Efecto de la temperatura y ph sobre la actividad y estabilidad de pectinasas producidas por bacillus spp”

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC I. Ó. Escuela Académico-Profesional de Microbiología y Parasitología. N. FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. FO. “EFECTO DE LA TEMPERATURA Y PH SOBRE LA ACTIVIDAD Y ESTABILIDAD. DE. IN. DE PECTINASAS PRODUCIDAS POR Bacillus spp”. EM AS. TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO DE:. SI. ST. BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO. DI. RE. CC. IO. N. DE. AUTOR: Br. Fantasía Oly Gasco Alvarez ASESOR: Dr. Marco Salazar Castillo TRUJILLO – PERÚ 2014. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC I. Ó. N. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. M UN. IC. Dr. Orlando Velásquez Benites. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. RECTOR. DE. IN. Dra. Vilma Julia Méndez Gil. Dr. Santiago Evaristo Uceda Castillo SECRETARIO GENERAL. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. VICE-RECTORA ACADÉMICA. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. AC I. Ó. Dr. José Mostacero León. A. Y. CO. M UN. IC. DECANO. RM. ÁT. IC. Dr. William Zelada Estraver. Dra. Bertha Soriano Bernilla. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. SECRETARIO. MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. DI. RE. CC. IO. N. DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. PRESENTACIÓN. AC I. Ó. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:. M UN. IC. En cumplimiento con las disposiciones vigentes establecidas en el Reglamento de Grados y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, someto a. CO. vuestra consideración y elevado criterio la presente tesis titulada: “Efecto de la. A. Y. temperatura y pH sobre la actividad y estabilidad de pectinasas producidas por. ÁT. IC. Bacillus spp”, con el propósito de obtener el Título Profesional de Biólogo-. Trujillo, Abril del 2014.. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. Microbiólogo.. CC. IO. N. _________________________. DI. RE. Br. Fantasía Oly Gasco Alvarez. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. M UN. IC. AC I. Ó. N. MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR. Y. MSc. Julio Arellano Barragán. CO. __________________________________. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. PRESIDENTE. EM AS. __________________________________. SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. Dr. Steban Ilich Zerpa. __________________________________ Dr. Marco Salazar Castillo VOCAL v. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran. Ó. N. que la presente tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentos. Y. CO. M UN. IC. AC I. teóricos, siendo aprobada por UNANIMIDAD.. IC. A. __________________________________. ÁT. Ms. C. Julio Arellano Barragán. EM AS. DE. IN. FO. RM. PRESIDENTE. __________________________________. SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. Dr. Steban Ilich Zerpa. __________________________________ Dr. Marco Salazar Castillo VOCAL. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEL ASESOR. N. El que suscribe, profesor asesor de la tesis titulada: “Efecto de la. AC I. Ó. temperatura y pH sobre la actividad y estabilidad de pectinasas producidas. IC. por Bacillus spp”. M UN. CERTIFICA:. CO. Que la presente investigación ha sido desarrollada de conformidad con su. A. Y. correspondiente proyecto y teniendo en cuenta las orientaciones pertinentes al. ÁT. IC. tesista.. RM. En cuanto al informe, éste ha sido redactado bajo mi asesoramiento de. FO. acuerdo al formato establecido en la Facultad de Ciencias Biológicas y acogiendo. DE. IN. las observaciones y sugerencias alcanzadas.. EM AS. Por ello, autorizo al Bachiller Fantasía Oly Gasco Alvarez, continuar con. __________________________________. CC. IO. N. DE. SI. ST. los trámites correspondientes según sus fines.. RE. Dr. Marco Salazar Castillo. DI. ASESOR. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC I. Ó. N. DEDICATORIA. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. mi vida.. M UN. en cada objetivo planteado en. IC. A DIOS por guiar mis pasos. FO. A mis padres, HUGO y DORYS por su apoyo y. IN. confianza en mí hasta el último momento, que sin sus. A mi hermano BRAYO y amiga MARILIA. quienes. supieron. ayudarme a superar los obstáculos.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. LOS AMO.. DE. consejos no sería lo que ahora pude lograr GRACIAS,. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTOS Un cordial agradecimiento a mi asesor de tesis Dr. Marco Salazar Castillo, por ser. Ó. N. un gran soporte en la realización de esta investigación, por sus sabios consejos,. AC I. por su paciencia, porque con su gran experiencia profesional supo encaminar la. M UN. IC. realización de este trabajo.. CO. A los miembros del jurado, el Ms. C. Julio Arellano Barragán y al Dr. Steban Ilich. A. Y. Zerpa quienes con su amplia experiencia ayudaron a encaminar esta. RM. ÁT. IC. investigación.. IN. FO. Al Laboratorio de Tecnología Enzimática y Productos Naturales, Departamento de. DE. Química Biológica y Fisiología Animal de la Facultad de Ciencias Biológicas, en. EM AS. especial al Mblgo. Doris Asmat Puente, Blgo. Melchora Veneros Cruzalegui y Blgo. Marino Olivares De La Cruz por el apoyo con el material, reactivos y equipos. DE. SI. ST. necesarios para la realización de este trabajo.. N. A mi amiga Mblgo. Rubi Bernal Sepúlveda por su valiosa colaboración en la. DI. RE. CC. IO. ejecución de la presente tesis.. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN Se aisló y seleccionó cultivos puros de Bacillus spp productores de pectinasas. Para ello. Ó. N. se sembró muestras de tierra de cultivo de papa y naranja en medio agar nutritivo con. AC I. sales y pectina como sustrato, se incubó y se realizó la lectura agregando alícuotas de. IC. una solución de lugol y aquellos cultivos que presentaban mayor halo de hidrólisis de. M UN. pectina fueron seleccionados. Estos cultivos se sembraron en medio líquido nutritivo más. CO. sales y pectina y se incubaron por 24 – 48 horas; luego se centrifugaron y se obtuvo el. Y. sobrenadante denominado extracto crudo de pectinasa (ECP), el c ual sirvió para realizar Se. IC. A. los ensayos de actividad y estabilidad del ECP a pHs y temperaturas variables.. ÁT. encontró que el pH y temperatura de máxima actividad del ECP está alrededor de 6,5 y. RM. 35°C respectivamente. El ECP es estable a pH 6,5 y 8,5 a 35°C p or 120 minutos, lo. FO. mismo es cierto a temperatura de 50°C hasta 120 minutos y pierde su estabilidad a 70°C. DE. IN. a los 120 minutos.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. Palabras clave: Bacillus, pectinasas, pH, temperatura, actividad y estabilidad.. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT Pure cultures of Bacillus spp pectinases producers were isolated and selected from soil. N. samples of potato and orange crops using nutritive agar containing salts and pectin as. AC I. Ó. substrate. It was incubated and then reading adding aliquots of lugol solution. The cultures. IC. that presented the higher halo of hydrolysis of pectin were selected. These cultures were. M UN. grown in liquid nutrient medium enriched with more salts and pectin incubated for 24-48 hours. After that, it was obtained the supernatant named crude extract pectinase (ECP) by. CO. centrifugation, which served for the next tests of temperature and pH activity and stability.. A. Y. It was found that the maximum activity of ECP for pH and temperature was about 6.5 and. IC. 35°C respectively. The ECP is stable at pH 6.5 and 8.5 and 35°C up to 120 mi nutes of. RM. ÁT. exposure; the same happen at 50°C up to 120 minutes and it loses its thermostability at. FO. 70°C up to 120 min.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. Keywords: Bacillus, pectinases, pH, temperature, activity and stability.. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ÍNDICE Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo ................................... ii. Ó. AC I. Miembros del Jurado Dictaminador ........................................................ iv. N. Autoridades de la Facultad de Ciencias Biológicas .................................. iii. M UN. IC. Del Asesor .............................................................................................v. Aprobación ........................................................................................... vi. CO. Presentación......................................................................................... vii. A. Y. Dedicatoria ...........................................................................................viii. IC. Agradecimiento ..................................................................................... ix. RM. ÁT. Resumen ..............................................................................................x. FO. Abstract ................................................................................................ xi. IN. Índice ................................................................................................... xii. DE. Introducción ...........................................................................................1. EM AS. Metodología ........................................................................................ .11 Material y método..................................................................................11. ST. 1. Material ...........................................................................................11. DE. SI. 1.1. Material biológico ......................................................................11. N. 2. Método ............................................................................................11. CC. IO. 2.1. Obtención de pectinas cítricas ....................................................11. RE. 2.1.1. Preparación de la materia prima..........................................11. DI. 2.1.2. Inactivación de enzimas pécticas ........................................11 2.1.3. Extracción ácida ................................................................11 2.1.4. Filtración de los residuos y precipitación ..............................12. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.1.5. Secado..............................................................................12. Ó. 2.3. Medio para la producción de pectinasas......................................13. N. 2.2. Aislamiento de Bacillus spp productor de pectinasas ...................12. AC I. 2.4. Producción de pectinasas ..........................................................13. IC. 2.5. Obtención de los extractos crudos enzimáticos............................13. M UN. 2.6. Determinación de actividad enzimática en los ECP ......................14. CO. 2.7. El pH y la pectinasa de Bacillus spp (ECP)..................................14. Y. 2.7.1. Efecto del pH sobre la actividad del ECP ............................14. IC. A. 2.7.2. Estabilidad del ECP a diferentes pH en el tiempo ................14. ÁT. 2.8. La temperatura y la pectinasa de Bacillus spp (ECP) ...................15. FO. RM. 2.8.1. Efecto de la temperatura sobre la actividad del ECP ............15. IN. 2.8.2. Estabilidad del ECP a diferentes temperaturas en el tiempo .15. DE. Resultados ......................................................................................16. EM AS. Discusión.........................................................................................21 Conclusiones ...................................................................................24. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. Referencias bibliográficas .................................................................25. xiii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC I. Ó. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN Las pectinas son mezclas complejas de polisacáridos que pueden llegar a constituir un. Ó. N. tercio del peso seco de la pared celular de las dicotiledóneas y algunas plantas. AC I. monocotiledóneas 1,2 . Las mayores concentraciones de pectina se han encontrado en la lámina media, con una disminución gradual en su abundancia hacia la membrana. M UN. IC. plasmática3 . Las pectinas tienen función lubricante y cementante en la pared celular d e las plantas superiores. También están involucradas en la textura y maduración de los frutos, en el crecimiento de los vegetales y en la interacción entre las plantas huésped y sus. Y. CO. patógenos.. A. La palabra pectina viene del nombre griego que significa solidificado o coagulado. En. IC. 1790 Vauquelin descubrió la pectina como una sustancia soluble presente en los zumos. ÁT. de fruta, pero no fue hasta el 1824 cuando Braconnot, quien continuó el trabajo de. RM. Vauquelin, llamó a esta sustancia ácido péctico, ya que tenía propiedades gelificantes. FO. cuando se le añadía ácido a la solución. En 1924 Smolenski fue el primero en identificar al. IN. ácido poligalacturónico como componente de la pectina. En 1944 el Comité para la Revisión de la Nomenclatura de Sustancias Pécticas estableci ó la definición para las. DE. pectinas 4, pero desde entonces la terminología ha ido cambiando y se han ido utilizando. EM AS. definiciones modificadas. Actualmente se consideran pectinas los polisacáridos ácidos complejos de naturaleza coloidal que contienen un esqueleto de residuos de ácido. ST. galacturónico.. SI. Atendiendo al tipo de modificación que sufre la cadena principal o esqueleto de la. DE. molécula, el término genérico pectina puede aplicarse a: Protopectinas, ácido pectico,. N. ácido pectinico y pectina5. La protopectina es insoluble en agua, mientras las otras tres. CC. IO. sustancias son totalmente o parcialmente solubles en agua 6 .. RE. La protopectina es una matriz de sustancia péctica que por hidrólisis da lugar a la pectina. DI. o al ácido pectínico. Protopectina es el término utilizado para describir las sustancias pécticas insolubles en agua encontradas en los tejidos vegetales y de las cuales se forman las sustancias pécticas solubles 7.. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Los ácidos pécticos son galacturonanos que no contienen grupos metilos. También pueden denominarse ácido poligalacturónico. A las sales de los ácidos pécticos se les. N. llama pectatos o poligalacturonatos.. AC I. Ó. Los ácidos pectínicos son galacturonanos con cantidades variables de grupos metilos. esterificados con los grupos carboxilos del C-6. A las sales de los ácidos pectínicos, se les. IC. llama pectinatos. Estas sustancias tienen la propiedad de formar geles con azúcares, con. M UN. ácidos y, si el contenido de metilos es bajo, con otros componentes como sales de calcio 8 .. CO. La pectina es una mezcla amplia de sustancias pécticas de diferente composición que contiene como componente principal ácido pectínico. La pectina en forma nativa se. A. Y. encuentra localizada en la pared celular y puede estar entrecruzada con otros. ÁT. IC. polisacáridos estructurales y proteínas para formar protopectina insoluble.. RM. El componente más abundante de las pectinas es el ácido galacturónico, que forma el. FO. esqueleto principal de la molécula consistente en una cadena de residuos de ácido D-galacturónico unidos mediante enlaces α(1→4) (Figura 1). Estos residuos pueden estar. IN. parcialmente metilados, esterificados en el C-6 con alcohol metílico, siendo el grado de. DE. metilación variable según el origen de la pectina. La pectina también contiene con. EM AS. frecuencia residuos de ramnosa, arabinosa y galactosa. Generalmente la ramnosa form a parte de la cadena principal, mientras que la arabinosa y la galactosa se encuentran en. ST. las cadenas laterales unidas a la cadena principal formando ramificaciones 9.. SI. Las pectinas son heteropolisacáridos complejos que contienen dos regiones definidas 10,11 .. DE. La región lisa o homogalacturonano consiste en un esqueleto de residuos de ácido D galacturónico unidos mediante enlaces α(1→4), los cuales pueden estar acetilados en el. IO. N. C-2 o en el C-3, o metilados en el C-6. La región rugosa o ramnogalacturonano I es un. CC. heteropolímero en el que los residuos de ácido D-galacturónico del esqueleto están interrumpidos por residuos de L-ramnosa unidos por enlaces α(1→2), a los cuales pueden. RE. unirse largas cadenas de arabinano y galactano mediante el C-412 (Figura 2). El. DI. ramnogalacturonano II es un polisacárido de 30 unidades que contiene un esqueleto de ácido galacturónico, sustituido por 4 cadenas laterales que contienen ramnosa, arabinosa y azúcares poco comunes como apiosa y metilfucosa11 . Se desconoce si el. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ramnogalacturonano II está unido covalentemente a la cadena principal de pectina. CO. M UN. IC. AC I. Ó. N. (Figuras 1 y 2).. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. Figura 1. Estructura de la molécula de pectina. Se representa una cadena de ácido poligalacturónico parcialmente metilesterificado.. Figura 2. Estructura esquemática de la pectina. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las pectinas se dividen en tres grupos según sus propiedades de gelificación asociadas con el grado de esterificación metílica: pectinas con alto índice de metoxilo (PAIM) , bajo índice de metoxilo (PBIM) y pectinas amídicas con bajo índice de metoxilo. N. PAmBIM). Las PAIM contienen más de un 50% de unidades del ácido poligalacturónico. AC I. Ó. esterificadas y por tanto no reaccionan con iones calcio. El poder de gelificación depende, entre otros, del contenido de ácido, del tipo de pectina y de la cantidad de sólidos. IC. solubles, que generalmente es más del 55%. Estas pectinas reaccionan con la caseína y. M UN. sirven para estabilizar bebidas fabricadas a partir de leche ácida. Este tipo de pectinas es. CO. el que se encuentra en la cáscara de la naranja13.. Las PBIM son las que tienen menos del 50% de unidades esterificadas del ácido. A. Y. poligalacturónico y por lo tanto forman geles no sólo con sólidos solubles que contienen. IC. iones calcio sino también con azúcares y otros ácidos. En este caso el poder de. ÁT. gelificación también depende del pH y de la concentración de iones calcio, lo cual influye. RM. en la textura de la gelatina formada. Las PAmBIM son aquellas que han sido desmetiladas. FO. con amoníaco en lugar de usar ácidos. Cuando se hace el proceso de desmetilización, una parte de los grupos éster se reemplaza por grupos amida, lo cual modifica las. IN. propiedades de gelificación de la pectina. Estas requieren pequeñas cantidades de iones. EM AS. DE. calcio para el proceso de gelificación13,14 .. En cuanto a su origen, las pectinas se obtienen de materiales vegetales tales como manzanas, frutas cítricas, piña, guayaba dulce, tomate de árbol, maracuyá y remolacha . Según el tratamiento que se haga a las materias primas se obtienen diferentes. ST. 155. SI. calidades de pectinas, de acuerdo con las necesidades de los productos terminados.. DE. Estas pectinas son, en la actualidad, ingredientes muy importantes en la industria de los. IO. N. alimentos, para hacer gelatinas, helados, salsas, queso 13.. CC. Tradicionalmente las pectinas se utilizan en la industria alimentaria como agentes gelificantes y espesantes. Suelen ser componentes habituales de productos alimentarios. RE. como mermeladas, jaleas, productos lácteos y también en productos cosméticos como. DI. geles y pastas. Actualmente las pectinas también se utilizan como fibras nutricionales y para la producción de proteína unicelular 15,16,17 . Recientemente, se ha incrementado su. utilización tanto como fuente de energía, como de materia prima para procesos industriales 11. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las pectinas se utilizan también en el sector farmacéutico como agentes detoxificantes, siendo conocidas por sus efectos antidiarréicos. La pectina en forma de carbohidrato. N. coloidal actúa como lubricante en los intestinos al recubrir la mucosa con polisacáridos y. AC I. Ó. promover el peristaltismo sin causar irritación, siendo adecuada como aditivo en la comida de bebés. La pectina reduce la toxicidad de algunos fármacos y prolonga su actividad sin. IC. disminuir los efectos terapéuticos. Los microglóbulos de pectina gelatinizada pueden. M UN. también utilizarse en quimioterapia de cánceres localizados como sistema de liberación. CO. intravascular de fármacos 18.. La presencia de estas sustancias pécticas en el zumo de frutas, origina importantes. A. Y. problemas en su procesamiento industrial. Ello se debe a que, por su escasa solubilidad,. IC. retienen el jugo espesándolo y disminuyendo el rendimiento de la extracción 19,20 . En la. ÁT. degradación de pectinas, las industrias dedicadas al procesamiento de jugos de frutas. RM. utilizan un sistema pectinolítico compuesto por varias enzimas distribuidas en tres grupos. FO. principalmente: pectinesterasas las cuales catalizan la desesterificación de los grupos metoxilo, pectina despolimerasas que rompen los enlaces α-1-4 glucosídicos por (polimetilgalacturonasas. y. poligalacturonasas). IN. hidrólisis. y. transeliminación. DE. (pectintranseliminasa y ácido poligalacturónico transeliminasa), reacciones que catalizan. EM AS. el rompimiento de la molécula14,21,22 .. Las pectinas son degradadas por enzimas pectinolíticos, pectinasas, los cuales presentan. ST. gran diversidad, debida en parte a la compleja naturaleza del sustrato degradado. Las. DE. SI. plantas y los microorganismos son los principales productores de estos enzimas 23 . Las pectinasas se clasifican en tres tipos principales: enzimas deses terificantes enzimas. despolimerizantes. (hidrolasas. y. liasas). (Tabla. 1). y. IO. N. (pectinesterasas),. DI. RE. CC. protopectinasas 8,17 .. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 1. Clasificación de los enzimas pectinolíticos y su nombre de acuerdo con la. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC I. Ó. N. Comisión de Enzimas (EC) (Recomendaciones de la IUPAC-IUB).. DE. Las pectinesterasas (Pectina pectilhidrolasa, 3.1.1.11) (Tabla 1), también conocidas como. EM AS. pectina metil esterasas, catalizan la desesterificación de los grupos metilo de la pectina dando lugar a ácido poligalacturónico o pectato 8. Su actividad se puededeterminar midiendo la liberación de metanol. Son sintetizadas por hongos, bacterias, levaduras y. ST. plantas superiores 17 . Las pectinesterasas de levaduras son activas a pH entre 3 y 5, y las 24. .. DE. SI. bacterianas entre 7 y 8. Estos enzimas se inactivan por calent amiento a 80ºC. N. Las enzimas despolimerizantes o despolimerasas (Tabla 1) se clasifican atendiendo a tres. IO. aspectos, que se refieren al modo de ataque al esqueleto de ácido poligalacturónico.. CC. Estos aspectos siguen los siguientes criterios: a) el mecanis mo químico de ruptura de los. RE. enlaces: hidrólisis o transeliminación; b) la naturaleza del sustrato preferido: pectina o ácido poligalacturónico; c) el modo de corte del polímero: endo o exo 8,17 .. DI. Los enzimas despolimerizantes pueden romper los enlaces α(1-4) glucosídicos entre los monómeros de ácido galacturónico de las pectinas por hidrólisis (hidrolasas) o por transeliminación (liasas).. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las hidrolasas rompen los enlaces entre los monómeros de ácido galacturónico por adición de agua. Son activas a pH ácido y pueden ser inhibidas por el ión calcio25 . Se. N. pueden dividir en dos grupos principales atendiendo al sustrato que hidrolizan:. AC I. Ó. Las poligalacturonasas o pectato hidrolasas degradan la pectina desmetilada, es decir, el ácido poligalacturónico o pectato. Pueden tener modo de acción endo o exo. Las. IC. endopoligalacturonasas (poli 1,4-α-D-galacturónido glucanohidrolasa, EC 3.2.1.15) están. M UN. ampliamente distribuidas y producidas por una gran variedad de organismos como bacterias, hongos, levaduras, plantas superiores y nemátodos parásitos de plantas 26 . Las. CO. exopoligalacturonasas (poli 1,4-α-D-galacturónido galacturonohidrolasa, EC 3.2.1.67; o poli 1,4-α-D-galacturónido digalacturonohidrolasa, EC 3.2.1.82) son producidas por bacterias. y. plantas. superiores 27 .. Y. algunas. Generalmente. las. A. hongos,. IC. exopoligalacturonasas de hongos y plantas liberan ácido galacturónico, mientras que las. ÁT. bacterianas liberan ácido digalacturónico26, aunque existe poca información sobre. FO. RM. exopoligalacturonasas de bacterias Gram positivas 27.. Las polimetilgalacturonasas o pectina hidrolasas degradan el polímero metilado, la. IN. pectina. Aunque hay algunos artículos que describen este tipo de actividad catalítica, la. DE. existencia de estos enzimas parece ser cuestionada ya que es posible que preparaciones. EM AS. de poligalacturonasas contaminadas con pectinesterasas, hayan sido consideradas por error como preparaciones de polimetilgalacturonasas 17 . Sin embargo, recientemente se han descrito algunas poligalacturonasas que degradan las zonas no esterificadas de la. SI. ST. pectina, hecho que apuntaríaa la existencia de auténticas pectina hidrolasas 28 .. DE. Las liasas, también llamadas transeliminasas, rompen los enlaces glucosídicos por β eliminación. Según el sustrato sobre el que actúen sea pectina o ácido poligalacturónico. CC. IO. N. se clasifican en polimetilgalacturonato liasas o poligalacturonato liasas, respectivamente 28 . Las polime tilgalacturonato liasas o pectina liasas (polimetoxigalacturónido liasa, EC. RE. 4.2.2.10) fueron descubiertas por Albersheim en 1960. Todas las descritas hasta la fecha. DI. actúan de forma endo17. Son sintetizadas mayoritariamente por hongos, aunque también. se han identificado en algunas bacterias, tales como Er winia y Pseudomonas 28.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las poligalacturonato liasas o pectato liasas (poli 1,4-α-D-galacturónido liasa, EC 4.2.2.2; o poli 1,4-α-D-galacturónido exoliasa, EC4.2.2.9) fueron descritas por primera vez por Starr y Moran (1962) en cultivos de Erwinia carotovora. Están ampliamente. N. distribuidas entre los microorganismos patógenos de plantas y son el objeto de diferentes. AC I. Ó. estudios debido a su posible papel como factores de virulencia. También se han. encontrado en numerosos microorganismos saprófitos, inc luyendo los géneros Bacillus,. IC. Pseudomonas, Clostridium, Amycolata y en algunas bacterias termófilas. Estos enzimas. M UN. actúan a pH alcalino, entre 8 y 10, pueden tener modo de acción endo o exo, y requieren. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. iones calcio para la actividad enzimática26 .. DI. Figura 3. Esquema de la acción enzimática de las pectinasas. PMGE: polimetilgalacturonato. esterasa (pectinesterasa); PMGL: polimetilgalacturonato liasa (pectina liasa); PMG: polimetilgalacturonasa (pectina hidrolasa); PGL: poligalacturonato liasa (pectato liasa ); PG: poligalacturonasa (pectato hidrolasa).. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. El género Bacillus produce diferentes enzimas pectinolíticos, que se encuentran distribuidos entre todas las familias enzimáticas citadas anteriormente menos en las familias PL2 y PL4. Es de destacar que la ma yoría de los enzimas identificados hasta el. N. momento en este género son pectato liasas,únicamente uno de ellos es pectina liasa y. AC I. Ó. otro tiene actividad hidrolasa29 .. IC. Las liasas de la familia PL1 son las más numerosas y presentan pesos moleculares entre. M UN. 30 y 50 kDa. A esta familia pertenece la única pectina liasa descrita hasta la fecha. La familia PL3 contiene pectato liasas de pequeño peso molecular, entre 20 y 25 kDa. La. CO. familia PL9 contiene dos pectato liasas que presentan un tamaño molecular superior a 72 kDa . Por último, la familia PL10 contiene pectato liasas con peso molecular entre 35 y. ÁT. IC. que pertenece a la familia 28 de las glucosil hidrolasas 29 .. A. Y. 140 kDa. La única hidrolasa identificada hasta la fecha es la poligalacturonasa Peh358,. RM. Las pectinasas se emplean en muchos procesos industriales, como por ejemplo la. FO. extracción, clarificación y reducción de viscosidad en jugos de frutas, extracción de aceites de vegetales y cítricos, fermentación de café y té, entre otras numerosas. DE. IN. aplicaciones industriales 8,22,30 .. EM AS. La inhibición y estabilidad enzimática son consideradas la mayor consternación en el desarrollo de procesos biotecnológicos. La estabilidad enzimática está influenciada por ambos parámetros físicos (pH y temperatura) y parámetros químicos (inhibidores y. ST. activadores). La hidrólisis enzimática de las sustancias pécticas también depende de. SI. varios factores fisicoquímicos. Depende del tiempo de contacto, concentración de enzima,. DE. temperatura de incubación y pH. El efecto de la temperatura fue estudiado entre 0°C y. IO. N. 90°C así como un pH óptimo de 4 – 1130.. CC. Se han desarrollado estudios sobre la producción de enzimas pécticas, utilizando la fermentación en medio sólido, sobre diferentes substratos: bagazo de caña de azúcar;. RE. salvado de trigo. Sin embargo, pocos estudios han sido efectuados sobre la influencia de. DI. la composición del medio, en cultivo sobre soporte sólido. La composición del medio de cultivo es un factor importante en la inducción de pectinasas ya que influye sobre la diversidad y la cantidad de dichas enzimas pécticas 31.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Existe una preocupación creciente por los efectos de la contaminación ambiental, por ello la presión pública ha influido tanto en la industria como en los gobiernos para su. AC I. Ó. eficiencia catalítica, su uso no daña el ambiente y su alta rentabilidad económica 29 .. N. disminución. Las enzimas microbianas presentan aplicación industrial debido a su elevada. Por lo tanto, siendo el Perú un país que ha crecido considerablemente en la agroindustria. IC. conviene desarrollar un proceso orientado al aprovechamiento integral de recursos. M UN. provenientes este sector, además evitar la contaminación ambiental, por los residuos provenientes de estas actividades. Uno de estos residuos, sería el albedo de naranja que. CO. por su volumen resulta atractivo para la producción industrial de enzimas pécticas, por lo que, en el presente trabajo de investigación, se estudiaron algunos parámetros cinéticos a. A. Y. nivel de laboratorio, para la producción de pectinasas por Bacillus spp32 . Para lo cual se. IC. planteó estudiar c uál es el efecto de la temperatura y pH sobre la actividad y estabilidad. ÁT. de la pectinasa producida por Bacillus spp aislados de suelos de tierra de cultivos. Siendo. RM. una posibilidad que a medida que se incrementa la temperatura y el pH, aumenta la. FO. actividad de la pectinasa hasta un punto donde ésta empieza a disminuir del mismo modo a medida que se incrementa la temperatura la estabilidad de la pectinasa disminuye en. DE. IN. función del tiempo.. EM AS. Objetivos: . Seleccionar cultivos de Bacillus spp productores de pectinasas.. . Determinar el efecto del pH y temperatura sobre la actividad y estabilidad de la. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. pectinasa de Bacillus spp.. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y MÉTODO. N. 1. Material. AC I. Ó. 1.1. Material Biológico. IC. Pectinasas producidas por Bacillus spp aislados a partir de muestras de suelo. M UN. agrícola de papa y naranja.. CO. 2. Método. A. Y. 2.1. Obtención de pectinas cítricas. IC. 2.1.1. Preparación de la materia prima. ÁT. Se empleó el albedo (mesocarpio) del fruto de naranja, residuo sólido. RM. producido por la venta artesanal del jugo de naranja; en estado fresco o. FO. congelado el mismo día de su colección con el fin de evitar el crecimiento. IN. de bacterias u otras formas vivientes que descompongan el producto. Se. EM AS. pectinas 33 .. DE. cortó en trozos pequeños lo que constituye la materia prima para aislar. ST. 2.1.2. Inactivación de enzimas pécticas. SI. Se inactivó las enzimas pécticas, colocando la materia prima en estufa a. N. DE. 98°C por 10 minutos 34.. DI. RE. CC. IO. 2.1.3. Extracción ácida 100g de materia prima inactivada fue suspendida en 600mL de agua destilada y a ésta se le agregó HCl 1N hasta obtener un pH entre 1.5 y 3. Luego se calentó a 70°C por 70 minutos 35 .. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.1.4. Filtración de los residuos y precipitación. Se filtró la suspensión anterior y el filtrado obtenido se enfrió a temperatura ambiente (25°C) y luego se precipitó con etanol al 60% (v/v), con respecto. AC I. Ó. N. al volumen de dicho filtrado34,35 .. IC. 2.1.5. Secado. M UN. El proceso de secado del extracto cr udo de pectina se realizó a 70°C en. CO. estufa y luego fue pulverizado34,35 .. Y. 2.2. Aislamiento de Bacillus spp productor de pectinasas.. IC. A. Se colectó muestras de suelo con un peso aproximado de 100 g procedentes de. ÁT. cultivos de papa del distrito de Otuzco y de cultivos de naranja del distrito Virú, las. RM. que fueron colocadas en bolsas plásticas de poliestireno (de primer uso) 36 . Se. FO. trasladaron al laboratorio de Tecnología enzimática y Productos naturales,. DE. IN. Departamento de Química Biológica y Fisiología Animal – Facultad de Ciencias. EM AS. Biológicas – Universidad Nacional de Trujillo – Perú.. El aislamiento Bacillus spp productor de pectinasas se llevó a cabo en medio. SI. ST. sólido Agar nutritivo. Para ello se realizó una suspensión de 1 g de tierra en 100. previo tratamiento térmico en baño maría a 85°C durante 10 minutos. Luego, se. N. 6. DE. mL de agua destilada estéril (ADE), se agitó y realizó diluciones seriadas hasta 10 -. IO. sembró en superficie (0,1mL de la dilución tratada). Se incubó a 28°C hasta 72. DI. RE. CC. horas 36,37,38 .. Las colonias con características morfológicas de Bacillus fueron sembradas en tubos con agar nutritivo39 y se incubó durante 24 horas a 28°C para efectuar la prueba de la catalasa a fin de ubicarlas en el género Bacillus. Los aislamientos que 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. resultaron positivos a la catalasa se conservaron en frascos de agar nutritivo. N. inclinado a 4°C40,41 .. AC I. Ó. 2.3. Medio para la producción de pectinasas. IC. El medio conteniendo pectina como única fuente de carbono está caracterizado. M UN. por (g/1000mL de agua destilada): pectina cítrica, 2; extracto de levadura, 1; agar,. CO. 15; KH2PO4, 0,2; CaCl2, 0,05; (NH4)2SO4, 1; MgSO4 .7H2 O, 0,8; MnSO 4, 0,05; pH =. Y. 6,820 . Se autoclavó a 15 lb/ 20 minutos. Se realizó control de esterilidad durante 24. ÁT. IC. A. horas 14.. RM. 2.4. Producción de Pectinasas. FO. En los medios anteriormente mencionados se sembró por puntura los cultivos de. IN. Bacillus spp aislados. Se incubará a 30°C por 18-24h. Luego se añadió alícuotas. DE. de una solución de lugol y se observó la presencia o ausencia de halos de. EM AS. hidrólisis 19. Se seleccionó los cultivos que presentaron mayor halo de hidrólisis de la pectina es decir los cultivos que presentaron mayor relación diámetro de halo/. SI. ST. diámetro de colonia y mayor diámetro de colonia42.. N. DE. 2.5. Obtención de los extractos crudos enzimáticos. CC. IO. Se sembró los cultivos seleccionados previamente (inóculo al 5%) en caldo YEPD. RE. modificado (g/100 mL buffer cítrico-citrato, pH 3,5): pectina, 2,0; peptona de soja,. DI. 1,0; peptona de carne, 1,0; extracto de levadura, 1,0. Los cultivos se incubaron en agitación constante durante 24 - 48 horas a 30°C. Luego, se centrifugó a 5.000 rpm durante 15 min y el sobrenadante obtenido fue denominado extracto crudo de pectinasa (ECP)42 . 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.6. Determinación de actividad enzimática en los ECP. N. Se determinó la actividad enzimática midiendo la cantidad de sustrato residual,. AC I. Ó. para ello se utilizó 4,5 mL de solución de sustrato bufferado de pectina al 0,2% y. IC. 0,1 mL de ECP; se incubó a 31°C por 1 hora; luego se detuvo la reacción con 0,5. M UN. mL de solución de HCl 0,05N y 0,5 mL de solución Iodada. Se realizó la lectura. CO. después de 15 minutos de reposo a de 530 nm de absorbancia en Spectronic 20. Una unidad enzimática fue definida como la cantidad de enzima requerida para. A. Y. variar 0,01 de absorbancia por minuto bajo las condiciones d el ensayo, 31°C, pH. RM. ÁT. IC. 6,832,42 .. IN. FO. 2.7. El pH y la pectinasa de Bacillus spp (ECP).. 2.7.1. Efecto del pH sobre la actividad del ECP. DE. Se determ inó el pH de máxima actividad del extracto crudo de la pectinasa. EM AS. realizando medidas de dicha actividad a diferentes pH (3,5; 4,5; 5,5; 6,5;. SI. ST. 7,5; 8,5 y 9,5) utilizando diferentes sistemas buffers de incubación 42 .. DE. 2.7.2. Estabilidad del ECP a diferentes pH en el tie mpo Para ello se colocaron alícuotas del ECP en tubos de ensayo y se. minutos. Luego se determinó la actividad residual del ECP 42.. DI. RE. CC. IO. N. sometieron a la acción de diferentes pH (4,5; 6,5 y 8,5) por 60 y 120. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.8. La te mperatura y la pectinasa de Bacillus spp (ECP).. 2.8.1. Efecto de la te mperatura sobre la actividad del ECP.. Ó. N. Se determinó la temperatura de máxima actividad realizando medidas. AC I. actividad de extracto crudo de la pectinasa a diferentes temperaturas: 25,. M UN. IC. 30, 35, 40, 45, 50 y 55°C42.. 2.8.2. Estabilidad del ECP a diferentes temperaturas en el tie mpo. CO. Para ello se colocó alícuotas del ECP en tubos de ensayo y se incubó a. Y. 50, 70 y 90ºC durante 60 y 120 minutos 42 y luego se determinó la actividad. ÁT. IC. A. residual del ECP.. FO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. ensayos y cada uno por triplicado.. RM. Para garantizar los resultados y su reproducibilidad del presente trabajo, se realizó 5. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS En la tabla 2, se observa la selección primaria, en medio sólido, de los cultivos de Bacillus. Ó. N. spp aislados a partir de muestras de suelo de cultivos de papa y de naranja, los que. AC I. presentaron halos de hidrolisis de pectina que van desde 2 mm hasta 17 mm de diámetro,. IC. siendo Bsn12, Bsn15, Bsn8 y Bsn7 los que presentaron mayor hidrólisis (17, 15, 13 y 12. M UN. mm) los cuales fueron seleccionados para realizar la selección secundaria en medio. Y. CO. líquido.. Acción de pectinasa Halo (mm). FO. Bacillus aislado N° Código. RM. ÁT. IC. A. Tabla 2.- Selección primaria de cultivos de Bacillus spp aislados a partir de muestras de suelo de cultivos de papa y de naranja con capacidad de hidrolizar la pectina (acción de pectinasa) expresado en milímetros (mm).. Bsp1. 2. Bsp2. 7. Bsp3. 2. 4. Bsp4. 4. 5. Bsp5. 8. 6. Bsp6. 2. Bsn7. 12. 8. Bsn8. 13. 9. Bsn9. 10. 10. Bsn10. 5. 11. Bsn11. 2. 12. Bsn12. 17. 13. Bsn13. 2. 14. Bsn14. 14. 15. Bsn15. 15. ST. EM AS. 3. RE. CC. IO. N. DE. SI. 7. DI. 4. DE. IN. 1. Bsp : Bacillus aislado de suelo de cultivo de papa Bsn : Bacillus aislado de suelo de cultivo de naranja. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En la Figura 4, se muestran los halos de hidrólisis de la pectina por cultivos de Bacillus spp aislados a partir de muestras de suelo de tierra de cultivos de papa (a) y naranja (b). a. Ó. N. respectivamente, siendo el halo mayor de 17 mm de diámetro.. Y. CO. M UN. IC. AC I. b. RM. ÁT. IC. A. Figura 4. Halos de hidrólisis de la pectina por cultivos de Bacillus spp aislados a partir de muestras de suelo de tierra de cultivos de papa (a) y naranja (b) respectivamente .. FO. En la tabla 3, se observa la selección secundaria, en medio líquido, de los cultivos de. IN. Bacillus spp aislados y seleccionados por presentar mayor capacidad de hidrolizar la. DE. pectina en medio sólido, encontrándose que el cultivo Bsn15 presenta mayor hidrólisis de. EM AS. pectina (0,21 Absorbancia – Spectronic 20 a 530 nm); del sobrenadante “extracto crudo. ST. de pectinasa” de éste cultivo se realizaron los ensayos propuestos en este trabajo. Tabla 3. Selección secundaria de cultivos de Bacillus spp aislados a partir de muestras de. DE. SI. suelo de cultivos de naranja con capacidad de hidrolizar la pectina (acción de pectinasa) expresado en unidades (cambio 0,01 de Absorbancia).. DI. RE. CC. IO. N. Bacillus aislado N° Código. Unidad de pectinasa / mL ECP Unidades (cambio 0,01 de Absorbancia). 1. Bsn7. 20,0. 2. Bsn8. 20,8. 3. Bsn12. 26,6. 4. Bsn15. 36,6. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En la Figura 5, se observa el efecto del pH sobre la actividad del extracto crudo de pectinasa de Bacillus spp aislado a partir de muestras de suelo de cultivos de naranja,. N. que describe un perfil clásico campaniforme con una máxima actividad entre los pH 6,5 y. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC I. Ó. 8,5 decreciendo a medida que los pH son más distantes de estos valores.. EM AS. Figura 5: Efecto del pH sobre la actividad del extracto crudo de pectinasa (ECP). ST. La Figura 6, muestra la estabilidad al pH del extracto crudo de la pectinasa de Bacillus. SI. spp aislado a partir de muestras de suelo de cultivos de papa y de naranja, donde se. DE. observa que el ECP es estable a pH 6,5 por 120 minutos y a pH 8,5 es estable hasta los. IO. N. 60 minutos, ya que conserva una actividad residual relativa de 85,5% y luego disminuye a. DI. RE. CC. 76,0% cuando es expuesta hasta los 120 minutos.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Y. CO. M UN. IC. AC I. Ó. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RM. ÁT. IC. A. Figura 6: Estabilidad del extracto crudo de pectinasa (ECP) sometida a diferentes pHs durante 60 y 120 minutos de exposición.. FO. En la Figura 7, se observa el efecto de la temperatura sobre la actividad del extracto crudo. DE. IN. de pectinasa de Bacillus spp aislado a partir de muestras de suelo de cultivos de naranja, el que describe un perfil clásico campaniforme con una máxima actividad alrededor de los. EM AS. 120. ST. Actividad de ECP relativa (%). 35°C, decreciendo a medida que las temperaturas son más distantes de estos valores.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. 100. 80 60. 40 20 0 25. 30. 35. 40. 45. 50. 55. Temperatura (°C) Figura 7: Efecto de la temperatura sobre la actividad del extracto crudo de pectinasa (ECP). 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En la Figura 8 se observa el efecto de la temperatura sobre la estabilidad térmica del extracto crudo de la pectinasa de Bacillus spp aislado a partir de muestras de suelo de. N. cultivos de naranja, observándose la pérdida de la estabilidad térmica a partir de los 70°C. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC I. Ó. a los 120 minutos de exposición y no es termoestable a los 90°C.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. Figura 8: Termoestabilidad del extracto crudo de pectinasa (ECP) sometida a diferentes temperaturas durante 60 y 120 minutos de exposición. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSIÓN La importancia de las pectinasas se ha incrementado por su relevancia comercial en la. Ó. N. industria. El crecimiento de Bacillus spp en agar y caldo nutritivo suplementado con sales. AC I. y pectina al 0,2% evidenció a partir de las 48 horas un mayor desarrollo a pH 6,8 y a la. IC. temperatura de 31ºC (Tablas 2 y 3). Los valores del efecto de pH (óptimo 6,5) y de la. M UN. temperatura (35ºC) utilizados en el presente trabajo de investigación, corresponden a. CO. cultivos de Bacillus spp aislados de suelo de cultivo de naranja; sin embargo, se reporta. Y. para Bacillus (otra especie), sometido a otras condiciones de ensayo, un pH que oscila. ÁT. IC. A. entre 5,0 y 9,0 siendo el óptimo 7,2 43 .. RM. Por otro lado, cabe indicar que para la producción de pectinasa en medio líquido, la. FO. bibliografía reporta que para una mejor producción se necesita aireación y agitación, lo. DE. EM AS. de 300 rpm para la agitación 44.. IN. que permitiría un mayor crecimiento de especies de Bacillus (0.5 vvm para la aireación y. La producción de pectinasas por Bacillus en medio líquido (Tabla 3), se ha encontrado. ST. datos que la enzima alcanza su mayor rendimiento al final de la etapa logarítmica del. DE. SI. crecimiento microbiano, lo cual estaría a partir de las 72 horas (3 días) de incubación, dependiendo de la especie, hasta los 5 ó 7 días de incubación. 44. , motivo por el cual se ha. IO. N. obtenido muy poca cantidad de enzima de pectinasa ya que éstas son enzimas inducidas. RE. CC. lentamente por la presencia de sustancias pécticas.. DI. La disminución de la actividad de pectinasa, respecto al pH, podría atribuirse al pH de crecimiento del Bacillus y a su lenta capacidad de adaptación para la producción de la. enzima en los diferentes valores de pH trabajados (Figura 5). 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Respecto a la temperatura, se ha encontrado que la máxima temperatura de actividad de. .. Ó. 43. IC. AC I. donde manifiestan que ésta oscila entre los 25 y 40°C. N. la pectinasa está alrededor de 35°C (Figura 7), lo que concuerda con algunos autores. M UN. Se ha encontrado que la temperatura para la producción de pectinasa, depende de la especie de Bacillus. Por ejemplo la temperatura óptima entre 50 y 60°C permite obtener la. CO. enzima de las especies Bacillus spp, con B. stearothermophilus muestra alta actividad a. IC. A. Y. 60°C, mientras que B. cereus y B. subtilis presenta excelente actividad a 50°C 42.. RM. ÁT. El pH óptimo de la enzima poligalacturonasa ha sido probada usando buffer acetato para. FO. pH 2,5 – 4,5 obteniéndose una actividad pectinolítica máxima a un pH de 3,5 42. Las. IN. bacterias anaeróbicas productoras de pectinasas presentan un buen crecimiento a pH 7.0. DE. y una temperatura de 45°C. La máxima actividad poligalacturonasa fue de 4.7 U.I/mL. EM AS. hallada en un caldo de fermentación42 . En otra investigación, trabajaron sobre el efecto de las reacciones al variar valores de pH y temperatura de las preparaciones enzimáticas,. SI. ST. hallando valores óptimos de 4,5 y 50°C, respectivamente 45.. DE. Estudios respecto a la term oestabilidad de la pectinasa de ciertos Bacillus coinciden con. N. los obtenidos en el presente trabajo30. Esta enzima es estable a 45°C durante 120. CC. IO. minutos (2 horas), se reduce un poco a 50°C y a los 60°C casi se ha reducido al 50% su. RE. actividad residual y a los 70 y 80 °C ha perdido toda su actividad residual (Figura 8). DI. Es importante mencionar que la actividad de algunas pectinasas depende de la presencia del ión Ca2+, de la presencia de pectina en la composición del medio de cultivo es un. factor importante, ya que influye sobre la diversidad y cantidad de enzimas pécticas,. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. sabiendo además que la producción de enzimas pectinasas es inducible y no constitutivo30.. IC. AC I. Ó. una actividad máxima alrededor del pH 10.5 y a una temperatura entre 50 y 55°C 44.. N. La enzima de cepas de Bacillus spp que degradan el ácido de poligalacturonico presenta. M UN. Por los resultados obtenidos en la presente investigación, cabe indicar la importancia de monitorear las condiciones de trabajo para producir más y mejor pectinasa a partir de los. CO. Bacillus spp aislados, ya que en medio sólido muestran buena producción de la enzima y. A. Y. cuando se pasa al medio líquido se presentan problemas que aún no se han podido. IC. solucionar del todo, por lo que sería de suma importancia mejorar y/o optimizar las. RM. ÁT. condiciones de incubación (medio sumergido), el tipo y calidad de sustrat o (carbono y. FO. nitrógeno), la presencia y cantidad de ciertos activadores, el pH, la temperatura, el tiempo. IN. de incubación para la máxima producción de la enzima y algunos inhibidores que podrían. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. estar disminuyendo dicha producción de la enzima.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIONES En el presente trabajo bajo las condiciones experimentales de ensayo, se puede concluir. IC. Los Bacillus spp aislados de suelos de tierra de cultivo de papa y naranja. M UN. . AC I. Ó. N. lo siguiente:. presentan diferentes grados de hidrólisis pectinoilítica.. El perfil de actividad de la pectinasa de Bacillus spp respecto al pH es. CO. . A. La pectinasa de Bacillus spp es pH-estable a los pH 6,5 y 8,5 durante los 120. IC. . Y. campaniforme y la máxima actividad está alrededor de 6,5.. El perfil de actividad de la pectinasa de Bacillus spp, respecto a la temperatura es. RM. . ÁT. minutos de exposición.. IN. La pectinasa de Bacillus spp es termoestable hasta temperaturas menores e 50°C y a temperaturas superiores de 70°C pierde su capacidad. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. termoestable.. DE. iguales a. EM AS. . FO. campaniforme y la máxima actividad está a 35°C.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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