Diseño y construcción de un sistema de biorreactores de inmersión temporal neumática para la multiplicación de ananas comosus var roja trujillana

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POSTGRADO

SECCIÓN DE POSTGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

DISEÑO Y CONSTRUCCIÓN DE UN SISTEMA DE

BIORREACTORES DE INMERSIÓN TEMPORAL NEUMÁTICA

PARA LA MULTIPLICACIÓN DE

Ananas comosus

var. ROJA

TRUJILLANA

TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS MENCIÓN EN BIOTECNOLOGÍA AGROINDUSTRIAL Y AMBIENTAL

Autor: Br. RICHARD ANDI SOLÓRZANO ACOSTA Asesora: Dra. ANA MARLENE GUERRERO PADILLA

Trujillo – Perú 2016

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JURADO DICTAMINADOR

Dra. Eva Villanueva de Cueva

PRESIDENTA

Ms. Aníbal Quintana Díaz

SECRETARIO

Dra. Ana Marlene Guerrero Padilla

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i DEDICATORIA

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ii AGRADECIMIENTO

Porque en la individualidad estamos solos, porque en el camino siempre aparecen las personas que necesitamos aunque no cuándo y cómo queramos, porque tras la adversidad al final todo parece tener sentido y las cosas haber estado escritas, porque nada es sólo nuestro y existe sin la voluntad de otros que comparten nuestros anhelos, quiero expresar mi agradecimiento a todos ellos.

Quiero agradecer de manera especial y sincera a mi asesora, la Dra. Marlene Guerrero Padilla por su amabilidad y especial cuidado en la revision del presente trabajo.

Sinceramente a la Dra. Miryam Borbor Ponce por permitirme realizar las pruebas con el cultivo de piña roja trujillana en el laboratorio de Biotecnología de la Escuela de Agronomía de la Universidad Naional de Trujillo.

Agradezco al Ing. Rubino Mejía Anaya por su apoyo con las plantas de piña y medio de cultivo en el laboratorio de Biotecnología.

A la Dra. Eva Villanueva Tarazona por su orientación en el Sistema de filtrado y su Amistad.

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iii Agradezco a mis padres por soportar varias veces, cortes del fluido eléctrico, ruido, apoyo incondicional y su orientación en instalaciones eléctricas, tuberías y tiendas plásticas que me sirvieron de mucho.

A Kathy por su compañia en todas las compras y la búsqueda de componentes y a los amigos Raúl y Guillermo, porque hicieron más llevadero el proceso con su curiosidad y a veces extravío.

A Felipe, quien indirectamente sin saberlo me facilitó financiar este proyecto y a la mosca de la fruta, ella sabe lo que pasamos y todo lo que me dió.

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iv ÍNDICE

DEDICATORIA ... i

AGRADECIMIENTO ... ii

ÍNDICE ... iv

RESUMEN ... v

ABSTRACT ... vi

I. INTRODUCCIÓN ... 1

II. MATERIALES Y MÉTODOS ... 9

2.1. OBJETO DE ESTUDIO ... 9

2.2. INSTRUMENTACIÓN O FUENTE DE DATOS ... 9

2.3. MÉTODOS Y TÉCNICAS ... 9

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 13

3.1.Diseño del sistema de soporte o andamiaje ... 13

3.2.Diseño del sistema de iluminación ... 15

3.3.Diseño del sistema de aireación ... 17

3.4. Diseño del sistema de filtrado ... 19

3.5. Diseño de los tanques o contenedores ... 21

3.6. Diseño del sistema de control y automatización ... 24

3.7. Pruebas de funcionamiento ... 26

3.8. Pruebas de cultivo de Ananas comosus var. roja trujillana ... 27

3.9. Determinación de la tasa de multiplicación del cultivo ... 29

IV. CONCLUSIONES ... 35

V. RECOMENDACIONES ... 36

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 37

ANEXOS ... .42

Anexo 1. Ficha técnica del filtro de venteo……...………...……...……42

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v RESUMEN

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vi ABSTRACT

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1

I. INTRODUCCIÓN

Dentro de las técnicas de cultivo de tejidos, la micropropagación es una técnica desarrollada para la producción a gran escala de plantas, que ha sido utilizada con éxito desde los años 60 del siglo pasado (Basail et al., 2012), con ventajas como, tasas de crecimiento mayores que en condiciones naturales lo que permite obtener una gran cantidad de plantas en corto tiempo reduciendo la superficie necesaria para mantenerlas, la obtención de plantas libres de bacterias, hongos y virus, la posibilidad de producir plantas durante todo el año (Juárez et al., 2011).

No obstante, esta técnica presenta ciertas limitaciones, requiere gran cantidad de recipientes de cultivo, mano de obra calificada, una escaza posibilidad de automatización, la eficiencia de propagación es limitada y son altos los costos de producción (Georgiev et al., 2014). Existen Biorreactores comerciales que permiten micropropagar plantas y tienen una gran aplicación en la biotecnología, dichos reactores se venden en el extranjero con un alto costo, estos prototipos son desechables.

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2 Los biorreactores constituyen una tecnología especializada, equipada y diseñada entre otros para el cultivo de tejidos vegetales; reconociéndose el cultivo de células, tejidos y órganos como una herramienta importante para la propagación clonal de cultivos de importancia comercial diversa, la producción de diversos metabolitos secundarios, la expresión de proteínas complejas (molecular farming), la fitorremediación convencional o mediante raíces transformadas (Georgiev et al., 2014).

Un biorreactor de inmersión temporal se caracteriza por sumergir parcialmente los explantes durante periodos iterativos. Entre sus diversas aplicaciones se encuentran: cultivos celulares para la producción de metabolitos, embriogénesis somática para la regeneración de plantas, cultivo de microbios procariotas (Gueguim et al., 2010), producción de compuestos fenólicos y flavonoides (Georgiev et al., 2014), producción de la enzima oxidativa laccasa que cataliza la degradación de lignina (Risdianto et al., 2007); además la producción de especies ornamentales como Gypsophila paniculata “lluvia” (Radmann, et al., 2001; citado por Newton et al., 2009). Así se prefiere la multiplicación clonal basada en el cultivo de tejidos de plantas porque proporciona una producción comercial libre de patógenos y homogénea genéticamente (Basail et al., 2012).

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3 maximiza el área de contacto del medio de cultivo con los explantes, ya que estos se sumergen en el medio líquido.

A nivel técnico y económico, el uso de biorreactores presenta ventajas a nivel de costos, ya que el consumo del sustrato es de manera eficiente, proporciona una mayor área de contacto con el explante reduciendo el costo por planta (Gueguim et al., 2010). El diseño y construcción de un biorreactor de inmersión temporal propio implica una menor inversión comparada con prototipos comerciales que son desechables y de alto costo; además la mayor velocidad de crecimiento se alcanza en menor tiempo, por lo tanto se obtiene explantes de igual tamaño en menor tiempo (Acuña, 2009).

La automatización reduce la mano de obra empleada en el proceso lo cual repercute en costos de operación, además el control de los parámetros de operación permite que la micropropagación sea más eficiente ya que se proporcionan las condiciones óptimas para el desarrollo de los explantes (Gueguim et al., 2010). También se pueden controlar algunas variables del proceso como el tiempo de inmersión y la frecuencia, el fotoperiodo y el flujo de CO2 (Arencibia, et al., 2013).

Finalmente es posible el escalamiento, ello implica que el trabajar con medio líquido permite micropropagar un mayor número de plantas en un mismo espacio, por lo tanto aumentar el volumen de operación permitirá producir más explantes (Juárez et al., 2011).

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4 Al respecto existen experiencias exitosas en otros países en la construcción de prototipos para esta índole. Monroy y Filgueira en 2010, en la Universidad Militar de Nueva Granada construyeron un prototipo con dos frascos gemelos para la micropropagación de Dianthus caryophyllus “clavel” empleando frascos de vidrio resistentes al calor y tapones de caucho perforados en los que se insertaron tubos de vidrio; el aire se adicionó a través de una bomba de pecera controlado por electroválvulas y un timer.

Empleando materiales de catálogo, Acuña (2009) en México, menciona el ensamblado de dos frascos gemelos. En Chile diversos proyectos han buscado introducir esta técnica en sus universidades y empresas agrícolas, para el caso particular de Vaccinium corymbosum “arándano” Arencibia et al. (2013) menciona el uso de frascos gemelos diseñados para su estudio.

Gueguim et al. (2010) construyeron un prototipo centrado en la implementación de detalles por computadora empleado un software para el control del proceso de fermentación de Pleurotus pulmonarius “seta ostra”. Juárez et al. (2011) diseñaron un biorreactor de inmersión temporal neumático y otro mecánico para la propagación de Aztekium hintonii, una cactácea en peligro de extinción, este sistema consta de un solo tanque en ambos casos.

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5 En Nigeria, bajo el patrocinio del Ministerio Federal de Ciencia y Tecnología, El Centro Nacional para los Recursos Genéticos y Biotecnología (NACGRAB) en 2012 construyeron un sistema completo de biorreactores de inmersión temporal de frascos gemelos y ensayan diversas especies agrícolas. Balogun et al. en 2014, en el mismo país, emplea una innovación en los Biorreactores de inmersión temporal de frascos gemelos consistente en tanques rectangulares superpuestos de la marca SETIS de la empresa BIOCHEMIE B.V.

A nivel nacional, el instituto de Biotecnología de La Universidad Nacional Agraria La Molina (2009) cuenta con un sistema, producto de un proyecto de propagación de Ananas comosus “piña” de la variedad Golden MD-2 financiado por CONCYTEC en asociación con Ecosolutions S.A. La empresa in vitro Perú S.A. en Lima comercializa un prototipo de índole cubana y el Centro Internacional de la papa (CIP) en Lima estudia su uso para lograr producir microtubérculos como semilla mejorada. Al margen de estas experiencias ninguno de estos sistemas son lo suficientemente accesibles económica y técnicamente para su uso masivo, convirtiéndose en exclusividad de quienes contratan el servicio de las instituciones mencionadas, por lo que el presente trabajo es pionero en su construcción y difusión técnica en nuestro país.

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6 Entre las variedades de piña comerciales de mayor demanda en el Perú están la Criolla Selva, la Cayenna Lisa y la MD-2, cuya producción se concentra principalmente en la selva central (provincias de Chanchamayo y Satipo); sin embargo importantes áreas cultivadas corresponden a variedades como Samba de Chanchamayo, Pucallpina, Roja trujillana y Motilona (Llanos, 2015).

En Poroto la variedad Roja trujillana es la más comercializada por su resistencia al transporte y grado de acidez (CEDEPAS NORTE, 2015); además se reportan en la zona variedades como Española, Piña Blanca, Vanila, Hawaiana, Selvática, Ecuatoriana, y Guayana Francesa cuyos sembríos se extienden por caseríos y anexos como Platanar, Con Con, Miñate, Dos de Mayo, Shirán, Chille y Cambarra, entre otros (Mendoza, 2010).

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7 Los productores de piña de Poroto y Salpo en La Libertad frecuentemente se abastecen de semillas de campos vecinos, teniendo graves problemas de uniformidad en las plantaciones y proliferación de plagas y enfermedades. Por lo que es importante realizar una limpieza de material propagativo y multiplicación mediante cultivo in vitro para evitar esta constante contaminación (Zavaleta, 2015). Esta actividad también permitiría establecer campos para semilla o unidades propagativas a fin de evitar llevar a campo definitivo plantas que presentan graves problemas sanitarios, además de seleccionar la semilla por tamaño y tipo para uniformizar cada área de cultivo (Sotomayor, et al., 2012). De esta manera se asegura una uniformidad de plantas en campo y por consecuencia fruta de buena calidad al momento de la cosecha.

Al utilizar la técnica de micropropagación, mediante la aplicación del método del SIT, en el cultivo de piña; se pretende mostrar el impacto que esta tiene, con respecto a los métodos tradicionales de micropropagación; ya que se obtiene una mayor tasa de multiplicación y aclimatación, así como mayores niveles de supervivencia en condiciones de campo (Cruzat, 2009).

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8 En las diferentes instituciones públicas de enseñanza superior que posee el país, existen carreras o especializaciones biotecnológicas; Genética y biotecnología en la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Ingeniería Biotecnológica en la Universidad Católica Santa María de Arequipa, Biotecnología en la Universidad Nacional del Santa, además de diversos institutos y laboratorios dedicados al cultivo de tejidos vegetales como el Instituto de Biotecnología Vegetal de la Universidad Nacional Agraria La Molina por citar los más representativos, en la mayoría de los casos orientadas hacia el cultivo de tejidos vegetales dada la naturaleza agrícola de nuestro país.

Es también cierto que los procesos en los casos citados, salvo la Universidad Nacional Agraria La Molina, no cuentan con el sistema de inmersión temporal dado su elevado costo y el hecho que la tecnología no se encuentra difundida en nuestro medio además que no existe información técnica suficiente para construir el sistema o muchos de los materiales son de importación o están destinados a otros usos.

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9

II. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1.OBJETO DE ESTUDIO

El sistema de biorreactores de inmersión temporal neumática

2.2.INSTRUMENTACIÓN O FUENTE DE DATOS

Se empleó como instrumentos para la toma de datos, fichas bibliográficas para recopilar los parámetros de diseños propuestos por cada autor consultado. Además se empleó fichas técnicas por cada producto a emplear en la construcción del Sistema de biorreactores para poder seleecionarlos según los parámetros establecidos.

2.3.MÉTODOS Y TÉCNICAS

2.3.1. Diseño del sistema de soporte o andamiaje (Acuña, 2009).

Se analizaron las dimensiones, material, tipo, forma y color para el adecuado soporte de los Biorreactores.

2.3.2. Diseño del sistema de iluminación (Georgiev et al., 2014).

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10 2.3.3. Diseño del sistema de aireación

Se analizaron los materiales, dimensiones, componentes, presión, volumen, caudal, velocidad, periodicidad y frecuencia de inmersión para el correcto mecanismo neumático que garantice la inmersión en los Biorreactores según los requerimientos del cultivo basado en Gueguim et al. (2010).

2.3.4. Diseño del sistema de filtrado

Se analizaron según Ducos et al. (2008) los filtros respecto a los tipos, dimensiones, material, porosidad, eficiencia, durabilidad y acople para garantizar la esterilidad en el proceso de cultivo en los Biorreactores.

2.3.5. Diseño de los tanques o contenedores (Arencibia et al., 2013 y Muñoz et al., 2009).

Se analizaron los tanques respecto al volumen, forma, dimensiones, material, durabilidad, resistencia al autoclavado y transparencia para el ensamblado de los Biorreactores basado en

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11 2.3.7. Pruebas de funcionamiento

Se analizaron de acuerdo a los parámetros establecidos en los numerales 2.3.1 al 2.3.6 el buen funcionamiento de los componentes para el correcto desempeño del sistema de biorreactores de inmersión temporal neumática y corrigieron las fallas encontradas.

2.3.8. Pruebas de micropropagación de Ananas comosus var. roja trujillana

Una vez determinada la operatividad del sistema de biorreactores se procedió a una prueba de micropropagación con la especie conocida como “piña” en la variedad mencionada. Las vitro-plantas o hijuelos (yemas con protocormo) introducidos en los biorreactores fueron proporcionados por el Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Escuela Académico Profesional de Agronomía, en un total de 90 hijuelos que fueron incubados en tres biorreactores para la prueba de eficiencia. Para ello se empleó como medio de cultivo el propuesto por el laboratorio de Biotecnología, el cual es una modificación del medio de Murashige y Skoog (1962) que se detalla en la tabla 1, no sólo el trabajo de construcción de este sistema es pionero en nuestro país sino también el cultivo in vitro de la piña roja trujillana, que no había sido introducida antes en un laboratorio para el cultivo de tejidos ni existen publicaciones de ello todavía hasta el término de este trabajo de investigación.

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12 2.3.9. Determinación de la tasa de multiplicación del cultivo

A los treinta días después de incubados los hijuelos, se determinó la tasa de multiplicación (TM) expresada en una razón del número promedio de material obtenido de hijuelos o unidades propagativas por biorreactor (NHF) entre el número de material parental sembrado (NHI):

TM = NHF / NHI

Ecuación 1. Tasa de multiplicación

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13

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1.Diseño del sistema de soporte o andamiaje

Se analizaron las dimensiones, material, tipo, forma y color para el adecuado soporte de los biorreactores a partir de Acuña (2009). Obteniéndose que:

a. Material: Los materiales más empleados son el aluminio, madera y plástico. Analizando las ventajas y desventajas de cada uno se prefirió el plástico que presenta buena durabilidad similar al aluminio sólo que sin oxidarse, no es susceptible al ataque de plagas como si lo es la madera y se puede adquirir en el comercio local en forma modular.

b. Tipo: Los tipos predominantes son los sistemas de soporte compacto y modular, se prefirió optar por el sistema modular porque facilita su ensamblado y desensamblado así como su manipulación y transporte.

c. Forma: Las formas estructurales más empleadas son cuadradas y rectangulares, se emplean las formas cuadradas para mayor resistencia, como no se requirió mayor resistencia de carga siendo los elementos que soportó son en su mayoría de plástico se optó por una forma rectangular cuya altura fue mayor que el ancho.

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14 e. Dimensiones: La altura de los contenedores más grandes a probar fue de 25 cm, a esta medida se le sumó la altura de los filtros que fue de 10 cm; se determinó que la altura mínima de cada nivel fue 35 cm y el ancho del mismo de 45 cm a partir del ancho de los contenedores más cinco centímetros adicionales de separación entre los mismos, la altura total del andamio y el número de niveles dependió de la disponibilidad de andamios en el mercado que cumplan las dimensiones por nivel antes especificadas.

Se adquirió un estante de tres niveles de 160 cm de altura y 90 cm de ancho, donde cada nivel tenía 45 cm de ancho y 40 cm de alto.

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15 3.2. Diseño del sistema de iluminación

Se analizaron los requerimientos de luminosidad: tipo, cantidad y periodo para mantener los niveles de crecimiento óptimos de los cultivos (Georgiev et al., 2014).

a. Tipo de luz: Con respecto al tipo de luz dependiendo de la bombilla eléctrica esta puede ser incandescente, fluorescente o LED. Se eligió el tipo fluorescente ya que su emisión corresponde a luz blanca fría que se asemeja a la luz natural bajo la cual crecen las plantas. Adicionalmente el tipo de fluorescente elegido fue de tubo horizontal de 65 cm de longitud basado en las dimensiones del estante.

b. Cantidad de luz: Según Mejía y Vittorelli (1988), los niveles de iluminación oscilan entre 1000 y 4000 Lux. Esto se logró colocando tubos fluorescentes blancos (40W) a una altura de 10-20 pulgadas sobre los cultivos.

c. Fotoperiodo: El fotoperiodo empleado para los cultivos in vitro de plantas es por lo general 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Como los autores revisados no especifican este parámetro el fotoperiodo fue diseñado para ser controlado con un timer digital que permite su control y cambio según criterio del especialista.

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16 Fig. 2. Timer digital programable 555 de 8 tiempos de encendido y apagado para el

control de paso de corriente en los fluorescentes.

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17 3.3.Diseño del sistema de aireación

Se analizaron los materiales, dimensiones, componentes, presión, volumen, caudal, velocidad, periodicidad y frecuencia de inmersión para el correcto mecanismo neumático que garantice la inmersión en los Biorreactores según los requerimientos del cultivo basado en Gueguim et al. (2010).

Gueguim et al. (2010), emplearon un compresor de aire AS9 280 (Ningbo Haosheng Pneumatic Machinery Ltd) en cual entregaba un caudal de 10 L por minuto y tranfería 3000 mL de medio en 20 segundos empleando 10 frascos gemelos (biorreactores) de 950 mL de capacidad.

Basail et al.(2012) emplearon una presión de aire de 2.0 atm (0.202 MPa) proveniente de un compresor la cual fue regulada por un manómetro, no menciona a cuanto fue regulado pero empleo tanques de 10 L de capacidad y adicionó 2 L de medio de cultivo.

Para el dimensionamiento del compresor se calculó las pérdidas por fricción en las tuberías y accesorios empleando la ecuación de Darcy-Weisbach y la fórmula de Colebrook-White automatizadas en una hoja de cálculo, según Mataix (1982) y Saldarriaga (1998) (Anexo 2).

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18 El sistema transfiere desde 500 mL de medio de cultivo en 10 segundos hasta 6 litros de medio de cultivo cuando se emplearon los 12 frascos gemelos (biorreactores) en 20 segundos a un caudal de compresor de 116 L por minuto.

Fig. 4. Compresor de aire de 0.8 MPa

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19 Figura 5. Tuberías, llaves de paso y terminales del sistema de aireación

3.4. Diseño del sistema de filtrado

Se analizaron según Ducos et al. (2008) los filtros respecto a los tipos, dimensiones, material, porosidad, eficiencia, durabilidad y acople para garantizar la esterilidad en el proceso de cultivo en los Biorreactores.

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20 Estos filtros tienen un muy bajo coeficiente de rozamiento y gran impermeabilidad, manteniendo además sus cualidades en ambientes húmedos. El acpople es rugulable ya que entrega dimensiones en una entrada cónica progresiva con crestas, desde 5mm hasta 10 mm.

Fig. 6. Filtro de venteo Acro 50 de 0.22 µm de poro

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21 Fig. 7. Manguera de silicona autoclavable de 10 mm de diámetro

3.5. Diseño de los tanques o contenedores

El contenedor más adecuado deberá ser de plástico claro, traslúcido y autoclavable, preferiblemente de boca ancha (Acuña, 2009). Existen diversos materiales en el mercado como el Carboy, Policarbonato y Boro-Silicato (vidrio). Estas botellas tienen como aditivo aparte tapas ventiladas con adaptadores para conectarlas con manguera de silicón autoclavable; así mismo se reportan envases de este tipo de varios volúmenes desde 250 ml hasta 10 L (Arencibia et al., 2013; Muñoz et al., 2009). Según Basail et al. (2012), los contenedores son frascos de cultivo tipo clearboys (Compañá Nalgene, E.U.A.) de 10 L.

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22 Figura 8. Contenedor de plástico resistente al calor de 2 L de capacidad

Dichos contenedores si bien es cierto soportan el autoclavado, la tapa no presentaba ninguna conexión hermética para la entrada y salida del aire filtrado, estas conexiones se adicionaron empleando conectores de riego de 10 mm, perforando en la tapa dos orificios con la ayuda de un taladro con una broca de 16 mm.

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23 Una vez construidos los contenedores o biorreactores se realizó una prueba de funcionamiento empleando aire a presión. El detalle del mecanismo se explica en la figura 10.

Figura 10. Principios de operación del Sistema de Frascos Gemelos (Georgiev et al., 2014)

(A) Periodo de exposición. Todo el volumen del medio líquido se encuentra en el

tanque de almacenamiento del medio. Las conexiones de ambos recipientes están

cerradas y las válvulas de solenoide se abren a la atmósfera; (B) Traslación del

medio de cultivo líquido de la cámara con explantes al tanque de almacenamiento.

La línea de aire de la cámara de cultivo se abre, y la línea de aire se cierra en el

tanque de almacenamiento de medio, lasobrepresión mueve el medio de un tanque a

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24 tanque de almacenamiento del medio está vacío. Las líneas de aire para ambos

recipientes están cerradas y las válvulas de solenoide se abrena la atmósfera; (D) que

drena el medio nutritivo de nuevo ael tanque de medio de cultivo. La línea de aire de

la cámara de cultivo se abre, mientras que la línea de aire del tanque de

almacenamiento de medio está cerrada. El exceso de presión se mueve hacia el

tanque de almacenamiento.

3.6.Diseño del sistema de control y automatización

A partir de lo mencionado por Gueguim et al. (2010), acerca de las variables de control en la automatización, se tomaron las siguientes, con sus respectivos parámetros:

a) Duración del proceso de propagación: es el tiempo total en horas o días que el biorreactor debe funcionar mientras se multiplica la planta. Para esta variable se consideró dejar este periodo abierto por lo que el sistema sólo dejará de repetir la frecuencia y duración de la inmersión por acción humana no programada; es decir, si se desconecta de la fuente de energía eléctrica o se desconfigura para iniciar otro cultivo o frecuencia.

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25 c) Frecuencia de inmersión: Indica la ocurrencia de cada inmersión expresada en minutos u horas. Para el sistema de control se programaron las siguientes horas como espacio entre cada inmersión: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 horas; de lo cual se entiende que la mayor frecuencia por día es de aproximadamente 24 veces por día y la mínima de tres veces.

d) Duración de la aireación: Indica el tiempo en que se proporciona oxígeno disuelto en el medio de cultivo, en este tiempo el aire entregado por compresión al sistema es suficiente para trasladar el medio de cultivo de un envase a otro, se determinó a partir del funcionamiento del sistema de biorreactores completo en tres repeticiones, que el tiempo mínimo promedio para ejecutar este proceso de traslación fue de diez segundos para el sistema de 12 frascos gemelos de 2 L de capacidad y 1/2 L de medio de cultivo por sistema de frascos gemelos (2 frascos).

El circuito temporizador se diseñó para entregar aire comprimido en base a este tiempo mínimo y se programaron periodos de aireación de: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 y 80 segundos respectivamente.

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26 Fig. 11. Sistema de biorreactores de Inmersión temporal neumática ensamblado y en

funcionamiento.

3.7. Pruebas de funcionamiento

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27 3.8. Pruebas de cultivo de Ananas comosus var. roja trujillana

Una vez determinada la operatividad del sistema de biorreactores se procedió a pruebas de cultivo con la especie conocida como “piña” en la variedad mencionada. Los hijuelos introducidos fueron proporcionados por el laboratorio de biotecnología vegetal de la Escuela Académico Profesional de Agronomía de la Universidad Nacional de Trujillo en un total de 90 hijuelos o unidades propagativas provenientes de un subcultivo en frascos en medio líquido los cuales fueron incubados en tres biorreactores (30 hijuelos por biorreactor) para la prueba de eficiencia. Para ello se empleó como medio de cultivo el propuesto por Murashige y Skoog (1962), que se expresa en la siguiente tabla.

Tabla 1. Composición del medio de cultivo a utilizar en la multiplicación de Ananas comosus en la prueba de Biorreactores

Sales de macronutrientes (mg·L-1) Sales de micronutrientes (mg·L-1)

NH4NO3 1650 KI 0.83

KNO3 1900 H3BO3 6.2

CaCl2·2H2O 440 MnSO4·4H2O 22.3

MgSO4·7H2O 370 ZnSO4·7H2O 8.6

KH2PO4 170 Na2MoO4·2H2O 0.25

CuSO4·5H2O 0.025

CoCl2·6H2O 0.025

Na2·EDTA 37.3

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28 Vitaminas:

1. Ácido nicotínico 5 mg·L-1 2. Tiamina hidrocloruro 5 mg·L-1 3. Piridoxina hidrocloruro 1 mg·L-1

Otros componentes  Mio-inositol 1 g·L-1  Sacarosa 3 %  BAP

 ANA

Dicho medio básico se suplementó con las vitaminas MS, que estuvieron preparadas en disoluciones concentradas stock y adicionalmente con sacarosa como fuente carbonada y con los reguladores de crecimiento ácido naftalen acético (ANA) y bencil amino purina (BAP) a una concentración en ambos casos de 2 mg·L-1.

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29 Fig. 12. Biorreactores instalados en el sistema de aireación e iluminación

3.9.Determinación de la tasa de multiplicación del cultivo

A los treinta días después de incubados los hijuelos, se determinó la tasa de multiplicación (TM) expresada en una razón del número promedio de material obtenido de hijuelos o unidades propagativas por biorreactor (NHF) entre el número de material parental sembrado (NHI):

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30 Fig. 13. Unidades propagativas obtenidas en un biorreactor a los 30 días después

de la siembra.

Tabla 2. Biomasa promedio de plántulas in vitro de piña, obtenida en el biorreactor

DÍA BIOMASA (g) N° UNID. PROPAGATIVAS

1 35 30

15 62 60

30 120 195

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31 Fig. 14. Evolución de la acumulación de biomasa de plántulas in vitro de piña,

obtenidas en el biorreactor hasta los treinta días.

Bajo el sistema convencional de recipientes de vidrio de 200 mL se obtienen de 2 a 3 yemas por cada hijuelo cultivado, de ello se contrasta el aumento considerable de la tasa de multiplicación en el biorreactor.

Fig. 15. Plántulas obtenidas en frascos en el sistema tradicional

y = 0.0764x2 + 0.564x + 34.36

0 20 40 60 80 100 120 140

0 5 10 15 20 25 30 35

gramo

s d

e

b

io

masa

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32 Como se mencionó anteriormente, el empleo de medio de cultivo liquido en las diferentes etapas de la micropropagación favorece el desarrollo de explantes y tal como se reportó para diferentes especies vegetales existen incrementos significativos de la tasa de proliferación (Bermúdez et al., citado por Albarracín 2012).

Llanos (2015) en el Sistema Automatizado de Inmersión Temporal (biorreactores) aplicó frecuencias de inmersión de 3 min cada 3 horas por un periodo de seis a ocho meses, para Ángel y Gonzáles (2013) en la fase de multiplicación, determinaron que al utilizar el Sistema de Inmersión Temporal con un tiempo de 5 minutos de inmersión, cada 2 horas, generó la mayor cantidad de brotes de piña variedad Golden. A diferencia del presente trabajo donde se sometió a periodos de inmersión de 1 minuto cada 8 horas.

(41)

33 Para Sepea y Sagawa, citados por García y Serrano (2005) la adición de reguladores y sus concentraciones son muy importantes, ellos lograron obtener alrededor de 5000 plantas a partir de un solo explante con medio liquido Murashige y skoog (MS) adicionado con agua de coco y transferidos a BAP para formar brotes axilares capaces de enraizar.

En cuanto al volumen de medio de cultivo empleado en este caso fue de 500 mL por contenedor de 2 L, al respecto Escalona et al., citado por Berthouly y Etienne (2005), demostrarón de manera similar con piña que un volumen de medio de cultivo óptimo para la proliferación de brotes, que se estimó es 200 ml por explante para esa especie. En este caso, volúmenes más grandes también condujo a una caída en la tasa de proliferación.

En sistemas de inmersión temporal de cultivo con tejido, es evidente que el tiempo de inmersión es muy importante, puesto que regula la absorción de nutrientes y expresión de hiperhidricidad (Ángel y Gonzáles, 2013). Los tiempos de inmersión utilizados para diferentes trabajos varían considerablemente; esto es probablemente debido a la gran variedad de especies, procesos y sistemas de micropropagación de inmersión temporal utilizado. Los largos tiempos de inmersión (1 h cada 6 h) demuestran ser eficaces para la tuberización de papa, mientras que los cortos tiempos de inmersión (1 min cada 12 h) estimulan la producción de embriones somáticos más en el café y el caucho (Berthouly y Etienne, 2005).

(42)

34 Salisbury, citado por González (2003), indica que utilizar una mayor frecuencia de inmersión puede presentar efectos como una baja en la concentración de oxígeno. El choque osmótico sufrido por los explantes durante cada inmersión en el medio de cultivo, posiblemente a mayor frecuencia los tejidos sufran un nivel de estrés que afecte la respuesta del explante (Maya, citado por González 2003).

(43)

35

IV. CONCLUSIONES

 Se diseñó y construyó un sistema de biorrreactores de inmersión temporal neumática con 24 tanques de 2 L cada uno para la micropropagación de plantas de piña.

 Se diseñó e implementó la automatización del sistema de biorrreactores de inmersión temporal neumática mediante un circuito temporizador que controló los mecanismos neumáticos de electroválvulas y compresor de aire.

(44)

36

V. RECOMENDACIONES

 Continuar con los ensayos del Sistema de Biorreactores de Inmersión Temporal Neumática para ajustar los parámetros de cultivo, como fotoperiodo, tiempo de inmersión y frecuencia de inmersión en el cultivo de la piña para generar y optimizar el protocolo de su cultivo in vitro.

 Ensayar otras especies en el Sistema de Biorreactores de Inmersión Temporal Neumática para comparar su eficiencia en la multiplicación masiva de especies de interés económico en nuestro país como el banano, la estevia y el arándano.

(45)

37

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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(48)

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http://www.fps.org.mx/divulgacion/attachments/article/812/Paquete%20tecnologico

%20para%20la%20produccion%20de%20pina%20en%20el%20sur%20de%20Sinal

oa.pdf

(50)

42 ANEXOS

Anexo 1. FICHA TÉCNICA DEL FILTRO DE VENTEO

Acro® 50 Vent Devices

Description

The Acro 50 vent filter is ideal for many filtration applications. The hydrophobic PTFE membrane repels water yet allows gases to pass freely through, a feature that makes the Acro 50 vent filter especially suited for venting applications, (i.e. incubators, bioreactors) and in-line air and gas filtration. The Acro 50 vent filter is compliant with OSHA standard 1910.1030 for use as a protective barrier against bloodborne pathogens1.

In organic solvent filtration, the Acro 50 vent filter offers excellent temperature and solvent-resistant characteristics, and will not lose its hydrophobicity while in use. The non fiber-releasing membrane and polypropylene housing both withstand autoclaving. It is available with a wide variety of inlet and outlet connections to facilitate incorporation into your system.

Acro 50 vent filters are designed to connect easily to hoses of various sizes “in-line” or as a final filter. Its hydrophobic PTFE membrane will not pass wáter unless its water breakthrough pressure is exceeded (refer to Integrity Test section).

Surfactants and solvents (i.e. alcohol) can be used to “wet-out” the membrane to enable filtration of aqueous solutions. For filtration of other non-aqueous solutions,

(51)

43

Certification

Pall Life Sciences certifies that this lot meets or exceeds the following specifications.

Specifications

Materials of Construction

Filter Media: PTFE on a polypropylene support

Filter Diameter

50 mm

Effective Filtration Area

19.6 cm2

Typical Air Flow Rates

0.2 μm 18 Lpm at 0.2 bar (20 kPa, 3 psi) 0.45 μm 12 Lpm at 0.2 bar (20 kPa, 3 psi) 1 μm 15 Lpm at 0.2 bar (20 kPa, 3 psi)

Maximum Operating Temperature

130 °C (266 °F) at 1.0 bar (100 kPa, 15 psi)

Maximum Operating Pressure

4.1 bar (410 kPa, 60 psi) at ambient temperature

Dimensions

(52)

44

Inlet/Outlet Connections

Stepped hose barbs, 6.4 - 12.7 mm (1/4 - 1/2 in.) diameter. Connections have internal taper design to accept male slip luer. The 0.2 μm pore size is available with 1/8 in. MNPT or 3/8 in. (9.5 mm) OD straight type connections.

Biological Safety

(53)

45 Anexo 2. CÁLCULO DE LAS PÉRDIDAS DE CARGA POR FRICCIÓN EN LAS

TUBERÍAS Y ACCESORIOS DEL SISTEMA DE AIREACIÓN

Los componentes a calcular se señalan en las siguientes figuras:

Fig. 16. Partes del sistema de aireación (tuberías)

Fig. 17. Partes del sistema de aireación (biorreactores)

PORTABIGOTES

PORTALATERAL

VÁLVULA

MATRIZ

FILTROS

BIGOTES

(54)

46 Basado en Mataix (1982) y Saldarriaga (1998), para el dimensionamiento del compresor se calculó las pérdidas por fricción en las tuberías y accesorios empleando la ecuación de Darcy-Weisbach, que permite calcular la pérdida de carga en un tramo longitud de tubería mediante la siguiente expresión:

donde,

Δp es la pérdida de carga medida según la altura manométrica (m.c.a.)

L es la longitud de tramo de la tubería (m) D es el diámetro interior de la tubería (m)

v es la velocidad del aire en el interior de la tubería (m/s) g es la acelaración de la gravedad (9,81 m/s2)

f es el es el factor de fricción de Darcy-Weisbach.

De la anterior expresión todos los parámetros son conocidos salvo el factor de fricción (f). En efecto, la velocidad del aire por la tubería (v) está relacionada con el caudal o flujo de aire (Q), que es un dato conocido proveniente del consumo necesario de cada punto de suministro.

En efecto:

Q = v · A

Donde:

Q es el caudal volumétrico o flujo de aire (m3/s)

(55)

47 En las instalaciones de aire comprimido la velocidad máxima recomendada para la circulación del aire por las tuberías está entre los 5-10 m/s, por lo que conocido el caudal (Q) necesario para el consumo y tomando una velocidad de circulación en ese intervalo, se obtiene de la expresión anterior el diámetro interior de la tubería (D). Por lo tanto es el factor de fricción (f), la gran incógnita a calcular.

El factor de fricción (f), es un parámetro adimensional que depende del número de Reynolds (Re) del fluido (en este caso, del aire) y de la rugosidad relativa de la

tubería (εr )

f= f (Re , εr ), donde el número de Reynolds (Re) viene expresado por la siguiente

formulación:

Re =

ρ · v · D

μ Siendo:

ρ la densidad del fluido, en este caso del aire (ρaire = 1,18 kg/m3 a 25

°C)

v es la velocidad del aire en el interior de la tubería (m/s) D es el diámetro interior de la tubería (m)

μ es viscosidad dinámica del fluido, en este caso del aire (μaire =

1,76·10-5 kg/m·s)

Por otro lado, la rugosidad relativa de la tubería (εr ) viene dada en función de la

rugosidad absoluta (K) del material del que está fabricada la tubería y de su diámetro interior (D) de acuerdo a la siguiente expresión:

εr =

K

D

(56)

48 Por otro lado, en el transporte de fluidos por el interior de tuberías, y el aire es un fluido, existen dos régimen: laminar y turbulento. Para cada fluido, y para una sección de tubería, a una temperatura determinada, existe una velocidad crítica (vc)

por debajo de la cual el régimen es laminar. Este valor crítico que marca la transición entre los dos regímenes, el laminar y el turbulento, se corresponde con un Re = 2300,

aunque en la práctica, entre 2000 y 4000 la situación es bastante imprecisa. Por lo tanto, en función del valor del número de Reynolds (Re) se tiene que:

• Re < 2000: Régimen laminar.

• 2000 < Re < 4000: Zona crítica o de transición.

• Re > 4000: Régimen turbulento.

Este concepto es importante conocerlo, porque la expresión para calcular el factor de fricción (f) es distinta según si el régimen es laminar o turbulento. Así se tiene que:

• Régimen laminar

En este caso el factor de fricción (f) depende únicamente del número de Reynolds a través de la ecuación de Poiseuille:

f = 64

Re

Expresión que resulta sencilla de aplicar para calcular el factor de fricción (f) en función del Reynolds (Re).

• Régimen turbulento

(57)

49 La expresión de la fórmula de Colebrook-White (1937, 1939), es la siguiente:

Donde, es el número de Reynolds, la rugosidad relativa y el factor de fricción. Para la obtención de lambda se empleó un método iterativo programado en Excel versión para Windows 2010. El detalle de los cálculos se muestra a continuación en las siguientes tablas.

A. Cálculo de la pérdida en Bigotes (x 36 unidades)

DATOS GENERALES

CARACTERÍSTICAS DEL FLUÍDO (Aire)

ρ (densidad) 1.21 Kg/m³

u (viscosidad dinámica) 0.0000180 Pa.s

v (viscosidad cinemática) 1.49E-05 m²/s

OTROS

g (gravedad) 9.81 m/s²

Ht (altura manométrrica del compresor) 81.58 m

E (error) 0.001 -

CARACTERÍSTICAS DE LAS TUBERÍAS

TUBERÍA

Diámetro d metros 0.01

Longitud L metros 7.2

Rugosidad absoluta Ks metros 0.0000015

Coeficiente global de pérdidas menores Km - 0.22

(58)

50 B. Cálculo de la pérdida en Portabigotes (x 6 piezas)

TUBERÍA

Rugosidad absoluta Ks metros 0.0000015 PVC

Coeficiente global de pérdidas menores Km - 0.99 codo+valvula

área A m² 0.00049

PRESIÓN DE ENTRADA VELOCIDAD MEDIA PÉRDIDA DE CARGA

POR FRICCIÓN PRESION DE SALIDA CAUDAL

Ht ks/d hf v hf i+1 hm Q

m - m m/s (m) m (m³/s)

81.58 0.00015 81.580 7.7363 80.9089 0.6711 0 0.001

81.58 0.00015 80.909 7.6991 80.9153 0.6647 0 0.001

81.58 0.00015 80.915 7.6995 80.9153 0.6647 1 0.001

PRUEBA

m - m m/s (m) m (m³/s)

81.58 0.00006 81.580 15.0111 70.2100 11.3700 0 0.007

81.58 0.00006 70.210 13.7866 71.9893 9.5907 0 0.007

81.58 0.00006 71.989 13.9837 71.7131 9.8669 0 0.007

81.58 0.00006 71.713 13.9533 71.7560 9.8240 0 0.007

81.58 0.00006 71.756 13.9580 71.7493 9.8307 0 0.007

81.58 0.00006 71.749 13.9573 71.7504 9.8296 0 0.007

81.58 0.00006 71.750 13.9574 71.7502 9.8298 1 0.007

(59)

51 C. Cálculo de la pérdida en Portalaterales (x 4 piezas)

TUBERÍA

Longitud L metros 4

Rugosidad absoluta Ks metros 0.0000015 PVC

Coeficiente global de pérdidas menores Km - 0.99 valvula+codo

área A m² 0.00049

D. Cálculo de pérdida en la tubería matriz de alimentación

TUBERÍA

Longitud L metros 2

Coeficiente global de pérdidas menores Km - 1.3 te+codo

área A m² 0.000

m - m m/s (m) m (m³/s)

81.58 0.00006 81.580 20.9237 59.4891 22.0909 0 0.010

81.58 0.00006 59.489 17.5085 66.1121 15.4679 0 0.009

81.58 0.00006 66.112 18.5841 64.1531 17.4269 0 0.009

81.58 0.00006 64.153 18.2712 64.7351 16.8449 0 0.009

81.58 0.00006 64.735 18.3646 64.5624 17.0176 0 0.009

81.58 0.00006 64.562 18.3369 64.6137 16.9663 0 0.009

81.58 0.00006 64.614 18.3451 64.5984 16.9816 0 0.009

81.58 0.00006 64.598 18.3427 64.6030 16.9770 0 0.009

81.58 0.00006 64.603 18.3434 64.6016 16.9784 0 0.009

81.58 0.00006 64.602 18.3432 64.6020 16.9780 1 0.009

81.58 0.00006 64.602 18.3433 64.6019 16.9781 1 0.009

81.58 0.00006 64.602 18.3432 64.6019 16.9781 1 0.009

(60)

52 E. Cálculo de pérdida en los filtros de venteo (x 24 unidades)

m - m m/s (m) m (m³/s)

81.58 0.000125 81.580 18.4722 58.9710 22.6090 0 0.002

81.58 0.000125 58.971 15.3450 65.9780 15.6020 0 0.002

81.58 0.000125 65.978 16.3631 63.8390 17.7410 0 0.002

81.58 0.000125 63.839 16.0576 64.4954 17.0846 0 0.002

81.58 0.000125 64.495 16.1518 64.2943 17.2857 0 0.002

81.58 0.000125 64.294 16.1230 64.3559 17.2241 0 0.002

81.58 0.000125 64.356 16.1318 64.3370 17.2430 0 0.002

81.58 0.000125 64.337 16.1291 64.3428 17.2372 0 0.002

81.58 0.000125 64.343 16.1300 64.3410 17.2390 0 0.002

81.58 0.000125 64.341 16.1297 64.3416 17.2384 1 0.002

81.58 0.000125 64.342 16.1298 64.3414 17.2386 1 0.002

81.58 0.000125 64.341 16.1298 64.3415 17.2385 1 0.002

PRUEBA

m - m m/s (m) m (m³/s)

81.58 0.00012 81.580 11.5216 72.7843 8.7957 0 0.001

81.58 0.00012 72.784 10.7892 73.8670 7.7130 0 0.001

81.58 0.00012 73.867 10.8814 73.7346 7.8454 0 0.001

81.58 0.00012 73.735 10.8702 73.7508 7.8292 0 0.001

81.58 0.00012 73.751 10.8715 73.7488 7.8312 0 0.001

81.58 0.00012 73.749 10.8714 73.7491 7.8309 1 0.001

PRUEBA

TUBERÍA

Coeficiente global de pérdidas menores Km - 1.3 ensanchamiento y membrana

(61)

53 F. Cálculo de pérdida en los tanques-biorreactores (x24 unidades)

TUBERÍA

Coeficiente global de pérdidas menores Km - 0.22

área A m² 0.011

G. Cálculo de las pérdidas totales en el sistema

Pérdidas totales de carga por fricción

COMPONENTE hm (altura manométrica) Presión (Mpa)

bigotes x 36 0.6647 0.01

portabigotes x 6 9.8298 0.1

portalateral x 4 16.978 0.17

matriz 17.23 0.17

filtros x 24 7.83 0.08

tanques 26.98 0.26

total pérdidas 79.5125 0.79

entrega compresor 81.58 0.8

m - m m/s (m) m (m³/s)

81.58 0.0000125 81.580 61.1211 39.6904 41.8896 0 0.691

81.58 0.0000125 39.690 41.1818 62.5633 19.0167 0 0.466

81.58 0.0000125 62.563 52.8590 50.2499 31.3301 0 0.598

81.58 0.0000125 50.250 46.8756 56.9413 24.6387 0 0.530

81.58 0.0000125 56.941 50.2013 53.3212 28.2588 0 0.568

81.58 0.0000125 53.321 48.4258 55.2848 26.2952 0 0.548

81.58 0.0000125 55.285 49.3954 54.2212 27.3588 0 0.559

81.58 0.0000125 54.221 48.8722 54.7977 26.7823 0 0.553

81.58 0.0000125 54.798 49.1564 54.4853 27.0947 0 0.556

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