Desarrollo y validación del método analítico por espectrometria nir y calibracion multivariable para la cuantificación de captopril en tabletas 25mg”
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(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. Dando cumplimiento a las disposiciones establecidas en el reglamento de grados y títulos de la Escuela de Pre Grado de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, presento a vuestra consideración y elevado nivel de criterio profesional, el Informe de Prácticas Pre-Profesionales:. NIR. Y. MÉTODO. ANALÍTICO. A. DEL. IC. VALIDACIÓN. CALIBRACION. MULTIVARIABLE. PARA. POR LA. UI. ESPECTROMETRÍA. Y. M. “DESARROLLO. BI. O Q. CUANTIFICACIÓN DE CAPTOPRIL EN TABLETAS 25mg”. Y. Es propicia esta oportunidad para hacer extensivo mi más profundo sentimiento de. AC. IA. agradecimiento a mi Alma Mater y a toda la plana docente que lo conforma, por su. FA R. M. meritoria labor de educadores y por la formación profesional que nos han brindado a través de sus enseñanzas y experiencias. De manera muy especial agradezco la valiosa. Trujillo, Enero del 2012. BI. BL. IO TE. CA. DE. colaboración de los señores Miembros del Jurado.. SALDAÑA CALDERON LUIS ALBERTO. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. Dedico este trabajo a Dios y a mis padres. A Dios porque ha estado conmigo a cada paso que doy, cuidándome y dándome fortaleza para continuar, a mis padres, quienes a lo largo de mi vida han. A. velado por mi bienestar y educación siendo mi. M. IC. apoyo en todo momento. Depositando su entera. UI. confianza en cada reto que se me presentaba sin. O Q. dudar ni un solo momento de mi inteligencia y. Los amo con mi vida.. BI. BL. IO TE. CA. DE. FA R. M. AC. IA. Y. BI. capacidad. Es por ellos que soy lo que soy ahora.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTO. En primer lugar a Dios por haberme guiado por el camino de la felicidad hasta ahora; en segundo lugar a cada uno de los que son parte de mi familia empezando por mi HERMANO GEMELO Luis José Saldaña, con quién no. A. solo comparto la misma sangre sino los mismos genes que lo convierten en. M. IC. mi soporte en todo aspecto y en la expresión más noble de amor de hermano. UI. desde el vientre de nuestra madre hasta ahora, a mi PADRE Damián. O Q. Saldaña, a quién admiro con orgullo por su gran fortaleza física y espiritual. Y. BI. por no escatimar ni mermar su perseverancia para salir adelante ante. IA. cualquier dificultad y por el amor que siempre nos ha demostrado a mi. M. AC. hermano y a mi; a mi MADRE Mónica Calderón por su amor y sacrificio desde. FA R. el embarazo con la decisión de continuar a costa de peligrar su vida misma hasta nuestro desarrollo como jóvenes de bien, mi SEGUNDA MADRE mi tía. DE. y madrina Carmen Calderón, por su amor incondicional y apoyo en cada una. CA. de las etapas de mi vida hasta ahora, a mi ABUELA Lidia de las Casas por su. IO TE. cariño y sus consejos, a mis amados TÍOS Lucila Saldaña y Patrocinio. BL. Castañeda; quienes nos acogieron a mi hermano y a mi en su hogar en los. BI. momentos más difíciles, brindándonos todo el amor y calor de un hogar. maravilloso, a mi PRIMO José Castañeda por su paciencia e impaciencia para realizar todos los trámites y gestiones burocráticas con el fin de poder graduarme y titularme, y gracias a todos y cada una de las personas que colaboraron conmigo dándome su fuerza y apoyo incondicional que me han ayudado y llevado hasta donde estoy ahora.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. JURADO EVALUADOR. A. _________________________. AC. IA. Y. BI. O Q. UI. M. PRESIDENTE. IC. Dr. Gallardo Meléndez, Jesús. M. _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _. FA R. Ms. Curo Vallejos, Yuri. BI. BL. IO TE. CA. DE. MIEMBRO. _________________________ Dr. Alva Plasencia, Pedro MIEMBRO. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. Pág.. ABSTRACT .................................................................................................................. i. RESUMEN .................................................................................................................... ii. IC. A. LISTA DE ANEXOS………………………………………………………………….iii. UI. M. I. INTRODUCCIÓN..................................................................................................... 1. BI. O Q. II. OBJETIVOS ............................................................................................................ 10. IA. Y. III. MATERIAL Y MÉTODO..................................................................................... 11. M. AC. IV. RESULTADOS…………………………………………………………………...32. FA R. V. DISCUSION ............................................................................................................. 42. CA. DE. VI. CONCLUSIONES .................................................................................................. 52. IO TE. VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 53. BI. BL. VIII. ANEXOS .............................................................................................................. 60. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT The present study was conducted to develop and validate the analytical method by NIR spectrometry and Multivariable Calibration for quantification of Captopril 25 mg tablets. The developed method makes use of NIR spectroscopy (Near Infrared) associated with the Multivariable calibration technique based on PLS-1 (Partial Least Squares). In the construction of the model, synthetic tablets were prepared from a Doptimized experimental design with captopril concentration range from 80% -120%. IC A. larger than the tablets produced by Induquímica Laboratory. NIR spectra were recorded in the range of 4000-10000 cm-1 with a Perkin Elmer NIR spectrometer with Fourier. UI M. transform, with diffuse reflectance accessory for solids and Teflon as a blank. The. Q. reference method for the determination of captopril concentrations in the samples was. BI. O. based on the HPLC technology (high performance liquid chromatography). The new. Y. method NIR-PLS-1 developed is fast, accurate and it doesn’t consume reagents harmful. IA. to the environment. Its main and remarkable advantage is not to need the solubilization. AC. of samples which makes the control the content of captopril in all tablets possible,. RM. without destroying them, as it happens in an analysis by HPLC. This method was. FA. developed and validated based on some figures of merit of ASTM E1655 05 and. DE. American Pharmacopoeia USP 32, what allow it to be certified later by Induquímica Laboratory, which has shown interest to implement it in the process quality control. The. CA. method showed good performance and results comparable to the HPLC reference. TE. method according to USP, being the standard error of calibration and validation 0.57 mg. IO. and 0.68 mg, respectively. The linearity test showed a coefficient of determination r2 of. BI BL. 0.9753, all values obtained by the reference method were within their limits of estimation and the significance of the bias test yielded a value of 0.4166 t calculado, what indicates that the method provides the same results as the reference method. The method showed good accuracy, as it was assessed according to the repeatability of the system, repeatability of the method and intermediate precision, yielding a CV of 0.52%, 3.48% and 3.83% respectively, results conforming to their specifications. These validation parameters allow the analytical method developed for NIR spectroscopy and multivariate calibration as validated for the quantification of Captopril 25mg Tablets.. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN En el presente trabajo se realizó el desarrollo y la validación del método analítico por espectrometría NIR y calibración Multivariable para la cuantificación de Captopril en tabletas 25 mg. El método desarrollado hace uso de la espectrometría NIR (Infrarrojo Cercano) asociado con la técnica de calibración Multivariable basada en PLS-1 (mínimos cuadrados parciales). En la construcción del modelo se prepararon tabletas sintéticas a partir de una planificación de experimentos D-optimizada, con un rango de. IC A. concentración de captopril de 80%-120%, más amplia que las tabletas producidas por Laboratorios Induquímica. Los espectros NIR se registraron en el rango de 4000 a 10000. UI M. cm-1 con un espectrómetro NIR Perkin Elmer con Transformada de Fourier, con. Q. accesorio de reflectancia difusa para sólidos y teflón como blanco. El método de. BI. O. referencia para determinar las concentraciones de captopril en las muestras se basó en la. Y. tecnología de HPLC (Cromatografía líquida de alta performance). El nuevo método. IA. NIR-PLS-1 desarrollado es rápido, preciso y no consume reactivos perjudiciales para el. AC. medio ambiente. Su principal y notable ventaja es no necesitar la solubilización de las. RM. muestras lo cual facilita controlar el contenido de captopril en todas las tabletas posibles,. FA. sin destruirlas, como ocurre en un análisis por HPLC. Este método fue desarrollado y en algunas figuras de mérito de la norma ASTM E1655 05 y. DE. validado con base. Farmacopea Americana USP 32, lo que le permite ser certificada más tarde por. CA. Laboratorios Induquímica, que ha mostrado interés en implementarla en el control de. TE. calidad de procesos. El método demostró buen desempeño y resultados comparables con. IO. el método de referencia por HPLC según USP, siendo el error estándar de calibración y. BI BL. validación de 0.57 mg y 0.68 mg, respectivamente. El ensayo de linealidad presentó un coeficiente de determinación r2 de 0.9753, todos los valores obtenidos por el método de referencia estuvieron dentro de sus límites de estimación y para el test de significancia del sesgo se obtuvo un valor tcalculado de 0.4166 que nos indicó que el método brinda los mismos resultados que el método de referencia. El método mostró buena precisión, ya que fue evaluado en función de la repetibilidad del sistema, repetibilidad de método y precisión intermedia, obteniéndose un CV de 0.52%, 3.48% y 3.83%, respectivamente; resultados conformes a sus especificaciones. Los parámetros determinados permiten dar como validado al método analítico desarrollado por espectrometría NIR y Calibración Multivariable para la cuantificación de Captopril en Tabletas 25mg.. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. LISTA DE ANEXOS. ANEXO 1: Procedimiento de Manufactura de Captopril 25mg Tabletas. ANEXO 2: Resultados de desarrollo y Validación del Método por Espectrometría NIR y Calibración Multivariable PLS-1. ANEXO 3: Fórmula Cualitativa-Cuantitativa de Captopril 25mg Tabletas.. IC A. ANEXO 4: Técnica Analítica de Captopril 25mg tabletas.. UI M. ANEXO 5: Instrucción de desarrollo y validación de técnica NIR implementada en. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. Laboratorios Induquímica.. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCIÓN. La problemática de un laboratorio de control en la industria farmacéutica es muy compleja, ya que continuamente recibe muestras de tipología, naturaleza y composición muy diferente que deben ser analizadas. Las metodologías convencionales de análisis requieren la preparación previa de la muestra, lo que supone la mayor parte del tiempo invertido en el análisis, acumula la mayor parte de los errores que se producen en todo el. IC A. proceso de control y están asociadas a un consumo importante de reactivos y disolventes.. UI M. Esto provoca que se preste mayor atención a nuevas metodologías que sean al mismo. Q. tiempo rápidas, fiables y, si es posible, capaces de lograr el control exhaustivo del. BI. O. proceso de producción, determinando más de un parámetro simultáneamente. En este. Y. contexto no es de extrañar el éxito que ha conseguido la espectroscopia en el infrarrojo. AC. IA. cercano. La posibilidad de realizar medidas directas de muestras sólidas, con mínima o. RM. nula manipulación de la misma, la convierte en una técnica ampliamente aceptada en los. FA. laboratorios de control, por su capacidad de realizar análisis rápidos y precisos, no. DE. solamente en el producto final, sino también en diferentes etapas del proceso de. CA. producción. Desde un punto de vista práctico, otro aspecto positivo es la posibilidad de. TE. acoplar una sonda de fibra óptica al espectrofotómetro NIR, que permite medir la. BI BL. IO. muestra a una cierta distancia y, por tanto, muy útil para análisis químico on-line [1-6].. Dado que normalmente un único instrumento debe controlar una gran variedad de productos y de parámetros analíticos, es necesario que previamente a la cuantificación del parámetro deseado se realice una etapa de identificación de la muestra, disminuyendo así la posibilidad de error debido a un incorrecto o incompleto etiquetaje. Esta etapa se puede realizar a partir del espectro NIR del compuesto, utilizando una biblioteca espectral previamente establecida. Una vez el producto es identificado positivamente, el analito es cuantificado, utilizando la ecuación de calibración apropiada. El gran solapamiento de las bandas en la región del infrarrojo cercano requiere trabajar con. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. técnicas de calibración Multivariable, siendo la más utilizada la regresión parcial por mínimos cuadrados PLS-1[1-6].. Para que un nuevo método de análisis de un preparado farmacéutico pueda ser aceptado, éste debe ir acompañado obligatoriamente de su validación. En general, la validación de métodos de análisis está perfectamente regulada. En el ámbito de la industria farmacéutica existen distintas normativas para llevarlas a cabo, aunque a nivel. IC A. internacional la normativa más extendida y aceptada es la de la International Conference. UI M. on Harmonisation (ICH). Sin embargo, uno de los problemas más importantes para el analista, es que las normativas existentes están estrictamente dirigidas a la validación de. O. Q. métodos cromatográficos. La falta de normativas oficiales para otro tipo de métodos reglas prestablecidas,. Y. BI. hace que sus validaciones se conviertan en un proceso sin. IA. obligando a que los laboratorios farmacéuticos adapten las normativas generales a las. AC. necesidades particulares. Así pues, diferentes autores han propuesto distintos enfoques. RM. para las validaciones de los métodos NIR, hasta que finalmente la ASTM (American. FA. Society for Testing Materials) creó la norma ASTM E1655 05 en la que se conjugan los. DE. lineamientos convencionales para el desarrollo y validación de métodos analíticos. CA. utilizando la espectrometría NIR y la calibración multivariable. Desde su establecimiento. IO. TE. en 1898, ASTM International es una de las organizaciones de desarrollo de normas. BI BL. internacionales más grande del mundo. Las normas de ASTM se crean usando un procedimiento que adopta los principos del World Trade Organization Technical Barriers to Trade Agreement (Convenio de obstáculos técnicos al comercio de la Organización Mundial de Comercio). El proceso de creación de normas de ASTM es abierto y transparente; lo que permite que tanto a individuos como gobiernos participen directamente, y como iguales, en una decisión consensual global [7-14].. La Farmacopea Americana (USP) define como método analítico a la adaptación especifica de una técnica analítica para un propósito de medición seleccionado; los métodos de análisis utilizados en el control de calidad de los productos farmacéuticos,. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. que no se sean métodos oficiales de análisis (registrados o contemplados en farmacopeas), deben haber sido validados previamente a su uso en rutina [11]. El objetivo de la validación de métodos NIR, como es el caso de la validación de cualquier procedimiento analítico, es demostrar que la medida es adecuada para los fines previstos. La espectroscopia NIR es algo diferente de las técnicas analíticas convencionales ya que la validación de la primera por lo general se logra mediante la evaluación de los parámetros quimiométricos, pero estos parámetros aún puede estar. IC A. relacionado con las características fundamentales que se requieren para la validación de. UI M. cualquier método analítico.. Q. El Pre-tratamiento de datos es a menudo un paso vital en el análisis de los datos. BI. O. quimiométricos espectrales NIR. El Pre-tratamiento de datos se puede definir como la. Y. transformación matemática de los datos espectrales NIR para mejorar las características. AC. IA. espectrales y / o eliminar o reducir las fuentes de variación no deseadas antes de usar el. RM. espectro. La calibración es el proceso de desarrollo de una relación matemática entre la. FA. respuesta espectral NIR y las propiedades de las muestras. Existen muchos algoritmos. DE. quimiométricos adecuados para el pre-tratamiento de datos y la calibración, la selección. CA. debe basarse en el criterio científico sólido y la idoneidad para el uso previsto [11].. IO. TE. Según la USP, las características de desempeño del método NIR, de manera similar a los. BI BL. métodos convencionales se expresa en función de los siguientes parámetros analíticos:. Especificidad. Es la capacidad de un método analítico para evaluar de manera inequívoca el analito en presencia de aquellos componentes que pueden estar presentes en la muestra, como impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz, este parámetro se debe determinar antes de iniciar el estudio de cualquier otro parámetro de validación, dado que debe conocerse en que grado la respuesta del método es únicamente proporcionada por el analito, sin interferencia de otras sustancias relacionadas con él, de una u otra forma. [11-13]. .. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Linealidad y Rango La linealidad de un método analítico es su capacidad para obtener resultados de prueba que sean proporcionales ya sea directamente, o por medio de una transformación matemática bien definida, a la concentración de analito en la muestra en un intervalo dado. El rango se define como el intervalo entre la concentración superior e inferior de analito para el cual se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del método. UI M. IC A. descrito [11-13].. Precisión. O. Q. La precisión de un método analítico es el grado de concordancia entre los resultados de. Y. BI. las pruebas individuales cuando se aplica el método repetidamente a múltiples muestreos. IA. de una muestra homogénea en las condiciones prescritas. El objetivo de este estudio es. AC. conocer la variabilidad del método de ensayo, esta variabilidad es debido a errores. RM. aleatorios inherentes a todo método de ensayo. Como consecuencia de la existencia de. FA. estos errores, los análisis efectuados sobre muestras idénticas, en las mismas. DE. circunstancias, no conducen generalmente a resultados idénticos. Los factores. CA. susceptibles de influir sobre los resultados de un ensayo no. pueden ser siempre. IO. TE. controlados (analista, equipo instrumental, tiempo, etc.) de aquí la importancia del. BI BL. estudio de la precisión.. La precisión de un método analítico habitualmente se expresa como la desviación estándar o la desviación estándar relativa (coeficiente de variación) de una serie de mediciones. La precisión puede ser considerada a dos niveles.. a) Repetibilidad: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra en las mismas condiciones operativas (por un mismo analista, con el mismo instrumento, un mismo día, etc.) en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo corto.. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. b) Precisión intermedia: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas, diferente instrumento, diferentes días, etc.) y en un mismo laboratorio. El estudio de los diferentes efectos mencionados anteriormente no es necesario que se realice de forma individual, se puede realizar diseños experimentales (matriz) para tal efecto [11-13].. IC A. Exactitud. UI M. La exactitud de un método analítico es la proximidad entre los resultados de la prueba obtenidos mediante ese método y el valor verdadero, debe ser demostrado en todo el. O. Q. rango especificado para el método analítico. La exactitud se expresará como el. Y. BI. porcentaje de recuperación de la cantidad valorada con respecto a la cantidad conocida. IA. del analito añadida a la muestra o como la media obtenida y el valor aceptado como. RM. AC. verdadero, considerando los intervalos de confianza [11-13].. FA. Límite de Detección (LD). DE. El límite de detección es una característica de las pruebas de límite. Es la cantidad. CA. mínima de analito en una muestra que puede detectarse, aunque no necesariamente. TE. cuantificarse, en las condiciones experimentales indicadas. Las pruebas de límite. IO. simplemente comprueban que la cantidad de analito se encuentra por encima o por. BI BL. debajo de un nivel determinado [11-13].. Límite de Cuantificación (LC) Es la mínima cantidad de analito en una muestra que se puede determinar con precisión y exactitud aceptables en las condiciones experimentales indicadas. El límite de cuantificación es una característica de las valoraciones cuantitativas de compuestos que se encuentran en baja concentración en la matriz de una muestra, como por ejemplo: impurezas en fármacos a granel y productos de degradación en productos farmacéuticos terminados.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El hecho que sea necesario evaluar unos u otros parámetros dependerá básicamente del tipo de ensayo; debido a la variedad de ensayos analíticos existentes, se hace necesario establecer categorías que faciliten el estudio y reconozcan el tipo de información que se requiere para la validación de un método analítico, según la clasificación de la Farmacopea Americana USP, estos métodos se dividen en cuatro categorías: Categoría I: Cuantificación de componentes principales de fármacos a granel o ingredientes activos (incluyendo conservantes) en productos farmacéuticos terminados.. IC A. Categoría II: Determinación de impurezas en fármacos a granel o productos de. UI M. degradación en productos farmacéuticos terminados. Q. Categoría III: Determinación de las características de desempeño (disolución,. Y. IA. Categoría IV: Pruebas de identificación [11-13].. BI. O. liberación de fármacos). AC. Los agentes antihipertensivos pueden ser clasificados de acuerdo a sus mecanismos de. RM. acción como [15]:. FA. i) Diuréticos;. DE. ii) Agentes simpatolíticos;. CA. iii) Vasodilatadores;. IO. TE. iv) Bloqueadores de canales de calcio e. BI BL. v) Inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECA) y antagonistas del receptor de angiotensina.. Captopril es parte del grupo de antihipertensivos clasificados como inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECA) y representan un gran avance en el tratamiento de la hipertensión. El primer inhibidor de ECA a ser comercializado fue captopril y varios otros fueron posteriormente desarrollados, como Enalapril, Lisinopril, perindopril, ramipril, Quinalapril etc. Sin embargo, entre estos el captopril es el antihipertensivo que posee menor costo, siendo producido a larga escala por laboratorios Induquimica S.A. y por ser parte del petitorio nacional de medicamentos esenciales [16].. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El nombre químico y la fórmula química son, respectivamente, (S)-1-(3-Mercapto-2methyl-1-oxopropyl)-L-proline y C9H15NO3S y su fórmula estructural se representa en la. IC A. figura 1.. UI M. Figura 1. Fórmula estructural de Captopril.. Este fármaco es un polvo cristalino, blanco a levemente amarillo, con leve olor. O. Q. característico a sulfato. Es fácilmente soluble en agua, etanol, cloroformo, metanol y. Y. BI. soluciones alcalinas [11]. Presenta un punto de fusión entre 104°C y 110°C. Posee un pKa. AC. IA. 10.10 y un logP de 1.02 [17].. RM. La calidad viene siendo utilizada como sello de garantía de cualquier producto industrial.. FA. Por este motivo, el control de calidad de los productos es indispensable en la mayoría de. DE. procesos industriales y en varios campos de aplicación. En las industrias farmacéuticas. CA. ese control es esencial teniendo en cuenta la finalidad para que son producidos los. TE. productos. Desviaciones en la calidad de estos productos pueden causar efectos. BI BL. muerte.. IO. perjudiciales a la salud de los consumidores, pudiendo en casos extremos llevar a la. La norma Standard ISO (Organización Internacional De Normalización) define calidad: “la totalidad de rasgos y características de un producto, proceso o servicio que inciden en su capacidad de satisfacer necesidades reguladas o implícitas”. Según esta definición, cuando se utiliza la expresión “de buena calidad” se pretende remarcar la excelencia de un producto o servicio y el cumplimiento de las especificaciones, cualitativas o cuantitativas, acordadas previamente con el cliente y/o definidas por la autoridad competente. El control de calidad consiste en realizar medidas de algunos parámetros del. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. producto considerando en verificar que los valores obtenidos están de acuerdo con las especificaciones pre-establecidas [18].. Para que una industria pueda producir y comercializar un fármaco precisa el cumplimiento de normativas específicas, como buenas prácticas de fabricación (GMPs,Good Manufacturing Practices) y buenas prácticas de laboratorio (GPLs, Good Laboratory Practices). Los fabricantes de medicamentos en el Perú deben cumplir las. IC A. Normas para la Correcta Fabricación de Medicamentos de Uso Humano, lo cual es. UI M. regulado por la DIGEMID (Dirección General de Medicamentos Insumos y Drogas). Entre estas exigencias está el control de calidad de insumos, productos intermediarios y. O. Q. finales, validación de los procesos de fabricación, instalaciones y equipos adecuados, y. Y. BI. el personal calificado [19].. AC. IA. Determinar todos estos parámetros de calidad en un proceso industrial normalmente. RM. envuelve un gran número de análisis. De este modo un laboratorio de control de calidad. FA. dispone de una cantidad considerable de técnicas para el control de rutina y actualmente. DE. la mayoría de estos análisis es realizada empleando métodos instrumentales.. CA. Se debe considerar que, las metodologías más comúnmente utilizadas en el control de. IO. TE. calidad de los fármacos son: espectrofotometría UV-VIS y la cromatografía líquida de. BI BL. alta eficiencia (HPLC). Estos métodos son lentos y trabajosos, pues envuelven mucha manipulación analítica (extracción/disolución de las muestras, preparación frecuente de reactivos y soluciones de calibración, etc) principalmente cuando son aplicados a productos farmacéuticos en fase sólida. Por otra parte, estos métodos son relativamente caros, pues requieren el uso de solventes y reactivos caros, precisan de personal calificado para la manipulación analítica y sobre todo producen residuos perjudiciales para el medio ambiente. Una buena alternativa para solucionar estos problemas presentados por las técnicas convencionales es la Espectrometría en el Infrarrojo Cercano (NIR) [11].. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La Espectrometría en el Infrarrojo Cercano (NIRS, Near Infrared Spectrometry) presenta una serie de ventajas frente a otras técnicas instrumentales, que la convierten en una herramienta idónea para satisfacer estas necesidades analíticas de un modo adecuado: i) No requiere pre-tratamiento de muestra, lo cual permite obtener el espectro de muestras sólidas directamente. ii) Nulo consumo de reactivos sin generación de residuos.. IC A. iii) Fácil y rápida adquisición de resultados.. UI M. iv) Es una técnica no destructiva que permite determinar múltiples parámetros a partir de la misma muestra.. O. Q. v) Se pueden realizar análisis no invasivos, in-line y on-line de un modo rápido y. Y. BI. simple: control a tiempo real.. IA. vi) Se obtiene información química de la muestra sin renunciar a información física.. AC. vii) A partir de un único espectro de la muestras se pueden establecer calibraciones. FA. RM. paralelas para realizar determinaciones multiparamétricas [1-6].. DE. Dada la importancia de lo mencionado, en el presente trabajo se ha realizado un estudio. CA. para desarrollar y validar un método de análisis por espectrometría NIR y Calibración. TE. Multivariable para la cuantificación de Captopril en tabletas 25 mg y su correspondiente. BI BL. IO. aplicación, lo cual garantizará que los resultados que se obtengan sean confiables.. PROBLEMA. ¿Cumple con los criterios de desarrollo y validación, para la cuantificación de captopril en tabletas 25mg, el método analítico por espectrometría NIR y Calibración Multivariable?. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II.. OBJETIVO. OBJETIVO GENERAL. 1. Desarrollar y Validar un método de Cuantificación mediante Espectrometría NIR y Calibración Multivariable, para la determinación de captopril en comprimidos. UI M. IC A. farmacéuticos de 25mg producidos por Laboratorios Induquímica S.A.. BI. O. Q. OBJETIVOS ESPECIFICOS. IA. Y. 1. Aplicar Técnicas quimiométricas de planeamiento experimental, de selección de variables y. AC. de muestras para construir los modelos de calibración.. RM. 2. Construir un modelo de Calibración Multivariable basada en PLS-1.. FA. 3. Determinar los parámetros de validación del modelo de calibración multivarible PLS-1. DE. desarrollado (Precisión del modelo, significancia de la validación del sesgo y concordancia. CA. entre el modelo y el método de referencia).. TE. 4. Validar el modelo PLS-1 desarrollado, con base en la norma ASTM E1655 05.. BI BL. IO. 5. Determinar los parámetros de validación del método analítico desarrollado (linealidad, exactitud, precisión y especificidad). 6. Evaluar los parámetros de validación mencionados para establecer si cumplen con los criterios establecidos por la norma ASTM E1655 05 y Farmacopea Americana. 7. Sugerir el método para ser implantado por Laboratorios Induquímica en el control de calidad de los comprimidos de captopril producidos y comercializados por esta empresa.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III.. MATERIAL Y MÉTODO. 1. MATERIAL 1.1. Material de estudio 250 tabletas sintéticas de captopril 25mg preparados en planta piloto y 120 tabletas de 12 lotes comerciales de captopril procedentes del almacén de contramuestras de. IC A. producto terminado de Laboratorios Induquímica S.A.. UI M. 1.2. Material y equipos de laboratorio. Q. 1.2.1. Estándar. BI. O. Estándar secundario Captopril. Y. Lote: Lote: 5103-08-039, F.Exp.2012 - JUL. RM. 1.2.2. Material de vidrio. AC. IA. Potencia: 99.6%. DE. FA. De uso común en el laboratorio.. CA. 1.2.3. Solvente. TE. Agua purificada. IO. Metanol grado HPLC. BI BL. Ácido Fosfórico 85%. 1.2.4. Equipos. Balanza Mettler Toledo MX5 Marca. : Mettler Toledo. Modelo. : MX5. Serie. : 1121440680. Codigo. : INDUQ 0012. Calibración y/o verificación: CONFORME Balanza Mettler Toledo XS205 Marca. : Mettler. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Modelo. : XS 205 DU. Serie. : 1126513220. Codigo. : INDUQ 0010. Calibración y/o verificación: CONFORME Sonicador Branson 2810 Marca. : BRANSON. Modelo. : 8510R-DTH. Serie. : RPC069910382e. Codigo. : INDUQ 0300. Agitador Magnetico KIKA-WERKE : KIKA-WERKE. Serie. : 00186003. Codigo. : INDUQ 0113. BI. : No Aplica.. Y. Calibración y/o verificación. O. Q. UI M. Marca. IC A. Calibración y/o verificación : No Aplica.. AC. IA. Espectrometro NIR Spectrum One-NTS Marca. : Perkin Elmer. RM. Modelo. FA. Código. : Spectrum One-NTS. : Induq 0145. DE. Calibración y/o verificación : CONFORME HPLC Lachrom Elite : Hitachi. Modelo. : Lachrom Elite. Bomba. : L-2130. IO. TE. CA. Marca. : L-2200. Horno. : L-2350. Detector UV-VIS. : L-2400. BI BL. Inyector Automático. Codigo. : INDUQ 0089. Calibración y/o Verificación: CONFORME. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2. METODO. 2.1. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA El conjunto de calibración fue compuesto tanto de muestras sintéticas como de muestras comerciales. Las muestras sintéticas se obtuvieron de un total de 25 lotes de comprimidos sintéticos que fueron preparados de acuerdo con un planeamiento de [20,21,22]. . Las. IC A. mezclas D-optimizado (incluida muestra de punto central por triplicado). UI M. muestras comerciales fueron compuestas por 12 lotes diferentes de comprimidos. BI. O. Q. producidas por Laboratorios Induquímica S.A .. Y. 2.1.1. LOTES COMERCIALES. AC. IA. Se recolectaron al azar 10 tabletas por cada lote seleccionado dentro del área de. RM. almacén de contramuestras de producto terminado de Laboratorios Induquímica. DE. FA. S.A., que no hayan cumplido su fecha de expira.. CA. 2.1.2. LOTES DE COMPRIMIDOS SINTÉTICOS. TE. Los comprimidos sintéticos fueron elaborados utilizando un planeamiento de. IO. mezclas D-optimizado del paquete quimiométrico Unscrambler (Anexo 2). La tabla. BI BL. muestra el planeamiento de mezclas, cada fila de la tabla representa una de las 25 composiciones utilizadas en la preparación de los comprimidos sintéticos. Las tres últimas filas de la tabla representan las repeticiones autenticas de punto central. Las características se muestran en la siguiente tabla:. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI. O. Q. Ácido Esteárico 1.000% 1.000% 1.000% 1.000% 1.000% 1.000% 1.000% 0.600% 0.600% 0.600% 0.600% 0.600% 0.600% 0.600% 0.800% 0.800% 0.600% 0.800% 1.000% 0.800% 1.000% 0.600% 0.800% 0.800% 0.800%. IC A. UI M. Celulosa 28.000% 28.000% 19.700% 18.700% 26.500% 18.700% 18.700% 20.100% 20.100% 26.900% 28.000% 28.000% 28.000% 18.700% 26.700% 18.700% 22.800% 28.000% 23.850% 18.700% 28.000% 18.700% 23.333% 23.333% 23.333%. Y IA. AC. Lactosa 59.900% 55.800% 68.200% 68.200% 55.800% 63.600% 63.600% 68.200% 68.200% 55.800% 60.300% 60.300% 55.800% 64.000% 55.800% 63.800% 59.900% 60.100% 64.050% 68.200% 57.850% 66.100% 61.983% 61.983% 61.983%. RM. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25. Captopril 11.100% 15.200% 11.100% 12.100% 16.700% 16.700% 16.700% 11.100% 11.100% 16.700% 11.100% 11.100% 15.600% 16.700% 16.700% 16.700% 16.700% 11.100% 11.100% 12.300% 13.150% 14.600% 13.883% 13.883% 13.883%. FA. La elaboración de estos comprimidos sintéticos, se llevó a cabo siguiendo las. DE. recomendaciones de la norma ASTM E 1655 05, para la preparación del conjunto de. CA. calibración en la construcción de un modelo de calibración multivariada empleando. IO. TE. espectrometría NIR; tomando en cuenta la formulación (principio activo y. BI BL. excipientes) usada por Laboratorios Induquímica para la producción de comprimidos comerciales con valor nominal de 25mg de Captopril y un peso promedio por tableta de 180mg.. De acuerdo con el planeamiento D-optimizado, fue generado un conjunto de calibración con un total de 25 composiciones para las muestras sintéticas, incluyendo muestras autenticas de punto central por triplicado. La concentración del principio activo captopril y los excipientes fue variada en + 20% en torno a los valores especificados en la formulación de Laboratorios Induquímica S.A., de modo que las. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 25 muestras sintéticas cubran un rango ampliado de concentración de 20 a 30 mg de captopril, en relación al valor nominal esperado (25 mg) para los comprimidos comerciales producidos por la empresa.. 2.1.2.1. Preparación de los Comprimidos Sintéticos. Para la producción de los comprimidos sintéticos en planta piloto se siguió el procedimiento de manufactura según se indica en la orden de producción para. IC A. captopril 25mg tabletas GI00063 (Anexo 1) de Laboratorios Induquímica y. UI M. fueron utilizados:. Q. Tamices tipo malla N°20, N°40 y N°60 para homogenizar el tamaño de. BI. O. partícula de los insumos.. Y. Bolsas de Polietileno para mezclar los insumos lo más homogéneamente. RM. comprimidos preparados.. AC. IA. posible, a fin de que el principio activo este distribuido uniformemente en los. FA. Tableteadora Mono punzón para producir las muestras sintéticas en forma de. BI BL. IO. TE. CA. DE. comprimidos, mostrada en la siguiente figura.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Para minimizar el error en el pesaje de los insumos, decidimos pesar por separado las cantidades de excipientes y principio activo para la preparación de 100 comprimidos de cada una de las 25 composiciones sugeridas por el diseño D-optimizado. Cada uno de los comprimidos debe tener una masa total de alrededor de 180 mg en comprimidos comerciales de Induquímica. De las masas pesadas sólo se utilizaron las cantidades para la preparación de 10 comprimidos de cada muestra de planeamiento y se desechó el resto. Esto resultó en un total. UI M. IC A. de 250 tabletas preparadas.. Q. Los 10 comprimidos de cada una de las 25 muestras de planeamiento fueron. BI. O. acondicionados en recipientes de vidrio ámbar y guardados en desecador hasta. RM. 2.1.3. MUESTRAS ANALIZADAS. AC. IA. Y. que fueron registrados los espectros NIR.. FA. Se utilizaron en la construcción y validación interna del modelo, 3 tabletas de cada. DE. una de las 25 composiciones sugeridas por el diseño D-optimizado y 10. CA. comprimidos diferentes de cada uno de los 12 lotes de producción. Por lo tanto, se. TE. dispuso de un total de 75 muestras de tabletas sintéticas y 130 muestras de. BI BL. IO. comprimidos comerciales.. 2.2. RECOLECCIÓN DE DATOS 2.2.1. CONTROL INSPECTIVO DE TABLETAS SINTÉTICAS Se registró el peso individual y la dureza de 20 tabletas, se procedió a calcular el promedio de los valores obtenidos (Anexo 2).. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.2. REGISTRO DE ESPECTROS NIR Los espectros NIR de las 205 muestras fueron registradas en el rango de 10000 cm-1 a 4000 cm-1 utilizando un espectrómetro NIR con Transformada de Fourier de marca. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. Perkin Elmer modelo Spectrum one NTS, equipo presentado en la siguiente figura.. FA. Para el registro de los espectros fue empleado el accesorio NIRA (Near Infrared. DE. Reflectance Accessory) con toma de muestra para tabletas de 8mm de diámetro,. BI BL. IO. TE. CA. mostrado a continuación.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En el registro del espectro de la muestra blanco fue utilizado Teflón (99% reflective Spectralon). Cada espectro registrado fue resultado de una media de 60 barridos realizados utilizando una resolución de 4 cm-1. En estas condiciones, el tiempo de obtención de un espectro fue de 60 segundos. Todos los espectros fueron registrados en el ambiente del área de Control de Calidad de Laboratorios Induquímica con temperatura (en torno a 25ºC) y humedad relativa (cerca de 45%) controlados.. IC A. Los espectros de todos los comprimidos fueron siempre registrados por ambos lados.. UI M. 2.2.2.1. CONUNTOS DE CALIBRACIÓN Y VALIDACIÓN. Q. El conjunto de calibración estuvo compuesto de 50 espectros de. BI. O. comprimidos sintéticos, considerando 2 espectros de 2 comprimidos. Y. sintéticos por cada una de las 25 muestras sugeridas por el planeamiento D-. AC. IA. optimizado, siendo cada una la media de 2 espectros, una por cada lado de la. RM. tableta; y de 12 espectros de comprimidos comerciales de Induquímica, 1. FA. espectro promedio de 10 espectros de los 10 comprimidos extraídos de cada. DE. lote, siendo cada uno la media de 2 espectros, uno por cada lado de la. CA. tableta. Se dispuso de un total de 62 espectros para el conjunto de. TE. calibración.. IO. El conjunto de Validación estuvo compuesto por 25 espectros de. BI BL. comprimidos sintéticos, considerando 1 espectro de 1 comprimido por cada una de las 25 muestras sugeridas por el planeamiento D-optimizado, siendo cada una la media de 2 espectros, una por cada lado de la tableta; y de 12. espectros de comprimidos comerciales de Induquímica, 1 espectro promedio de 10 espectros de 10 comprimidos extraídos por cada lote, siendo cada una a su vez la media de 2 espectros, una por cada lado de la tableta. Se dispuso de un total de 37 espectros para el conjunto de validación [1-6, 23-30].. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.3. PRE-PROCESAMIENTO DE LOS ESPECTROS NIR Antes de iniciar la etapa de construcción de los modelos quimiométricos, frecuentemente es necesario realizar una etapa de pre-procesamiento de los espectros. Se procedió a remover cualquier información que no este relacionada al problema químico en estudio [1-6, 23-30].. 2.2.4. VALORES DE REFERENCIA DE LOS COMPRIMIDOS. IC A. El contenido de captopril de los comprimidos de cada uno de los 12 lotes. UI M. comerciales de Induquímica y de las 25 muestras sintéticas preparadas fue. Q. determinada empleando el método HPLC de referencia, recomendado por la. BI. O. farmacopea americana. Estos valores de referencia fueron usados en la calibración y. AC. IA. Y. validación del modelo.. RM. 2.2.4.1. METODO HPLC DE REFERENCIA. FA. a. Condiciones cromatográficas:. DE. COLUMNA. CA. FLUJO. TE. TEMPERATURA. : 1 mL/min. : 25 ºC. : 220 nm.. IO. LONGITUD DE ONDA. : ZORBAX XDB C18 250mm x 4.6mm. BI BL. VOLUMEN DE INYECCIÓN: 20 uL FASE MOVIL : AGUA: METANOL: Ac. FOSFORICO / (450 : 550 : 0.5). b. Preparación del estándar Se pesó aproximadamente 25 mg de Captopril estándar, se colocó en una fiola de 25 mL, se agregó 15 mL de fase móvil, se sonicó por 10 minutos y agito 10 minutos, se enrasó luego con fase móvil y se homogenizó. Concentración final = 1 mg/mL. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. c. Preparación del estándar Se colocaron las tabletas una a una en fiolas de 25 mL, se agregó 10 mL de fase móvil, se sonicó por 10 minutos, se enrazó con fase móvil y se homogenizó. Concentración final = 1 mg/mL. Tanto estándar y muestra se pasaron a través de un filtro de poliamida de 0.45 um de tamaño de poro y se colocó en viales para su análisis en el equipo. UI M. Cálculos (Ver Anexo 2):. Q. d.. IC A. HPLC.. BI. O. Amp Wst FDst Captopril mg / tab x x( Pot st ) x( Pp ) x ASt Wmp fd mp . Y. Donde:. Área del pico de Captopril en la muestra. ASt=. Área del pico de Captopril en el estándar. Wst=. Peso del estándar en mg. Wmp=. Peso de la muestra en mg. PotSt=. Potencia del estándar en % tal cual.. Pp=. Peso promedio de tabletas, en mg.. FDst=. Factor de dilución del estándar. fdmp=. Factor de dilución de la muestra. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Amp=. IO. 2.3. DESARROLLO Y VALIDACION DEL MODELO QUIMIOMÉTRICO. BI BL. 2.3.1. CALIBRACIÓN MULTIVARIABLE MEDIANTE ESPECTROMETRÍA NIR SEGÚN NORMA ASTM E 1655 2.3.1.1. Construcción del modelo PLS1 de calibración utilizando la espectrometría NIR a. Se realizó una calibración exploratoria del modelo PLS1 usando el método de validación cruzada, que consiste en desarrollar un modelo de calibración con todas las muestras, menos una. La muestra que se descarta fue entonces estimada por el modelo de calibración. El algoritmo repite este paso hasta que todas las muestras hayan sido descartadas y estimadas por cada modelo de. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. calibración desarrollado. Este método se realizó con un número entre 30 y 50 muestras cubriendo toda la gama de muestras dadas por el diseño Doptimizado (Conjunto de Calibración). b. Se tomaron como valores de referencia para la calibración de la propiedad de interés, los valores reportados con el método HPLC de referencia. c. El modelo de calibración PLS1 elaborado fue probado mediante SECV (Standard Error of Cross Validation). El valor de SECV obtenido por la. IC A. validación cruzada sugiere que un modelo de precisión adecuada se puede. UI M. construir, a continuación se utilizó otro conjunto de muestras para el. Q. desarrollo y validación final del modelo PLS1 cubriendo también toda la. BI. O. gama de muestras dadas por el diseño D-optimizado (Conjunto de. AC. IA. Y. Validación) [1-6, 23-30].. 2.3.1.2. Selección de las muestras del conjunto de Calibración. RM. Para la selección del conjunto de calibración adecuado se evalúan diversos. FA. parámetros en el modelo de calibración PLS1 exploratorio construido. DE. mediante validación cruzada. Las pruebas estadísticas que se utilizan para. CA. detectar muestras anómalas protegen contra conjuntos de calibración no. IO. TE. ideales. Los puntos evaluados fueron los siguientes:. BI BL. a. Los valores RMSSR (Root Mean Square Espectral Residual) detectan cuando las muestras para ser analizadas contienen componentes que no están representados en la calibración. Este valor fue evaluado con muestras del conjunto de validación en un reporte de predicción del Software Quant+. b. Las estadísticas de influencia (leverage) detectan cuando las muestras a analizar se encuentran fuera del rango de concentraciones representadas en el conjunto de calibración. Este valor fue evaluado en los gráficos de Standard Leverage, Variable Leverage, Influence, Validation Leverage Ratio y Validation Influence.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. c. La detección de muestras anómalas durante el desarrollo del modelo identifica componentes para los que los rangos de concentración en el conjunto de calibración no son uniformes. Este valor fue evaluado mediante los gráficos de Outliers y Validation Outliers. d. El número de muestras necesarias para calibrar un modelo multivariado utilizando la espectrometría NIR depende de la complejidad de las muestras para ser analizadas. Las muestras para ser analizadas contienen algunos. IC A. componentes que varían en la concentración, entonces habrá un pequeño. UI M. número de variables (componentes principales, variables latentes, longitudes. Q. de onda), y un conjunto relativamente pequeño de calibración que es. BI. O. apropiado para definir la relación entre las variables y concentraciones o. Y. propiedades. La evaluación del número de variables (k) a ser utilizada fue. RM. AC. IA. realizada mediante el análisis del gráfico de SEP y Validation SEP [1-6, 23-30].. FA. 2.3.1.3. Selección de las muestras del conjunto de Validación. DE. La validación del método multivariado utilizando la espectroscopia NIR se. CA. realizó aplicando el modelo PLS1 construido, para analizar un conjunto de. TE. muestras de validación, mediante el método de validación Independiente, y. IO. estadísticamente comparando con los valores de referencia conocidos para. BI BL. estas muestras. La validación requiere un examen a fondo del modelo para garantizar que su rendimiento alcanza las expectativas derivadas de las estadísticas del conjunto de calibración. Para la validación del modelo multivariado, el conjunto de muestras de validación se evaluó mediante los criterios a, b y c descritos para el conjunto de calibración y:. a. El número de muestras necesarias para validar un modelo multivariado depende de la complejidad del modelo. Solamente las muestras cuyos análisis son interpolaciones del modelo fueron utilizados en el procedimiento de. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. validación. Para ello la evaluación del número de variables (k) se realizó mediante el análisis del gráfico Validation SEP [1-6, 23-30].. 2.3.2. VALIDACIÓN DEL MODELO 2.3.2.1. Test de Significancia de validación del sesgo . Evalúa si el modelo brinda estadísticamente los mismos valores promedio que los de referencia. Nos da a conocer si los resultados de la validación del modelo presentan. Se evaluaron los valores estimados por el modelo frente a los valores. Q. . UI M. tendencias estadísticamente no significativas.. IC A. . Se aplicó el test de t-Student:. FA. RM. AC. IA. Y. . BI. O. obtenidos con el método de referencia para el Conjunto de Validación.. DE. donde: ev es el valor medio de las tendencias de los valores estimados dv es el numero total de valores. CA. para el conjunto de validación;. TE. individuales de las medidas de referencia; SDV es la desviación estándar. BI BL. IO. del error de validación [1-6, 23-30].. 2.3.2.2. Concordancia entre el modelo y el método de referencia . Evalúa si las muestras del conjunto de validación están dentro de sus límites de confianza de predicción.. . Se evaluaron los valores estimados por el modelo en comparación con los valores obtenidos con el método de referencia mediante: Y+t*SEC*1+h < Valor de referencia < Y+t*SEC*1+h. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Donde: SEC (Standard Error of Calibration) es el error estándar de la de calibración, Y es el valor de referencia para la muestra respectiva, t es el valor t-tabla para n-k-1 grados de libertad y h es el estadístico de influencia (leverage) [1-6, 23-30].. 2.3.2.3. Precisión en función del método de referencia . Evalúa la precisión del modelo en función de los valores esperados que. La precisión de los valores estimados por un modelo multivariado de. UI M. . IC A. se obtienen con el método de referencia.. Q. regresión por espectrometría NIR se calcula utilizando mediciones. BI. La precisión del modelo se determinó usando amtest ≥ k ≥ 3 (amtest =. Y. . O. espectrales repetidas.. AC. IA. número de muestras de prueba para las cuales se hicieron réplicas) y r ≥. Las muestras utilizadas para las repeticiones cubrieron al menos el 95%. FA. . RM. 6 (r = número de repeticiones por muestras). DE. del rango de concentración utilizada en el modelo. Cuando sea posible. CA. deben ser seleccionadas muestras que aseguren que alguna variación en. Los espectros fueron analizados y los resultados se estimaron para cada. IO. . TE. cada variable espectral aparece entre las muestras.. BI BL. espectro. Se calculó el promedio estimado para cada muestra y se obtuvo la desviación estándar entre los valores estimados. Si yij es la estimación. para el jth espectro de ri espectros totales para la ith muestra, entonces la media estimada para la muestra es:. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. . La desviación estándar de las repeticiones estimadas fue calculado como:. . Un valor X2 fue calculado usando el valor de desviación estándar. UI M. IC A. calculado:. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. Donde:. El valor de χ2 calculado se compara con el valor tabulado para n-1. CA. . DE. Y z es el número de muestras para los cuales se hicieron réplicas.. Una medida en el NIR tiene una repetibilidad esperada en el orden de. IO. . TE. grados de libertad. El valor de χ2 calculado es menor que el valor crítico.. BI BL. amtest . 2σ [1-6, 23-30].. 2.4. VALIDACION DEL MÉTODO ANALÍTICO Se desarrolló la validación del método analítico siguiendo el procedimiento contemplado en la Farmacopea Americana (USP) y recomendaciones de la norma ASTM E1655 05.. 2.4.1. ENSAYO DE ESPECIFICIDAD Se procedió a evaluar la especifidad de la siguiente manera:. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. o Se compararon los Espectros de placebo y de validación, con un espectro de calibración en el rango de modelado. o Se compararon los pre-tratamientos de espectros ST, placebo y muestra de Calibración en el rango de modelado. Se evaluó la similitud de bandas del ST con la muestra de validación que se diferencian del placebo en el rango especificado. o Se evaluó la variación descrita por el modelo para la propiedad de interés (uniformidad de dosis de captopril), para el número de variables (k) seleccionado [16, 11, 23-30]. IC A. .. UI M. 2.4.2. ENSAYO DE EXACTITUD. Q. La exactitud fue determinada por concordancia entre el error estándar de. BI. O. predicción (SEV) y el error estándar del método de referencia expresado por el. Y. error de calibración (SEC) para la validación.. AC. IA. 2.4.3. ENSAYO DE LINEALIDAD. RM. Para evaluar la linealidad del conjunto de calibración se tomó en cuenta los. FA. siguientes test en el conjunto de validación:. DE. a. Test de significancia de validación del sesgo: nos permite saber si el modelo. CA. brinda estadísticamente los mismos valores promedio que los de referencia. Se. TE. procedió de la misma forma que en la validación del modelo.. IO. b. Concordancia entre el modelo y el método de referencia. Nos permite. BI BL. comprobar si las muestras están dentro de sus límites de confianza de predicción. Se procedió de la misma forma que en la validación del modelo.. c. Pendiente e Intercepto. Parámetros característicos de la linealidad [1-6, 11, 23-30]. 2.4.4. ENSAYO DE PRECISION Se evaluó en términos de Repetibilidad y Precisión Intermedia. Repetibilidad: La repetibilidad se demostró mediante lo siguiente: - Repetibilidad de Sistema: Se realizó la evaluación estadística de una serie de mínimo 6 mediciones repetidas de la muestra realizadas por 1 analista en 1 solo instrumento y en 1. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. solo día; sin recolocar la muestra entre cada adquisición espectral individual. No incluye la inexactitud de colocación de la muestra y medición. - Repetibilidad de Método: Se realizó la evaluación estadística de mínimo 6 mediciones independientes de la muestra realizadas por 1 analista en 1 solo instrumento y en 1 solo día; cada resultado. fue. un. análisis. de. una. muestra. replicativa. posterior. al. reposicionamiento entre las adquisiciones espectrales. Incluye inexactitud de. IC A. colocación de la muestra y medición.. UI M. Precision Intermedia: La precisión intermedia se demostró mediante lo. Q. siguiente:. BI. O. Se realizó la evaluación estadística de una serie de mediciones NIR repetidas de. Y. las muestras realizadas por 2 analistas en 1 solo instrumento y en 2 días distintos .. AC. IA. [1-6, 11, 23-30]. RM. 2.4.5. ENSAYO DE RANGO. FA. Cumplidas las especificaciones de Linealidad, Precisión y Exactitud, se. DE. estableció que el rango de este método analítico es de 80% a 120 %,. CA. verificándose que el método analítico funciona correctamente cuando se aplica. TE. a muestras que contienen principio activo a concentraciones iguales a los. IO. extremos superior e inferior, así como dentro del intervalo de concentración. BI BL. definido [1-6, 11, 23-30].. 2.5. ANALISIS DE LOS DATOS 2.5.1. PROGRAMAS ESTADÍSTICOS El programa Unscrambler v.9.8. de CAMO Process A.S fue usado para generar el planeamiento de mezclas D-optimizado. El programa Spectrum que controla el equipo Espectrómetro Infrarrojo Cercano Perkin Elmer Spectrum One NTS fue usado para el registro de los espectros NIR, pre-tratamiento de espectros y medición de las muestras.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El programa Quant+ de Perkin Elmer fue usado para el análisis quimiométrico de los datos, la calibración Multivariable mediante mínimos cuadrados parciales PLS-1 y el análisis de influencia de las muestras industriales insertadas en el modelo de calibración Multivariable. El programa Excel de Miscrosoft Office 2010 fue usado para someter los datos a análisis estadístico considerando parámetros descriptivos: promedios, desviación estándar, coeficiente de variación porcentual, coeficiente de regresión y. IC A. coeficiente de determinación. Además se utilizaron pruebas inferenciales: t -. Q. UI M. Student y χ2, todas con un nivel de significancia del 5% (=0,05) [11].. BI. O. 2.5.2. ESPECIFICACIONES Y CRITERIOS DE ACEPTACIÓN.. IA. Y. 2.5.2.1. DESARROLLO Y VALIDACION DEL MODELO. RM. AC. A. Límites de Parámetros estadísticos. Limite 3.0. FA. Parámetro Estadístico Leverage. 3.0. DE. Sample Outlier, Calibration. 2.6. Individual Value Outlier, Calibration. 3.0. Individual Value Outlier, Validation. 2.6. Variable Outlier, Calibration. 3.0. Variable Outlier, Validation. 3.0. Numero de variables (k) , Calibration and. Elegir de. Validation. acuerdo a. BI BL. IO. TE. CA. Sample Outlier, Validation. <SEP. B. Cuestionario. para. la. evaluación. del. modelo. de. Calibración. Multivariable El cuestionario de evaluación del modelo de calibración fue establecido por la ASTM para ayudar al analista a determinar si un modelo de calibración se. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ha desarrollado y validado según la norma ASTM E 1655 05. Si todas las preguntas a continuación se responde afirmativamente, entonces la Calibración Multivariable puede ser considerado como desarrollados y validados. de. acuerdo. con. la. norma. ASTM. E. 1655. 05. [23]. .. Preguntas relativas a la metodología matemática utilizada en la Calibración. IC A. 1. ¿La técnica utilizada para la calibración fue MLR, PCR o PLS-1?. UI M. 2. ¿La metodología de calibración es capaz de detectar muestras anómalas. Q. utilizando la influencia estadística, h?. BI. O. 3. ¿La metodología es capaz de detectar muestras anómalas en base al. Y. residuo espectral?. AC. IA. Preguntas relativas al modelo de calibración. RM. 4. ¿ncal (ncal = número de muestras de calibración) > 6k (k = número de. FA. variables de MLR espectral, o PC’s para PCR o variables latentes para PLS). DE. para los modelos que no se centran en la media) o ncal> 6(k +1) para los. CA. modelos centrados en la media?. TE. 5. ¿Se utilizaron al menos 24 muestras de calibración?. IO. Preguntas relativas a la validación del modelo. BI BL. 6. ¿Un conjunto de muestras de validación se separó y se utilizó para comprobar la calibración? 7. ¿Las muestras anómalas identificadas por la estadística de influencia (la distancia Mahalanobis) o de residuo espectral fueron excluidos del conjunto de validación? 8. ¿El número de muestras de validación (nv) fue superior a 4k (para los modelos no centrados en la media) o superior a 4(k +1) (para los modelos centrados en la media)? 9. ¿El número de muestras de validación es de al menos 20?. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
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