Efecto sinérgico in vitro del aceite esencial de Origanum vulgare con Imipenem sobre pseudomonas aeruginosa

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE MEDICINA. ED. IC. TESIS. IN. A. -U. NT. ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA. Efecto sinérgico in vitro del aceite esencial de Origanum vulgare con. M. Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa. DE. PARA OPTAR EL TITULO PROFESIONAL DE:. LT. AUTOR:. AD. MEDICO CIRUJANO. CU. Pesantes Calderón, Juan Manuel ASESOR:. FA. Dra. Mejía Delgado, Elva Manuela. CO-ASESOR: Dra. Soto Vásquez, Marilú Roxana. TRUJILLO – PERÚ. 2018. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. DEDICATORIA. A Dios, por guiar cada paso que doy, mostrarme el camino correcto y. NT. mejorar diariamente como persona.. A ms padres: Clara Calderón y Juan Pesantes. -U. por su apoyo y motivación diaria que me permite. IN. A. seguir adelante cada día.. IC. A mi hermano: Gilberth Pesantes por la. el camino del bien.. DE. M. ED. motivación y consejos que me brinda en. A Katheryn Quiroz, por ser mi fiel. FA. CU. LT. AD. compañera y hacer más hermosos mis días. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. AGRADECIMIENTOS. A la Dra. Elva Manuela Mejía Delgado, por su tiempo, paciencia y experiencia impartida antes y durante la realización. IC. IN. A. -U. NT. de este trabajo.. ED. A la Dra. Marilú Soto, por sus consejos, aportes, recomendaciones y tiempo invertido en la. FA. CU. LT. AD. DE. M. construcción del presente trabajo de investigación.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. RESUMEN. i. ABSTRACT. ii. I. INTRODUCCIÓN. 3. 1.1. Problema. 7. 1.2. Hipótesis. NT. INDICE. 7. -U. 1.3. Objetivo General. A. 1.4. Objetivos Específicos. IN. II. MATERIAL Y MÉTODO. IC. 2.1 Objeto de Estudio. ED. 2.2. Materiales. M. 2.2.1. Criterios de Inclusión. 7 8 8 8 9 9 9. 2.2.4. Unidad de Muestreo. 9. 2.2.5. Tamaño Muestral. 9. LT. 2.2.3. Unidad de Análisis. AD. DE. 2.2.2. Criterios de Exclusión. 7. 10. 2.3.1. Diseño. 10. 2.3.2. Tipo de Estudio. 12. FA. CU. 2.3. Método. 2.3.3. Procedimientos. 12. 2.3.4. Operacionalización de Variables. 24. 2.3.5. Definiciones Operacionales. 25. 2.4. Aspectos Éticos. 26. 2.5. Análisis e Interpretación de la información. 26. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 28. IV. DISCUSIÓN. 34. V. CONCLUSIONES. 37. VI. RECOMENDACIONES. 38. VII. LIMITACIONES. 38. VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 39. NT. III. RESULTADOS. 45. FA. CU. LT. AD. DE. M. ED. IC. IN. A. -U. ANEXOS. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Efecto sinérgico in vitro del aceite esencial de Origanum vulgare con Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa RESUMEN Objetivo: Evaluar el efecto sinérgico in vitro del aceite esencial de Origanum vulgare (AEOV) con Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa. Materiales y métodos: El diseño experimental se desarrolló en 2 fases: en la primera, se evaluó el efecto del AEOV. NT. y de Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa mediante el método de disco de difusión. -U. y macrodilución en caldo, se realizaron 10 repeticiones para cada tratamiento. En la segunda, se obtuvo la concentración inhibitoria mínima (CIM) para el AEOV e. IN. A. Imipenem, posteriormente se determinó efecto sinérgico entre AEOV con Imipenem. IC. mediante el método de “tablero de damas” Resultados: La susceptibilidad de. ED. Pseudomonas aeruginosa frente al AEOV fue de 6.5mm, 8.2mm, 11.4mm y 16.5mm al 25%, 50%, 75% y 100% respectivamente y la susceptibilidad frente a Imipenem fue de. M. 37.3mm. La CIM de AEOV e Imipenem fue de 697.5ug/ml y 4ug/ml respectivamente.. DE. La CIM del AEOV con Imipenem mediante la técnica “Tablero de damas" fue de. AD. 30.51563 ug/ml y 1ug/ml respectivamente. La concentración inhibitoria fraccionada (CIF) entre el AEOV e Imipenem osciló entre 0.29 y 0.42. Conclusión: El AEOV si tiene. CU. LT. efecto sinérgico in vitro con Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa.. Palabras clave: Efecto sinérgico, aceite esencial de Origanum vulgare, Imipenem,. FA. Pseudomonas aeruginosa.. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Synergistic effect in vitro of the essential oil of Origanum vulgare with Imipenem on Pseudomonas aeruginosa. ABSTRACT Objective: To evaluate in vitro synergic effect of the essential oil of Origanum vulgare (EOOV) with Imipenem on Pseudomonas aeruginosa. Materials and methods: The. NT. experimental design was developed in 2 phases: in the first phase, the effect of EOOV. -U. and Imipenem on Pseudomonas aeruginosa was evaluated by diffusion disc and macrodilution in broth method, 10 repetitions were performed for each treatment. In the. IN. A. second, the minimum inhibitory concentration (MIC) was obtained for the EOOV and. IC. Imipenem, subsequently the synergic effect between EOOV and Imipenem was. ED. determined by the "checkerboard" method. Results: The susceptibility of Pseudomonas aeruginosa to EOOV was 6.5mm, 8.2mm, 11.4mm and 16.5mm at 25%, 50%, 75% and. M. 100% respectively and the susceptibility to Imipenem was 37.3mm. The MIC of EOOV. DE. and Imipenem was 697.5ug / ml and 4ug / ml respectively. The MIC of the EOOV with Imipenem using the technique "Checkerboard" was 30.51563 ug / ml and 1ug / ml. AD. respectively The fractional inhibitory concentration (FIC) between the EOOV and. LT. Imipenem ranged between 0.29 and 0.42 Conclusion: The EOOV does have synergistic. CU. in vitro effect with Imipenem on Pseudomonas aeruginosa. Key words: Synergistic effect, essential oil of Origanum vulgare, Imipenem,. FA. Pseudomonas aeruginosa.. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. I. INTRODUCCIÓN Pseudomonas aeruginosa es el patógeno humano más importante del género Pseudomonas, caracterizado por su alta virulencia y morbimortalidad. Es un bacilo Gram negativo ligeramente curvado que crece mejor en aerobiosis, es muy versátil nutritivamente y no fermenta hidratos de carbono. Este microorganismo es común en el. NT. medio ambiente, tradicionalmente considerado como un patógeno oportunista asociado a. -U. múltiples infecciones adquiridas tanto en la comunidad como en ámbitos nosocomiales. 1, 2,3. A. Según la Red Nacional de Seguridad Sanitaria, por sus siglas en inglés NHSN, realizó. IN. un estudio en 4515 hospitales de los Estados Unidos obteniendo que Pseudomonas. IC. aeruginosa ocupa el sexto lugar en los índices de resistencia a antibióticos. 4 El Perú no. ED. es ajeno a esta realidad como lo mencionan Labarca et al, que en nuestro país se cuenta. M. con la más alta resistencia a antibióticos de toda América Latina, contando Pseudomonas. DE. aeruginosa con resistencia a Imipenem y Meropenem del 66% y 57% respectivamente. 5 Según el Consorcio Internacional de Control de Infecciones Nosocomiales reportó que en. AD. el Perú entre los años 2003 y 2007 Pseudomonas aeruginosa tuvo una resistencia del. LT. 36.1% a Imipenem en cuatro centros de UCI de cuatro hospitales del Perú. 6Esta. CU. resistencia se debe a la presencia de metalo-β-lactamasas (MBLs), que son un conjunto diverso de enzimas que catalizan la hidrólisis de una amplia gama de fármacos β-. FA. lactámicos incluyendo los carbapenems. La difusión de los genes que codifican estas enzimas entre las bacterias Gram-negativas los ha hecho una causa importante de la resistencia.7, 8 La resistencia a carbapenems, particularmente imipenem, puede surgir por mutación sencilla que resulta en la pérdida de un porin-carbapenem específico, llamado OprD.9, 10 En el ámbito internacional, con menos frecuencia, se ha reportado resistencia debido a la presencia de las VIMβ-lactamasas e IMP β-lactamasas, mientras que en Brasil se ha reportado que el mecanismo de resistencia es debido a la presencia de clones SPM3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 1β-lactamasas. Algunos han causado brotes importantes, con docenas a cientos de pacientes afectados durante periodos prolongados.11 Imipenem, a semejanza de otros antibióticos β-lactámicos, se une a las proteínas de unión a la penicilina, interrumpe la síntesis de la pared bacteriana y causa la muerte de microorganismos susceptibles. Ante el mayor peligro de infección con bacterias. NT. resistentes a cefalosporinas, penicilina o a ambos fármacos el Imipenem es utilizado como. -U. tratamiento empírico de infecciones graves en sujetos hospitalizados que en fecha reciente recibieron otros antibióticos β-lactámicos. El imipenem no debe usarse como. IN. A. fármaco único en infecciones causadas por P. aeruginosa por el peligro de que surja. IC. resistencia durante la terapia. 12. ED. Estudios demuestran que la resistencia a múltiples fármacos en P. aeruginosa puede ser secundaria a la presencia de bombas de eflujo en la superficie bacteriana. La detección. M. temprana de diferentes bombas de eflujo en P. aeruginosa podría permitir el uso de otros. DE. antibióticos y el uso de inhibidores de la bomba de eflujo en combinación con terapia antibiótica. 13. AD. La OMS apoyó el uso de hierbas medicinales como terapia segura para el tratamiento. LT. de diferentes enfermedades. A partir de ello se acuña que las plantas medicinales serían. CU. la base primordial para obtener una nueva gama de fármacos con propiedades antimicrobianas. 14. FA. El orégano incluye un grupo de plantas que derivan taxonómicamente de cuatro. familias: Asteraceae, Fabaceae, Lamiaceae y Verbenaceae. El género Origanum está representado por hierbas perennes nativas de suelos calcáreos, secos, rocosos del sur de Europa, el suroeste de Asia y los países del Mediterráneo. Normalmente tienen una altura de 0,8 a 1 m, y presentan tallos pubescentes, hojas ovaladas, verde oscura, y flores blancas. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. o moradas asimismo son reconocidas aproximadamente un total de 38 especies de orégano en todo el mundo. 15 Los aceites esenciales (AE) son líquidos aromáticos aceitosos extraídos de vegetales mediante: fermentación, maceración, extracción o destilación, de estos métodos el más utilizado es la destilación. Existen más de 3000 AE conocidos, de estos aproximadamente. NT. 300 están en uso, principalmente en fragancias de cosmética y perfumes. Su función del. -U. aceite esencial obtenido de las plantas es probablemente antibacteriana, antifúngica, insecticida y defensa antiviral. 16. IN. A. Origanum vulgare es una fuente de aceites esenciales y metabolitos fenólicos, sus. Estos aceites han mostrado que poseen propiedades antioxidantes, antibacterianas,. ED. 17. IC. hojas y flores son tradicionalmente usados para el alivio de desórdenes gastrointestinales.. antifúngicas, antiespasmódico y actividad analgésica.18 Coccimiglio et al demostraron. M. que el extracto etanólico de Origanum vulgare posee actividad antioxidante, citotóxico y. DE. gran poder antibacteriano que son atribuidos a la presencia de constituyentes fenoles isoméricos como: carvacrol y thymol.19. AD. Da Costa et al realizaron un trabajo donde se evaluó la actividad antibacteriana in. LT. vitro del aceite esencial de Origanum vulgare (AEOV) en 24 cepas de bacterias. CU. multidrogo resistentes (MDR) obteniendo que el O. vulgare en baja concentración era capaz de prevenir el crecimiento de las cepas: Acinetobacter baumannii, Escherichia coli,. FA. Klebsiella pneumoniae, P. aureginosa, Eenterococcus faecalis y Staphylococcus aureus meticilino resistente (SARM). 20 Han y Parker proporcionaron la primera evidencia de la actividad biológica del AEOV en fibroblastos dermales humanos. Asimismo ellos sugieren que los aceites esenciales de Origanum vulgare, con su constituyente carvacrol, es una opción para el uso en productos de cuidado de piel con sus propiedades anti inflamatorias y anticancerígenas. 21, 22. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. En la actualidad, el carvacrol se usa en bajas concentraciones como ingrediente nutritivo y conservante, así como un ingrediente de fragancia en formulaciones cosméticas. En los últimos años se han llevado a cabo considerables investigaciones en las propiedades para su uso potencial en aplicaciones clínicas, los resultados en estudios in vitro e in vivo muestran que carvacrol posee una variedad de propiedades biológicas y. NT. farmacológicas, incluyendo antioxidante, antibacteriano, antifúngico, anticancerígeno,. -U. antiinflamatorio, hepatoprotectora, espasmolítico y vasorelaxante. 21. Se realizó un estudio mediante el método de doble dilución, haciendo uso de la. IN. A. concentración inhibitoria fraccionada (CIF) para ello realizaron el primer reporte de. IC. sinergia entre el AEOV sólo y en combinación con trece antibióticos contra E. coli,. ED. concluyendo que las fluoroquinolonas, doxiciclina y lincomicina tienen un efecto sinérgico con Origanum vulgare contra dicho microorganismo con un CIF entre 0.375 y. M. 0.5. 23. DE. Se realizó un estudio donde se consolidó y describió el efecto sinérgico entre los aceites esenciales y los antibióticos, destacando las posibilidades de los aceites esenciales. AD. como un potencial agente modificador de la resistencia.24. LT. Es por ello que este trabajo de investigación, enmarcado dentro de las estrategias. CU. planteadas por la OMS para el periodo 2014 – 2023, el cual es fomentar la cobertura sanitaria universal a través de la integración de la Medicina no tradicional en la prestación. FA. de servicios de la salud, busca evaluar el efecto sinérgico in vitro del AEOV con Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa.. 1.1. Problema. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. ¿Tiene efecto sinérgico el aceite esencial de Origanum vulgare con Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa? 1.2. Hipótesis Si tiene efecto sinérgico el aceite esencial de Origanum vulgare con Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa.. NT. 1.3. Objetivo general.. -U. Evaluar el efecto sinérgico in vitro de Origanum vulgare con Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa.. IN. A. 1.3.1. Objetivos específicos: ›. IC. Determinar la susceptibilidad de Pseudomonas aeruginosa frente. ED. las distintas concentraciones del aceite esencial de Origanum vulgare mediante la técnica de Kirby - Bauer. ›. M. Determinar la susceptibilidad de Pseudomonas aeruginosa frente. DE. Imipenem mediante la técnica de Kirby Bauer. ›. Determinar la concentración inhibitoria mínima del aceite esencial. AD. de Origanum vulgare sobre Pseudomonas aeruginosa mediante la. LT. técnica de macrodilución.. FA. CU. ›. ›. Determinar la concentración inhibitoria mínima de Imipenem sobre. Pseudomonas. aeruginosa. mediante. la. técnica. de. macrodilución. Determinar la concentración inhibitoria mínima del aceite esencial de Origanum vulgare e Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa mediante la técnica del “tablero de damas”.. II. MATERIAL Y MÉTODOS. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2.1.. Objeto de Estudio:. El número de colonias de Pseudomonas aeruginosa cultivadas en Placas Petri con agar Mueller Hinton. La medida del diámetro del halo de inhibición sometidas a tratamiento con. Materiales:. -U. 2.2.. NT. Origanum vulgare en combinación con antibióticos.. A.  Material Biológico:. IN. La cepa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 fue adquirida del. IC. cepario de la Sección de Microbiología de la Facultad de Medicina. M.  Material Botánico:. ED. de la Universidad Nacional de Trujillo.. DE. El Origanum vulgare fresco fue adquirido de la Provincia de OtuzcoLa Libertad.. AD.  Material Farmacéutico:. FA. CU. LT. El Imipenem fue adquirido de una farmacia de la ciudad de Trujillo.. 2.2.1. Criterios de inclusión:. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT.  Placas Petri con la macrodilución de Pseudomonas aeruginosa y la concentración de Origanum vulgare correspondiente. 2.2.2. Criterios de exclusión:  Placas Petri con la macrodilución que presente algún tipo de deterioro o daño en su estructura durante el proceso de incubación.. NT.  Placa Petri cuyo resultado en el proceso de incubación este. -U. contaminado por hongos u otras bacterias. 2.2.3. Unidad de análisis:. IN. A.  Estará constituida por cada una de las repeticiones para cada. IC. concentración del aceite esencial realizada en las placas Petri. 2.2.4. Unidad de muestreo:. ED.  Colonias formadas en cada una de las repeticiones para cada. M. concentración del aceite esencial realizada en las placas Petri.. DE. 2.2.5. Tamaño muestral: Por tratarse de un trabajo experimental, se empleó la siguiente formula estadística para el cálculo del número de. LT. AD. repeticiones necesarias que validen el diseño experimental: (𝑍𝛼⁄2 + 𝑍𝛽 )2 2𝑆 2 𝑛= ̅̅̅1 − 𝑋̅2 ) (𝑋. FA. CU. Siendo “n” el número de repeticiones a efectuar en cada investigación 𝑍 𝛼/2 = 1.96 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝛼 = 0.05 𝑍 𝛽 = 0.84 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝛽 = 0.20 ̅̅̅1 − 𝑋̅2 ) valor asumido por no haber estudios previos S = 0.8 (𝑋. Reemplazando: 𝑛 = 10 2.3. Método:. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2.3.1. Diseño: El diseño experimental del presente trabajo se desarrolló en dos fases: Fase 1: Se evaluó el efecto del AEOV y de Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 -. Método de disco de difusión: Se utilizaron discos embebidos. NT. con cada concentración de AEOV (25%, 50%, 75% y 100%). -U. y discos de Imipenem de 10 ug: hallándose la medida de los halos de inhibición. Se realizaron 10 repeticiones por cada. IN. Método de macrodilución en caldo: De los tubos que. IC. -. A. tratamiento.. ED. contienen las respectivas concentraciones del AEOV se tomaron 0.5 ml y se colocaron en otros cinco tubos estériles,. M. además a este nuevo grupo de tubos se agregaron dos tubos de. DE. control (uno con 0.5ml de Caldo de Müller-Hinton y 0.5ml de Tween 80). Luego con un asa bacteriológica se tomaron del. AD. tubo, que contiene la cepa joven de Pseudomonas aeruginosa. LT. activa, entre 3 a 5 colonias morfológicamente idénticas y. FA. CU. fueron depositadas en un tubo con 5 ml de caldo de MuellerHinton (CMH) y fue comparado con el estándar 0,5 de McFarland a 1,5𝑥108 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙 (UFC: Unidad Formadora de. colonia), luego se dejó reposar por un periodo de 15 minutos. Pasado este tiempo se tomaron 0.5ml de esta suspensión y fue puesto en los nuevos 7 tubos estériles preparados. Se mezclaron suavemente y uniformizaron el contenido de los tubos, se sellaron con algodón e incubó a 37º durante 18 horas.. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Después de este periodo de incubación, se tomaron 0.1ml de cada tubo y se lo puso en la placa Petri con Agar MüllerHinton (AMH) para luego ser estriado con el asa de Drigalsky. Estas placas estriadas fueron incubadas a temperatura de 37º durante 18 horas. Luego de este periodo de incubación se. NT. examinaron las placas y se registró el número de colonias.. -U. Además la CIM del AEOV quedó definida como la concentración donde se registre el menor número de colonias. IN. A. observables y fue registrado en nuestra hoja de cálculo.. IC. Fase 2: Se obtuvo el CIM para el AEOV y se tomó éste y los valores. ED. superiores hasta llegar a la concentración de 100%, de esta selección de tubos de ensayo se tomó 50ug y fue embebida sobre su respectivo disco. M. estéril (papel de filtro de 6mm de diámetro) durante 1 hora. Con un asa. DE. bacteriológica se tomó del tubo, que contiene la cepa joven de Pseudomonas aeruginosa activa, entre 3 a 5 colonias morfológicamente. AD. idénticas y fueron depositadas en un tubo con 5 ml de caldo de Mueller-. LT. Hinton (CMH) y fue comparado con el estándar 0,5 de McFarland a. CU. 1,5𝑥108 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙 (UFC: Unidad Formadora de colonia), luego se dejó. FA. reposar por un periodo de 15 minutos. Pasada la hora que los discos estuvieron embebidos en las distintas concentraciones de Origanum vulgare, se tomó cada disco y se emparejó con un disco de sensibilidad a Imipenem. Estos dos discos fueron puestos en la placa Petri y fueron incubados durante 18 h a 37ºC. La distancia que los discos estuvieron separados debió corresponder con la distancia de los radios de los halos. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. de inhibición que fueron evaluados por separado. Para ello se tuvo las siguientes consideraciones: o Sinergismo: Cuando el aumento de la zona de inhibición “puente” cerca de la unión de ambas zonas o. NT. inhibición del crecimiento debido a los efectos combinados. sinergismo:. Cuando. existan. dos. -U. o No. círculos. A. independientes o el truncamiento de las zonas de. IN. inhibición cerca de la unión de ambas zonas.. IC. 2.3.2. Tipo de estudio. Finalidad del estudio: explicativo. ›. Secuencia temporal: transversal. ›. Control de la asignación de los factores de estudio:. M. ED. ›. Inicio del estudio en relación a la cronología de los hechos:. AD. ›. DE. experimental puro. prospectivo.. LT. 2.3.3. Procedimientos. FA. CU. . Recolección y reconocimiento de la planta: La planta completa de Origanum vulgare se recolectó, del anexo Maymall (3399 m.s.n.m.), latitud 7° 50' 17.75'' S, longitud: 78° 42' 40.06'' O, distrito San Ignacio, provincia de Otuzco, región La Libertad, en el mes de Junio del año 2017. Un ejemplar completo de la planta se llevó al Herbarium Truxillense (HUT) de la Universidad Nacional de Trujillo para su identificación y. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. posterior verificación taxonómica (Anexo N° 1). El espécimen está registrado bajo el código N° 59173 (Anexos N° 2 y 3). . Obtención de aceite esencial de Origanum vulgare: El material recolectado fue transportado al laboratorio de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la. NT. Universidad Nacional de Trujillo, en donde se separó de las. -U. sustancias extrañas presentes en la muestra y luego se secó a temperatura ambiente.. IN. A. La obtención del aceite esencial de Origanum vulgare (AEOV). IC. se realizó por el método de destilación por arrastre de vapor de. ED. agua (convencional), el cual permitió un buen rendimiento. El AEOV fue extraído a partir de las hojas, previo tamizaje y. M. pulverización, luego se colocaron en un balón de fondo plano y. DE. se sometieron a una corriente de vapor de agua sobrecalentada; de esta manera se arrastró la esencia que posteriormente por. AD. acción del refrigerante, fue condensada. El destilado se separó. LT. tomando en cuenta sus propiedades de inmiscibilidad y. FA. CU. diferencia de densidades entre el agua y AEOV, utilizando una pera de separación de vidrio, se deshidrató las impurezas de agua con N2SO4 anhidro, se filtró y se guardó en un frasco de vidrio color ámbar (para evitar la descomposición por la luz) bajo refrigeración a una temperatura de 4 °C 25 (Anexo N° 4).. . Obtención de concentraciones del aceite esencial de Origanum vulgare:. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Una vez obtenido el AEOV puro se depositaron en 4 probetas de 10ml, volúmenes de 1.5, 3, 4.5 y 6 ml y se completó hasta un volumen de 6 ml con Tween 80, obteniéndose concentraciones de 25%, 50%, 75% y 100% respectivamente. Cada concentración se colocó en frascos de color ámbar, para. NT. protegerlos de la luz y se guardaron a 4ºC para el estudio. . -U. microbiológico25 (Anexo N° 5). Reactivación de la cepa:. IN. A. La cepa de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 se cultivó. Determinación de la susceptibilidad de halos de inhibición. ED. . IC. en medio TSA a fin de obtener colonias jóvenes.. del aceite esencial de Origanum vulgare a distintas. M. concentraciones e Imipenem:. DE. Para este procedimiento se hizo uso de la técnica de Kirby Bauer para la cual con un asa bacteriológica se tomaron del tubo que. AD. contiene la cepa joven de Pseudomonas aeruginosa ATCC. LT. 27853, entre 3 a 5 colonias morfológicamente idénticas y fueron. FA. CU. depositadas en un tubo con 5 ml de caldo de Mueller-Hinton (CMH) se agitó hasta obtener una solución homogénea. Posteriormente dicha suspensión fue comparada con el estándar 0,5 de McFarland que equivale a 1,5𝑥108 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙 (UFC: Unidad Formadora de colonia). Luego con un hisopo estéril se untaron en la suspensión recientemente preparada y estrió en una placa Petri con Agar de Mueller-Hinton.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Con una micropipeta se tomó 50ug de cada concentración de AEOV (25%, 50%, 75% y 100%) sobre su respectivo disco estéril (papel de filtro de 6mm de diámetro) los cuales fueron embebidos durante 1 hora. Además se utilizaron los discos de sensibilidad con Imipenem de 10 ug para el control positivo y. NT. discos estériles embebidos en el Tween 80 como control. -U. negativo.. Pasada la hora que los discos estuvieron embebidos en las. IN. A. distintas concentraciones de Origanum vulgare fueron tomados. anteriormente.. Es. decir. se. colocaron. ED. mencionado. IC. con una aguja estéril y puestos en la placa Petri que se había. aproximadamente 5 discos embebidos sobre cada placa Petri. Se. M. dejaron reposar alrededor de 15 minutos y fueron puestas en. DE. incubación por un periodo de 18 horas a temperatura de 37ºC. Pasado este tiempo con una regla milimetrada se midieron los. AD. diámetros de inhibición de cada disco y fueron anotados en la 26. (Anexo N° 6, 7 y 13). Se realizaron 10. LT. hoja de cálculo. FA. CU. repeticiones por concentración.. . Obtención de la concentración inhibitoria mínima del aceite esencial de Origanum vulgare: Se hizo uso del método de macrodilución en caldo, método cuantitativo. para. determinar. la. CIM. de. un. agente. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. antimicrobiano. que. inhibe. el. crecimiento. de. los. microorganismos in vitro. Todos los pasos de este método se realizaron de acuerdo con las directrices publicadas por el Clinical and Laboratory Standards Institute27 De los tubos que contienen las respectivas concentraciones del. NT. AEOV se tomó 0.5 ml y se puso en otros cinco tubos estériles,. -U. además a este nuevo grupo de tubos se agregaron tres tubos de control (uno con 0.5ml de CMH, 0.5ml de Tween 80 y un. IN. A. control sin tratamiento).. IC. Con un asa bacteriológica se tomaron del tubo, que contiene la. ED. cepa joven de Pseudomonas aeruginosa activa, entre 3 a 5 colonias morfológicamente idénticas y fueron depositadas en un. M. tubo con 5 ml de caldo de Mueller-Hinton (CMH) y también. DE. fueron comparados con el estándar 0,5 de McFarland a 1,5𝑥108 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙 (UFC: Unidad Formadora de colonia), luego. AD. se dejó reposar por un periodo de 15 minutos. Pasado este. LT. tiempo se tomó 0.5ml de esta suspensión y fue puesto en los. FA. CU. nuevos 8 tubos estériles preparados. Se mezclaron suavemente y uniformizó el contenido de los tubos, se incubaron a 37ºC durante 18 horas. Después de este periodo de incubación se observó presencia de turbidez, el tubo que no tuvo turbidez se consideró como la CIM, sin embargo para determinar las cuentas viables se tomó 0.1ml de cada tubo y se lo colocó en la placa Petri con AMH para luego ser estriado con el asa de Drigalsky. Estas. placas. estriadas. fueron. incubadas. a. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. temperatura de 37ºC durante 18 horas. Luego de este periodo de incubación se examinaron las placas y se registraron el número de colonias. Además la CIM del AEOV quedará definida como la concentración donde se registre el menor número de colonias observables y fueron registrado en nuestra hoja de cálculo 26. Obtención de la concentración inhibitoria mínima de. -U. . NT. (Anexo N° 8).. Imipenem:. IN. A. Se tuvieron alrededor de 25 tubos debidamente rotulados del 1. IC. al 25 y se agregaron 0.5ml de CMH a partir del tubo número 2. ED. hasta el 25. Luego se agregaron 0.5 ml de Imipenem al primer y segundo tubo, para luego tomar 0.5 ml del segundo tubo y. M. pasarlo al tercero, cambiar de pipeta, se volvió a tomar de este. DE. tercer tubo 0.5 ml y se pasó al cuarto tubo, así sucesivamente hasta llegar al tubo número 23, donde se desechó 0.5 ml de la. AD. combinación. El tubo número 24 fue nuestro control el cual no. LT. recibió antibiótico.. FA. CU. Con un asa bacteriológica se tomó del tubo, que contiene la. cepa joven de Pseudomonas aeruginosa activa, entre 2 y 3 colonias morfológicamente idénticas y fueron depositadas en un tubo con 5 ml de caldo de Mueller-Hinton (CMH) y fue comparado con el estándar 0,5 de McFarland a 1,5𝑥108 𝑈𝐹𝐶/ 𝑚𝑙 (UFC: Unidad Formadora de colonia), luego se dejó reposar por un periodo de 15 minutos. Después de este tiempo se tomaron 0.5 ml y serán puestos a cada tubo, excepto en el tubo. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. número 23 (el cual fue el control de caldo). Se mezcló suavemente con el fin de uniformizar el contenido de los tubos y fueron sellados con algodón y se incubaron durante 18 horas. Finalmente se tomaron 0.1 ml de cada tubo de ensayo y fue estriado en su respectiva placa Petri con AMH para luego fue. NT. incubado a 37ºC durante 18 horas. Después de este periodo de. -U. incubación se observó presencia de turbidez, el tubo que no tuvo turbidez se consideró como la CIM y fue registrado en nuestra. IN. Evaluación de la interacción del aceite esencial Origanum. IC. . A. hoja de cálculo 26 (Anexo N° 8).. disco:. ED. vulgare con Imipenem mediante el método de difusión en. M.  Preparación de los discos:. DE. Para la preparación de los discos se tomaron con una micropipeta 50ug de cada concentración de AEOV (50%,. AD. 75% y 100%) y se embebieron sobre cada uno de los discos. FA. CU. LT. estériles (papel filtro de 6 mm de diámetro), los cuales después de ser embebidos fueron dejados en reposo durante 1 hora. Por otro lado se tuvieron los discos de sensibilidad de Imipenem 10ug listos para su uso. Todos los discos se mantuvieron a la misma temperatura y condiciones ideales..  Preparación del inóculo: Se tomaron entre 2 a 3 colonias de P. aeruginosa ATCC 27853 en 5 ml de CMH estéril se agitó hasta obtener una. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. solución homogénea luego se incubó a 35 ºC hasta lograr una turbidez equivalente al estándar 0.5 de McFarland (1.5 x 108 UFC/Ml).  Inoculación en las placas con agar: Transcurridos 15 minutos después de ajustar la turbidez de la. Se introdujo un hisopo estéril en el inóculo y se giró. -U. -. NT. suspensión del inóculo:. varias veces.. A. Se eliminó el exceso del inóculo presionando el. IN. -. -. ED. líquido.. IC. hisopo contra la pared del tubo por encima del. Se frotó sobre toda la superficie del agar por tres. M. veces, girando la placa aproximadamente 60º para. DE. asegurar una distribución uniforme del inóculo.. AD. -. Se dejó la placa inoculada en reposo durante 15 minutos, antes de la aplicación de los discos.. FA. CU. LT.  Aplicación de los discos en las placas de agar inoculadas: Con una pinza estéril se colocaron los discos separados por una distancia mayor o igual a la suma de los radios de los halos de inhibición obtenidos con Imipenem y AEOV (50%, 75% y 100%) ensayados por separado. Se presionó cada disco para asegurar el contacto completo con la superficie del agar. No se movió un disco una vez que se ha puesto en contacto con la superficie del agar.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT.  Incubación: Se colocaron las placas con tapas hacia abajo y se incubaron a 37 ºC durante 18h.  Lectura de placas: Se examinaron y se procedió con la lectura de las placas con. NT. crecimiento uniforme. Se observó la interfaz de las zonas de.  Interpretación de resultados:. -U. inhibición (Anexo N° 9 y 15).. A. A los resultados que se encontraron dentro de los límites. IC. IN. o Sinergismo: Aumento o zona de inhibición “puente”. ED. cerca de la unión de ambas zonas o inhibición del crecimiento debido a los efectos combinados de ambos.. M. o No sinergismo: Se considerará cuando los dos círculos. DE. independientes o truncamiento de las zonas de. LT. AD. inhibición cerca de la unión de ambas zonas.. FA. CU. . Evaluación de la interacción del aceite esencial Origanum vulgare con Imipenem mediante el modelo de “tablero de damas”: El AEOV al 100% fue llevado al 75%, 37.5% y 18.75%, para ello:  Preparación del AEOV al 75%: Se tomó 5.25mL de la muestra madre (100%) y se mezcló con 1.75mL de Tween80. 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT.  Preparación del AEOV al 37.5%: Se tomó 2.625mL de la muestra madre (100%) y se mezcló con 4.375 mL de Tween80.  Preparación del AEOV al 18.75%: Se tomó 1.3125mL de la muestra madre (100%) y se mezcló. NT. con 5.6875mL de Tween80.. -U. La ampolla de Imipenem se combinó en 100mL de solución salina obteniéndose una concentración de 5000ug/mL esta. IN. A. concentración fue llevada a 16ug/mL, 8ug/mL y 4ug/mL. IC. (Anexo N° 10).. ED.  Concentración a 16ug/mL:. De los 100mL se tomaron 320uL y se mezclaron. M. nuevamente con 100mL de solución salina de este volumen. DE. total se tomaron 0.75mL y se mezclaron con 0.75mL de. LT. AD. AEOV al 75%, 37.5% y 18.75%.. FA. CU.  Concentración a 8ug/mL: De los 100mL se tomaron 160uL y se mezclaron nuevamente con 100mL de solución salina de este volumen total se tomaron 0.75mL y se mezcló con 0.75mL de AEOV al 75%, 37.5% y 18.75%.  Concentración a 4ug/mL: De los 100mL se tomaron 80uL y se mezclaron nuevamente con 100mL de solución salina de este volumen total se. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. tomaron 0.75mL y se mezcló con 0.75mL de AEOV al 75%, 37.5% y 18.75%. Completándose así el tablero de damas 3x3. Donde en cada casilla se encontraron 0.5mL de la mezcla establecida (Anexo N° 11 y 12).. NT. Del tubo con la cepa joven de Pseudomonas aeruginosa se tomó. -U. con un asa bacteriológica entre 3-5 colonias en 4 tubos estériles conteniendo 5 mL de CMH. Luego, se incubó a 37 °C hasta que. IN IC. 1,5𝑥108 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙 ). A. la turbidez sea equivalente al estándar 0,5 de McFarland (. ED. Con una pipeta estéril, se añadió 0.5 mL de suspensión de P. aeruginosa a cada uno de los tubos previamente preparados con. M. las diferentes concentraciones de Imipenem y AEOV,. DE. obteniéndose un total de 1mL en cada tubo, luego se incubó por 18 horas. Pasado este tiempo se examinó el tubo control de. AD. crecimiento para la viabilidad de P. aeruginosa y se procedió a. LT. tomar 0.1mL de cada de los nueve tubos y posteriormente. FA. CU. distribuirlo uniformemente con el asa de Drigalsky en su respectiva placa Petri, estas placas se incubaron a 37 °C durante 18 h. Se hizo el cálculo de UFC en las placas de verificación y se registró el crecimiento o no crecimiento de todas las placas en una hoja de trabajo. Finalmente se registró los resultados de la CIM para el aceite esencial e Imipenem (Anexo N° 14).. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) AD. DE. M. ED. IC. IN. A. -U. NT. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Tipo de variable. Catego ría. Independiente Cuantitativa. -------. CU. Variable. LT. 2.3.4. Operacionalización de variables. FA. Aceite esencial de Origanum vulgare e Imipenem. Efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial de Origanum vulgare e Imipenem. - Concentraciones del 25%, 50%, 75% y 100%.. Dependiente Cuantitativa. -------. Escala de Medición. Indicador. -. -. Diámetro del halo de inhibición. Unidades Formadoras de Colonias. Aumento del inhibición. 27. halo. Razón. Razón. de. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. -. Formación de un puente de inhibición entre las dos zonas de inhibición. 27 - Concentración Inhibitoria Efecto sinérgico de Dependiente Fraccionada CIF ≤ 0.5. 27 Origanum vulgare Cualitativa e Imipinem sobre - Halo de inhibición Nominal Dicotómica Pseudomonas formados aeruginosa ATCC independientemente. 27 No 27853 - Halo de inhibición truncado junto de las dos zonas. 27 - Concentración Inhibitoria Fraccionada > 0.5. 27 27 Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for antimicrobial susceptibility Testing; Seventeenth Informational Supplement. 2007; 27(1): 38-9. FA. CU. LT. AD. DE. M. ED. IC. IN. A. -U. NT. Sí. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2.3.5. Definiciones operacionales:  Susceptibilidad: Determina la cantidad de droga que se requiere para matar o inhibir el crecimiento de un microorganismo patógeno. Se considera sinónimo de sensibilidad. 28. NT.  Efecto antibacteriano in vitro: Capacidad para evitar la. -U. reproducción o producir la muerte de la bacteria en. A. condiciones experimentales.. IN.  Halo de Inhibición: Zona alrededor del disco donde una. IC. sustancia antibacteriana es capaz de impedir el crecimiento de. ED. la bacteria al cabo de 18 a 24 horas de incubación. Se utilizará como medida los diámetros de estas zonas en mm, según la. M. escala de Duraffourd. 29. DE.  Escala de Duraffourd: Escala cualitativa que determina el. AD. efecto inhibitorio in vitro, según diámetro del halo de. FA. CU. LT. inhibición. 29 o Nula (-) para un diámetro inferior a 8mm. o Sensibilidad límite (+) para un diámetro comprendido entre 8 a 14 mm. o Muy sensible (++) para un diámetro entre 14 y 20 mm. o Sumamente sensible (+++) para un diámetro superior a 20 mm..  Concentración inhibitoria mínima (CIM): concentración más baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento de un microorganismo después de su incubación.30 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT.  Efecto sinérgico: Cuando el efecto combinado es mayor que la suma de los efectos individuales. 24  Método de “Tablero de damas”: Técnica más utilizada para evaluar las interacciones de fármacos. Consiste en la utilización. de. múltiples. diluciones. de. dos. agentes. NT. antimicrobianos que se estén probando, para esto se hace uso. -U. de la Concentración inhibitoria fraccionada (CIF)26: o Sinergismo: Si se tiene una CIF ≤ 0.5. IC. IN. A. o No sinergismo: Si se tiene una CIF > 0.5. ED. 2.4. Aspectos éticos. El proyecto de investigación se presentó para consideración, comentario,. M. consejo y aprobación a los comités designados por la Facultad de Medicina de. DE. la Universidad Nacional de Trujillo. Se tuvo en cuenta los principios de bioseguridad, prestando atención adecuada. AD. a factores que puedan dañar el medio ambiente. 31. LT. 2.5. Análisis e interpretación de la información. CU. Se utilizó el método estadístico ANOVA para analizar el efecto de las. FA. diferentes concentraciones del AEOV sobre Pseudomonas aeruginosa, luego se usará pruebas de comparaciones múltiples para determinar si el efecto sinérgico del AEOV con Imipenem tiene mayor eficacia que el tratamiento con dicho antibiótico. Se utilizó el paquete Estadístico SPSS 22. El nivel de significación (p ≤ 0,05) fue considerado estadísticamente significativo. Todos los datos se presentaron como valores medios ± desviación estándar.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) FA. CU. LT. AD. DE. M. ED. IC. IN. A. -U. NT. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. III. RESULTADOS. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Gráfico N° 01:. Medias de la medida de los halos del aceite esencial de. Origanum vulgare al 25%, 50%, 75% y 100% e Imipenem sobre. AD. DE. M. ED. IC. IN. A. -U. NT. Pseudomonas aeruginosa.. LT. Fuente: Datos recolectados por el autor - IBM SPSS Stastistics 22 - Facultad de. FA. CU. Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo.. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Gráfico N° 02: Medias de la UFC/ml del aceite esencial de Origanum vulgare al. AD. DE. M. ED. IC. IN. A. -U. NT. 25%, 50%, 75% y 100% sobre Pseudomonas aeruginosa.. Fuente: Datos recolectados por el autor - IBM SPSS Stastistics 22 - Facultad de. FA. CU. LT. Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo.. Gráfico N° 03. Medias de la medida de los halos entre la interacción del aceite esencial de Origanum vulgare al 25%, 50%, 75% y 100% con Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) DE. M. ED. IC. IN. A. -U. NT. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Fuente: Datos recolectados por el autor - IBM SPSS Stastistics 22 - Facultad de. FA. CU. LT. AD. Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo.. Tabla N° 01. Test de Tukey entre los grupos a diferentes concentraciones de aceite esencial de Origanum vulgare sobre Pseudomonas aeruginosa. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 0.000. 8543.41. 10092.59. Orégano 100%. 0.000. 9307.41. 10856.59. Orégano 25%. 0.000. -4420.59. -2871.41. Orégano 75%. 0.000. 4897.41. 6446.59. Orégano 100%. 0.000. 5661.41. Orégano 25%. 0.000. -10092.59. -8543.41. Orégano 50%. 0.000. -6446.59. -4897.41. Orégano 100%. 0.054. Orégano 25%. 0.000. Orégano 50% Orégano 75%. NT. Límite superior 4420.59. -U. 7210.59. -10.59. 1538.59. -10856.59. -9307.41. 0.000. -7210.59. -5661.41. 0.054. -1538.59. 10.59. M. Orégano 100%. Orégano 75%. IN. Orégano 75%. 0.000. IC. Orégano 50%. Orégano 50%. Límite inferior 2871.41. ED. Orégano 25%. Sig.. A. (I) Orégano. DE. Fuente: Datos recolectados por el autor - IBM SPSS Stastistics 22 - Facultad de. FA. CU. LT. AD. Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Tabla N° 02. Concentración inhibitoria fraccionada (CIF) del aceite esencial de Origanum vulgare e Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa obtenidos mediante la técnica del “Tablero de damas” CIF Imipenem. Σ CIF. 0.04375. 0.25. 0.29375. 0.04375. 0.5. 0.54375. 0.04375. 1. 0.0875. 0.25. 0.0875. 0.5. 0.0875. 1. 0.175. 0.25. 0.175. 0.5. NT. CIF Orégano. 1.04375. IN. A. -U. 0.3375 0.5875 1.0875 0.425 0.675. ED. IC. 1 1.175 0.175 ® Fuente: Datos procesados por el autor, Microsoft Office Excel 2013 - Facultad. FA. CU. LT. AD. DE. M. de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo.. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Tabla N° 03. Test de Tukey entre las interacciones de aceite esencial de Origanum vulgare al 25%, 50%, 75% y 100% con Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa.. +Oregano 75%. .000. -11.30. +Oregano 100%. .000. -13.80. +Oregano 25%. .031. +Oregano 75%. .000. +Oregano 100%. .000. +Oregano 25%. -8.40 5.60. -8.40. -3.00. -10.90. -5.50. .000. 5.90. 11.30. .000. 3.00. 8.40. A. .20. +Oregano 50%. .078. -5.20. .20. +Oregano 25%. .000. 8.40. 13.80. +Oregano 50%. .000. 5.50. 10.90. +Oregano 75%. .078. -.20. 5.20. M. +Oregano 100%. DE. +Oregano 100%. -5.90. NT. +Oregano 75%. Límite superior -.20. -U. .031. IN. +Oregano 50%. +Oregano 50%. Límite inferior -5.60. IC. +Oregano 25%. Sig.. ED. (I) Imipenem. AD. Fuente: Datos procesados por el autor, IBM SPSS Statistics 22 - Facultad de. FA. CU. LT. Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo.. IV DISCUSIÓN. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Es alarmante saber que en estos días es común encontrar aislamientos bacterianos, tanto en el entorno clínico como en el ambiente externo, con diferentes niveles de resistencia tales como: los multidrogorresistentes (MDR; resistente a 2 o más antibióticos), extremadamente resistentes (XDR; resistente a 3 o más antibióticos), y aún más perturbador, aislamientos panresistentes, los cuales son literalmente intratables con. NT. los regímenes farmacológicos actuales, incluyendo terapias combinadas, es por ello que. -U. la estrategia ha sido continuar la búsqueda de nuevos antibióticos naturales, así como desarrollar modificaciones sintéticas de antibióticos existentes para desarrollar eficacia.. IN. A. 32, 33. IC. Debido a esta problemática mundial en los últimos años se ha ido desarrollando. ED. un creciente interés en la búsqueda de plantas con principios activos antimicrobianos, con el fin de determinar su eficacia y evaluar su potencial como fuentes de nuevas drogas, ya. M. que es de suma importancia descubrir nuevos compuestos que sean más eficaces y de. DE. menor toxicidad para el ser humano y evitar así la resistencia a antibióticos. 34, 35 El presente estudio evaluó el efecto sinérgico in vitro del aceite esencial de. AD. Origanum vulgare (AEOV) con Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa. El estudio. LT. mostró que el AEOV al 100%, según la escala de Duraffourd tuvo una característica muy. CU. sensible (con un halo de inhibición de 16.5mm) mientras que para la concentración al 75% tuvo sensibilidad límite (con un halo de inhibición de 11.4mm) (Gráfica N° 01). Esta. FA. característica es la misma que encontraron Mehreen et al. 36. quienes obtuvieron en. promedio un halo de inhibición de 20 mm sobre cepa de Pseudomonas aeruginosa, en cambio Esen et al. 37. realizaron un análisis de los halos de inhibición en 22 especies de. Origanum vulgare de distintas partes de Turquía obteniendo como valor mínimo de 7mm y máximo de 11mm, cabe destacar que ambas muestras de Pseudomonas aeruginosa en los trabajos mencionados se trataron de cepas no estandarizadas. Por otro lado Busatta et. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. al38 no registró sensibilidad del AEOV sobre Pseudomonas aeruginosa en contraste con Mallet et al39 quienes trabajaron con una cepa de Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 y reportaron una gran zona de inhibición de 30-37mm. Con estos datos podemos observar que no existe un mismo comportamiento en la susceptibilidad del AEOV, ello se podría fundamentar al tipo de condiciones climáticas, localización geográfica del lugar de. NT. recolección del orégano, tipo de cepa microbiana utilizada o resistencia adquirida a los. -U. agentes antibióticos utilizados, esta resistencia puede ser explicada por distintas teorías: según Fah Mah et al8, a la presencia de la subclase AmpC-β-lactamasa, espectro. IN. A. extendido beta lactamasa y reducción a la baja de proteínas de membrana OprD, según. IC. Yokoyama et al9 mencionan que la resistencia se podría deber a la capacidad del. ED. microorganismo para formar un biofilm con la posible transferencia de un gen de metilasa 16S rRNA de actinomicetos o lo mencionado hace poco por Talebi et al13, a la presencia. M. de bombas de eflujo en la superficie bacteriana.. DE. Se obtuvo una concentración inhibitoria mínima (CIM) para el AEOV e Imipenem de 697.5ug/ml y 4ug/ml; por otro lado Sarikurkcu et al40 reportaron una CIM para el. AD. AEOV de 256ug/ml mientras que Becerril et al41 observaron una CIM de 800ug/mL esta. LT. disparidad de resultados pueden ser atribuidos a la variación de la composición química. CU. del aceite esencial obtenido de la misma parte de la planta, debido a que los aceites esenciales están constituidos por un gran número de constituyentes químicos y no es de. FA. sorprendernos que las diferentes combinaciones de estos puedan mostrar efectos sinérgicos o no sinérgicos, en particular el AEOV se encuentra constituido principalmente por carvacrol y thimol19. La actividad antibacteriana de los aceites esenciales se fundamenta en su compleja composición, debido a distintos mecanismos de acción que implica muchos sitios diana en la célula. Esta es la razón por la cual raramente se espera que las bacterias desarrollen un mecanismo de resistencia a los aceites esenciales. Becerril. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. et al41 no detectaron resistencia al aceite esencial de Origanum vulgare para Pseudomonas aeruginosa tras haber expuesto 50 veces a dicho aceite esencial. Con respecto al CIM del Imipenem en el presente estudio no hubo diferencias con la bibliografía citada. Moussaoui y Alaoui demostraron in vitro, mediante el método de disco difusión,. 42. este mismo efecto se observó en el presente. -U. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. NT. el efecto sinérgico entre el aceite esencial de Origanum majorana con Imipenem sobre. estudio mediante el método “Tablero de damas” donde se determinaron las. IN. A. concentraciones inhibitorias fraccionadas (CIF) del AEOV e Imipenem obteniéndose una. IC. sumatoria de CIF entre 0.29 y 0.42; con estos índices se confirmó que dichos tratamientos. ED. si presentan efecto sinérgico (Tabla N° 2). El mecanismo de acción de los aceites esenciales no es único debido a que aumenta la permeabilidad de la membrana celular y. M. altera la constitución de sus proteínas. Por otro lado promueve la alteración de la fuerza. DE. motriz del protón citoplasmático, disminuye la capacidad de formación de biofilm por parte de la célula y disminuye los niveles de factores de virulencia celular43.. AD. El presente estudio in vitro ha logrado demostrar una interacción farmacodinámica. LT. importante entre el AEOV e Imipenem (Gráfica N° 03), la sinergia, contribuyendo de este. CU. modo a proponer los posibles efectos que puedan existir al combinar los aceites esenciales y antibióticos, destacando las posibilidades de los aceites esenciales como un potencial. FA. agente modificador de la susceptibilidad bacteriana.. V. CONCLUSIONES. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 1. El aceite esencial de Origanum vulgare tiene efecto sinérgico in vitro con Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa. 2. La susceptibilidad de Pseudomonas aeruginosa frente al AEOV fue de 6.5mm, 8.2mm, 11.4mm y 16.5mm al 25%, 50%, 75% y 100% respectivamente, mediante la técnica de Kirby-Bauer.. NT. 3. La susceptibilidad de Pseudomonas aeruginosa frente a Imipenem fue de 37.3mm. -U. 4. La concentración inhibitoria mínima de aceite esencial de Origanum vulgare fue de 697.5ug/ml mediante el método de macrodilución en caldo.. IN. A. 5. La concentración inhibitoria mínima de Imipenem fue de 4ug/ml mediante el método. IC. de macrodilución en caldo.. 6. La concentración inhibitoria mínima del aceite esencial de Origanum vulgare con. ED. Imipenem sobre Pseudomonas aeruginosa mediante la técnica del “tablero de damas”. FA. CU. LT. AD. DE. M. fue de 30.52 ug/ml y 1ug/ml respectivamente.. VI. RECOMENDACIONES. 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. . Realizar estudios para evaluar el efecto antibacteriano del carvacrol, principal componente del aceite esencial de Origanum vulgare sobre Pseudomonas aeruginosa.. . Realizar estudios para comparar el efecto antibacteriano del aceite esencial de Origanum vulgare con otros antibióticos utilizados en el tratamiento de infecciones. Incrementar investigaciones experimentales para demostrar el efecto antibacteriano. -U. . NT. por Pseudomonas aeruginosa.. del aceite esencial de Origanum vulgare sobre otra bacterias.. A. Realizar estudios para evaluar el efecto antibacteriano de Origanum vulgare en. IN. . IC. modelos animales mediante diferentes vías de administración.. . ED. VII. LIMITACIONES. Carencia del Cromatógrafo de gases para un estudio detallado del porcentaje de cada. FA. CU. LT. AD. DE. M. componente del aceite esencial de Origanum vulgare.. VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 38 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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