es la cantidad de aminoácido original de MDA y Gmax _es la máxima cantidad de Tirosina obtenida mediante la Hidrólisis ácida de desecho de atún, colocando 0.lg de desecho a 4ml de solución digestora de HCI 6N, Fenol 0.1% (wh) y mercaptoetanol al 0.05% y se sometió a 110°C durante 24 horas.

‘Electroforesis: La enzima Flavourzyme (10AUKg) fue adicionada a la MDA bajo condiciones óptima a los diferentes tiempos (40, 80, 120 min). Luego de estos tiempos, la reacción se $tuvo sometiéndola a un baño de agua a 90°C durante 15min y posteriormente se centrifugo a 200 rpm por 10 min.

Se utilizó gel de electroforesis de poliacrilamida de acuerdo al método de Laemmli (1970) usando un gel de retención al

4%

y un gel de separación al

15%.

El estándar de

proteína utilizado fue de altos pesos moleculares (por SIGMA) con Miosina de conejo (205.000), 0-Galactosidasa de

E

coli

(I 16,000), Fosforilasa de conejo (97,000), Albúmina de bovino (66,000), Albúmina de huevo (45.000) y Entrocitos bovinos (29,000).

...

-1

... .,

r,.

~. .

Analisis Bromalológico: al desecho de atún se le practicó los análisis para determinar Nitrógeno total por el mitodo de Kjieldhal, Contenido de grasa de acuerdo a la norma de calidad NMX-F-89-S-1978.. Cenizas con la NMX-F-664-1978 y Humedad con la norma:

NMX-116-SSAI-1994. Asimismo se realizó el método de Biuret para cuantificar la proteína contenida en la MDA.

OBJETIVOS

Y

METAS ALCANZADAS.

1. Optimización del método enzirnático para la obtención de péptido en términos de pH, temperatura y tiempo, usando la enzima Flavourzyme.

*

Se logró caracterizar la enzima obteniendo pH óptimo, temperatura óptima de reacción y temperatura óptima de almacenaje, velocidad máxima, velocidad inicial,

Km

(coeficiente de afinidad), grado de hidrólisis y solubilidad a diferentes pH's.

2. Caracterización Bromatológica del Homogeneizado de Pescado y a los péptidos obtenidos.

*

Se realizó un análisis bromatológico al desecho de atún, mediante las normas de calidad; también se le cuantificó proteína ai MDA, así como a los hidrolizados por el método de

Biuret.

3. Caracterización de los diferentes péptidos obtenidos en términos de peso molecular

*

Con la ayuda de la tknica de Electroforesis se llegó a caracterizar en términos de peso

molecular a los diferentes peptidos obtenidos a partir de la reacción enzimática al MDA,

teniendo en cuenta el grado de hidrólisis al cual se están obteniendo dichos péptidos.

-4. Proponer usos alternativos de los péptidos obtenidos en base a pesos moleculares.

*

Se propuso una serie de alternativas para el uso de los péptidos obtenidos.

Por io anterior, si se alcanzaron las metas satisfactoriamente.

._.

..,.

__<

RESULTADOS Y CONCLUSIONES.

Optimización del método enzimático

Para poder determinar el pH y la temperatura Óptimos se realizó una reacción ewimática durante una hora para saber la actividad proteoítica con respecto al tiempo (Fig I). esto es importante ya que para realiza las pruebas de pH y temperatura se tiene que trabajar cuando la enzima esté en velocidad inicial, por esto se analizó su cinética enzimática variando la Concentración de sustrato (h4DA) con respecto al tiempo (Fig. 2 y 3).

Las gráficas 1 nos muestra que la actividad enzimática durante una hora, sigue aumentando, esto nos dice que podemos trabajar en este intervalo de tiempo asegurando que se

encuentra en velocidad inicial.

Al realizar el análisis de la cinética enzimática se encontró, con la ayuda de las ecuciones de Michaeli-Menten y Lineweaver-Burk, que la Velocidad máxima es de 226.86mgíml.min y la constante de afinidad

Km

tiene un valor de 0.0086mg/ml.

La actividad proteolítica de la enzima fue reportada como % de Actividad Relativa al

medir la concentración de Tirosina en _mgíd al someter la enzima a pH de 3,4, 5,6, 7, 8, 9 y 10

durante 25 min controlando la temperatura. De la gráfica 4 se nota que existe mayor actividad en un intervalo de pH de 6

-

7 , tomando pH 7 como Óptimo para realizar la pruba de grado de

hidrólisis (Fig 4).

Las temperaturas a

las

que se realizó la prueba fueron: 24, 35, 40, 50, 60 y 70°C. reportando un aumento en la actividad a 50 y 60°C, promediando este intervalo nos da que la temperatura óptima es de 55OC como lo reporta la ficha técnica proporcionada por industrias Novo (Fig 5)

-.

Análisis Bromatológico.

El

desecho de atún presentó las siguientes composición porcentual: Proteína: 22.83% en base húmeda

Grasa: 2.89% Humedad: 71.79% Cenizas: 2.48%

.

Con el factor de 6.25 se deduce que el desecho de atún tiene 3.65% de Nitrógeno total

El contenido de proteína

O

3 Tiempo(min) que presentaron ‘YO Grado de Hidrólisis las fracciones obtenidas de la hidrólisis son:

O 4.46

40 13.96 2.96

80 15.26 3.04

120 15.87 2.97

Proteína (mghni)

L . La hidrólisis total (100%GH) presentó una cantidad de proteína de 0.21 mgíml.

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Actividad Ploteolitina durante una hora

0.006

0.005

*

0.003

2

0.002

0.001

1

, '

Figura 2. Datos cinéticos de la enzima Flavourzyme sobre desecho de atún en condiciones óptimas

( 5 5 T

y

pH

7)

250 T

y

-

28123xt 115 15 W.09479

170 L

1M I , , ,-t

,,a t

i ~ o i m p i m ~ n i , "O r

4 W . T O %.Wl 0.W2 OW3 O w 1 OW5

70 ;

50

rl[mgirnq

Figura 3

.

Gráf~ca de Lineweaver-Burk

, .

r-

pH 6ptimo

I

1 ?O

1

12 10

O '

2 4 6 0

PH

Figura 4. Efecto del pH en la actividad enzimática de Flavourzyme en desecho de atún, manteniendo la temperatura a 55°C

Tempersturn bptima

>..-

e-

."

c

.

".

c

.-

P.

120,

O

30 40 50 60 70

20

Temperatura en 'c

Figura 5. Efecto de la temperatura en la actividad proteolitica de Flavorzyme en desecho de atún a un pH de 7.

Pesos moleculares de los péptidos obtenidos en las fracciones.

El el gel de electreofóresis se inyectaron las muestras como se muestra el la siguiente

figura:

I 1 2 3 4 5 6

Se inyectó en el siguente orden: I) MDA sin hidrolizar (OYoGH), 2) Hidrolizado a los 40

minutos (13.96%GH), 3) Hidrólisis a los 80 min. (l5.29%GH), 4) Estándar, a la derecha se

muestra los diferentes pesos molecuiares contenidos en la muestra; 5 ) Hidrólisis a los 120 min.

Con un grado de hidrólisis de 15.87%, y finalmente el carril 6 donde se inyectó Gmáx

(lOO%GH).

AI interpolar en la curva patrón del estandar se muestra que la MDA contiene proteinas y péptidos de diversos pesos moleculares, por lo que al hidrolizar a 40 minutos se logran obtener

péptidos menores de 129 Kdaltons, observando existe una mayor proporción de 20 -25 Kdaltons.

Al hidrolizar durante

80 minutos se tiene una mayor proporción de péptidos menor de los 33 Kdaltons. A los 120 minutos de reacción las fkacciones que se obtienen, contienen péptidos menores a 25 Kdaltons (Apéndice C).

Usos

.

alternativos de las fracciones obtenidas.

De los resultados anteriores podemos decir que de una hidrólisis de 40 minutos se

obtienen péptidos de pesos moleculares grandes que nos permite dar a un producto. la capacidad

A los 80 y 120 minutos se obtienen péptidos de menor peso molecular, lo que nos permite solubilizar y con ellos enriquecer bebidas, además de poder utilizarse en dietas especiales para hipoalergénicos, ancianos (por su fácil digestibilidad). y para deportistas.

RECOMENDACIONES

J Es importante que se cuantifique por otro método, el grado de hidrólisis, además del método que utiliza Baek y Cadwallader (1995) que sólo determina tirosina y hiptofano presente en

los péptidos, la dewentaja de éste es quz cl color no siempre es igual a la coricrnir?cii;n d,:

proteína, adem& que existe interferencia de algunos carbohidratos, Iípidos, hexosaminas, sulfato de amonio, sulfhidrilos, fosfatos y algunas soluciones amortiguadoras, pues interfieren

con los reactivos de este método. La otra opción puede ser el método propuesto por Adler- Niessen que utilizan solución TNBS.

J

Al

realizar la proteólisis para determinar el tamaño de los péptidos obtenidos se observa que

si se detiene la reacción con temperatura, la reacción no para en _el momento justo que

queremos por lo que yo propondría detenerla con inhibidores, con el objeto de parar al tiempo deseado.

J

Un

factor impomte es el pH que se modifica durante l a hidrólisis, por ello es importante que este se controle.

J Para separar la fracciones conforme a pesos moleculares sería recomendable hacer-una

filtración en gel.

J Sena recomendable realizar un análisis sensorial a los hidrolizados obtenidos.

.

i..

.

..

r-

.

..

BIBLIOGRA

~ i 4

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.

.

APENDICE A

Determinación de Unidades Anson (AU). (por el método analítico AF 4.3/5-GB,

modificado)

1. Se preparó 0.01 gramos de enzima en 10 ml de buffer universal y de esta concentración

2. AI tiempo cero se le adicionó 0.5

ml

de hemoglobina (utilizada como sustrato), excepto

3. A los 25 minutos de reacción se detuvo con 1

ml

de TCA al 0.3N y al blanco se le

1. Se dejó enfriar durante 20 minutos y se centnfugó.

5. Se le hizo la prueba de desarrollo de color con el reactivo de Folín, igual que con la

>e

tomó O 1 nil en iin hiha y 52 incub;) junto con un blanco a 50°C.

al blanco.

adicionó 0.5 ml de hemoglobina luego de poner el TCA.

curva patrón. (Apéndice B).

Cálculos:

Actividad = Absorbancia leídaíudml) X l X volumen de la solución de enzimaíml)

gramos de enzima X dilución

Se leyó: 0.01523 de absorbancia, extrapolando en la curva patrón no arroja: 0.01 169, entonces:

Actividad = (0.1 16963) XlX CIO) = 11.69 AU/g

(0.01)

Cálculos para determinar AU de acuerdo al peso del desecho de pescado.

Sabemos que por cada gramo de enzima se tienen 11.7 AU, para obtener 10 AU por kilogramo en una muestra de pescado de 30 g, se tiene que:

11.7AU A I g

IO AU

-

1000 g de pescado

X

-

30 g de pescado 3 x = 0.3 AU

.

11.7AU M lgdeenzima

0.3 AU

X

2

x=

0.02564de-

(+

APÉNUICE

B

CURVA PATRbN

DE

TIROSINA

1.

Se reaiizó una sene de diluciones de Tirosina con TCA ai

0.3M

como sigue:

mg de Tirosina ml de

TCA

al

0.3M

1

Diiuci6n

<n I ín

I

₁

J

..

.,

2"

Tomar 8 ;id de la dilución 1 y aforarios a i ü mi de

nx

ai 0.3M

Tomar 4 ml de la dilución 1 y aforarlos a 10 ml Tomar 2 ml de la dilución

1

y aforarlos a 1 O ml

'Tomar O mi de la dilución 1 y aforarlos a 10 ml

0.8

0.6

0.4

0.2

O

Tomar 6 ml de la dilución 1 y aforarlos a 10 ml

2. Se agregó lml de la dilución

1 y 2 mi de TCA a un tubo y se agitó.

3.

De cada una de las mezclas se tomó 25 p1 y se colocaron en un tubo, adicionando 0.225 mi de agua, 1.25 ml de NaOH ai 0.5

N

y 0.25 ml de reactivo de Folín al

1N.

4. Se colocaron los tubos en un baiio de temperatura a _30°C durante 15 minutos.

5. Se leyó absorbancia a 1=578 nm.

6. Se graficó absorbancia contra concentración y se obtuvo la ecuación de la curva como se

muestra:

Curva Patrón de Tirosina

.

0.3

y = 0.2517~. O.ooo4

0.25 .- Fp = 0.997 I

0.2 --

0.15 .-

0.2 0.4 0.6 O 8

-0.05 '

Tiroiina mgiml

(+

CINÉTICA ENZIMÁTICA (Determinación de

Km

y Vmax)

1. Se preparó la muestra de desecho de pescado homogeneizado con una proporción 1:2

(w/v). Se pesó lOOg de desecho de pescado y se Iicuaron con 200 mi de buffer universal

@H 7), se filtró la muestra y

se aforó a 200 ml.

2. De esta mezcla se tomaron las siguientes diluciones: 0.4,0.3, 0.2, 0.1 y O dml.

3. Estas diluciones fueron puestas a 55°C y se le adicionó la solución de enzima.

4. Decada dilución, se fueron tomando muestras a los siguientes tiempos: O, 5 , 10, 15,20 y

5. Se procedió al desarrollo del color como en la curva patrón.

6. Se graficó cadla dilución con respecto al tiempo. interpolando las absorbancias leídas en

25 minutos. L.a reacción se detuvo con TCA al 0.3 M

la curva patrón.

Se obtuvieron las gráficas siguientes:

V3 do la Dilución 0.1 glml Vo de la Dilución 0.2 glml

01345

Y ~ O ~ l X + 0 1 7 0 5

01146 R2 = O 8842

O2256

$

01045

E _{O 0945 O 1756}

CI 10 20 ~ 30 O 10 20 30

y = O 0015x + O 0978

R' _{O 96283}

Tiempo en minutos

Vo de la dilución 0.3 glmi Vo de la dilución 0.4 glml

0.3841

O 3341

o 10 20 30 O 10 20 30

Tiempo en minutos Tiempo en minutos

Vo de ir diluci6n 0.5 glmi

E

2

0.5429 Fp = 0.8729

'3 0.4929 c

3

0.4429

E.

0.3929

y = 0.0058~ + 0.4129

O 10 20 30

Tiempo en minutos

4 ~~~ ~

Cada pendiente se grafcó con respecto a la concentración de sustrato y de esta

Posteriormente se le calculó el inverso de la velocidad y de la concentración de

manera se encontró la cinetica enzhnatica.(Fig 2)

sustrato para encontrar la gráfica de Lineweaver-Burk y calcular

Km

y Vmáx.(Fig ₃₎

EFECTO DEL

pH.

I . Se preparó la

M D P

con relación 1:4 (wiv) para cada pH (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10) y se

2.

Las

muestras fueron puestas a una temperatura de 55°C y se les adicionó la enzima.

3.

De

cada pH, se fueron tomando muestras a los siguientes tiempos: O, 5, 10, 15, 20 y 25

4.

S z pocediij 3 realiza e1 desarrollo de color como en la curva patrrin.

5. L ~ S rcsuI:.iiios se cstr;lpolaron en la c w a p a d n y se graficó la coriccntración de

preparó la solución de enzima a 10 AUkg.

minutos. La reacción se detuvo con TCA al 0.3 M

tirosina con respecto al tiempo, obteniéndose las siguientes gráficas:

m - PH 4

PH 3

a

0.3247 R = 0.9088

'e

0.3047 0.2847

O 10 20 30

ten minutos

.~ ~ . -

__

PH 5

0.3758

0.3258

8

0.2758

E 0.2258

O 10 20 30

minutos

=

0 . w Y

4 O 10 M 30

minutos

.

-

Q.40*6

2 0.3586 R =o.

'8

03086

t! 02586

O 10 20 30

PH 9

pH 10

1

I o 5475 T--- -. 7

x + 0 4 0 1 4 ~ = 0 0 0 4 7 O 5524

-

0,5024 7 0.4524

2

2 0.4024 n _c

O 3524

-

-

1

-

-

O 10 20

min

Luego de calcular la actividad obteniéndose la gráfica de la figura no. 5 .

-

_{2 0.4975}

o(

0.4475

I

FP=O.4984

1

i

.-

~ I

y = 0.0032~ + 0.4399

0.3975 .

~

_

_

.

30 O 10 20 35

m in

relativa se graficó con respecto de cada pH

EFECTO DE LA TEMPERATURA.

1. Se preparó la

MDP

con relación 1:4 (wiv) para cada temperatura (24, 35, 40, 50, 60,

2. Las muestras fueron puestas en una solución a pH 7 y se les adicionó la enzima.

3. De cada temperatura, se fueron tomando muestras a los siguientes tiempos: O, 5, 10, 15,

4. Se procedió a realizar el desarrollo de color como en la curva patrón.

tirosina con respecto al tiempo, obteniéndose las siguientes gráficas:

70T) y se preparó la solución de enzima a 1 O AUikg.

20 y 25 minutos. La reacción se detuvo con TCA al 0.3

M

Los

resultados se extrapolaron en la curva patrón y se graficó la concentración de

~ ~~

. . .

Vo a 36%

V o a 24%

0 4

E

04268 =00023~+03668

O 3868

o 3 4

I

O 32 I

O 10 20 30

Tiempo en minutos O 10 20 30

Minutos

r

..

r-

L

c

..

c .

b -.

c

L

>I-

&..

c

b..

*

--

I

V o r 4 0 ' C

y = O W25x +O2995 F = 0 9 5 5 6 0.3791

03591

a

O3391 03191 O2991

.-

O 5 10 15 20 25

Vo a 50%

..

E

E

0.3268

g

e 0.2768 i 0.2268 i

O 5 10 15 20 25

Minutos Minutos

.

Vo a 60'C Vo a 70%

y=OW74x+O2345

e

O 24

E 023

O 5 10 15 20

E

02185

O 5 10 . - 15 .~

Minutos Minutos

Cada pendiente fue grafcada con respecto a la temperatura y así se obtuvo la

óptima.

.,,..

I. L

I-

..-

c

r”-

c,..

c-

L,

r

L...

r-

L.,.

I I

L

rl

..

<.

v -

L ..

-

c ..

_.

I.

.

APENDICE

c

Curva patrón del esthdar de pesos mleculares.

s

5.4

/

y = 0 . 2 3 0 6 ~ -t 4.1876

Rz

= 0.99

I

O 1

2

3 4 5 6

Distancia

(em)

~ ; / - #

I

5 t

4.9 T

4.8

-

4.1 A

4.6 T

4.4

I