Criptobiósis de plásmidos de Azotobacter Vinelandii

U N I V E R S I D A D A U T O N O M A D E N U E V O L E O N F A C U L T A D DE C I E N C I A S B I O L O G I C A S DIVISION DE E S T U D I O S DE P O S T O R A D O

C R I P T O B I Ü S I S D E P L A S M I D O S D E AZOTOBACTER VI NELAND11

T E S I S Q U E P A R A O B T E N E R EL G R A D O DE D O C T O R E N CIENCIAS E S P E C I A L I D A D E N MICROBIOLOGIA

P R E S E N T A

JUAN M A N U E L S A N C H E Z YAFEZ

4 ;

MONTERREY, N.L.

TD Z 5 3 ^ FCB

1 0 2 0 0 6 6 5 2 1

UNIVERSIDAD A U T O N O M A DE N U E V O L E O N F A C U L T A D DE CIENCIAS BIOLOGICAS DIVISION DE ESTUDIOS DE P O S T G R A D O

CRIPTOBIOSIS DE PLASMIDOS DE

AZOTOBACTER VI NELANDII

TESIS QUE P A R A OBTENER EL GRADO DE D O C T O R E N CIENCIAS ESPECIALIDAD E N MICROBIOLOGIA

P R E S E N T A

JUAN MANUEL SANCHEZ YAFEZ

T D

2532 O

T C ^ •

1992

£ 2

E Q N Q Q TESÍS

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

C R I P T O B I O S I S DE P L A S M I D O S D E Arotobacter

T E S I S QUE PARA O B T E N E R EL G R A D O DE DOCTOR EN C I E N C I A S E S P E C I A L I D A D EN M I C R O B I O L O G I A

P R E S E N T A

JUAN M A N U E L SANCHEZ YAflEZ

APROBADA

C O M I S I O N D E T E S I S

DIRECTOR EXTERNO

CODIRECTOR

ASE50R INTERNO

MitíMBRO DE LA C O M I S I O N

DR. ROLANDO G. VELA UITI.A M J 1 7 Q H T 1 7 V /

DR. JUAN JOSE PENA CA

O

. L A U R % / t R E ¿v" A V ^ A ( j DRA

ü U I i J j

C R I P T O B I O S I S D E P L A S M I D O S D E AZOTOBACTER VIHELANDI1

INDICE

P a g

RESUMEN 1

INTRODUCCION Y A N T E C E D E N T E S

a).— B r e v e resefía h i s t ó r i c a s o b r e A-zotobajz íer •uin.Gland.i i. .... 3

b).— Importancia b i o q u í m i c a y fisiológica d e A-zotóbcuc ter spp

y Asotobac£«r . . . 4

c ) . - C a r a c t e r í s t i c a s d e las espec i e s de Asotobac íer 5

d).— P l Á s m i d o s del g é n e r o Asotobcicíer, . . . 11

H I P O T E S I S 13

O B J E T I V O S 13

MATERIAL Y M E T O D O

a).— Origen y tipo d e s u e l o s u s a d o s . 14 b).— Cuantificación d e los m i c r o o r g a n i s m o s a e r o b i o s

s o b r e v i v i e n t e s d e los s u e l o s t e x a n o s a l m a c e n a d o s

p o r d i f e r e n t e s p e r i o d o s . 1 4

c).— Identificación b i o q u í m i c a d e b a c t e r i a s Gram n e g a t i v a s a i s l a d a s d e las m u e s t r a s d e s u e l o s

a l m a c e n a d a s p o r 3 0 a ñ o s 15

d).- P r u e b a s d e r e s i s t e n c i a d e l o s a i s l a d a s de A. vinelaridii

a a n t i b i ó t i c o s y a g e n t e s q u í m i c o s . . . 16

e).- Detección d e los A D N — p l á s m i d o s en Aso t oboe L e r vínelcotdii.18

e.l.— C o n d i c i o n e s d e c u l t i v o y c e p a s d e referencia. .... 18

e. 2. — A i s l a m i e n t o d e los A D N — p l á s m i d o s 18

e. 3. — E l e c t r o f o r e s i s en ge1. . . . 19

e. 4. - T i n c i ó n y f o t o g r a f í a d e los g e les 2 0

— E n s a y o s s o b r e la p o s i b l e f u n c i ó n d e los plásmidos. ... 2 0 •.

Pag

h).— C o m p o r t a m i e n t o d e A&otobac ter- -u l ne L a.nd i i en s u e l o s e s t é r i l e s y n o e s t é r i l e s con d i f e r e n t e s t i p o s d e

texturas. . . . 21

RESULTADOS Y D I S C U S I O N

a).- Análisis d e las p o b l a c i o n e s d e m i c r o o r g a n i s m o s a e r o b i a s s o b r e v i v i e n t e s d e s u e l o s t e x a n o s a l m a c e n a d o s p o r

d i f e r e n t e s p e r i o d o s . . . . 23

b).— P o r c e n t a j e d e las b a c t e r i a s a i s l a d a s d e los s u e l o s

a l m a c e n a d a s p o r d i f e r e n t e s períodos. . . . 2 5

c).- D e n s i d a d e s d e las p o b l a c i o n e s de Asotobacter s p p s o b r e v i v i e n t e s en s u e l a s a l m a c e n a d o s p o r d i f e r e n t e s

períodos. 26

d).- Identificación b i o q u í m i c a d e los a i s l a d o s s o b r e v i v i e n t e s

d e Azolobac ter a l m a c e n a d o s p o r d i f e r e n t e s p e r i o d o s 2 7

e).- Identificación b i o q u í m i c a d e b a c t e r i a s G r a n n e g a t i v a s

aisladas d e m u e s t r a s d e s u e l o a l m a c e n a d a s p o r 3 0 afíos. . 2 8

f >.- P a t r o n e s d e r e s i s t e n c i a y susceptibi1 idad a d i v e r s o s a g e n t e s q u í m i c o s p o r a i s l a d o s de AsotobcLCter vinelctndii r e c u p e r a d o s d e s u e l o s a l m a c e n a d o s por d i f e r e n t e s

períodos. - 2 9

g).— P a t r o n e s d e r e s i s t e n c i a y s u s c e p t i b i l i d a d a c o m p u e s t o s a r o m á t i c o s p o r c e p a s d e A-zotobajcLer- •oirvelaxtd.H

r e c u p e r a d a s d e s u e l o s a l m a c e n a d o s p o r d i f e r e n t e s

periodos. 29

h). - P a t r o n e s d e r e s i s t e n c i a y s u s c e p t i b i l i d a d a a n t i b i ó t i c o s , p o r c e p a s d e Azotobcuc íer -vinelandii a i s l a d a s d e s u e l o s

a l m a c e n a d o s p o r d i f e r e n t e s períodos. 3 0

i).- P a t r o n e s d e r e s i s t e n c i a y s u s c e p t i b i l i d a d a a n t i b i ó t i c o s ; p o r cepas d e A. v í n e i a n d i i a i s l a d a s d e s u e l o s a l m a c e n a d a s p o r d i f e r e n t e s p e r í o d o s a n t e s y d e s p u é s d e la e l i m i n a c i ó n del plásmido. . . . 31

j).- C a r a c t e r í s t i c a s g e n e r a l e s d e los p l á s m i d o s d e t e c t a d o s en c e p a s d e A. •oiruela.nd.it a s o c i a d o s a la r e s i s t e n c i a a

a n t i b i ó t i c o s . . . . 32

k).- P a t r o n e s d e r e s i s t e n c i a y s u s c e p t i b i 1 idad a p e s t i c i d a s p o r cepas d e A. v i n « lartd.i ¿ a i s l a d a s d e s u e l o s a l m a c e n a d o s

1>.- P a t r o n e s de i-esistencia y susceptibilidad a pesticidas por cepas de A. oineierncfii aisladas de suelos almacenados p o r diferentes perí odos a n t e s y d e s p u é s de la eliminación

del plásmido. 35

115.- Garacteri stlcas generales d e los plAsmidos de cepas de

Ascitohact&f vxnerlandii asociadas con la resistencia a

pesticidas. 35

m>.- C o m p o r t a m i e n t o de cepas de Assotok>cict&r- win&lanciii e n suelos estériles y n o estériles con diferentes tipos de

texturas. . . . 35

CONCLUSION 67

INDICE DE T A B L A S

P o b l a c i o n e s d e m i c r o o r g a n ismos aerob ios s o b r e v i v i e n t e s d e s u e l o s t e x a n o s a l m a c e n a d o s por d i f e r e n t e s p e r í o d o s - 40

2.- P o r c e n t a j e d e las b a c t e r i a s a i s l a d a s d e s u e l o s

a l m a c e n a d o s p o r d i f e r e n t e s p e r í o d o s 41

3 . - D e n s i d a d e s de las p o b l a c i o n e s de Azotobcuc t e r spp

s o b r e v i v i e n t e s d e suelos a l m a c e n a d o s por 3 0 afíos ... 42

4.- D e n s i d a d e s d e las p o b l a c i o n e s d e Azotobacter spp

s o b r e v i v i e n t e s d e s u e l o s a l m a c e n a d o s por 11 afíos ... 43

5.— D e n s i d a d e s d e las p o b l a c i o n e s Azotobac t&r spp. a i s l a d a s d e s u e l o s r e c i e n t e m e n t e c o l e c t a d o s . . . . 44

6." C a r a c t e r í s t i c a s b i o q u í m i c a s de los a i s l a d o s d e

Azotobacter vinel candi i r e c u p e r a d o s de s u e l o s

a l m a c e n a d o s p o r d i f e r e n t e s p e r í o d o s - 45

7.- C a r a c t e r í s t i c a s b i o q u í m i c a s d e a i s l a d o s d e b a c t e r i a s Gram n e g a t i v a s s o b r e v i v i e n t e s de s u e l o s a l m a c e n a d o s

p o r 3 0 aftos - 46

8.- P a t r o n e s d e r e s i s t e n c i a y susceptibilidad d e los a i s l a d o s d e Asotobacter vinelariclii r e c u p e r a d o s d e s u e l o s a l m a c e n a d o s p o r d i f e r e n t e s p e r í o d o s a d i v e r s o s

a g e n t e s q u í m i c o s y a n t i b i ó t i c o s - 47

9.- P a t r o n e s d e r e s i s t e n c i a y susceptibilidad a c o m p u e s t o s a r o m á t i c o s p o r c e p a s d e Asotobactcr vinelandii a i s l a d a s

d e s u e l o s r e c i e n t e m e n t e c o l e c t a d o s 48

10. - P a t r o n e s d e r e s i s t e n c i a y suscept ibi 1 idad a antib ióticos por c e p a s d e Azoiobacter- vin^landii a i s l a d a s d e s u e l o s a l m a c e n a d o s p o r 3 0 aftos

11.- P a t r o n e s d e r e s i s t e n c i a y susceptibilidad a d i f e r e n t e s a n t i b i ó t i c o s p o r c e p a s d e Azotobacter vinelandii

a i s l a d a s d e s u e l o s r e c i e n t e m e n t e c o l e c t a d o s

12.- P a t r o n e s d e r e s i s t e n c i a y susceptibilidad a a n t i b i ó t i c o s p o r c e p a s d e Azotobacter \)in&la.ndii PLA y PLA a i s l a d a s d e s u e l o s a l m a c e n a d o s p o r 3 0 a H a s . . . 51

R E S U M E N

C R I P T O B I O S I S D E P L A S M I D O S D E AZOTOBACTER VIXELAXDII

L a bactei'ia A-s&icikjctczt&r- e s impor-ianíe e n la microbiologi a agrí cola y el ciclo del nitrógeno, por» su capacidad de fijar- nitrógeno atmosférico. A. vin&lctnclii pu«^de ser aislada de suelo, a g u a y rlzósfera de algunas gramí neas, e>-¡ medios minerales libres de nitrógeno con una fuente sencilla de carbono. C o n ciertas c e p a s s e h a n realizado investigaciones, e n u n intento p o r entender s u papel e n la naturaleza. A 80 aPíos • de s u descubrimiento, su genética es bien conocida e n algunos a s p e c t o s que se relacionan con los genes de la fijación biológica del nitrógeno molecular, sin dilucidar la influencia de plásmidos e n la bioquí mica y fisiología de Asototfac.-t&r-. Recientemente s e publicó que cepas de A chr-ctococcunx y A. uin&lctntdíi contení a n plásmidos sin aparente actividad biológica <crí pticos>. Este estudio tuvo como principal propósito detectar y analizar la presencia de plásmidos cor» actividad funcional e n aislados de Asatat>ciat&r-vin&landii recuperados de suelos almacenadas por 30 años. Por lo que suelos c o n s e r v a d o s e n contenedores de vidrio estériles a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e por 30' • años, f u e r o n inoculados directamente e n a g a r Burk, colonias sospechosas de pertenecer a A. vin&lcmcli.i. se identificaron bioquí micamente. L o s plásmidos detectados e n los aislados s e les intentó asociar con algunas de s u s actividades biológicas. L o s resultados

resultada c o r r o b o r a r o n : CI> 1a existencia de pláamldos er» las cepas de A. tsinoi¿tn£li.i y <II> sen ¿tía por« p r i m e r a v e z la criptobiosis de plásmidos e n c e p a s de bacterias sobrevivientes en suelos almacenados por 30 años. Finalmente p a r a establecer la influencia del plásmido s o b r e la capacidad de crecimiento y sobrevivencia de la bacteria e n suelo, c e p a s de A. vin&landii

I N T R O D U C C I O N V A N T E C E D E N T E S

a>.- B R E V E R E S E R A H I S T O R I C A S O B R E AZOTOBACTER

E n 1840 Wilfarth. Hellriegel, Riegel y Bertlot citados por* T h o m p s o n y Sk&r-man <234 > demostrar-oii que cierta cantidad de nitrógeno atmosférico llega al suelo por la acción de microorganismos, que asociados con las raí ees de plantas leguminosas tienen la capacidad de t r a n s f o r m a r el nitrógeno molecular en proteí ñ a s vegetales constituyendo un aspecto fundamental del ciclo del nitrógeno. Tiempo d e s p u é s s e especuló la existencia de o t r o s microorganismos que podrí an fijar el nitrógeno del aire sin la asociación con plantas. En 1808 Winogradsky <!25l> aplicó u n a n u e v a f o r m a p a r a aislar e s a s bacterias f ijador»es de nitrógeno del aire y c o m o resultado se obtuvo por primera vez, la bacteria anaeróbica estricta conocida c o m o Clostr-icH-um pctst&ut-ianum. Diez a ñ o s después-Beijerinck e n Holanda t30, 31> repitió los trabajos de

Winogi-adsky, pero c o n la intención de encontrar alguna bacteria aeróbica c a p a z de f'ijax- nitrógeno molecular. Al agregar pequeñas cantidades de suelo e n m a t r a c e s erlenmeyer que c o n t e n í a n medio de sales minerales libres de amoniaco, nitrato o cualquier o t r a f o r m a de nitrógeno combinado, enriquecida c o n manitol c o m o fuente de carbono, e n t r e s di a s se desarrolló u n a delgada pelí otila de bacterias e n la superficie del liquido, el cual se t o r n a b a turbio. E n el microscopio o b s e r v a r o n g r a n d e s células G r a m <-> e n f o r m a de bastón» m u y diferentes a la única bacteria conocida fijadora de nitrógeno de e s t e tiempo» C. pa&t&ur-iamjm. D e e s t a m a n e r a se describió por p r i m e r a v e z el género n o m b r a d o por Bei jerinck

como: Azc>t<jt>cic.t&r- y d o s especies» A. chr-occocum y A. La primera c o m ú n e n el suelo y la segunda en los canales de la

ciudad d e V i n e l a n d , N.J. , E U A . D e s d e e n t o n c e s s e h a n d e s a r r o l l a d o m u c h a s i n v e s t i g a c i o n e s p a r a e v a l u a r el papel del género Azolobact&r en el c i c l o del n i t r ó g e n o , e s p e c i a l m e n t e en

la fijación b i o l ó g i c a d e n i t r ó g e n o .

b).- I M P O R T A N C I A B I O Q U I M I C A Y F I S I O L O G I C A D E AZOTOBACTER SPP Y

A. V 2 NELAND2 2

El g é n e r o A-zotobcuc ter e s d e i n t e r é s en b i o q u í m i c a y fisiología m i c r o b i a n a , d e b i d o a q u e t i e n e u n a d e l a s m á s a l t a s tasas r e s p i r a t o r i a s (medida p o r el p o r c e n t a j e d e a s i m i l a c i ó n de o x í g e n o y p r o d u c c i ó n d e C02= mol O2/1M0ICO2) q u e c u a l q u i e r otro o r g a n i s m o v i v o (10).

s e m e j a n t e s al n i t r ó g e n o m o l e c u l a r c o m o el c i a n u r o , a c e t i l e n o e hidrógeno (33, 35). La actividad natural d e los m i c r o o r g a n i s m o s que fijan el n i t r ó g e n o del a i r e , e s relativamente fácil de m e d i r por la técnica de r e d u c c i ó n del acetileno a e t i l e n o , que p o r o t r a s formas de medición d e la fijación b i o l ó g i c a del d i n i t r ó g e n o (88, 118).

c>.- C A R A C T E R I S T I C A S D E L A S E S P E C I E S D E AZOTOBACTER

L a s e s p e c i e s del g é n e r o AaoL&bcLct&r- son m i e m b r o s importantes d e c i e r t o s tipos d e s u e l o (35, 200, 2 5 5 ) , d e la rizósfera de a l g u n a s g r a m í n e a s (47, 209) y en la f i l o s f e r a d e algunas p l a n t a s a c u á t i c a s (131), d o n d e podrían c o n t r i b u i r sustancialmente a la g a n a n c i a d e n i t r ó g e n o a t r a v é s del mecanismo de fijación biológ ica d e nitrógeno m o l e c u l a r (28, 33, 251). En la actualidad s e investigan, o t r a s formas d e beneficio de Asotobact&t- para la fertilidad del s u e l o tales como: la solubi 1 ización d e fósforo inorgánico, en s u e l o s con problema de d i s p o n i b i l i d a d de e s t e e l e m e n t o (20, 193).

En los m i c r o o r g a n i s m o s a u t ó c t o n o s del suelo, e x i s t e la capaciad de o x i d a c i ó n d e á c i d o sv fenólicos d e r i v a d o s d e

residuos v e g e t a l e s , c o m o la 1ignina considerada u n a de las fracciones d e la m a t e r i c ^ r g á n i c a más a b u n d a n t e del suelo, aunque Azotobacter es una b a c t e r i a nativa del s u e l o (1, 4, 6 ) pocos reportes <177, 2 5 8 ) le reconocen la c a p a c i d a d d e utilizar los á c i d o s fenóli'bs c o m o fuente de c a r b o n o y energía, lo que podría e x p l i c a r el c r e c i m i e n t o , s o b r e v i v e n c i a y distribución u n i v e r s a l del g é n e r o A-zotohaoter en los s u e l a s del m u n d o (196, 199, 2 1 1 ) .

L a s e s p e c i e s del género Azotobac. t&r p u e d e n influir positivamente en el c r e c i m i e n t o d e p l a n t a s porque tienen la capacidad de s i n t e t i z a r fitohormonas en la r i z ó s f e r a d e g r a m í n e a s (211): como cafla de a z ú c a r , maíz, trigo, sorgo y algunos p a s t o s tropicales, en e s p e c i a l Paspcclxiri notaíu/n (21, 47), e f e c t o s s i m i l a r e s pueden l o g r a r s e c u a n d o se inoculan en semillas y r a i c e s jóvenes de o t r a s p l a n t a s (13, 48, 129). Un ventaja del g é n e r o A&otobac £<?r- s o b r e o t r o s m i c r o o r g a n i s o s q u e producen fitohormonas, es que p u e d e n p r o d u c i r l a s in vitro, en medios d e c u l t i v o sintét icos s i m p l e s (52, 107, 227), en s u e l o dializado (medio que a s e m e j a las c o n d i c i o n e s del s u e l o natural

(104) , o "in s i t u " (102). Los d a t o s a n t e r i o r e s apoyan el punto d e vista d e que e s t a s s u s t a n c i a s son en realidad el mecanismo mas p r o b a b l e p o r cual A s o t o b a c í e r tiene un e f e c t o positivo sobre el d e s a r r o l l o v e g e t a l , m á s que por la vía d e fijación b i o l ó g i c a del n i t r ó g e n o (82). El género Aso toba.c ter puede s e r usado en la producción d e v i t a m i n a s y a m i n o á c i d o s

(103¿z, 112, 151), s u s t a n c i a s ant i t u m o r a l e s (92), a l g i n a t o s (65) y hasta c o m o s u p l e m e n t o a l i m e n t i c i a d e ganado v a c u n o y peces (211).

El g é n e r o Azotcrbactei- tiene capacidad de f o r m a r quistes <57, 58, 59 ), modificaciones estructurales y fisiológicas de su células vegetativas con resistencia a: la desecación <124, 210, 251), desintegración mecánica C24ó, 247), radiación ultravioleta e ionizante <2455, contra ciertos tipos de predación <113) y a n t a g o n i s m o microbiano en suelo libre de raí ees <46, 213). E n contraste con las endosporas» los quistes de -420Í0bacter n o s o n resistentes al calor ni completamente inactivos, ya que bajo determinadas condiciones oxidan c o n rapidez fuentes exógenas de energí a. Parece ser que la cubierta del quiste, e s la que confiere la resistencia a factores ambientales» p u e s cuando los quistes se tratan c o n a g e n t e s quelantes de metales, c o m o el citrato de sodio, se origina la solubilización de las capas externas y los quistes pierden la resistencia a a g e n t e s físicos y quí micos <213 >. E n la naturaleza s e cree que Azotabact&r- e s inducido a f o r m a r quistes por los mencionados a g e n t e s fí sicos y químicos» sin que e s t o s e h a y a d e m o s t r a d o exper i m e n t a l m e n t e ni reportado e n la literatura <Reddy y Vela 1986) (datos sin publicar). Mientras que cuando Azotobacter- s e cultiva artificialmente el n-butanol y el /3-hidroxibutirato c o m o fuente carbono existe u n a rápida ' y abundante formación de quistes <2i3), e s t a capacidad d e formación de quistes de la bacteria s e utiliza p a r a s u identificación primaria y separación de o t r o s m i e m b r o s de la familia Azotctbact&r-acea

<56, 234 >.

p l a n e a d o inocular Asotobetc t&r en s e m i l l a s y r a í c e s de p l a n t a s jóvenes, como medida d e p r o t e c c i ó n c o n t r a m i c r o o r g a n i s m o s fitopatógenos d e la rizósfera, p a r a que por c o m p e t e n c i a d e iones m e t á l i c o s eviten la acción de los fitopatógenos, q u e dependen de e s t o s iones p a r a su e s t a b l e c i m i e n t o en la zona d e rizósfera (117, 142).

L a información a n t e r i o r s o b r e Aso tóbete: ter IctncLi i,

parte d e la 1 i teratura actual (7, 234) y la última edición del manual d e Bergey (143) señalan q u e la e s p e c i e p e r t e n e c e a la

familia Aso tóbete t&r-etc&et&, con las s i g u i e n t e s c a r a c t e r í s t i c a s : es un b a c i l o G r a m n e g a t i v o , móvil por flagelos p e r í t r i c o s , heterotrófico, a e r o b i o e s t r i c t o , c a p a z de fijar n i t r ó g e n o molecular al o x i d a r u n a fuente de c a r b o n o senei 1la c o m o : glucosa o m a n i t o l . C a p a z d e f o r m a r q u i s t e s p o r inducción c o n n—butanol, m i e m b r o en la n a t u r a l e z a de d i v e r s o s e c o s i s t e m a s : agua d u l c e y marina, r i z ó s f e r a d e a l g u n a s gramíneas, distribuido r e g u l a r m e n t e en el suelo. Esta descripción del género Asotobact&r f u é e s t a b l e c i d a en base al c u l t i v o d e la bacteria en m e d i o s q u í m i c a m e n t e d e f i n i d o s libres d e c u a l q u i e r forma d e n i t r ó g e n o c o m b i n a d o (88, 249).

En general la fijación b i o l ó g i c a del n i t r ó g e n o m o l e c u l a r por Aso tóbete t&r- spp s e c o n s i d e r a el a s p e c t o de m a y o r relevancia p o r la literatura c i e n t í f i c a , que c u a l q u i e r o t r a act i vidad b i ológ ica d e las a t r i b u i d a a este g énero (45, 185,

186) .

L a capacidad de fijación del d i n i t r ó g e n o p o r Aso tóbete ter

spp n o e s la única ni p r i n c i p a l indicadora del papel d e la b a c t e r i a en la n a t u r a l e z a , i n v e s t i g a c i o n e s r e c i e n t e s (103b, Vela c o m u n i c a c i ó n p e r s o n a l ) c u e s t i o n a n la capacidad d e

e x p e r i m e n t o s d e inocalac i ón d e A. \>in&lct.nd.i i en s u e l o s y m e d i o s d e s u e l o d i a l i z a d o con d i v e r s a s c o n c e n t r a c i o n e s de n i t r ó g e n o c o m b i n a d o y p o b r e s en c a r b o n o o r g á n i c o s e n c i l l o , n o

lograron d e t e c t a r fijación b i o l ó g i c a d e n i t r ó g e n o g a s e o s o medido por- la técnica d e reducción d e acetileno. L o que sug iere que las cond ic iones espec í f icas q u e r e q u i e r e

Azotobacter p a r a e f e c t u a r la fijación b i o l ó g i c a d e nitrógeno-molecular con dificultad pueden p r e s e n t a r s e en el suelo, en especial porque s i e m p r e e x i s t e en los s u e l o s c o n c e n t r a c i o n e s de n i t r ó g e n o c o m b i n a d o s u f i c i e n t e s p a r a inhibir la reducción biológica del d i n i t r ó g e n o (257) y p r o b a b l e m e n t e la razón m á s importante q u e limita la actividad de fijación b i o l ó g i c a d e nitrógeno g a s e o s o es la a u s e n c i a d e c a n t i d a d e s a b u n d a n t e s (mas de 1V-) de c a r b o n o o r g á n i c o simple, ya q u e Asotobojc t&r d e b e r á oxidar u n a unidad d e a z ú c a r s i m p l e para p r o d u c i r d e 5 — 2 0 mg d e nitrógeno reducido, e s t a cantidad s ó l o s e p r o p o r c i o n a a la bacteria en c o n d i c i o n e s a r t i f i c a l e s , p o r lo tanto el enrequecimiento con c a r b o h i d r a t o s al s u e l o seria u n a p r á c t i c a e c o n ó m i c a m e n t e p o c o f a c t i b l e p a r a a p l i c a r s e en la agricultura.

(49, 105, V e l a 1986 c o m u n i c a c i ó n p e r s o n a l ) .

c o m p o r t a m i e n t o fisiológico difei-ente eri condìciories de cultivo artificial; e n 1930 J e n s e n <134 > refutó todos e s t o s trabajos al señalar que la selección inadecuada de filtros bacterianos usados en e s a s investigaciones, permitió que bacterias a t r v e s a r a n los filtros y desarrollaran colonias, por lo que las bacterias obtenidas no pertenecí an en realidad a la familia Azotcitjact&rac&a y concluyó que ningún m i e m b r o de la familia p o s e e ciclo biológico. Finalmente en 1981

Gonzá lez-López y Vela <103), repitieron los trabajos que apoyan el ciclo biológico con el u s o de filtros bacterianos de calidad reconocida <0.45 ,u), c o m p r o b a r o n que e n efecto Ios-m i e Ios-m b r o s de la faIos-milia Asotobact&r-ac&a p o s e e n ciclos biológicos complejos y que ciertos e s t a d i o s s o n filtrables, rio crecen en medios libres de nitrógeno y s o n incapeces de fijar nitrógeno molecular. Sin e m b a r g o la literatura científica ha ignorado e s t a investigación.

Estos n o s o n los únicos a r g u m e n t o s que intentan cambiar el concepto de A&otot>acter- e n la microbiologia.

En 1984 S m i t h y Vela <221 > (datos sin publicar) u s a r o n u n medio de suelo dializado que contení a algunos de los ácidos fenólicos m á s c o m u n e s derivados del h u m u s y e n c o n t r a r o n que

dializado se d e b e al "tipo de f u e n t e de carbono y energí a y no a la fase especí fica de la c u r v a de crecimiento. L a anterior investigación fué a p o y a d a por M o r e n o <177 > y W u et.al. <258> al d e m o s t r a r que A. vinelandii utilizó u n a amplia variedad de ácidos fenólicos: e n t r e ellos p-hidroxibenzoico c o m o fuente de carbono y energía, c o m ú n e n el suelo.

d>.- P L A S M I D O S D E L G E N E R O AZOTOBACTER.

El g é n e r o Asotot>act&r- contiene copias múltiples de s u g e n o m a <107, 2125, de Ahí la dificultad p a r a o b t e n e r m u t a n t e s , aunque la genética de Azotot>acter* e n relación a el sitio, regulación y expresión de los g e n e s que codifican p a r a la fijación biológica de nitrógeno g a s e o s o han' sido intensamente estudiados y actualmente e s t o s g e n e s s o n bien conocidos en 420í0bacíer <36, 37, 38), o t r o s trabajos sugieren que e s t e c o m p o r t a m i e n t o genético puede s e r debido a plásmidos, los cuales contienen copias múltiples de su g e n o m a <169, 175} o por lo m e n o s a que A&otobact&r* tiene u n a c a r g a genética superior a la de los procariotes m á s conocidos c o m o Escherichia coii <215>.

E s propósito de e s t a investigación contribuir' a la aclaración de la controversia sobre la función de los plásmidos, asociados c o n c e p a s de A-zot obcrcíer* vi¡i&lan<3'¿i

sobrevivientes e n suelos almacenados por 30 años.

1.- ¿ G o m o c o n s e r v a r o n las azotobacterias los AON-pías m i dicos durante este perí odo ?

2.- ¿Existen similitudes e n t r e las p lis mi dos de las cepas de

A. tjin&landii sobrevivientes e n suelos, almacenados por 30 a ñ o s a los d e t e c t a d o s e n cepas de A. \j%n&lctncli.i aisladas de los suelos recién colectados ?

H I P O T E S I S

Asotcitiaatenf- t¿•irt&lancii.i contiene plásmidos que, si multarte a m é n t e a JLa viabilidad de s u s células, h a n conservado s u capacidad de expresión génica, no o b s t a n t e ser recuperadas de suelos almacenados por largos periodos.

OBJETIVOS

1> Analizar las poblaciones de microorganismos sobrevivientes de suelos colectados y almacenados por 30 afíos, c o n especial interés e n las poblaciones sobrevivientes de

Asot&baat&r- spp y Asotobact&r* vtn&landii que contienen plásmidos.

2> D e m o s t r a r que c e p a s las sobrevivientes de

Asc/tobact&t-xjin&lanciii. r e c u p e r a d o s de sueleé almacenados p o r largos p e r ! odos p u e d e n p r e s e r v a r Ccriptobiosls) plásmidos c o n capacidad de expresión genica.

M A T E R I A L Y M E T O D O S

a).- O R I G E N Y TIPO DE S U E L O S U S A D O S

Un total de 40 m u e s t r a s d e sue los c o l e c t a d a s en 1as áreas d e Austin. Fort Worth y Denton Texas. E.U.A. en d i f e r e n t e s años fueron u t i l i z a d a s en esta investigación. De un total d e 18: 11 fueron d e tipo c h e r n o z e m v 7 d e tipo arenoso, ¿eü i'jn o esc n o c í -on de M o r e n o e t al (178) . Los sue 1 os s e c< 1 iTwren aro . t=n el 1 ahora cor i o a t e m o e r a t u r a amb íen te (25.5 + / — Z."2°C> Dor 30 años, tres s u e l o s oor 11 años: dos de las s e r i e s Burleson v uno de la s e r i e C r o c k e t t v i9 s u e l o s recién colectados: n u e v e de las s e r i e s Birome. s e i s de las s e r i e s Bu.r 1 e s o n y cuatro de 1 a s s e r i e s Crockett. De a c u e r d o con 1 a clasificación d e suelos del D e o a r t a m s n t o de A g r i c u l t u r a de los E s t a d o s Unidos oara al e s t a d o d e Texas (229). L o s suelos s e c o n s e r v a r o n en viales e s t é r i l e s a b i e r t o s sólo el día de su análi sis.

b > . - C U A N T I F I C A C I Ü N D E L O S M I C R O O R G A N I S M O S S O B R E V I V I E N T E S D E L O S SUELOS A L M A C E N A D O S POR D I F E R E N T E S P E R I O D O S

1>.- Agar Nutrí tiva (AN>: e x t r a c t o d e c a r n e 8.0 g, p e p t o n a 5 . 0 g, a g a r 15.0 g, a g u a d e s t i l a d a 1000 mi (Difco. Detroit, Mich), para e n u m e r a r las b a c t e r i a s a e r o b i a s totales

(64, 171, 226).

2 ) . - Aoar C a s e í n a Almidón (ACA): c a s e í n a 10.O o, almidón soluble 2.0 g, KNO3 2 . 0 g, NaCl 2 . 0 g, MgSCU 7HsO 0 . 0 5 g, FeSÜ4.7H2Ü trazas. K2HPO4 1.0 9, KH2PO4 l.O Q, CaCDa 0.02 9, aoar 18.0 9, <Di fco. Detroít. Mich). agua dest ilada 1000 mi. pH 7 . 2 , para enumerar los a c t i n o m i c e t o s (132, 137. 139),

3).— Agar Rosa d e B e n g a l a — E s t r e p t o m i c i n a (ARBE): glucosa 10.0 g, p e p t o n a 5 . 0 g, KzHPü* 1.0 g, MgSO*. 7H2O 0 . 5 g, rosa d e b e n g a l a 3 3 mg, a g a r 15 g, (Difco. D e t r o i t , Mich) agua d e s t i l a d a 1000 mi, DH 3 . 8 a j u s t a d o con H2SO4 0.1 N, s u l f a t o de e s t r e p t o m i c i n a (Sigma. Co. San Luis. M o ) se e s t e r i l i z ó p o r filtración y a g r e g ó al m e d i o b a s e d e S D u é s d e e s t e r i l i z a r en a u t o c l a v e y e n f r i a r p a r a u n a c o n c e n t r a c i ó n final d e 2 0 jjg/ml. para enumerar los p r e p á g u l o s s o b r e v i v i e n t e s d e hongos y

levaduras (87, 176) .

4 ) . - Agar Burk (AB) : g l u c o s a 5.0 g, K H 2 P C U 0 16 g, K2HPQ4 0 . 6 4 o, NaCl 0 . 2 g, M g S 0 4 . 7 H Z 0 0 . 2 g, CaSCU. 2 H 2 O 0 . 0 5 g. NaMoÜ4.2HzO 0.01 g, F e S D * 0 . 0 0 3 g, agua d e s t i l a d a 1000 mi. pH 6 . 8 para e n u m e r a r las a z o t o b a c t e r i a s y b a c t e r i a s afines

(90, 2 1 4 ) .

C u a n d o las p o b l a c i o n e s m i c r o b i a n a s fueron a b u n d a n t e s s e — i - —2 —3

P a r a la d e t e r m i n a c i ó n de la tasa y p o r c i e n t o d e las bac ter i a s G r a m — n e g a t i v a s , G r a m — p o s i t ivas: f o r m a d o r a s d e e s p o r a s y no e s o o r u l a d a s , se tomaron 100 c o l o n i a s c u l t i v a d a s en a g a r n u t r i t i v o de c a d a s u e l o y s e o b s e r v a r o n al m i c r o s c o p i o oor tinción al Gram (68, 69),

c>.- B I O Q U I M I C A D E B A C T E R I A S GRAM N E G A T I V A S A I S L A D A S DE L A S M U E S T R A S D E S U E L O S A L M A C E N A D O S POR 3 0 A R O S

F'ara el a i s ! amien t o d e Asa L abete £ er spp y A. vine laná l i

s o b r e v i v i e n t e s de los s u e l o s a l m a c e n a d o s Dor 3 0 a ñ o s se s e m b r ó d i r e c t a m e n t e d e los s u e l o s (0.1 g > en c a j a s de AB. L a s c o l o n i a s que d e s a r r o l l a r o n un p i g m e n t o f l u o r e s c e n t e verde. se s e p a r a r o n y sembraron en agar n u t r i t i v o para observar el p l e o m o r f i s m o d e los a i s 1 a d o s s o s p e c h o s o s de Azotobactsr, s e uso un m icroscopi o de c o n traste d e fases (134, 143, 249). M i e n t r a que p a r a la inducción d e los q u i s t e s en los a i s l a d o s de Aso toban L&r se u s ó n — b u t a n o 1 (Sigma. Co. San Lui s, Mo. ) al 0.3 V. (v/v) c o m o s u s t i t u t o de g l u c o s a en el m e d i o AB.

S e u s ó la técnica d e reducción d e a c e t i l e n o para la medición indirecta de la capacidad d e fijación d e n i t r ó g e n o d e

los a i s l a d o s d e AsaLobaaL&r y p a r a su identificacion las D ruebas b ioquími cas r e q u e r i d a s fueron: ut i I i zac i on d e d i f e r e n t e s f u e n t e s de c a r b o n o , p<ara esta prueba se e m p l e ó el medio Bu.rk como base y la adición de la fuente e s p e c í f i c a d e c a r b o n o en concent rae i ón de 0 . 5 V. (p/v), las Que s e e s t e r i l i z a r o n por f i l t r a c i ó n con m e m b r a n a m i l i p o r e d e 0 . 2 pra

de A. vine LancH i de 2 4 h r s s u s p e n d i d a s en solución salina 0 * 8 5 7. (143, 178).

De las m u e s t r a s d e s u e l o s a l m a c e n a d o s por 3 0 años se aislaron en agar n u t r i t i v o a l g u n a s c o l o n i a s (10 d e cada 100 con s i d e r a d a s semejan tes) y q u e m i c r o s c ó p i c amen te n o se relacionaron con los g é n e r o s Aso L abete t er spp o BclcULus spp,

ti fíe ron al Gram v se realizaron las s i g u i e n t e s p r u e b a s bioouim i cas: c rec un i en to en anaerobi osís, c i toe romo oxi dasa,

formac i ón de ác ido y g a s d e g lucos a y lac tosa, D rodu.ee i ón d e acetil metil carbinol (Vogues—Proskauer), utilización d e c i tratos como ún ica fuente de carbono, h i d r ó l i s i s de urea, movilidad, formación d e HzS e inool (49, 74, 143).

d).- P R U E B A S D E S U S C E P T I B I L I D A D D E L A S C E P A S D E AZCTOBACTER VINELAHDII A A N T I B I O T I C O S Y A G E N T E S Q U I M I C O S

P a r a e s t a prueba fueron u s a d o s agar n u t r i t i v o v a g a r Burk c o m o b a s e para d e t e r m i n a r la r e s i s t e n c i a de los a i s l a d o s de A. uin&Laneti i a a n t i b i ó t i c o s (162, 187) imoregnados en sens id i s e o s con 1as s i gu ien tes concen trac iones en ug/mi: CM cioranfenicol 25.0, SM e s t r e p t o m i c i n a 25.0, TC tet rae i c I i na

15.0, AP amo ic i 1 ina 15.0, CB c a r b e n c i lina 15.0, K kanamic i na 1.0, NA ácido nalidix ico 20.0, R r i f a m o i c i n a 10.0, GM gentamicina 10.0, E e r i t r o m i c i n a 10.0, B b a c i t r a c i n a 10.0, VA vancom i c i na 30. 0 (S igma. Co. San Lu i s) .

A d e m a s de este e n s a y o se e s t a b l e c i ó uno o a r a estudiar la

resistenc i a de 1 os a i s l a d o s de A. xjí ríe I eincí i. ii 1) fenol 0.5 V.

(o / v) , 2 > b e n z o a t o d e sod io O.5 '/• (p / v) , 3 ) fl u o r u r o de sod i o 0.01 M (234), 4) tolueno O. 1 7. (v/v) , 5) xileno 0.1 X (v/v>

Karmex 0.1 y/1 y 8) A q u a z i n e O.1 g/1 (Aldrich. Co. M i l w a u k e e ) (16, 17, 18, 19) con s e n s i d i s c o s p o r o b s e r v a c i ó n del c r e c i m i e n t o o inhibición d e los a i s 1 a d o s d e s p u é s de u n a semana d e incubación a 3 0 °C (250).

L o s a i s 1 a d o s de A. ui rte L arid l i d e los sue los s e c o m p a r a r o n con 1 a cepa d e col ecc i ón A-zo tobac t er u i ne L a.nd. l i

ATCC 12837 y s i m u l t á n e a m e n t e s e c o n s e r v a r o n en AB y AN.

e).- D E T E C C I O N D E L O S A D N - P L A S M I D I C O S E N AZOTOBACTER. VINELAND2I

e.l).— C o n d i c i o n e s d e c u l t i v o

L a s 12 c e p a s de A. xti.ne'La.nd.i i, 7 a i s l a d a s d e los s u e l o s a l m a c e n a d o s por 3 0 afíos s e d e s i g n a r o n : Oíd—8, O í d — R , Oíd—Si, Oíd—83, Oíd—8b, Oíd—E y O I d - 8 i , 5 c e p a s a i s l a d a s de los suelos recién colectados: L - 2 , D - l . S - 6 A , UW-A1 y 2489, al igual q u e 4 c e p a s d e Esch&richict coli con ADN—plásmido d e p e s o m o l e c u l a r conocido: Col El (4.2 M D a ) , R 6 - 5 (61 MDa). R P 4 (34 M D a ) y R6—k (24.7 M D a ) s e usaron c o m o referencia (lóS), se c u l t i v a r o n en matraces d e 3 0 0 0 mi con 1000 mi d e c a l d o Burk e n r i q u e c i d o , con l.O V. d e Bacto—peo tona y 5 . 0 '/. d e e x t r a c t o d e

levadura (Difco, Detriot, Mich) (92, 249).

L o s m a t r a c e s se incubaron a 2 8 °C d u r a n t e 2 días en agitación rotatoria a 2 5 0 rom, h a s t a que las c é l u l a s a l c a n z a r o n una densidad óptica d e 0 . 8 — 1.0, p o r medición en e s o e c t r o f o t ó m e t r o Bauch y Lomb 20, a 6 0 0 nm (169).

e.2).— A i s l a m i e n t o de A D N — p 1 á s m i d i c o s

r e s u s p e n d i ó en 1 mi de r e g u l a d o r E (solución d e 4 0 mM d e Tris—Tham—Tris, H i d r o x i m e t i l a m i n o m e t a n o (Fisher. Co. Fairlawn, NJ), s e m e z c l ó con 1.5 mM de Á c i d o e t i l e n d i a m i n o t e t r a c ó t i c o y el pH se a j u s t ó a 7 . 0 con á c i d o a c é t i c o glacial), dos mi d e r e g u l a d o r de lisis fueron a R a d i d o s al paquete celular. Este r e g u l a d o r f u é una solución a c u o s a de 1.5 V. (p/v) d e dodecil s u l f a t o d e s o d i o (Fisher, Co. Fairlawn. NJ), en 4 0 mi d e r e g u l a d o r Tris. El pH se a j u s t ó a 12.5 con una solución 2 N de NaOH, se m e z c l ó s u a v e m e n t e la suspensión, se incubó en b a ñ o de a g u a a 65°C, por 60 minutos, luego 6 mi d e una solución f e n o l - c l o r o f o r m o (Fisher, Co. F a i r l a w n , NJ")

1:1 (v/v), fué a g r e g a d a d e l i c a d a m e n t e i n v i e r t i e n d o el tubo una sola vez para m e ¿clar. L a s u s p e n s ión c e l u l a r fué c e n tri fugada a 7 5 0 0 x g por 15 m i n u t o s . La f a s e acuosa d e r i v a d a d e las c é l u l a s 1isadas que se o b s e r v ó en la m e z c l a c o n t e n í a las m o l é c u l a s s o l u b l e s con A D N y ARN, fueron c o l e c t a d a s con una pipeta p l á s t i c a (Drummond- C. S a m c o . San F r a n c i s c o , C a ) y se transfirieron a tubos d e 5 mi p a r a a l m a c e n a r s e a 4 °C hasta su a n á l i s i s por e l e c t r o f o r e s i s en g e 1 . La interfase q u e se f o r m ó rica en ADN c r o m o s o m a 1 s e d e s e c h ó de a c u e r d o c o n : Hada y S i z e m o r e (114), Hardman •et.al. (120), Hill y C a r l i s l e (123), Holben et.al. (130) y p r i n c i p a l m e n t e K a d o <146).

e.3).— E l e c t r o f o r e s i s en g e l

revelador c o m p u e s t o p o r u n a solución a c u o s a con 2 0 mg/mi d e dodecil sulfato d e s o d i o S D S (Sigma. Co. San Luis, M o ) y 1 mi d e azul d e bromotimol 7 M (174).

e.4).— Tinción y f o t o g r a f í a d e los g e l e s

P a r a la d e t e c c i ó n y o b s e r v a c i ó n d e los A D N — p 1 a s m i d i eos, los g e 1 e s de a g a r o s a fueron t e ñ i d o s por 3 m i n u t o s con una solución d e 0.5 ¿jg/ml de b r o m u r o d e e t i d i o

(Siama. Co. San Luis, M o ) , d i l u i d o en 1000 mi de a m o r t i g u a d o r £, d e s p u é s se 1avaron en e1 m i s m o a m o r t i g u a d o r E. S e c o l o c a r o n en el T r a n s í l u m i n a d o r (modelo 3—3000, Fotodyne. Inc. New Ber1 in) y se fotografiaron con una cámara Polaroid (CU—5 Land

tipo 6 6 5 ) provista de un filtro No. 2 5 n a r a n j a (Eastman. Kodak. Co. R o c h e s t e r ) c o n un tiempo de e x p o s i c i ó n de 2 . 5 m i n u t o s (63, 170). Todo el material d e v i d r i o fué p r e v i a m e n t e esteri 1 i zada para e l i m i n a r la act i vidad d e n u c l e a s a s , y s e usaron g u a n t e s d e 1átex p a r a p r e v e n i r c o n t a m i n a c i ón d e las m u e s t r a s con n u c l e a s a s d e la piel (170).

f).- E N S A Y O S O B R E LA P O S I B L E F U N C I O N D E L O S P L A S M I D 0 S

D e t e c t a d o s los o l á s m i d o s en las 12 c e p a s de A. vine lancH i. , s e u t i l i z a r o n los r e s u l t a d o s d e la c a r a c t e r i z a c i ó n b ioauímica de la r e s i s t e n c i a a 1os ant ib i ót i e o s y o t r o s a g e n t e s químicos, la capacidad d e fijación b i o l ó g i c a del n i t r ó g e n o y la s í n t e s i s del p i g m e n t o fluorescente v e r d e c o m o base p a r a e s t a b l e c e r alguna relación e n t r e e s a s c a r a c t e r í s t i c a s y los p 1 á s m i d o s (127, 191, 206).

g ) . - E N S A Y O D E E L I M I N A C I O N DE P L A S M I D 0 (CURACION)

P a r a verificar que los p l á s m i d o s e s t a b a n r e l a c i o n a d o s con a l g u n a de las c a r a c t e r í s t i c a s b i o q u í m i c a s -y/ó p r u e b a s d e r e s i s t e n c i a realizadas, las 12 c e p a s d e A. vineLandi¿ s e

e x t r a c t o de levadura 0 . 2 5 % <Difco. Detroit, M i c h ) a d i c i o n a d o s con dodecil s u l f a t o de sodio- (SDS) O . 6 2 5 g/l» naranja de acridina (NA) Sigma. Co. San Luis, Mo) 0 . 2 5 mM y bromuro de etidio (BE) 0.125 mM. E s t e medio d e c u l t i v o fué p r e p a r a d o en m a t r a c e s de 500 mi con 150 mi de v o l u m e n d e trabajo. L o s m a t r a c e s se agitaron a 2 5 0 rpm p o r tres d í a s a 3 7 °C, p a r a luego recuperar las c é l u l a s en a g a r Burk y / ó AN, se repitieron los e n s a y o s de utilización d e d i v e r s a s f u e n t e s de carbono, patrón d e res ¿ stenci a a an tibí o t i c o s y agen tes au1mieos, reducc1ón de acet i 1eno y síntesi s de p i gmen to f1uorescen te verde, rea1 i zando la técnica d e extracci On, purifi cac1ón, c a r a c t e r i z a c i ó n d e los p l á s m i d o s y e l e c t r o f o r e s i s en gel p a r a c o m p r o b a r la eliminación (curación) del p l á s m i d o por efecto d e SDS, NA y BE (79, 169)v.

h).- C O M P O R T A M I E N T O D E AZOTOBACTER VINELANDI1 E N S U E L O S E S T E R I L E S Y NO E S T E R I L E S EN D I F E R E N T E S TIPOS D E T E X T U R A S

Con el propósito d e observar el e f e c t o de la p r e s e n c i a y / o a u s e n c i a d e los p l á s m i d o s s o b r e el c o m p o r t a m i e n t o de las c e o a s d e A. -o i ri&la.rudi i L — 2 y OLD—81 fueron inoculadas en suelos e s t é r i l e s y no e s t é r i l e s d e las s e r i e s Burleson y Croe kett. En v i a l e s d e 2 0 mi con tapón d e rosca se 1es ag r e g ó

10 g d e suelos s e c o s y tamizados. los s u e l o s fueron esfceri 1 i sados en a u t o c l a v e 121°C p o r u n a hora durante tres di3s. L a s c é l u l a s de A. u í n e l a n d ü fueron a c t i v a d a s en a g a r Burk 4 8 h, lavadas con solución s a l i n a 2 veces por centrifugación a 3 0 0 0 r p m / 1 5 minutos, p a r a resuspender el o a a u e t e celular en amort iguador d e f o s f a t o s oH 7.0. E s t a s c é l u l a s fueron incubadas p o r 48 h a temperatura ambiente, lavadas de nuevo por c e n t r i f u g a c i ó n con s o l u c i ó n salina, la suspensión c e l u l a r fué a j u s t a d a a 2 . 0 X 103bacterias/ mi e

P a r a registrar la s o b r e v i v e n c i a de las c e p a s de A. •vine LcltícLí i L — 2 y OLD—81 en 1 os sue 1 os n o estéri les. 1 as c é l u l a s fueron p r e p a r a d a s c o m o se d e s c r i b i ó p r e v i a m e n t e ,

inoculando 1 x l'Otí celulas/ml en 10 g r a m o s de s u e l o (67,

102). L a selectividad del agar Burk se b a s ó en la süición de: cloranfenicol 2 5 ¿jg/ml (Sigma. Co. San Luis), b e n z o a t o de sodio al 0.5 V. (p/v), m i c o s t a n t m 0.1 q/'l (p/v) (Sigma. Co. San La i s) y f en o 1 ¡"».2 /; (p / v) (AJrrich. Co. Mil w e u k e e ) (1 15.

141), con sust i tucion a e y iucosa por ramnosa í Di feo. Detro11', como única fuente de c a r b o n o . r e a l i z a n d o c u e n t a s v i a b l e s a

R E S U L T A D O S Y D I S C U S I O N

A.- A N A L I S I S D E L A S P O B L A C I O N E S S O B R E V I V I E N T E S D E M I C R O O R G A N I S M O S A E R O B I O S D E S U E L O S A L M A C E N A D O S P O R D I F E R E N T E S P E R I O D O S

E n la Tabla No 1. se m u e s t r a n las poblaciones de los microorganismos sobrevivientes de los suelos del estado de Ttíxas. Las bacterias c o m o s« h a reportado i u e r o n el grupo de sobrevivientes n u m e r o s o encontrado, a pesar del tiempo de almacenamiento de algunas de las m u e s t r a s de los suelos. Por lo que la diferencia e n t r e el promedio de las densidades de las poblaciones bacterianas de los suelos almacenados por 30 afíos fué de 1.2 X 10° UFC/ g de suelo seco, d o s unidades exponenciales m e n o s que el p r o medio de las poblaciones homólogas aisladas de los suelos recién colectados de 3.0 X

Q

células de b a c t e r i a s c u l t i v a b l e s en c é l u l a s v i v a s pero n o c u l t i v a b l e s en los m e d i o s a r t i f i c i a l e s d e laboratorio (14, 15, 43) .

El p r o m e d i o de las d e n s i d a d e s d e las p o b l a c i o n e s de los a c t i n o m i c e t o s s o b r e v i v i e n t e s de los s u e l o s a l m a c e n a d o s por 3 0 años f u é de 2 . 0 X IO2 U F C / g d e s u e l o seco, el cual fué

diferente al p r o m e d i o d e las d e n s i d a d e s d e las o o b l a c i o n e s h o m ó l o g a s de los suelos a l m a c e n a d o s por l1 a R o s d e 17.O X 1 03

UFC/ g de suelo seco y el p r o m e d i o d e las d e n s i d a d e s de las p o b l a c i o n e s de los a c t i n o m i c e t o s e n c o n t r a d o en los s u e l o s c o l e c t a d o s recientemente fué de 6 . 6 0 X 10 UFC/ g d e s u e l o seco. Aunque los a c t i n o m i c e t o s son m i c r o o r g a n i s m o s a u t ó c t o n o s del s u e l o (4) no e'«isten r e c o r t e s de u n a capacidad d e sobrevivencia en suelos p o r p e r i o d o s s e m e j a n t e s a los de e s t a

investigación. L o a n t e r i o r s u g i e r e que los a c t i n o m i c e t o s s o b r e v i v i e n t e s en los s u e l o s a l m a c e n a d o s o o r 3 0 a ñ o s pudieron u t i l i z a r c i e r t a s formas d e r e s i s t e n c i a a las c o n d i c i o n e s adversas que existen en los s u e l o s (64) (como la falta d e h u m e d a d ) y q u e a su vez inhibieron c u a l q u i e r actividad metabòlica (97), r e d u c i e n d o de é s t a manera la velocidad de su tasa d e m u e r t e ( 121, 137), lo que se ha c o m p r o b a d o al disminuir el c o n t e n i d o d e humedad en el s u e l o que induce a la formacion de e s t r u c t u r a s d e latencia o p e r s i s t e n c i a (182, 2 4 0 , 254). A u n q u e s e r á n e c e s a r i o una investigación m á s p r o f u n d a d e estos a c t i n o m i c e t o s p a r a e s t a b l e c e r el o los m e c a n i s m o s

resoonsables d e su p e r s i s t e n c i a .

El promed io de 1as densi d a d e s d e poblac iones d e oropágulos fúngicos s o b r e v i v i e n t e s fueron d e 2 5 UFC y 1.5 X

IO2 UFC / g d e suelo s e c o en los s u e l o s a l m a c e n a d o s oor 3 0

de p r o p á g u l o s v i a b l e s f u é d e 7. 1 X 10"* U F C / g d e s u e l o seco, lo q u e s u g i e r e q u e a p e s a r de las 1 imi t a c i o n e s d e la técnica d e c u a n t i f i c a c i ó n e m p l e a d a , no s e r e f l e j ó el tamaño real d e

las p o b l a c i o n e s fúngicas, a u n q u e se l o g r ó d e t e c t a r la p r e s e n c i a de p r o p á g u l o s v i a b l e s en los s u e l o s a l m a c e n a d o s p o r 3 0 y 11 años, p o s i b l e m e n t e por q u e las c o n d i c i o n e s d e p o b r e z a nu.tr i c i o n a l e s y 1im i tac i ones d e humedad d e e s t o s s u e 1 o s

impidieron su c r e c i m i e n t o <85, 87, 93) y por tanto estimularon coito ya se e x p l i c ó ia f orm-ac i ón d e al g u n a s e s t r u c t u r a s de resistencia, p r o l o n g a n d o su viabilidad (98, 99) p o r p e r i o d o s m a y o r e s a los c o n o c i d o s (4, 100). En n i n g u n a d e las m u e s t r a s de los s u e 1 o s anal i z a d a s se detec t ó 1a p r e s e ñ e i a d e levaduras, lo que s e a t r i b u y ó al p H y a la c o m p o s i c i ó n f i s i c o a u í m i c a de los s u e l a s estudiados''\(4) .

B . - P O R C E N T A J E D E L A S B A C T E R I A S A I S L A D A S D E L O S S U E L O S A L M A C E N A D O S POR D I F E R E N T E S P E R I O D O S

a l m a c e n a d o s p o r 3 0 a ñ o s f u é d e 5 8 . 7 % d e los c u a l e s un 7.77. n o fué forma.dor d e esporas, lo a n t e r i o r p a r e c e reafirmar q u e existen o t r o s m e c a n i s m o s d e resi s t e n c i a natura1 de los m i c r o o r g a n i s m o s a f a c t o r e s a d v e r s o s del s u e l o (97, 138, 201), ésta m i s m a tendencia f u é o b s e r v a d a en los g r u p o s b a c t e r i a n o s de los s u e l o s a l m a c e n a d o s por 11 a ñ o s en los c u a l e s el 39.OX fué de b a c i l o s Gram <-) , el 617. d e b a c i l o s Gram ( + ) y el 2 4 . 0 % de b a c i l o s Gram ( + ) no e s p o r u l a d o s (29, 152).

C.- D E N S I D A D E S D E L A S P O B L A C I O N E S D E AZOTOBACTER SPP

S O B R E V I V I E N T E S DE L O S S U E L O S A L M A C E N A D O S POR D I F E R E N T E S P E R I O D O S

L a s T a b l a s No. 3, 4 y 5 p r e s e n t a n las d e n s i d a d e s de las p o b l a c i o n e s d e A-zotobác t&r- spp s o b r e v i v i e n t e s de los s u e l o s del e s t a d o de Texas a l m a c e n a d o s p o r 3 0 y 11 años, así como las d e n s i d a d e s d e estas p o b l a c i o n e s en los s u e l o s recién colectados. En estas t a b l a s se m u e s t r a n q u e las p o b l a c i o n e s d e

•y

las a z o t o b a c t e r i a s fluctuaron d e s d e 0.0 h a s t a 9.0 X 10 UFC/ g de s u e l o seco. La Tabla No. 3 c o n f i r m a los datos c o n o c i d o s sobre la capacidad de s o b r e v i v e n c i a d e A-zotohac: t&t- spp en a l g u n o s s u e l o s (i78, 214, 2 4 4 ) , lo q u e s u g i e r e q u e e f e c t i v a m e n t e esta b a c t e r i a p o s e e u n o o v a r i o s m e c a n i s m o s d e resistencia a las c o n d i c i o n e s a d v e r s a s de los s u e l o s (210), estos m e c a n i s m o s de a d a p t a c i ó n fisiológica (222) le perm i t ieron n o sólo p e r m a n e c e r vi a b l e s s i n o tamb i én c u l t i v a b l e s (256), lo a n t e r i o r n o n e c e s a r i a m e n t e s i g n i f i c ó q u e fué deb ido a la formac i ón d e q u i s t e s (29, 64, 152). La Tabla No. 4 m u e s t r a que las d e n s i d a d e s d e las p o b l a c i o n e s d e

de sus1 o fué el factor m á s importan te q u e i n f 1 u y ó en 1a sobrevivencia de las a z o t o b a c t e r i a s (64). En la T a b l a No 5 se muéstra s 1 rango de v^r^iAC i ón d e las pob 1 ac i o n e s nat ivas de

las a z o t o b a c t e r i a s presen tes en 1os s u e l o s rec i én c o l e c t a d o s del c o n d a d o de Dentón, que c o m o se e s o e r a b a , en general dieron las m a y o r e s d e n s i d a d e s d e p o b l a c i o n e s en comparación con las d e n s i d a d e s d e las p o b l a c i o n e s n a t i v a s de las -a ^ü^abac te?r i as de los o t r o s s u e l o s (143, 203), aunque sn ñ 1-jitnns sus 1 os n o se detect ó n inguna pob 1 ac i ón nat i va se supone aue ésto s e d e b i ó al tipo d e suelo. (14, 15, 44).

D.- IDENTIFICACION MORFOLOGICA Y BIOQUIMICA D E L O S A I S L A D O S D E AZOTOBACTER SPP S O B R E V I V I E N T E S D E L O S SUELOS A L M A C E N A D O S POR D I F E R E N T E S P E R I O D O S

En relación a las c a r a c t e r í s t i c a s generales m ic rose óp i cas, macroscóp i c a s y b i o q u í m i c a s , d e los ai si a d o s sob revi v i en tes s o s p e c h o s o s de s e r Aso tóbeteter de los sue1as a l m a c e n a d o s oor 3 0 a ñ o s v s u e l o s recién col =c r ¿c :? = "»o se encon t r ó r inguna d i feren te - i a s r e p o r t a d a s en la 1 i teratura

¡.143, 234). _ o= .i'siados c o r r e s p o n d i e r o n a b a c i l o s G (-) , al

-- - =n med i o sin ni t reo en o y h ierro 1 iberaron un p igman to fluorescente verde, mostraron capacidad d e fijar nitrógeno, medida par la técnica d e reducción de a c e t i l e n o al cultivarse sn fned ' o c árente de ni t r ógeno comb i nado, y formaron ÚU i s tes en medio d e Burk con n—butanol como fuente d e c a r b o n o d e s p u é s de 4S h de incubación. La Tabla No. 6 p r e s e n t a las

c a r a c t e r í s t i c a s bioauí m i c a s de los a i s l a d o s de Azotobac t&r

por 3 0 a ñ o s fueron b i o q u í m i c a y f i s i o l ó g i c a m e n t e m á s v e r s á t i l e s , q u e los a i s l a d o s d e los s u e l o s recién c o l e c t a d o s ; de las m u e s t r a s d e s u e l o s c l a s i f i c a d a s c o m o A u s t i n y 3 . 3 Con t ro1 a l m a c e n a d o s p o r 3 0 a ñ o s , se e n c o n t r ó que a p r o x i m a d a m e n t e un 10"/. d e los a i s l a d o s a n a l i z a d o s p e r t e n e c í a n a la e s p e c i e de A. vine Lctridi i (fueron d e s i g n a d a s c o m o O L D — R , O L D - S , 0 L D - 8 A , 0 L D - 8 b , O L D - 8 3 , O L D - E , 0 L D - 8 r , 0 L D - 8 c y O L D — S x) ; mi en t r a s que de 1as 19 m u é s t ras de 1os s u e 1 o s recién c o l e c t a d o s se a i s l a r o n 12 c e p a s de A. u i n e i a n d i i ( d e s i g n a d a s como S —£>A, W i l d , S-9, ló-AB, S - 6 1 , B - 1 6 A , L - 2 , 0 - 1 , S - 6 , W U - A L , UW y 2 4 8 9 ) , de las m u e s t r a s de s u e l o s n ú m e r o 2 2 , 2 4 y 25 lo q u e s i g n i f i c ó un 11'/. del total de la p o b l a c i ó n d e a z o t o b a c t e r i a s d e t e c t a d a (178, 180, 181), en o t r a s p a l a b r a s la mayor p a r t e d e 1 a s pob.l ac i o n e s n a t i vas d e Aso tóbete ter en t o d o s

los s u e l o s , c o r r e s p o n d i ó a la e s p e c i e de A. chrococc-um.

E . - I D E N T I F I C A C I O N B I O Q U I M I C A D E B A C T E R I A S GRAM N E G A T I V A S A I S L A D A S DE M U E S T R A S D E S U E L O S A L M A C E N A D O S PDR 3 0 A R O S

F . - P A T R O N E S D E R E S I S T E N C I A Y S U S C E P T I B I L I D A D A D I V E R S O S A G E N T E S Q U I M I C O S D E L O S A I S L A D O S D E AZOTOBACTER VINELANDII

R E C U P E R A D O S D E S U E L O S A L M A C E N A D O S P O R D I F E R E N T E S P E R I O D O S L a T a b l a N o 8 p r e s e n t a los p a t r o n e s d e r e s i s t e n c i a y s u s c e p t i b i l i d a d d e a i s l a d o s d e A-zotob&c ¿er v i n e í a.nc¿ l i

r e c u p e r a d o s d e s u e l o s a l m a c e n a d o s p o r di f e r e n tes p e r í o d o s a v a r i o s a g e n t e s q u í m i c o s y a n t i b i ó t i c o s . S e m u e s t r a , q u e el p e r i o d o d e a l m a c e n a m i e n to d e 1 o s s u e l o s n o a f e c t ó

t o t a l m e n t e la c a o a c i d a d d e r e s i s t e n c i a d e las c e o a s a los d i s t i n t o s i n h i b i d o r e s m i c r o b i a n o s , lo a u e s u g i r i ó q u e la d i f e r e n c i a e n t r e la r e s i s t e n c i a d e las c e p a s d e A. \>in&la.ncli.i

a i s l a d a s d e los s u e l o s a l m a c e n a d o s p o r 3 0 a ñ o s y la d e las c e p a s d e A. u í n e i a n d i i a i s l a d a s d e los s u e l o s r e c i é n c o l e c t a d o s , f u é debida", a q u e las c e p a s d e Azotoba.o t&r a i s l a d a s d e los s u e l o s a l m a c e n a d o s p o r 3 0 a ñ o s al p e r m a n e c e r en e s t a d o d e s e m i l a t e n c i a o l a t e n c i a (121, 2 0 1 , 2 1 0 ) , n o d e s a r r o l l a r o n n i n g ú n m e c a n i s m o d e a d a p t a c i ó n o r e s i s t e n c i a c o n t r a e s t o s c o m p u e s t o s (46, 64), m i e n t r a s q u e la r e s i s t e n c i a a c 1 o r a n fen icol p r o b a b l e m e n t e s e deb i ó al i n t e r e a m b i o d e i n f o r m a c i ó n g e n é t i c a d e AsoLoba.c t&r- c o n o t r o s g r u D o s m i c robi a n o s del s u e l o s r e s i s t e n t e s e s t e an t i b i ót ico (70, 7 2 ) p u e s s e s a b e q u e , a p e s a r d e las c o n d i c i o n e s a d v e r s a s n a t u r a l e s , el i n t e r c a m b i o d e i n f o r m a c i ó n g e n é t i c a e s p o s i b l e (71, 7 5 ), a d q u i r i r n o s ó l o la r e s i s t e n c i a ai c l o r a n f e n i c o l , s i n o t a m b i é n la c a p a c i d a d d e m a n t e n e r e s t a i n f o r m a c i ó n (81, 9 6 ) d u r a n t e un l a r g o p e r í o d o .

G . - P A T R O N E S D E R E S I S T E N C I A Y S U S C E P T I B I L I D A D A C O M P U E S T O S A R O M A T I C O S P O R C E P A S D E AZOTOBACTER VINELANDI1

R E C U P E R A D A S D E S U E L O S A L M A C E N A D O S POR D I F E R E N T E S P E R I O D O S

x i leño p o r c e p a s de A. uineiaadii a i s i a d a s d e s u e l o s rec1én colectados, indicándose q u e 3 d e las 5 c e p a s p r o b a d a s fueron resistentes y 2 fueron c o m p l e t a m e n t e s u s c e p t i b l e s , la d i f e r e n c i a e n t r e la r e s i s t e n c i a y susceptibilidad d e las c e p a s pudo s e r el resultado de la c o m p o s i c i ó n química y c o n t a m i n a n t e s de los s u e l o s a p a r t i r de los c u a l e s fueron aisladas, ya que existen e v i d e n c i a s de la p r e s e n c i a de e s t o s c o m p u e s t o s en a l g u n o s s u e l o s (13, 19) y d e Que los microorgani s m o s nat i vos t ienen 1a capac i dad d e adquirir p1ásmi d o s que conf i eren resi stenci a a e s t o s c o m p u e s t o s Dor d i v e r s o s m e c a n i s m o s b i o l ó g i c a s ( 97, 157). En c o n t r a s t e n inguna d e 1 as c e p a s de A. xji lcindi i a i s 1 a d a s de 1 os s u e l o s a l m a c e n a d o s por 3 0 aRos fué r e s i s t e n t e a e s t o s c o m p u e s t o s a r o m á t i c o s , lo que apoya a1 a r g u m e n t o d e que 1a capac idad m e t a b ó l i c a de 1os mi croorgan i s m o s depende d e su in formaci ón g e n é t i c a y del m e d i o a m b i e n t e en el cual son a c t i v o s (lió, 125, 145) .

H.- P A T R O N E S D E RESISTENCIA Y S U S C E P T I B I L I D A D A A N T I B I O T I C O S POR C E P A S D E AZOTOBACTER VINELANDII A I S L A D A S D E S U E L O S A L M A C E N A D O S POR D I F E R E N T E S P E R I O D O S

L a s T a b l a s 10 y 11 muestran la resistencia y suscep t ib i 1 idad de las c e p a s d e A. vin&Landii aisladas d e suelos a l m a c e n a d o s por d i v e r s o s p e r í o d o s , 3 0 aRos v s u e l o s recién c o l e c t a d o s a un g r u p o de 13 a n t i b i ó t i c o s con d i f e r e n t e sitio d e actividad a n t i m i c r o b i a n a , en general s e e n c o n t r ó q u e todas las c e p a s d e A. vi.nela.rt.dii fueron m á s resistentes a los a n t i b i ó t i c o s s e m i s i n t é t i c o s como: a m p i c i l i n a y c a r b e n c i l i n a

deriva del origen de c o n d i c i o n e s del suelo 236) .

las c e p a s <42, 51, 7 8 ) a parti r de1 cua1 fueron

o del tipo y a i s l a d a s (44,

I.-PATRONES DE R E S I S T E N C I A Y S U S C E P T I B I L I D A D A A N T I B I O T I C O S POR C E P A S D E AZOTOBACTER VINELANDII A I S L A D A S D E S U E L O S A L M A C E N A D O S POR D I F E R E N T E S P E R I O D O S A N T E S Y D E S P U E S DE LA E L I M I N A C I O N DEL P L A S M I D O

C u a n d o L a s cepas fueron s o m e t i das al t ratami en to a u n m c o de eliminación del A D N — p 1 á s m i d i c o (Tablas No. 12 y 13). s e e n c o n t r ó que la r e s i s t e n c i a de A. \>in& Icltuíí l c e p a s OLD-R , OLD-81, 0LD-B3, S - 6 , L - 2 a c 1 o r a n f e n icol d e s a p a r e e ió, lo m i s m o fué o b s e r v a d o en las c e p a s L — 2 a ácido n a l i d í x i c o , UW—AL a kanamicina, O L D - S a ri.fampicina y a m p i c i l i n a , O L D — B 3 y UW-AL a estreptomicina. L o que s u g i r i ó que e s t a capacidad d e r e s i s t e n c i a a a n t i b i ó t i c o s se o r i g i n ó en un factor R c o m p a r t i d o por las cepas a i s l a d a s d e s u e l o s a l m a c e n a d o s por 3 0

a ñ o s y las cepas de A. vin.Gla.-n.cLii. a i s l a d a s de los s u e l o s recién c o l e c t a d o s (34, 73). L o a n t e r i o r también s u g i r i ó q u e la información g e n é t i c a r e s p o n s a b l e de e s t a resistencia fué lo s u f i c i e n t e m e n t e e s t a b l e p a r a e x p r e s a r s e y t r a n s f e r i r s e e n t r e e s p e c i e s del mismo genero (253) o con o t r a s b a c t e r i a s s a p r o b i a s del suelo (S, 9, 97), ya que se h a r e p o r t a d o que la transferencia de g e n e s p u e d e s u c e d e r s e en los ecosistemas, suelo-agua-ai re en una m a y o r frecuenc ia de lo que s e supone (165, 2 0 2 , 261 ), e v i d e n c i a s e x p e r i m e n t a l e s han demostrado que existe un verdadero intercambio de ADN e n t r e especies d e bac ter i a s genét i camen te d i s t a n t e s y o b v i a m e n t e común e n t r e e s p e c i e s del m i s m o g é n e r o (237), e s p e c i a l m e n t e hoy, cuando la

J.- C A R A C T E R I S T I C A S 0 I N E R A L E S D E L O S P L A S M I D O S D E T E C T A D O S EN

C E P A S DE AZOTOBACTER VINELAMDII A S O C I A D A S A LA R E S I S T E N C I A A A N T I B I O T I C O S

L a s T a b l a s No. 14 y 15 muestran las c a r a c t e r í s t i c a s g e n e r a l e s de los p l á s m i d o s de las cepas d e A. -u i ne- L a.nd. i i

resistentes a a n t i b i ó t i c o s , a i s l a d a s de s u e l o s a l m a c e n a d o s por 3 0 a ñ o s y s u e l o s rec i én colec tados. En a m b a s s e muést ra aue s ó l o e n c o n t r ó un o l á s m i d o por cepa, c u y o peso m o l e c u l a r que? fluctúa e n t r e 2 0 a 5 2 MDa, en general con una d o b l e resistencia a o t r o s antibióticos. Parece s e r que el p l á s m i d o de la cepa OLD—81 sólo c o n t e n í a r e s i s t e n c i a p a r a cloranfen icol, como en las cepas D—1 y S — 6 lo tuvieron p a r a e s t r e p t o m i c i n a y gentamicina. L o a n t e r i o r s u g i e r e que la resistencia a a n t i b i ó t i c o s n o requiere d e u n a continua

inducción humana p a r a que b a c t e r i a s s a o r o b i a s c o m o A-s.otci'bcLC t&'c la desarrollen <94. 147, 233), s u g i e r e también que las p r o p i e d a d e s de p o s e e r y transferir f a c t o r e s R p u e d e ser natural e n t r e los m i c r o o r g a n i s m o s a u t ó c t o n o s , antes del uso g e n e r a l i z a d o de a n t i b i ó t i c o s en la v i d a del h o m b r e , lo que s i g n i f i c a que e s t a capacidad de r e s i s t e n c i a p l a s m í d i c a va s e p r e s e n t a b a en la n a t u r a l e z a gen-ética de los m i c r o o r g a n i s m o s <70, 7 1 , 83), evidencia d e ello son i n v e s t i g a c i o n e s en suelo y aoua a u e han d e m o s t r a d o q u e en a l g u n o s s i t i o s donde jamás s e han a p l i c a d o antibióticos, los m i c r o o r g a n i s m o s n a t i v o s poseen res istene ia c romosomal y / ó en o 1ásmi dos (8, 51, 81).

i

d e s u e l o s recién colectados. T a m b i é n se e s t a b l e c i ó que la proporción d e las c e p a s d e A vineLandi i q u e contenían un s o l o p l á s m i d o fué de 4 0 V. y 3 0 7. en relación al total de la poblac i ón d e A. virusIclti.<¿í i a i s l a d a de 1 os s u e l o s a l m a c e n a d o s por 3 0 a ñ o s y de los s u e l o s recién c o l e c t a d o s r e s p e c t i v a m e n t e ,

p ropore i ón reíat i vamente a1 ta c o m p a r a d a con invest i g a c i o n e s d e frecuencia d e plásmidos en o t r a s b a c t e r i a s d e suelo y acuáticas, en zonas con a l t a y b a j a incidencia en el uso d e a n t i b i ó t i c o s <22, 26, 91).

O t r o s trabajos señalan que las c é l u l a s b a c t e r i a n a s pueden p o s e e r plásmidos por p e r í o d o s de a l m a c e n a m i e n t o n o m a y o r e s a 2 a ñ o s y que e s t o s p l á s m i d o s pudieron m a n t e n e r alguna c a r a c t e r í s t i c a b i o l ó g i c a funcional p o r un tiempo m á x i m o de 2 a ñ o s (54, 55, 259), sin e m b a r g a e s t a s investigaciones n o aclaran el o los m e c a n i s m o s de p r e s e r v a c i ó n (criptobiosis) d e

los p l á s m i d o s en las b a c t e r i a s en c o n d i c i o n e s naturales, Aunaue sí establecen la posiblidad de que d u r a n t e p e r í o d o s en los c u a l e s el medio a m b i n e t e n o p e r m i t e el c r e c i m i e n t o microb i a n o , med i an te mod i f i cac iones de la f isi olog í a c e l u 1 a r el material e x t r a c r o m o s ó m i c o n o sea u t i l i z a d o como una fuente de c a r b o n o y energía (81, 184, 188), d e m a n e r a que al cultivar a r t i f i c i a l m e n t e en el laboratorio e s t a s c é l u l a s s o b r e v i v i e n t e s el o l á s m i d o pueda expresare a c o r d e con la inducción e s p e c í f i c a (62. 96). Con la posibilidad d e q u e e s t o s p l á s m i d o s tipo R sean t r a n s f e r i d o s e n t r e c é l u l a s b a c t e r i a n a s d e igual o d i f e r e n t e g é n e r o (195, 145, 204).

con a g e n t e s químicos, la resistencia d e la c e p a D—1 a estreptomicina se perdió, así c o m o la de la c e p a L — 2 al á c i d o n a l i d í x i c o y cloranfen icol, de igual forma la r e s i s t e n c i a d e la cepa UW-AL a k a n a m i c m a y e s t r e p t o m i c i n a , la c e p a S—6 la perd i ó a c1oran fen icol. S e e n c o n t r ó que 1a resi stenci a de las cepas d e A. t> i n.e la-ricti i a i s l a d a s de 1 o s suel os rec i é?n c o l e c t a d o s a c l o r a n f e n i c o l , kanamicina y e s t r e p t o m i c i n a fué coiT.par "c i d'a por las cepas d e A. yirtelaadn a i s l a d a s de los sue1os a l m a c e n a d o s oor 3 0 años, 1 o gue s u g i e r e que 1a información genética de r e s i s t e n c i a que se e n c u e n t r ó a s o c i a d a a los p l á s m i d o s de ambas c e p a s , fué e s t a b l e en las a z o t o b a c t e r i a s s o b r e v i v i e n t e s a i s l a d a s d e los s u e l o s a l m a c e n a d o s por 3 0 años, lo cual fué d e m o s t r a d o c u a n d o e s t a s b a c t e r i a s se probaron . e n c o n d i c i o n e s d e c u l t i v o artifical

(62, 2 3 9 , 259).

K.- P A T R O N E S D E R E S I S T E N C I A Y S U S C E P T I B I L I D A D A P E S T I C I D A S POR CEPAS D E AZOTOBACTER VINELANDII A I S L A D A S D E S U E L O S A L M A C E N A D O S POR D I F E R E N T E S P E R I D D O S

L a s T a b l a s No. 16 y 17 contienen d a t o s que muestran la resistencia y susceptibilidad a p e s t i c i d a s por c e p a s de A.

•>j\.n&la.ndi i a i s l a d a s de s u e l o s a l m a c e n a d o s por d i f e r e n t e s periodos. En general se o b s e r v a r o n d i f e r e n t e s r e s p u e s t a s d e

las c e p a s de 4. y i ne L arid i i a los pest ic idas, por e jemp lo: las cepas d e A. xj t. ne L andi 1 ai s 1 ad as d e sue los a 1 macen ad o s por 3 0 años fueron m á s suscept i b l e s al 2,4—D que 1as c e p a s a i s 1 a d a s

de los suelos recién c o l e c t a d o s , respuesta s e m e j a n t e s e d e t e c t ó para Diauat y K. Tea. L o a n t e r i o r s u g i e r e aue el con tac to de 1as aso fcobac teri as del sue1o con pest i c i das es m á s frecuente en la actualidad (16, 167) que lo fue h a c e 3 0 a ñ o s