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ANÁLISIS DE CANTIDAD Y CALIDAD DE ADN GENÓMICO EXTRAIDO EN FOLÍCULOS PILOSOS Y SANGRE DE Vicugna pacos “ALPACAS” MEDIANTE EL MÉTODO COMERCIAL

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Academic year: 2020

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS. PE CU AR IA S. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE ZOOTECNIA. RO. ANÁLISIS DE CANTIDAD Y CALIDAD DE ADN GENÓMICO EXTRAIDO EN FOLÍCULOS PILOSOS Y SANGRE DE Vicugna pacos “ALPACAS”. AG. MEDIANTE EL MÉTODO COMERCIAL. TESIS. DE. PARA OBTENER EL TITULO DE. : Br. Magaly Evamaria Espinoza Blas. TE. AUTOR. CA. INGENIERO ZOOTECNISTA. IO. CÓDIGO DE MATRICULA : 022200110. BI BL. ASESOR. : Dr. Gilmar Mendoza Ordoñez. TRUJILLO-PERÚ 2017 i. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) BI BL. IO. TE. CA. DE. AG. RO. PE CU AR IA S. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) PE CU AR IA S. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. A Dios por cada día de vida que me ofrece, por guiarme en mi camino,. RO. por darme la sabiduría en mis obstáculos, decisiones y por las. AG. fuerzas para lograr mis objetivos ante la adversidad.. A mis padres Berardo y Norma por darme oportunidad,. en. mi. formación. DE. otra. educacional, por su apoyo. constante,. consejos, cuidados y sobre todo paciencia. IO. TE. profesional.. CA. en el trayecto de mi formación personal y. BI BL. A mi Papi Francisco, que, en un rinconcito del cielo, sé que está cuidándome en mis viajes.. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PE CU AR IA S. AGRADECIMIENTOS. A Dios por darme las fuerzas y valentía en cada paso de mi vida para poder lograr mis metas, por darme la sabiduría para comprender los episodios de mi vida,. que viene acompañado de un propósito, por haberme cuidado durante este tiempo y no abandonarme cuando lo necesite.. A mis padres, que son mi inspiración y motivación de superarme cada día, por su apoyo en mis decisiones y por el coraje de sacarme adelante, por sus consejos,. RO. su amor y sobre todo su paciencia durante mi formación académica.. Al Dr. Gilmar Mendoza Ordoñez por incentivarnos a explorar nuevos campos que gracias a él pude formar parte del equipo del Laboratorio de. AG. Mejoramiento Genético de Huancavelica.. Al M.Sc. Rufino Paucar Chanca por la orientación, paciencia, ayuda y. DE. sobre todo por impartir sus conocimientos en esta etapa de mi formación profesional para la realización de la tesis.. CA. A FOCAM, por el financiamiento de la presente tesis del proyecto “Evaluación Genética de caracteres de importancia económica en alpacas Huacaya. TE. del distrito de Pilpichaca de la provincia de Huaytara- Región Huancavelica” Al profesor Manuel Pesantes Vera, quien me brindo su asistencia de forma. IO. generosa durante el proceso de este proyecto.. BI BL. De manera especial, a una persona importante en mi vida por su apoyo. incondicional, sus consejos y sobre todo su afecto acompañándome en este trayecto de mi vida. Finalmente, agradezco a todas las personas que ayudaron directa e. indirectamente en la realización de este proyecto.. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PE CU AR IA S. RESUMEN La presente investigación se llevó a cabo en el Centro de Investigación y Desarrollo. de Camélidos Sudamericanos – Lachoc, ubicado a 4680 m.s.n.m. en la provincia y región de Huancavelica, con el objetivo de determinar cuál de las fuentes de. extracción de ADN: folículos pilosos y sangre, se obtiene una mayor cantidad y calidad del ADN en Vicugna pacos “Alpacas”. Se seleccionaron aleatoriamente 19 alpacas por tratamiento y se tomaron muestras de un trozo de piel con folículos. pilosos y 2 ml de sangre extraído de la vena yugular. El análisis molecular se realizó. RO. en el Laboratorio de biotecnología de la Universidad Nacional de Huancavelica.. AG. Para el establecimiento de los parámetros estadísticos y la prueba de T de Student se utilizó el software SPSS versión 21. La cantidad de ADN, tuvo una media de 38,8 ± 19,4 para folículo piloso (T1) y 9,0 ± 2,1 ng/μl, para sangre (T2), calculándose. DE. diferencias estadísticas altamente significativas (p ≤ 0,01) entre las medias de ambos tratamientos. La pureza del ADN en sangre de alpacas, tuvo una media de 1,818 ±. CA. 0,057 para el T1 y 1,849 ± 0,112 nm, para el T2, no estableciéndose diferencias estadísticas significativas (p>0.05) entre las medias ambos tratamientos. Para la. TE. integridad del ADN, se obtuvo mejores resultados con el método de extracción en. IO. sangre, que presento un 58 % de bandas no fragmentadas, mientras que las muestras del método de extracción con folículos pilosos, presento un 37% de bandas con. BI BL. fragmentación.. Palabras claves: ADN, folículos pilosos, sangre, alpacas.. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PE CU AR IA S. ABSTRACT. This research was carried out at the Center for Research and Development of South American Camelids - Lachoc, located at 4680 m.s.n.m. In the province and region of. Huancavelica, in order to determine which of the sources of DNA extraction: hair. follicles and blood, a greater quantity and quality of the DNA in Vicugna pacos "Alpacas" is obtained. 19 alpacas were randomly selected per treatment and samples. RO. were taken from a piece of skin with hair follicles and 2 ml of blood extracted from. the jugular vein. The molecular analysis was carried out in the Biotechnology. AG. Laboratory of the National University of Huancavelica.. The SPSS software version 21 was used to establish the statistical parameters and the. DE. Student's t test. The DNA quantity had an average of 38.8 ± 19.4 for hair follicle (T1) and 9.0 ± 2, 1 ng / μl for blood (T2), with highly significant statistical differences. CA. (p ≤ 0.01) being calculated between the means of both treatments. DNA. The bility in alpacas blood had an average of 1,818 ± 0,057 for T1 and 1,849 ± 0,112 nm for T2,. TE. with no statistically significant differences (p> 0.05) between the two treatments. For DNA integrity, better results were obtained with the blood extraction method, which. IO. presented 58% of non-fragmented bands, while samples of the hair follicle extraction. BI BL. method presented 37% of bands with fragmentation.. Keywords: DNA, hair follicles, blood and alpacas.. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PE CU AR IA S. ÍNDICE GENERAL. Páginas. DEDICATORIA............................................................................................................. iii AGRADECIMIENTO ................................................................................................... iv RESUMEN ...................................................................................................................... v. RO. ABSTRACT .................................................................................................................... vi. CAPÍTULO I: INTRODUCCION ................................................................................ 1 : MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................... 5. AG. CAPÍTULO II. DE. CAPÍTULO III: RESULTADOS ................................................................................ 14 CAPÍTULO IV: DISCUSIÓN ..................................................................................... 24. CA. CAPÍTULO V: CONCLUSIONES ............................................................................. 28. TE. CAPÍTULO VI: REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................... 29. BI BL. IO. ANEXOS ........................................................................................................................ 32. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PE CU AR IA S. ÍNDICE DE ESQUEMAS. Pág.. BI BL. IO. TE. CA. DE. AG. RO. Esquema 01. Distribución de las unidades experimentales por tratamientos ..............10. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PE CU AR IA S. ÍNDICE DE TABLAS Pág.. Tabla 01. Niveles de concentración (ng/ μl) de ADN en piel con folículo piloso. alpacas ........................................................................................................................... 15 Tabla 02. Niveles de concentración (ng/μl) de ADN en sangre de alpacas ................. 16 Tabla 03. Parámetros estadísticos descriptivos de las cantidades de ADN (ng/μl). RO. por tratamiento .............................................................................................................. 17 Tabla 04. Prueba T de Student de la comparación de las medias de las cantidades. AG. de ADN en folículos pilosos y sangre .......................................................................... 18 Tabla 05. Niveles de pureza (A260/A280nnm) de ADN en folículos pilosos de. DE. alpacas ........................................................................................................................... 19. CA. Tabla 06. Niveles de pureza (A260/A280nnm) de ADN en sangre de alpacas ........... 20 Tabla 07. Parámetros estadísticos descriptivos de la pureza(A260nm/A280nm) de. TE. ADN por tratamiento .................................................................................................... 21 Tabla 08. Prueba T de Student de la comparación de las medias de pureza del ADN. BI BL. IO. en folículos pilosos y sangre. ........................................................................................ 22. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PE CU AR IA S. ÍNDICE DE FIGURAS Pág.. Figura 01. Visualización de la integridad del ADN en electroforesis en gel de. agarosa, en muestras con folículos pilosos. ..................................................................23 Figura 02. Visualización de la integridad del ADN en electroforesis en gel de. BI BL. IO. TE. CA. DE. AG. RO. agarosa,en muestras de sangre……............................ ..................................................24. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PE CU AR IA S. ÍNDICE DE FOTOS. Pág.. Foto 01. Selección de animales en Lachoc...................................................................40. Foto 02. Ubicación de la vena yugular ......................................................................... 40 Foto 03. Extracción de sangre de la vena yugular ........................................................ 40. RO. Foto 04. Materiales para extracción de piel con folículo piloso .................................. 41 Foto 05. Ubicación de la región costillar media de la alpaca ....................................... 41. AG. Foto 06. Lavado con agua y jabón de la región costillar media. ................................. 41 Foto 07. Rapado de costillar media .............................................................................. 41. DE. Foto 08. Desinfección con alcohol en el costillar media. ............................................ 41. CA. Foto 09. Presión con el sacabocado en área del costillo media. ................................... 41 Foto 10. Marca superficial después del uso del sacabocado. ....................................... 42. TE. Foto 11. Retiro del tejido epitelial haciendo uso de un bisturí y una pinza (diente de. IO. ratón). ............................................................................................................................ 42 Foto 12. Muestra ya extraída, colocada en un frasco de vidrio debidamente. BI BL. esterilizado y rotulado. .................................................................................................. 42 Foto 13. Colocación de alcohol en la zona de incisión. ............................................... 42 Foto 14. Aplicación de curabichera en el área de la incisión. ...................................... 42. Foto 15. Muestra extraída retirada del frasco de vidrio. .............................................. 43. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Foto 16. Lavado de la muestra con agua ultra pura...................................................... 43. PE CU AR IA S. Foto 17. Colocación de la muestra en un eppendorf de 11ml. ..................................... 43 Foto 18. Muestra de piel con folículo piloso en un eppendorf. .................................... 43. Foto 19. Muestras de piel con folículo piloso congelados. .......................................... 44 Foto 20. Muestra en eppendorf congelada de piel con folículo piloso......................... 44. Foto 21. Muestra de piel con folículo piloso ................................................................ 44. Foto 22. Trituración de la muestra con la ayuda de un bisturí y una pinza. ................. 44. RO. Foto 23. Colocación de la muestra ya triturada en un eppendorf. ................................ 44. Foto 24. Muestra triturada en un eppendorf. ................................................................ 44. AG. Foto 25. Pipeteo de 180 μl de tampón ATL ................................................................. 45 Foto 26. Adición de 180 μlde tampón ATL a muestras a trituradas ............................ 45. DE. Foto 27: Adición de 20 μlProteinasa K, a muestras. .................................................... 45 Foto 28. Homogenización de las muestras en el vortéx. ............................................. 45. CA. Foto 29. Muestra después de la homogenización ......................................................... 45. TE. Foto 30. Muestras para incubar a temperatura ambiente toda la noche ....................... 45. IO. Foto 31. Incubación de muestras 1 hora a una T° 56°C. .............................................. 46. BI BL. Foto 32. Adición a 200ul de tampón AL. ..................................................................... 46 Foto 33. Incubación de muestras a 56 °C durante 10. .................................................. 46 Foto 34. Adición a 200 μl de etanol (100%) ................................................................ 46 Foto 35. Homogenización en el vortéx ........................................................................ 46 Foto 36. Pipeteado de mezcla en una columna de centrifugación ................................ 46 xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Foto 37. Columna y tubo de recolección ...................................................................... 47. PE CU AR IA S. Foto 38. Colocación de columnas y tubos de recolección. .......................................... 47 Foto 39. Centrifugación a ≥ 6000 x g (8000 rpm) durante 1 min. ............................... 47 Foto 40. Descarte y traspaso a columna y l tubo de recolección. ................................. 47. Foto 41. Pipeteo 500 μl Buffer AW1 ........................................................................... 48. Foto 42. Adición de 500 μlBuffer AW1 a muestras. .................................................... 48 Foto 43. Centrifugación durante 1 min a ≥6000 x g. ................................................... 48 Foto 44. Descarte y traspaso de columna y tubo de recolección. ................................. 48. RO. Foto 45. Adición de 500 μl Buffer AW2 a muestras. ................................................... 48. AG. Foto 46. Centrifugación de las muestras durante 3 min a 14 000 rpm. ........................ 48 Foto 47 Transferencia tubo de micro centrífuga de 1,5 ml o 2 ml. .............................. 48. DE. Foto 48. Precalentado de tampón AE a durante 5 min T° 56°C. ................................. 48 Foto 49. Adición de 500 μl Buffer AW2 a muestras. ................................................... 49. CA. Foto 50. Colocación de las muestras a centrifugar durante 1 min a 8000 rpm. ........... 49. TE. Foto 51. Traspaso de la muestra de a un tubo de recolección. ..................................... 49. IO. Foto 52. Muestras de ADN procesado a partir de piel con folículo piloso. ................. 49 Foto 53. Colocación de muestras de ADN procesado en el refrigerador a 4 °C. ......... 50. BI BL. Foto 54. Adición 20 μl de proteínas K en un tubo de micro centrífuga de 1,5 ml o 2 ml. .............................................................................................................................. 50 Foto 55. Muestras de sangre en tubos vacutainer ......................................................... 50 Foto 56. Adición 50 - 100 μl de sangre tratada con anticoagulantes. .......................... 50 xiii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Foto 57. Adición a 200 μlde tampón AL a las muestras de sangre. ............................. 50. PE CU AR IA S. Foto 58. Colocación de las muestras en el termoshecker. ............................................ 50 Foto 59. Muestras en el termoshecker a 5’ a una T° 25° C .......................................... 50. Foto 60. Muestra después de la incubación. ................................................................. 51. Foto 61. Adición a 200 μl de etanol (100%). Absoluto helado. ................................... 51 Foto 62. Homogenización de la muestra. ..................................................................... 51 Foto 63. Pipeteo de la mezcla obtenida ........................................................................ 51 Foto 64. Columna de centrifugación DNeasy Mini colocado en un tubo de recogida. RO. de 2ml. .......................................................................................................................... 51. AG. Foto 65. Adición de la mezcla a la columna de centrifugación. .................................. 51 Foto 66. Colocación de muestras para centrifugar a ≥ 6000 x g (8000 rpm) durante. DE. 1 min. ............................................................................................................................ 52 Foto 67. Muestra después de la centrifugación en el tubo de recolección. ................. 52. CA. Foto 68. Traspaso de columnas de ADN a tubos de recolección. ................................ 52. TE. Foto 69. Adición 500 μl Buffer AW1. ......................................................................... 52 Foto 70. Centrifugación de muestras durante 1 min a ≥6000 x g. ............................... 52. IO. Foto 71. Muestra después de la centrifugación. ........................................................... 52. BI BL. Foto 72. Colocación la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recogida de 2 ml .............................................................................................................................. 53. Foto 73. Adición 500 μl Buffer AW2. ......................................................................... 53 Foto 74. Centrifugación de muestras durante 3 min a 20.000 x g (14 000 rpm).......... 53. xiv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Foto 75. Muestra después de la centrifuga. .................................................................. 53. PE CU AR IA S. Foto 76. Traspaso de muestras después de la centrifuga a tubos de recolección. ........ 53 Foto 77. Calentado de tampón AE durante 5 min a una T° 56°C. ............................... 53. Foto 78. Adición de 200 μlde tampón AE. ................................................................... 54 Foto 79. Centrifugación durante 1 min a ≥6000 x g (8000 rpm). ................................ 54. Foto 80. Muestra después de la centrifugación. ........................................................... 54. Foto 81. Retirada de la columna. .................................................................................. 54. RO. Foto 82. Muestra de ADN procesado a partir de sangre. ............................................. 54 Foto 83. Conservación del ADN extraído en el refrigerador a 4 °C ............................ 54. AG. Foto .84: Limpieza del lente con un papel absorbente ................................................. 55 Foto 85. Pipeteo con agua ultra pura 0.3μl para calibración. ....................................... 55. DE. Foto 86. Colación de agua ultra pura en el pedestal. .................................................... 55 Foto 87. Colocación del dispositivo de diluciones Lid Factor 10. ............................... 55. CA. Foto 88. Calibración del Nanodrop. ............................................................................. 55. TE. Foto 89. Secado del lente con papel absorbente. .......................................................... 55. IO. Foto 90. Homogenización de ADN, en el vortéx del Nanodrop. ................................. 56 Foto 91. Pipeteo de ADN homogeneizado. .................................................................. 56. BI BL. Foto 92. Pipeteo 0.3 μl de ADN procesado en el pedestal ........................................... 56 Foto 93. Procesamiento de ADN. ................................................................................. 56 Foto 94. Peso 1.6 gr. de agarosa en una balanza analítica. .......................................... 57 Foto 95. Adición de agarosa indicada en el punto anterior en un erlenmeyer ............. 57 xv. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Foto 96. Tampón TBE 0.5X, junto con la cantidad de agarosa ................................... 57 Foto 97. Medición de 150 ml de tampón TBE 0.5X, para verter en un erlenmeyer. PE CU AR IA S. con agarosa. .................................................................................................................. 57 Foto 98. Removiendo el erlenmeyer, durante el calentamiento hasta disolver. .......... 57. Foto 99. Gel de agarosa enfriándose ............................................................................ 57 Foto 100. Reactivo Gel Red ......................................................................................... 58 Foto 101.Adición de 15 μl de Gel Red en solución de agarosa. .................................. 58. Foto 102. Vaciado de la solución en el molde y colocación del peine......................... 58. RO. Foto 103.Verificación del gel con la ayuda de una puntilla para ver si ha sido. AG. solidificado.................................................................................................................... 58 Foto 104. Colocación del molde en la cubeta de electroforesis ................................... 58. DE. Foto 105. Adición de buffer TBE 0.5X 700 ml en la cubeta pequeña de electroforesis ...................................................................................................................................... 58. CA. Foto 106. Tampón de carga, azul de Bromophenol ..................................................... 59. TE. Foto 107. Pipeteo de 2.5 μl de tampón de carga, sobre un trozo de parafilm .............. 59 Foto 108. Pipeteo 5μl ADN procesado......................................................................... 59. IO. Foto 109.Mezcla del volumen de muestra a cargar con el tampón de carga ................ 59. BI BL. Foto 110. Pipeteo de las mezclas obtenidas dentro del pocillo .................................... 59 Foto 111. Marcador de peso molecular 100 bp (ng/banda = 150 ng DNA total) ......... 59 Foto 112. Fuente de alimentación 40 V para a geles de calidad de DNA .................... 60 Foto 113Visualización de la franja de ADN ................................................................ 60. xvi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Foto 114.Retiro del gel de la solución de TBE 0.5X, en una cubeta para ser transportado al fotodocumentador ................................................................................ 60. PE CU AR IA S. Foto 115.Gel de agarosa en el fotodocumentador ........................................................ 60. BI BL. IO. TE. CA. DE. AG. RO. Foto 116. Sistema fotodocumentador……………………………………………… 60. xvii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PE CU AR IA S. CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN. La crianza de camélidos sudamericanos domésticos (alpacas y llamas) constituyen el principal medio de subsistencia para más de un millón de pequeños productores de. los andes centrales de Sudamérica (Quispe et al., 2009); en el caso del Perú según la. FAO (2005), las alpacas y llamas constituyen el principal medio de subsistencia de un gran sector de la población de las zonas alto andinas, a través del aporte de fibra,. RO. carne, energía de trabajo y otros subproductos (Wang et al., 2003).. El manejo y aprovechamiento de las alpacas data desde las culturas pre colombinas. AG. que habitaron los andes meridionales de América del Sur. El número de estos animales se redujo notablemente, lo cual produjo una disminución del acervo. DE. genético en esta especie. Esto producido por dos hechos principales. El primero, la conquista española, con la cual decayó la crianza de estos animales, así como el. CA. mejoramiento genético; y el segundo, radicó en la caza furtiva a la que fueron afectadas debido a su valiosa fibra. (Fernández, 1991).. TE. Históricamente, la colecta de muestras para estudios de genética en animales silvestres ha sido a través de la captura de los animales, lo que implica la generación. IO. de estrés, alteración del comportamiento individual o social y, algunas veces, la. BI BL. muerte del animal. En la actualidad, con el avance de la ciencia, el monitoreo no invasivo de poblaciones de animales es una herramienta de importancia en los estudios de conservación y manejo de especies amenazadas o elusivas (Kohn y Wayne, 1999; Waits y Paetkau, 2005). Dichos estudios se ven facilitados con la obtención y análisis de ADN a partir de muestras como las heces, pelos y restos de 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. piel, entre otros. La extracción y análisis de ADN (Panasci et al., 2011) permite obtener información detallada sobre la estructura genética (Quéméré et al., 2010) y. PE CU AR IA S. genómica (Ouborg et al., 2010; Perry et al., 2010), así como la abundancia de las poblaciones sin perturbar a los animales; información esencial para un adecuado. manejo de especies amenazadas. (Luikart et al., 2010; Brinkman et al., 2011 y Poole et al., 2011). El estudio de la variación genética entre individuos, poblaciones y especies permite. explicar patrones y procesos ecológico-evolutivos, el cual se aborda mediante marcadores moleculares, segmentos de ADN con o sin función conocida que. RO. proporcionan información sobre la variación alélica y permiten distinguir individuos (Schlotterer, 2004). Estos marcadores se obtienen con técnicas como PCR (por las. AG. siglas en ingles de Polymerase Chain Reaction) y secuenciación, que hacen posible analizar la variación en la molécula del ADN con un detalle sin precedentes. DE. (Schlottlerer, 2004; Hudson, 2008). Los marcadores moleculares corresponden a cualquier secuencia de ADN y/o detección de efectos cuantificable u observable. CA. (características fenotípicas), que además puede detectarse fácilmente. Este tipo de marcadores pueden evaluarse desde que los individuos están en sus primeros estadios. TE. de desarrollo, y se pueden usar en todo el individuo o sólo parte de él. Se habla de marcadores genéticos cuando se transmiten según las leyes básicas de la herencia. IO. mendeliana, por lo que es importante destacar que no todos los marcadores. BI BL. moleculares pueden considerarse como genéticos. Existen dos tipos de marcadores moleculares: los marcadores proteicos e izoenzimáticos y los marcadores de ADN. (Nuez y Carrillo, 2000). Los datos moleculares han permitido estudiar con mayor precisión los patrones de diversidad genética y su distribución; el comportamiento; la selección natural; las. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. interacciones biológicas; la composición, funcionamiento; así como las relaciones filogenéticas, entre otros (Sunnucks, 2000; Schlotterer, 2004 y Hudson, 2008).. PE CU AR IA S. La aplicación de técnicas moleculares se inicia con la extracción de ADN y la obtención exitosa de datos confiables y reproducibles depende, en gran medida, de la. extracción de ADN íntegro y puro. A lo largo del tiempo se han diseñado distintos protocolos con la finalidad de obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así. como garantizar la eliminación de inhibidores potenciales que dificulten el. tratamiento posterior de la molécula. Los métodos tradicionales, desarrollados en los años 50, utilizan solventes orgánicos para separar a las proteínas del ADN y, una vez. RO. suspendido en la fase acuosa, aislarlo por precipitación con etanol. Estos métodos requieren preparar soluciones y la extracción puede tomar desde unas horas hasta. AG. varios días por los numerosos pasos que deben realizarse (Sunnucks, 2000; Schlotterer, 2004 y Hudson, 2008).. DE. A partir de los años 90 se introdujeron al mercado combos o kits de extracción que utilizan matrices inorgánicas compactas cargadas positivamente capaces de retener. CA. varios microgramos de ADN y separarlos del resto de las biomoléculas, permitiendo obtener un extracto libre de inhibidores. Los combos se venden en presentación de. TE. membranas de sílice o perlas magnéticas, las primeras están formadas por una resina y las segundas consisten de un centro de hierro recubierto por resina (Guinn, 1966;. IO. Dundass et al., 2008). Los combos también incluyen soluciones de lisis, unión y. BI BL. lavado que no contienen fenol ni cloroformo para extraer proteínas, tampoco requieren etanol para precipitar al ADN (Qiagen, 2005; Invitrogen, 2005). Los kits comerciales disminuyen la extracción a unas cuantas horas porque reducen el número de pasos del procedimiento, utilizados bajo las recomendaciones de cada proveedor, garantizan una extracción de alta pureza ya que tanto la recuperación del ADN como. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. la eliminación de contaminantes son muy eficientes (Qiagen, 2005; Invitrogen, 2005).. PE CU AR IA S. La selección del método de extracción es un paso fundamental en las técnicas. moleculares y depende del organismo bajo estudio, el tejido disponible y su estado. de conservación, la técnica que se aplicara posteriormente, así como la infraestructura de los laboratorios, los recursos económicos, la necesidad de personal. capacitado y tiempo para obtener resultados independientemente del método seleccionado es necesario encontrar un equilibrio entre pureza y rendimiento de. acuerdo a la aplicación posterior, que permitirá lograr optimizar un protocolo de. RO. extracción de ADN favorable, con la obtención de ADN íntegro y puro, que es parte. primordial para el buen desempeño de las técnicas utilizadas en biología molecular. AG. (Tang et al., 2005; Wang et al., 2005). De esta manera se favorece que los investigadores se enfoquen en analizar e interpretar la gran cantidad de datos. DE. genómicos obtenidos (Tang et al., 2005, Stormer et al., 2007 y Dundass et al., 2008). Debido a la carencia de información sobre este tema, el presente estudio tiene como objetivo determinar el análisis de cantidad y calidad de ADN genómico extraído en. CA. folículos pilosos y sangre de Vicugna pacos “alpacas” mediante el método comercial.. TE. Este trabajo sentara las bases para poder iniciar un plan de mejoramiento genético con aplicación de marcadores a partir de la optimización de protocolos establecidos y. IO. así contribuir con el desarrollo de la ganadería alpacuna en la región de Huancavelica. BI BL. y en el Perú.. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. CAPÍTULO II. PE CU AR IA S. MATERIALES Y MÉTODOS. 2.1. LUGAR DE INVESTIGACION:. El presente trabajo de investigación se realizó en el Laboratorio de Mejoramiento Genético (LAMG) de la Universidad Nacional de Huancavelica, ubicado en el. distrito, provincia y departamento de Huancavelica, a una altitud aproximada de 3680 msnm a 74º 98’ longitud oeste y 12º 78’ latitud sur. El clima es frío, siendo la. 829.6 mm.. AG. 2.2. MATERIAL DE ESTUDIO:. RO. temperatura media anual que varía entre 5 a 8 ºC y una precipitación pluvial anual de. DE. Material Experimental:  38 Alpacas. CA. Material de campo:.  Botas de jebe. TE.  Cuaderno de campo  Cámara Fotográfica. IO.  Lapiceros. BI BL.  Guantes  Overol. Material de Laboratorio:  Guantes de nitrilo. 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación.  Papel toalla..  Erlenmeyer  Gradillas para tubos eppendorf  Matraz (1000 ml). PE CU AR IA S.  Bisturí y pinza..  Tubos vacutainer (EDTA) de 5 ml  Tubos falcón graduado 50 ml  Tubos eppendorf 1.5 y 2 ml..  Micropipeta de Rango Variable de 0.5 − 10 μl. RO.  Micropipeta de Rango Variable de 2 − 20 μl.  Micropipeta de Rango Variable de 10 − 100 μl. AG.  Micropipeta de Rango Variable de 20 − 200 μl  Micropipeta de Rango Variable de 100 − 1000 μl. DE.  Puntas pipetas (Tips 0.1 - 10 ul,100 - 1000ul y 1-200ul) (1000 puntas)..  Frasco Transparente tapa rosca (1000 ml).. CA.  Papel parafilm.. TE.  Papel aluminio.. BI BL. IO. Equipos de laboratorio:  Vortéx VWR Internacional.  Minicentrífuga de cabina (6000 rpm)  Termoshecker.  Microcentrífuga Refrigerada para 24 tubos de 1.5ml o 2.0ml  Horno microondas Samsung 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación.  Ph metro Compact. (Eppendorf).. temperatura)  Congelador de -20ºC.. (agitador. magnético. y. PE CU AR IA S.  Thermomixer.  Implen NanoPhotometer®P-Class (p330)  Fotodocumentador de geles..  Cámara de electroforesis vertical y horizontal (Cubetas y fuente de electroforesis) Reactivos:. RO.  Proteinasa K (35 unid. /mg) (2 ml).  Etanol Absoluto helado (2.5 Lt). AG.  DNeasy® Blood&Tissue Kit de extracción de DNA sangre y piel.  Agua desionizada. DE.  ddH2 O (Agua ultra pura - 500 ml)  Agarosa de alta calidad (25 Gr). CA.  Ácido bórico 99% X 1K.  EDTA (PM 372) (100 gr).. TE.  Tris ultra puro (PM 121.14) x 500 Gr.  Gel Red 10,000x. BI BL. IO.  Bromophenol Blue-Xylen Cyanole Dye Solution  Marcador de peso molecular (100 Y 50. bp ladder)  HCl (2.5 Lts)  Hidróxido Sódico (500 gr)  Hibimax (Desinfectante) (1000 ml). 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Material de escritorio:  Hojas bond A4 de 80 g. PE CU AR IA S.  Laptop HP 14  Memoria USB- Hp 16gb..  Impresora Canon- PIXMA MP 250  Cuaderno de trabajo  Lapiceros y regla. 2.3.METODOLOGÍA:. RO. 2.3.1. Tamaño de Muestra:. La muestra fue de 38 alpacas (19 en cada fuente de extracción). AG. Para el cálculo del tamaño de muestra, se comparó promedios en dos. DE. poblaciones. Se utilizó la siguiente expresión:. ( X1  X 2 )2. BI BL. IO. TE. CA. n. ( Z1 / 2  Z1  ) 2 * ( S12  S 22 ). 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Donde:. 𝜶. 1 − α = Nivel de Confianza 𝑧1−𝛼/2 = Valor Tipificado de Z β = Error tipo II 1-β= Poder Estadístico z1−β = Valor Tipificado de Z Varianza del Grupo 1. RO. Varianza del Grupo 2. AG. Diferencia Propuesta. 0.05. PE CU AR IA S. 𝜶 = Error tipo I. 0.95. 𝑧1−𝛼/2. 1.96. Β. 0.20. 1-β. 0.80. z1−β. 0.84. 𝑠12. 0.19. 𝑠22. 0.19. d=. 0.40. 18.72. DE. Tamaño de cada grupo (n). 1−α. 2.3.2. Modelo de la investigación:. CA. Se utilizó un diseño completamente al azar, donde los tratamientos fueron las fuentes de obtención de ADN: folículos pilosos y sangre de alpaca.. TE. Tratamientos:. BI BL. IO. . . T1: ADN extraído en folículos pilosos de piel de alpaca previo raspado. T2: ADN extraído de la sangre de alpaca.. La distribución de las unidades experimentales de la presente investigación puede observarse en el Esquema 1.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Fuentes. PE CU AR IA S. Esquema 01. Distribución de las unidades experimentales por tratamientos. Tratamientos. Repeticiones R1 R2. Folículos Pilosos. T1. …. …. R19 R1. RO. R2. ….. T2. … R19. DE. AG. Sangre. 38. CA. TOTAL. TE. 2.3.3. Obtención de Muestras:. 2.3.3.1. Procedimiento en Campo:. BI BL. IO. . . Selección de Animales: Se utilizaron 38 alpacas de raza Huacaya al azar. Toma de muestras de Piel con folículos pilosos: Procedimiento:  Se sujetó al animal adecuadamente.  Ubicó la región costillar media de la alpaca.. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación.  Con una tijera se cortó parte de la fibra, para facilitar la preparación del área donde se tomó la muestra.. PE CU AR IA S.  Realizo el lavado con agua y jabón en el área de incisión.  Uso de la navaja para afeitar la zona donde se realizó la incisión..  Desinfecto con alcohol el área de incisión..  Se ejerció una ligera presión con el sacabocado con. movimientos circulares de manera superficial a nivel epitelial sin profundizar en el músculo.. RO.  Retiró del tejido epitelial con folículos pilosos (raíz del pelo) haciendo uso de un bisturí y una pinza (diente de ratón).. AG.  La muestra ya extraída se colocó en un frasco de vidrio debidamente esterilizado y rotulado con la identificación del. DE. animal..  Aplico un desinfectante (curabichera en aerosol) en la zona de. Transporte de la muestra:. TE. . CA. incisión.. BI BL. IO.  Cada muestra fue identificada y colocada en una caja de tecnopor..  Evito movimientos bruscos durante el trasladó al lugar donde se realizó los análisis respectivos (laboratorio de mejoramiento genético – LAMG).. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. . Toma de muestras en sangre: Procedimiento:. PE CU AR IA S.  Se sujetó al animal..  Extrajo muestras de sangre, mediante punción de la vena yugular con agujas de calibre 21, en cantidad de 2ml,. utilizando tubos al vacío con 0.3 ml de anticoagulante (EDTA). Transporte de la muestra:.  Cada muestra fue identificada.. RO.  Conservó la muestra a -4ºC..  Evitó movimientos bruscos durante el trasladó al lugar donde realizó. los. análisis. AG. se. respectivos. (laboratorio. de. DE. mejoramiento genético – LAMG).. 2.3.3.2.Procedimiento en Laboratorio:. CA. Muestras de piel con folículos pilosos:. TE.  Las muestras, fueron retiradas (pinza diente de ratón) de los frascos de recolección, para luego ser lavadas con agua ultra pura.. IO.  Cada muestra fue colocada en un eppendorf de 1 ml.. BI BL.  Colocadas todas las muestras en las gradillas, se procedió a llevar al refrigerador a 4° C. El método utilizado se muestra en Anexos: Protocolo para extracción de ADN en folículos pilosos y sangre.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.3.4. Datos registrados:  Cantidad de ADN obtenido.. PE CU AR IA S.  Calidad de ADN obtenido.. o Pureza de ADN obtenido.. o Integridad de ADN obtenido. 2.3.5. Parámetros evaluados: 2.3.5.1.Cantidad y calidad de ADN obtenido:. La cantidad y calidad (pureza) de ADN, se evaluó a través del equipo NanoPhotometer® P-Class(P330).. Que es un espectrofotómetro de UV. RO. visible de espectro completo, utilizado para cuantificar el ADN, ARN, proteínas, oligo proteínas, BCA, Bradford, Lowry y Biuret en micro. AG. volúmenes en unidades de 0,3 μl – 5 μl.. DE. Cantidad de ADN obtenido:. El equipo NanoPhotometer® P-Class (P330), arroja la concentración (ng/ μl). CA. de ADN presente en la muestra. El método utilizado se muestra en Anexos:. TE. Protocolo de Nanophotometer® p-class (p 330). Calidad de ADN obtenido:. IO. Para la calidad de ADN, se puede evidenciar de dos maneras, con la pureza. BI BL. y la integridad de ADN. o Pureza de ADN obtenido: El ADN está establecido que se puede cuantificar a 260 nnm, se lee a una absorbancia de 260nnm de longitud de onda, que equivale a un Lid Factor 50. La relación será. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. dada a una A 260 /A 280 nnm, da una indicación de la pureza mas no una indicación definitiva.. rangos: o 1.8 hasta 2.0 nnm o < 1.8 nnm. PE CU AR IA S. Las proporciones de A 260 /A 280 nnm, se evaluó con los siguientes. = Alta Pureza. = Contaminación de Fenoles. o > 2.0 nnm. = Contaminación de Proteínas. o Integridad de ADN obtenido: La integridad de ADN, se evalúo a. RO. través del equipo de Electroforesis. El método consistió en someter la muestra con ADN a una corriente eléctrica mientras está embebido en. AG. una matriz de agarosa por donde se desplazó en función de la corriente aplicada, el tiempo de migración, el tamaño y carga de las. DE. cadenas de DNA. (Alejos V, Aragón M y Cornejo R. 2010). El. CA. método utilizado se muestra en Anexos: Protocolo de Electroforesis.. 2.3.5. Análisis estadístico:. TE. Se utilizó el análisis de varianza correspondiente al diseño completamente al azar. Para determinar las diferencias estadísticas entre los promedios de los. IO. tratamientos, se utilizó la prueba de T de Student.. BI BL. Para el procesamiento de datos se usó las hojas Excel, y para el análisis estadístico se utilizó el software SPSS versión 21.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. CAPÍTULO III. PE CU AR IA S. RESULTADOS 3.1 DETERMINACIÓN DE LA CANTIDAD DE ADN PARA FOLÌCULOS PILOSOS Y SANGRE. Los niveles de concentración (ng/μl) de ADN por cada animal evaluado, se observan en las siguientes tablas.. Tabla 01. Niveles de concentración (ng/μl) de ADN en piel con folículos pilosos alpacas. 31,0. 1. 49,0. 4. DE. 5. AG. 2 3. Concentración ng/ μl. RO. N° de Animal. 26.5 30,0 52.5. 7. 55.5. 8. 23,0 21.5. 10. 40.5. 11. 36,0. 12. 21,0. 13. 14.5. 14. 22.5. 15. 12,0. 16. 49.5. 17. 78.5. 18. 76,0. 19. 39,0. TE. CA. 6. 9. IO BI BL. 59,0. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PE CU AR IA S. Tabla 02. Niveles de concentración (ng /μl) de ADN en sangre de alpacas. N° de Animales. Concentración ng/μl. 1. 8,0. 2. 6,0. 3. 13,5. 4. 7,0. 5. 8,5. 6. 8,5. 7. 8,5. 8. 8,0 7,0. RO. 9 10. 8,5. 12 13 14. DE. 15. 11,0. AG. 11. 14,0 9,5 8,5 8,5 9,0. 17. 11,5. 18. 6,5. 19. 9,5. BI BL. IO. TE. CA. 16. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En la tabla 03, se muestra los parámetros estadísticos descriptivos, donde se obtuvo para el T1, una media de 38,8 ± 19,4 ng/μl; con un valor mínimo de 12,0 y un. PE CU AR IA S. máximo de 78,5 ng/μl, correspondiéndole un coeficiente de variación de 50%. Para el T2, una media de 9,0 ± 2,1 ng/μl, con un valor mínimo de 6,0 y un máximo de 14,0 ng/μl, correspondiéndole un coeficiente de variación de 23,3 %.. Tabla 03. Parámetros estadísticos descriptivos de las cantidades de ADN (ng/μl) por tratamiento. Máx.. T1. 19. 12,0. 78,5. T2. 19. 6,0. Coeficiente de Variación. 38,8. 19,4. 50,0. AG 14,0. 9,0. 2,1. 23,3. BI BL. IO. TE. CA. DE. Tratamiento. Desviación Estándar. Media. RO. N. Mín.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La tabla 04, presenta la prueba T de Student, determinándose un valor de p= 0,00. Esto indica que entre los promedios de ambos tratamientos existen diferencias. PE CU AR IA S. estadísticas altamente significativas (p ≤ 0,01) entre las medias de concentraciones de ADN en folículo piloso y sangre; siendo mayor en folículos pilosos (38,8) que en sangre (9,0).. Tabla 04. Prueba T de Student de la comparación de las medias de las cantidades de ADN en folículos pilosos y sangre. RO. Prueba T para la igualdad de medias Tratamiento. 38,8. DE. T1. Sig.. 6,6. 36. 0,0. 9,0. BI BL. IO. TE. CA. T2. G. L. AG. T. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 3.3 DETERMINACION DE LA CALIDAD DE ADN PARA FOLÌCULOS. PE CU AR IA S. PILOSOS Y SANGRE: PUREZA:. Los niveles de pureza (ng /μl) de ADN, por cada animal evaluado se observan en las siguientes tablas.. Tabla 05. Niveles de pureza (A260/A280nnm) de ADN en folículos pilosos de alpacas. 1.771. 1. 1.815. 4. DE. 5. AG. 2 3. A260/A280. RO. N° de Animal. 1.828 1.846. 6. 1.818. 7. 1.914. 8. 1.769. CA TE IO BI BL. 1.788. 9. 1.955. 10. 1.761. 11. 1.800. 12. 1.750. 13. 1.812. 14. 1.731. 15. 1.846. 16. 1.800. 17. 1.805. 18. 1.831. 19. 1.902. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PE CU AR IA S. Tabla 06. Niveles de pureza (A260/A280nnm) de ADN en sangre de alpacas. N° de Animal. A260/A280 1.778. 1. 1.714. 2. 1.800. 3. 2.000. 4. 1.889. 5. 1.889. 6. 2.125. 7. 1.778. 8. 1.750. RO. 9. 1.889. 10. 1.833. 12 13. DE. 14. AG. 11. 1.867 1.727 1.889 1.700. 16. 2.000. 17. 1.917. 18. 1.857. 19. 1.727. BI BL. IO. TE. CA. 15. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En la tabla 07, se muestra los parámetros estadísticos descriptivos, donde se obtuvo para el T1, una media de 1,818 ± 0,057 nm.; con un valor mínimo de 1,731 nm y un. PE CU AR IA S. máximo de 1,955 nm, correspondiéndole un coeficiente de variación de 3,1%. Para el T2, una media de 1,849 ± 0,112 nm.; con un valor mínimo de 1,700 nm y un máximo de 2,125 nm, correspondiéndole un coeficiente de variación de 6,1%. Tabla 07. Parámetros estadísticos descriptivos de pureza (A 260 nm /A 280 nm) de. RO. ADN por tratamiento. 19. T2. 19. Media. Desviación Estándar. Coeficiente de Variación. 1,731. 1,955. 1,818. 0,057. 3,1. 1,700. 2,125. 1,849. 0,112. 6,1. AG. T1. Máx.. Mín.. DE. N. BI BL. IO. TE. CA. Tratamiento. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La tabla 08, presenta la prueba T de Student, determinándose un valor de p= 0, 291. Esto indica que entre los promedios de ambos tratamientos no existe diferencias. piloso y sangre en alpacas.. PE CU AR IA S. estadísticas significativas (p>0.05) entre las medias de pureza del ADN en folículo. Tabla 08. Prueba T de Student de la comparación de las medias de pureza del ADN en folículos pilosos y sangre.. Prueba T para la igualdad de medias Tratamiento. T1. 1,818. AG. RO. T. -1,071. Sig.. 36. 0,291. 1,849. BI BL. IO. TE. CA. DE. T2. G. L. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. INTEGRIDAD DE ADN PARA FOLÍCULOS PILOSOS Y SANGRE:. PE CU AR IA S. Se aprecia en la Figura 1, en los carriles 1,3,4,5,6,7,8,12,13,14,15,16 representan un 63% de ausencia de bandas de ADN y en los carriles 2,9,10,11,17,18,19 representa el 37% muestras de bandas fragmentadas. El carril 20 contiene el marcador del peso molecular (MPM).. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20. AG. RO. 1. DE. Figura 1. Visualización de la integridad del ADN en electroforesis en gel de agarosa,. BI BL. IO. TE. CA. en muestras con folículos pilosos.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Se aprecia en la Figura 2, en los carriles 1, 3,11,12,13,14,15,16,17,18,19, representan un 58 % muestras integras o bandas no fragmentadas y en los. PE CU AR IA S. carriles 2,4,5,6,7,8,9,10 representa el 42 % ausencia de bandas de ADN. El carril 20 contiene el marcador del peso molecular (MPM).. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20. DE. AG. RO. 1 2. Figura 2. Visualización de la integridad del ADN en electroforesis en gel de. BI BL. IO. TE. CA. agarosa, en muestra de sangre.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. CAPÍTULO IV. PE CU AR IA S. DISCUSIONES.  De acuerdo a los resultados obtenidos se determinó que, la media de concentración de ADN para folículos pilosos en alpacas, fue de 38,8 ± 19,4. ng/μl, y para sangre de 9,0 ± 2,1 ng/μl. Obteniéndose mejor concentración con folículos pilosos en relaciona muestras en sangre. Estos resultados. difieren con los obtenidos por Burgos, Cerón y Moreno (2010), quienes. RO. reportaron que, en comparación de métodos comerciales aplicados para. extracción de ADN en cuyes “Cavia porcellus”, donde usaron muestras de. AG. pelo total para la extracción con Kit, obteniendo una media de 20.7± 4,8 ng/µl, que fueron comparados a partir de muestras de sangre con una. DE. concentración media de ADN de 53.0 ± 3.48 ng/µl, dando mejores resultados en concentración en sangre con respecto a pelo total.. CA.  Respecto a, la extracción de ADN con folículos pilosos en muestra de piel, es. TE. un tipo de fuente que asegura la presencia de folículos pilosos, de acuerdo a los resultados obtenidos por Ysai (2013), quien realizó estudios, sobre la. IO. densidad folicular en piel de alpacas en Huancavelica, obteniendo como. BI BL. resultados, 200 folículos pilosos aproximadamente, por cada muestra en piel (costillar medio), asegurando así la presencia de células nucleadas. En comparación de otras investigaciones de extracciones con folículos pilosos a partir de pelo total. Contrariamente, los investigadores Moller y Brinkmann. (1994) y Yoshii et al. (1994) sugieren no elegir este tipo de muestra si se. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. puede optar por otras fuentes que permitan obtener mayor eficiencia en la extracción de ADN, como son sangre, semen, uñas, saliva, etc., ya que. y que en ningún caso llega al 100%.. PE CU AR IA S. aseguran que extraer ADN a partir de pelo total, tiene una eficiencia muy baja.  En relación a la determinación del índice de pureza del ADN, que fue. evaluada a partir de los promedios de las relaciones A260 nm /A280 nm, donde los resultados mostraron que, las medias estuvieron dentro del rango. ≥1.8 nm aceptado como ADN puro; según Sambrooket al. (1989). En esta. RO. investigación no se calcularon diferencias estadísticas significativas (p>0.05). entre las medias del T1 y T2. Qiagen (2005) e Invitrogen (2005), refieren que. AG. los kits comerciales, utilizados bajo las recomendaciones de cada proveedor, garantizan una extracción de alta pureza tanto en la recuperación del ADN. DE. como la eliminación de contaminantes son muy eficientes.. CA.  Para la determinación de la integridad de ADN, de acuerdo al patrón de corrido de las bandas a través el método comercial en muestras de sangre. TE. permitió obtener un 58% con presencia de bandas no fragmentadas a diferencia del método comercial en muestras con folículos pilosos, donde se. IO. observó un 37% de bandas fragmentadas; obteniendo así mejores resultados. BI BL. con el protocolo en muestras de sangre. Estos resultados obtenidos coinciden con las investigaciones de Sambrook et al. (1989), quienes señalaron que,. usando kit comercial permite obtener la integridad de la molécula del ADN a partir de muestra de sangre.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(44) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación.  Al observar en electroforesis en gel de agarosa, muestras de sangre, se aprecia ligeras bandas de ADN y queda confirmado que las concentraciones. PE CU AR IA S. obtenidas a través de este protocolo varían considerablemente entre cada. muestra. También podría deberse posiblemente a errores de operación al momento de separar con pipeta los ácidos nucleicos del resto de la solución u otros factores que afectan las cantidades finales de ADN extraído, que es el. tiempo de almacenamiento de las muestras bajo congelación. Según. Sambrook et al. (1989), señala que las muestras de sangre almacenadas por largos periodos bajo congelación o refrigeración, puede mermar los. RO. rendimientos del ADN en la extracción, sin embargo, el procesamiento de las. muestras para las evaluaciones hechas en este trabajo, no superaron los 3 días. AG. en almacenamiento. Es necesario recalcar que los criterios para evaluar la integridad de las bandas de corrido, se hicieron según a lo establecido por. DE. Alejos et al. (2010) donde consideran que, si el ADN esta integro, se debe observar una banda estrecha cercana al pozo en que se colocó la mezcla de. CA. ADN, si está fragmentado, se observara una banda de más de 1cm de ancho o. BI BL. IO. TE. un sendero luminoso en el carril de la muestra.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(45) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. CAPÍTULO V. PE CU AR IA S. CONCLUSIONES.  Se encontraron diferencias estadísticas altamente significativas (p ≤ 0,01), en las concentraciones de ADN en folículos pilosos y sangre de alpacas, siendo. mayor en folículos pilosos (T1), con un valor promedio de 38,8 ± 19,4 ng/μl en relación a la sangre (T2) que tuvo un nivel promedio de 9,0 ± 2,1 ng/μl..  En cuanto a la pureza del ADN obtenido a partir de folículos pilosos y sangre. RO. de alpacas, no se establecieron diferencias estadísticas significativas (p > 0.05), calculándose medias de 1,818 ± 0,057 nm, para T1y 1,849 ± 0,112 nm,. AG. para T2.. DE.  Para la integridad del ADN, tiene mejor eficacia la fuente de extracción de ADN en sangre, la cual presento un 58% de bandas no fragmentadas, con. CA. respecto a la fuente de extracción de ADN en folículos pilosos, donde. TE. presentó 37% de bandas con fragmentación..  Se concluye que se obtiene mayor cantidad de ADN para la fuente de. IO. extracción en folículos pilosos, la pureza fue igual para ambos y mejor. BI BL. integridad de ADN en sangre.. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(46) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. CAPÍTULO VI. PE CU AR IA S. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. Alejos, V., Aragon, M. y Cornejo, R.2010. Extracción y Purificación de AND.. Disponible en: http://www.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/25/extraccion.pdf. Burgos, P., Cerón, M. y Moreno, O. 2010. Comparación de métodos para la. extracción de ADN en cuyes (Cavia porcellus). Universidad Antioquia de Colombia.. RO. Dundass, N., Leos, NK. Mitui, P., Revell and Rogers, B. 2008. Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction. Journal of. AG. Molecular Diagnostics 10: 311-316.. Fernández, B. 1991. Avances y Perspectivas del conocimiento de los Camélidos. 327-335 p.. Bio. Sprint. DNA. Plant. Handbook.. Disponible. en:. CA. Qiagen.2005.. DE. Sudamericanos. Oficina Regional de la FAO para América Latina y el Caribe-. www.qiagen.com/hb/biosprintplatndnakit.. TE. Guinn, G. 1966. Extraction of nucleic acids from lyophilized plant material. Plant. IO. Physiology 41: 689-695. Hudson, ME. 2008. Sequencing breakthroughs for genomic ecology and. BI BL. evolutionary biology. Molecular Ecology Resources 8:3–17. Invitrogen. 2005. Nucleic acid purification and quantification sourcebook. Invitrogen Industries- EE.UU. Disponibleen: htto// tools. Invitrogen.com/ content/ sts/ manuals/ pure link_genomic_man_.pdf.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(47) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Kohn, H. and Wayne,K. 1999. Facts from feces revisited. Trends Ecol Evol 12: 223-227.. PE CU AR IA S. Luikart,G., Zundel, S., Rioux, D. Miquel, C., Keating, B. et al. 2006. Low. genotyping error rates and noninvasive sampling in Bighorn sheep. J Wildlife Manage 72: 299-304.. Moller, A. and Brinkmann. 1994. Adv. in For. Haem. 5: 336-338.. Nuez, F. y Carrillo, M. 2000. Los marcadores genéticos en la mejora vegetal. Valencia: Universidad Politécnica de Valencia.. Ouborg, N., Pertoldi, C., Loeschcke, V. Bljlsma, R. and Hedrick, P. 2010.. RO. Conservation genetics in transition to conservation genomics. Trends Genet 26: 177-187.. AG. Panasci, M., Ballard, B., Breck, S., Rodriguez, D. and Densmore, Webster, B., Baker, R. 2011. Evaluation of fecal DNA preservation techniques and effects of. DE. sample age and diet on genotyping success. J Wildlife Manage 74: 1616-1624 Protocolo del DNeasy® Blood & Tissue Kit (Qiagen).. CA. Quéméré, E. Louis, E., Ribéron, A., Chikhi and Crouau, B. 2010.Noninvasive conservation genetics of the critically endangered golden-crowned sifaka: high. TE. diversity and significant genetic differentiation over a small range. Conserv Genetic 11: 675-687. IO. Quispe, ECL., Alfonso, A., Flores, Guillen and Ramos, R. 2009.Bases para. BI BL. establecer un programa de mejora de alpacas en la región alto andina de Huancavelica- Perú. Archivos de Zootecnia. 58 (224): 705-716 Ricardo Fujita, Genómica y su Aplicación en Producción Animal: Centro de Genética y Biología Molecular- Facultad de Medicina Universidad de San Martín de Porres. Vol. 15 (Supl. 1) 2007.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(48) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Sambrook, J., Fritsch, E. and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York. PE CU AR IA S. Schlotterer, C. 2004. The evolution of molecular markers: Nature Reviews 5: 6369.. Stormer, M., Kleesiek, K. and Dreier, J. 2007. High-Volume Extraction of Nucleic Acidsby Magnetic Bead Technology for Ultrasensitive Detection of Bacteria in Blood Components. Clinical Chemistry 53: 104–110.. Tang, W., Sefers, F. Kohn, D. and Procop, W. 2005. Comparative evaluation of three commercial systems for nucleic acid extraction from urine specimens.. RO. Journal of Clinical Microbiology 43: 4830-4833.. Valadez, E. y Günter, K. 2000. Huellas de ADN en genomas de plantas (teoría y. AG. protocolos de laboratorio). México: Universidad Autónoma de Chapingo /Mundi Prensa.. DE. Wang, L. and Wang, Liu, X. 2003.The Quality and Processing Performance of Alpaca Fibras. RIRDC Publication No 03/128.. CA. Waits, P. and Paetkau, D.2005. Noninvasive genetic sampling tools for wildlife biologists: A review of applications and recommendations for accurate data. TE. collection. J Wildlife Manage 69: 1419-1433. Yoshii, T., Akiyama, K., Tamura and Ishiyama. 1994. Detection of specific. IO. sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis Adv. in For.. BI BL. Haem. 5: 393-396. Ysai, P. 2013. Densidad folicular en piel de alpaca en la comunidad campesina de Carhuancho distrito de Pilpichaca provincia de Huaytara regiòn de Huancavelica.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(49) RO. PE CU AR IA S. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI BL. IO. TE. CA. DE. AG. ANEXOS. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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