Determinación fisicoquímica y evaluación de la actividad biológica del aceite esencial de Hedyosmum strigosum (Todzia) (Chloranthaceae) de la provincia de Loja

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Texto completo

(1)
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II

CESIÓN DE DERECHOS

Yo Estefanía Lilibeth Ramírez Loayza declaro ser la autora de presente trabajo.

Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del artículo 67 del Estatuto Orgánico de la Universidad Técnica Particular de Loja que en su parte pertinente textualmente dice “Forman parte del patrimonio de la

Universidad la propiedad intelectual de investigadores, trabajos científicos o técnicos o tesis de grado que se realicen a través, o con el apoyo financiero, académico o institucional (operativo) de la Universidad”.

..………..

(3)

III

CERTIFICACION DE APROBACIÓN

M.Sc. Vladimir Morocho

DOCENTE INVESTIGADOR DE LA UTPL DIRECTOR DE TESIS

Certifico:

Haber dirigido el trabajo de investigación titulado: “DETERMINACIÓN FISICOQUÍMICA Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DEL ACEITE ESENCIAL DE Hedyosmum strigosum (CHLORANTHACEAE) DE

LA PROVINCIA DE LOJA” elaborado por la Srta. Estefanía Lilibeth Ramírez Loayza el mismo que ha sido revisado durante su ejecución, se ajusta a los requisitos legales exigidos por la Escuela de Bioquímica y Farmacia, por lo tanto autorizo su presentación.

Loja, Enero del 2013

………

(4)

IV AUTORIA

La presentación, procedimientos y conceptos, así como, los resultados y conclusiones vertidos en el presente trabajo de tesis son de responsabilidad absoluta de la autora.

(5)

V

AGRADECIMIENTO

Empezando quiero darle gracias a mi Dios por todo lo maravilloso que me ha dado por estar

conmigo todos los días de mi vida, por enseñarme tantas cosas, por consolarme cuando más lo

necesitaba y darme fuerza para seguir luchando por lo que tanto anhelaba.

A mis padres Nilo y Mercy por el inmenso apoyo que me brindan, por estar alentándome cada día a

seguir adelante y sobre todo por sus consejos tan valiosos que definitivamente me han conducido

por el camino correcto, mil gracias a los dos porque siempre me dejaron ser libre y me permitieron

tomar mis propias decisiones, porque a pesar de mis locuras me supieron querer y reprender cuando

estaba equivocada, gracias por educarme y formarme como un ser responsable por lo cual me siento

muy orgullosa y agradecida y nunca terminare de agradecerles por permitirme culminar mi carrera.

A mi pequeño hijo por darme el cariño que necesitaba para seguir adelante y tener las fuerzas de

culminar una de mis metas, gracias mi pequeño por ser parte de mi vida.

A mis dos chiquitines Luisa y Roland que a pesar de nuestras peleas y diferencias siempre

confiaron en mí que podía seguir adelante, aunque hay veces que me cambiaban el genio con sus

ocurrencias y chistes me sacaban una sonrisa, gracias por ser mis hermanitos consentidos.

A mi abuelita Rosario que desde el cielo está guiándome por el camino del bien, gracias mí abuelita

bella por todos tus consejos y por consentirme en todo tus eres uno de mis ejemplos a seguir.

A mis tías, tíos, primos por alentarme a culminar una de mis metas y apoyarme en todo.

Al Ing. Vladimir Morocho en calidad de Director de tesis por compartir sus conocimientos y

experiencia, y sobre todo por haber confiado en mí para llevar a cabo este proyecto; a todo el

personal del Departamento de Química por darme la oportunidad y brindarme todos los medios

para realizar mi proyecto de tesis.

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VI

DEDICATORIA

Mi tesis le dedico con todo mi amor y cariño a un ser extraordinario como es Dios por estar siempre

a mi lado, por darme valor cuando más lo necesitaba y por nunca dejarme sola y sobre todo por

darme una familia hermosa que siempre están conmigo.

A mis padres por darme la oportunidad de superarme y ser alguien en la vida, por el inmenso apoyo

que me dieron, por siempre confiar en mí y nunca dejarme sola y sobre todo por darme aliento para

seguir luchando a pesar de mis temores y tropiezos.

A mi hijo que es la razón de mí vivir que a pesar que no podía estar a diario con él sentía su

pequeño apoyo y a mis hermanos que a pesar de nuestras diferencias siempre creyeron que podía

llegar a alcanzar una de mis tantas metas.

(7)

VII

ÍNDICE DE CONTENIDO

CESION DE DERECHOS……….. I

CERTIFICACIÓN………. II

AUTORIA……….. III

AGRADECIMIENTO……… IV

DEDICATORIA………. V

INDICE……….. VI

RESUMEN……… XII

ARTICULO……… XIII

I. PRESENTACION DE FIN, PROPOSITO Y COMPONENTES DEL

PROYECTO

1.1 Fin del Proyecto………. 2

1.2 Propósito del proyecto……….. 2

1.3 Componentes del proyecto……….. 2

1.4 Hipótesis………. 3

1.5 Diseño estadístico………. 3

II.INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES 2.1 Introducción……… 5

2.2 Antecedentes………. 10

III. MATERIALES y METODOS 3.1 Recolección del Material Vegetal……… 15

3.2 Destilación del Aceite Esencial……… 16

3.2.1 Determinación de la Humedad……….. 17

3.2.2 Determinación del Rendimiento………. 18

(8)

VIII

3.3.1 Densidad Relativa………. 18

3.3.2 Índice de Refracción ………. 19

3.4 Determinación de la Composición Química del Aceite Esencial…. 20

3.4.1 Cromatografía de Gases………. 20

3.4.2 Cromatografo de gases……… 20

3.4.3 Características de la Columna……… 21

3.4.4 Preparación de la Muestra para el Análisis……….. 23

3.4.5 Corrida Cromatográfica de las Muestras en la Columna DB-5 24 3.4.6 Obtención de Cromatogramas……… 25

3.4.7 Determinación de los Índices de Kovats……… 26

3.4.8 Identificación Cualitativa y Cuantitativa de los Compuestos Químicos del Aceite Esencial con base en los Índices de kovats y los Espectros de Masas……… 27

3.4.9 Corrida Cromatográfica de las Muestras por CG-FID en la Columna Capilar DB-5………. 27

3.5 Evaluación de la Actividad Biológica……… 29

3.5.1 Microorganismo de Prueba ……….. 29

3.5.2 Preparación del Aceite Esencial……….. 29

3.5.3 Preparación de los Medios de Cultivo………. 29

3.5.3.1 Bacterias……… 30

3.5.3.1.1 Caldo de Cultivo Muller Hilton………. 30

3.5.3.1.2 Cultivo Overnight……… 30

3.5.3.1.3 Preparación de la Suspensión de Inóculos.. 30

3.5.3.2 Hongos……… 31

3.5.3.2.1 Caldo Saboroud………. 31

3.5.3.2.2 Preparación de la Suspensión de Inóculos… 31

3.5.4 CMI Antibacterianos……… 31

3.5.4.1 CMI Antifúngicos……….. 32

3.5.5 Interpretación de Resultados………. 33

(9)

IX

4.2 Rendimiento del Aceite Esencial………. 35

4.3 Determinación de las Propiedades Físicas……… 35

4.3.1 Densidad………. 35

4.3.2 Índice de Refracción………. 36

4.4 Composición Química de Aceite Esencial de H. strigosum……… 36

4.5 Comparación del aceite esencial de H. strigosum en CG/MS-FID 37

4.5 Espectros de los Compuestos Mayoritarios del Aceite Esencial de H. strigosum………. 42

4.6 Actividad Biológica………. 46

4.6.1 Concentración Mínima Inhibitoria para bacterias………….. 46

4.6.2 Concentración Mínima Inhibitoria para Hongos………. 46

V. CONCLUSIONES……….. 50

VI. RECOMENDACIONES……… 52

(10)

X

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Características de las columnas capilares……… 20

Tabla 2. Humedad media de H. strigosum……… 34

Tabla 3. Rendimiento promedio de H. strigosum………. 35

Tabla 4. Densidad relativa (g/cm3)………. . 36

Tabla 5. Índice de refracción……… 36

Tabla 6. Composición química del aceite esencial de H. strigosum………. 38

Tabla 7 Comparación del aceite esencial de H. strigosum en CG/MS-FID 41

Tabla 8. CMI para hongos……… 48

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Análisis experimental………. 3

Figura 2. Hedyosmum strigosum ………. 11

Figura 3. Esquema de los análisis realizas……… 14

Figura 4. Área de estudio de la especie Hedyosmun strigosum de la provincia de Loja……… 15

Figura 5. Proceso de destilación……….. 16

Figura 6ª). Obtención del aceite H. strigosum, b) Frascos ámbar con Aceite……….. 17

Figura 7.Humedad……… 17

Figura 8ª). Material para la humedad, b) Picnómetro con aceite H. strigosum, c) Balanza analítica………... 18

Figura 9. Determinación del índice de refracción………. 19

Figura 10. Cromatógrafo de gases……….. 20

Figura 11. Esquema de la identificación de la composición química del aceite esencial………. 21

Figura 12. Preparación de muestras……… 22

Figura 13. Inyección cromatográfica………... 22

Figura 14. Parámetros operacionales de la columna DB-5MS……… 23

Figura 15. Cromatograma típico del aceite esencial d H. strigosum…….. 24

Figura 16. Parámetros operacionales de la columna DB-5 (CG-FID)……. 27

Figura 17. Placa TC96 antibacterianos………. . 31

(11)

XI

Figura 19. Compuestos Mayoritarios de la Especie………. 43

Figura 20. Espectros de los Compuestos Mayoritarios………. 48

LISTA DE ANEXOS Anexo I. Determinación de humedad……… 56

Anexo II. Determinación del rendimiento……….. 58

Anexo III. Determinación de la densidad relativa……… 59

Anexo IV. Determinación del índice de refracción……….. 61

Anexo V. Cálculo del coeficiente de variación………. 62

(12)

XII RESUMEN

Se obtuvo el aceite esencial de las partes aéreas en periodo de fructificación de

Hedyosmum strigosum, recolectada en el Cantón Saraguro provincia de Loja

en los meses de agosto y septiembre del 2012, la cual fue destilada por hidrodestilación

La composición química fue determinada por CG/MS obteniendo un total de 45 compuestos identificados representando el 89.02% del total del aceite esencial. Los compuestos mayoritarios son germacrene D (13.84%), 1-8 cineole (10.26%), linalool L (6.64%), α-pinene (6.24%), sabinene (5,93%), β-pinene (5.24%), germacrene D-4-ol (3.92%), δ cadinene (3.36%).

La actividad biológica se determinó por el método de microdilución en caldo. El aceite esencial de H. strigosum inhibió el crecimiento de los hongos

Tricophytonmentagrophytes (ATCC® 28185), Tricophytonrubrum (ATCC®

28188) y para bacterias Staphylococcus aureus (ATCC® 8427) - Klebsiella

pneumoniae (ATCC® 9997), mientras que para las demás bacterias no

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Physicochemical determination and evaluation of the

biological activity of the essential oil of Hedyosmum

strigosum (Chloranthaceae) of the province of Loja

Estefanía Ramírez1; Vladimir Morocho2.

1 Titulación de Bioquímica y Farmacia- Universidad Técnica Particular de Loja San Cayetano Alto s/n, PO Box 11 01 608, Loja - Ecuador.

2 Departamento de Química, Universidad Técnica Particular de Loja San Cayetano Alto s/n, PO Box 11 01 608, Loja - Ecuador.

Corresponding author: elramirez@utpl.edu.ec

ABSTRACT

The chemical composition of the essential oil of Hedyosmum strigosum was determinated by

GC/MS and CG/FID. A total of 45 compounds were identified, representing 89.02% of the total of the essential oil. The main compounds are: germacrene D (13.84%), 1-8 cineole

(10.26%), linalool L (6.64%), α-pinene (6.24%), sabinene (5.93%), β-pinene (5.24%), germacrene D-4ol (3.92), δ cadinene (3.36%). The biological activity was determined by the

broth microdilution method where oil of H. strigosum inhibited the growth of Tricophyton mentagrophytes- Tricophyton rubrum - Staphylococcus aureus - Klebsiella pneumonia, but it

was inactive against the Gram-negative bacterium Pseudomona aeruginosa, Proteus vulgaris, Escherichia coli, Salmonella typhimurium and Gram-positive bacterium Enterococcus faecalis.

Keywords: Hedyosmum strigosum, Chloranthaceae, Germacrene D, T. rubrum, T. mentagrophytes.

INTRODUCTION

The use of traditional medicine in the treatment of diseases is an ancient practice which has been transmitted through generations. According to the World Health Organization, 80% of the world population use plants, mixtures of them or their active principles to treat medical issues.1-2

There are about 25,000 species of medicinal plants around the world from which we know only 10% of them. It implies a great potential for future drug discovery.3

Ecuador has a great cultural tradition in the use of plants for medicinal purposes. It has been reported about 5172 useful species included in 238 botanical families from which the 60% are used for medicinal purposes.4

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The Chlorantaceae family comprises four genera, Sarcandra, Chloranthus, Ascarina

and Hedysomum.

Hedyosmum genus is represented by

approximately 40 species of aromatic trees and shrubs that grow mainly in the mountains. In Ecuador, this genus is represented by 16 species6

In several Latin American countries the aromatic leaves of some trees of

Hedyosmum genus are used as soft

drinks or as a substitute for coffee and tea. Also, they are used to soothe ailments and pains abdominals.7

The aim of this study is to determine the chemical composition and physical properties of the essential oil of

Hedyosmum strigosum as well as the

biological activity against several pathogenic fungi and bacteria.

H. strigosum is a native species of

Ecuador which is distributed in the provinces of Cotopaxi, Imbabura, Napo, Pichincha, Sucumbíos Tungurahua and Loja between 2000-3500 m.a.s.l.8 Commonly known Quinillo (Castilian) and olloco (language does not specify). It is used as an edible plant and the infusion leaves is aromatic drink besides being bird food is used as a fuel.9

MATERIALS AND METHODS

Plant material collection and essential oil extraction

The aerial parts of H. strigosum were

collected in Saraguro town, Loja province at 2190 m a.s.l. (692104E, 9593236N). The plant material was distillated in three different occasions with a 15 days interval. The specie was identified by Bolivar Merino Herbarium Loja and Fanny

Tinitana Herbarium UTPL with voucher PPN-ct-002.

The essential oil was obtained from 1000 g. from the fresh aerial parts by hydro-distillation for 2 hour using Clevenger-type apparatus.

Gas chromatography (GC/FID)

The analysis of the essential oil of H. strigosums was determined through a gas

chromatograph (Agilent 6890 Series) coupled to a mass spectrometer (Agilent 5973 Series Inert) analytical column using a nonpolar DB-5MS (30m x 0.25mm, film thickness 0.25μm), and an automatic split/splitles injector (7683 series), provided with a computerized system MSD-Chemstation D.01.00 SP1 and a Flame Ionization detector

The dilution of oil was made using 10 µL of the essential oil concentrated, diluted in 990 µL dichloromethane and injected under the following parameters: carrier gas Helium 0.9 ml/min; split ratio 50:1; temperature of the injector 2100C; temperature of the detector 2500C; temperature of the oven 50ºC-210ºC with a ramp of 2.5 ml/min.

Identification and quantification

The essential oil composition was identified by calculating Kovats index. Kovats index was determined with reference to a homologous series of aliphatic hydrocarbons (C10-C25). Mass spectra were compared with the spectra of the 7n.1 Wiley database computer. The quantification of the components is based in calculating about their GC peak areas.

Physical properties

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according to the standard AFNOR NF T 75-111, and the refraction index was determined using a refractometer (model ABBE), according to the standard AFNOR NF T 75-112.

Biological activity

Essential oil was evaluated against bacterial strains; 2 Gram positive:

Enterococcus faecalis (ATCC® 29212), Staphylococcus aureus (ATCC® 25923)

and 5 Gram-negative: Pseudomona aeruginosa (ATCC® 27853), Klebsiella pneumoniae (ATCC® 9997); Proteus vulgaris (ATCC® 8427), Escherichia coli

(ATCC® 25922),

Salmonella typhimurium

(LT2), and two fungal strains,

Trichophyton mentagrophytes (ATCC®

28185), and Trichophyton rubrum (ATCC®

28188).

The broth microdilution method was used to determine the biological activity. All tests were performed in Mueller Hinton broth, with the exception of fungi which employed Sabouraud dextrose broth. The oils were diluted using 20 µL of the essential oil concentrated, diluted in 980 µl Dimetil sulfoxide (DMSO).

For evaluating the antibacterial activity the bacterium the microorganism were grown overnight at 360C incubated for 24 hours. From this broth 150-300 µl were took in 7 ml of NaCl solution, adjusting the inoculum to an equivalent concentration to 0.5 in the scale of McFarland. From this suspension were takes 140 µl and inoculated in 7 ml Mueller Hinton broth adjusting to a bacterial population of 2x106 CFU/ml. 100 µl of this suspension were used to complete to 200 µl the final volume of the cultivation dish, in this was adjusted the bacterial population to 5x105 CFU/ml. Finally the plates were incubated at 370C for 18 to 24 h. Antibiotics solutions of ampicillin, gentamicin, were used as

positive control and the DMSO as negative control.

The CMI values were determined in fungi using a final concentration of 5x104 spores/ml of Trichophyton mentagrophytes (ATCC® 281885), and Trichophyton rubrum (ATCC® 28188). It

incubated at 28°C for five days. Antifungal Itraconazol was used (1mg/ml) DMSO as a positive control and negative control.

RESULTS AND DISCUSSION

The essential oil of H. strigosum is liquid

at room temperature and under refrigeration, has a light yellow color. In the table1, shows the mean values of humidity, performance and properties physical of the essential oil.

Tabla 1. Humidity, performance and physical properties.

Code* Hm (%) R (%) d20 n20 HS1-00 33.49 0.27 0.91 1.477

HS2-00 56.11 0.19 0.90 1.477

HS3-00 45.16 0.20 0.90 1.480 * It uses the HS code for the species Hedyosmum strigosum, and numbers 1-00, 2-00 and 3-00 for each collection.

Hm = relative humidity of the sample

R = yield

d20 = relative density

n20 = refractive index

A total of 45 compounds of the essential oil of H. strigosum were identified, representing

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Table 2.Chemical composition (%) of essential oil of H. strigosum determined for CG/MS and comparison CG/MS-FID

COMPOUNDS

DB-5MS/FID

KOVATS

INDEX % Percentages HS- 1 HS- 2 HS- 3

IKa IKref σ CV MS FID MS FID MS FID MS FID

1 α-pinene 939 937 1.29 0.21 7.76 0,45 6,75 2,14 4,31 0,44 6.24 2,94

2 Camphene 954 951 0.23 0.22 2,43 0,44 2,20 0,44 1,34 0,44 1.99 0,44

3 Sabinene 972 975 0.81 0.14 6,61 0,47 6,47 0,43 4,71 0,47 5.93 0,45

4 β-pinene 976 979 1.05 0.20 6,33 0,45 5,85 0,44 3,72 0,46 5.30 0,45

5 β-myrcene 990 990 0.12 0.13 1,07 0,53 0,89 0,45 0,74 0,52 0.90 0,50

6 Benzene,1methyl - 1022 1030 0.01 0.06 0,13 1,55 0,12 0,52 0,14 0,89 0.13 0,98

7 d-limonene 1026 1029 0.22 0.12 2,16 0,58 1,83 0,54 1,51 0,73 1.84 0,62

8 1-8cineole 1029 1031 0.71 0.07 10,62 0,56 10,97 0,56 9,19 0,67 10.26 0,60

9 Z-ocimene 1035 1037 0.43 0.38 0,47 0,63 1,12 0,57 1,74 0,64 1.11 0,61

10 E-ocimene 1045 1050 0.12 0.36 0,18 0,65 0,32 0.54 0,53 0,65 0.34 0,61

11 δ-Terpinene 1055 1059 0.04 0.15 0,31 0,67 0,24 0,63 0,21 0,66 0.26 0,65

12 E-sabinene 1068 1068 0.01 0.05 --- --- 0,20 0,65 0,18 0,68 0.19 1,00

13 Linalool-L 1101 1096 1.01 0.15 5,12 1,68 6,95 0,66 7,85 0,84 6.64 1,06

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15 E-verbenol 1143 1144 0.06 0.13 0,54 0,84 --- 1,41 0,42 1,98 0.48 1,41

16 Pinocarvone 1158 1164 0.40 0.47 0,94 0,84 1.35 1,30 0,26 1,62 0.85 1,25

17 Verbenol 1162 1145 0.02 0.03 0,41 0,94 --- --- 0,30 1,16 0.79 1,05

18

Bicyclo [3.1.1[heptan-3- one,2,6,6- trimethyl-,(1α,2α,5α)

1171 1163 0.05 0.14 0,77 1,03 0,42 0,83 0,81 1,16 0.38 1.01

19 Terpineol-4-ol 1178 1177 0.46 0.10 0,47 1,04 0,53 0.82 0,40 1,32 0.46 1,06

20 α-terpineol 1193 1188 0.03 0.07 --- 1,03 0,35 1,08 0,40 1,20 0.37 1,10

21 Neral 1237 1238 0.53 0.46 0.36 1,16 1,15 0.97 3,24 0,17 1.15 0,77

22 Geranial 1267 1267 0.90 0.47 0.57 1,16 1,96 1,07 1,94 1,30 1.92 1,18

23 αacetate-terpinenyl 1343 1349 0.92 0.33 3.8 1,03 3,21 1,01 1,44 1,20 2.82 1,08

24 Geraniol 1251 1253 0.17 0.23 --- --- 0,58 1,15 0,93 1,37 0.76 1,26

25 α-copaene 1369 1376 0.02 0.13 0,16 1,50 --- --- 0,54 2,94 0.14 2,22

26 Geranyl acetate 1378 1381 0.15 0.49 0,12 1,13 0,23 1,08 0,16 3,12 0.31 1,78

27 β-bourbonene 1376 1388 0.00 0.00 0,19 0,88 --- --- 0,19 2,98 0.19 1,94

28 β-cubebene 1382 1388 0.00 0.02 0,88 0,06 --- --- 0,50 2,94 0.15 1,50

29 Methyl eugenol 1400 1403 0.45 0.55 0,28 0,38 --- 1,38 1,50 2,23 0.82 1,33

30 βcaryophyllene-E- 1411 1419 0.20 0.25 0,14 0,70 0,67 1,51 0,15 2,04 0.79 1,42

31 Germacrene-D 1473 1464 0.10 1.37 14.98 1,17 11,78 0,07 14,8 2,09 13.84 1,11

32 α-huumulene 1473 1454 0.07 0.20 0,43 1,23 0,23 0,35 0,34 1,98 0.33 1,19

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34 Bicyclogermacrene 1487 1500 0.05 0.02 2,65 0,76 2,70 0,02 2,79 2,12 2.71 0,97

35 α-muurolene 1492 1500 0.26 0.44 0,28 0,75 0,51 0,83 0,98 2,07 0.59 1,22

36 δ-cadinene 1506 1513 0.36 0.39 2,06 0,80 2,71 1,21 5,31 2,39 0.93 1,47

37 Delta-cadinene 1512 1523 1.30 0.39 0,58 0,48 0,73 1,14 1,48 2,43 3.36 1,35

38

Naphthalene,1,2, 3,5,6,8a- hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1 methylethyl), (1S-cis)

-1508 1523 0.22 0.36 ---- --- 0,84 0,83 0,40 2,38 0.41 1,60

39 Elemol 1543 1549 0.05 0.14 0,41 0,75 --- --- 0,31 2,33 0.36 1,55

40 GermacreneD-4-ol - 1569 1575 2.30 0.59 2,67 0,75 1,82 0,04 0,95 2,72 3.92 1,17

41 Carotol 1593 1594 0.57 0.32 1,96 1,42 2,44 0,57 7,37 2,36 1.81 1,45

42 α-cadinol 1648 1654 0.91 0.49 1,38 1,74 1,00 0,06 3,25 2,09 1.88 1,30

43 ț-muurolol 1637 1642 0.37 0.46 0,43 3,90 --- --- 1,17 1,96 0.80 2,93

44 Cadinol-(epi-α) 1635 1640 0.62 0.31 1,17 4,18 2,92 --- 1,86 1,18 1.99 1,79

45 Shyobunol 1684 1689 0.01 0.02 0,52 3,96 --- --- 0,50 --- 0.51 3,96

Total 93.13 56.96

Compounds ordered according to the elution order in the column DB5-MS Ika = Kovats index experimentally determined

Ikref= Reference of literature = Standard deviation CV = coefficient of variation MS= mass percentage of total FID= fid percentage of total

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TITULACIÓN DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

The main compounds of the essential oil correspond to Germacrene D (13.84%), 1-8 cineole (10.26%), linalool L (6.64%), α -pinene (6.24%), sabinene (5.93%), β -pinene (5.24%), germacrene D-4-ol (3.92),

δ cadinene (3.36%), α-terpinenyl acetate (2.82%), bicyclogermacrene (2.71%).

At the moment there are no reported studies about the chemical composition of the essential oil of H. strigosum.

Reviewing literature there are some reports of the chemical composition of son

Hedyosmum species, as H.brasiliense that

present as majority compounds α -terpineol (10.22%), curzerene (8.93%), pinocarvone (8.39%), β-thujene (7.09%) and carotol (6.06),10 In

H. costaricensis

the main compounds were germacrene D (32.0%), (E,E)-α farnesense (8.0%), β -caryophyllene (6.0%) and bourbonene (6.0%).11

Essential oil exhibited growth inhibition against Gram-positive bacterium S. aureus at 1000 ug/mL and 500 ug/mL for K. pneumonia, while as for the rest of

bacteria was non active (Table 3).

Table 3. Concentration Minima Inhibitory (CMI) (μg/mL)

Oil HS Tm Tr

HS101 500 500

HS102 500 500

HS103 500 500

HS201 62.5 1000

HS202 62.5 1000

HS203 62.5 1000

HS301 125 250

HS302 125 125

HS303 125 250

Used HS101-2-3 to the first collection, 1,2,3 distillation. Itraconazole, 100% inhibition positive control (7.81 mg / mL)

Tm: T. mentagrophytes (ATCC® 281885)

Tr: T. rubrum (ATCC® 28188)

The MIC values obtained for T. mentagrophytes showed good inhibition to

62.5 ul/ml in the second collection, while

for T. rubrum present a inhibition of 125

ul/ml in the third collection. According to Holetz et.al. essential oil has moderate

activity against T. rubrum and T. mentagrophytes.12

Antifungal evaluation conducted in essential oil H. brasiliense has activity

against dermatophyte fungi, which mentions that these are responsible for the keratinisation of the skin, nails and hair, causing serious infecciones.13

CONCLUSIONS

In the present research we identified a total of 45 compounds representing 89.02% of the essential oil composition. The antibacterial activity was not good except for S. aureus and K. pneumoniae

where the activity was observed at higher doses. The antifungal activity was better showing a promising profile of inhibition with doses lower than 62.5 ug/mL.

ACKNOWLEDGEMENT

My sincere thanks to the Departamento de Química from the Universidad Técnica Particular de Loja for all the facilities and support given through the project.

REFERENCES

1. Organización Mundial de la Salud. (2005). Estrategia de la OMS de la Medicina Tradicional. Ginebra.

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UTPL

UNIVERSIDAD TÉCNICA

PARTICULAR DE LOJA

ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

3. E. Palacios, (2005). Economía y plantas medicinales. Facultad de Ciencias Económicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

4. L. de la Torre, H. Navarrete, P. Muriel M, M. J. Macía & H. Balslev (eds.), (2008). Enciclopedia de las Plantas Útiles del Ecuador. Herbario QCA & Herbario AAU. Quito & Aarhus: 1–3.

5. V. Tene, O. Malagón, P. Vita, G. Vidari, C. Armijos. (2007). An ethnobotanical survey of medicinal plants used in Loja and Zamora Chinchipe. Journal of Ethnopharmacology 111 63–81.

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7. P. Jorgenser, S. Leon Yanez, (1999). Catalogue of the Vascular Plants pf Ecuador. Missouri Botanical Garden Press, pp. 519-522

8. M. Moraes, B. Ollgaard, L.P. KVist, H. Balslev, (2006). Aromas y Sabores Andinos. Universidad Mayor de San Andres, La Paz. Vol. 313-318.

9. L. de la Torre, H. Navarrete, P. Muriel, M. Macia, B. Henrik. Enciclopedia de las Plantas útiles del Ecuador. Pág. 208.

10. K.Kirchner, A. Wisniewski, A. Cruz, M. Biavatti, D. Nets. (2010). Chemical composition and antimicrobial activity of Hedyosmum brasiliense Miq., Chloranthaceae, essential oil. Brazilian journal of Pharmacognosy. Vol. 20(5); 692-699.

11. M. Mundina, R.Vila, F.Tomi, J. Ciccio, C. Ibañez, T. Adzet, J. Casanova, S. Cañigueral. . (2000). Composition of the essential oils from leaves and fruits of three Hedyosmum species from Costa Rica. Vol. 15. pp: 201-205.

12. K.Kirchner, A. Wisniewski, A. Cruz, M. Biavatti, D. Nets. (2010). Chemical composition and antimicrobial activity of Hedyosmum brasiliense Miq., Chloranthaceae, essential oil. Brazilian journal of Pharmacognosy. Vol. 20(5); 692-699.

13. F. Holetz, G. Pessini, N. Sanches, D. García, C. Nakamura, B. Días, (2002). Screening of some plants used in the Brazilian folk medicine for the treatment of infectious diseases. Memorias del Instituto Oswaldo Cruz. Vol: 97 (7), pp. 1027–

(21)

FIN, PROPOSITO Y COMPONENTES DEL PROYECTO

Universidad Técnica Particular de Loja

Capítulo I.

Presentación del Fin,

Propósito y Componentes

(22)

FIN, PROPOSITO Y COMPONENTES DEL PROYECTO

Universidad Técnica Particular de Loja

2

1.1 Fin del Proyecto

La presente investigación aportará al estudio físico-químico y biológico del aceite esencial de Hedyosmum strigosum, esta forma parte del proyecto de

Evaluación Química y ecológica de Hedyosmum spp. de la provincia de Loja y Zamora.

Este proyecto permitirá evaluar la actividad biológica del aceite esencial de la especie Hedyosmum strigosum frente a cepas patógenas, con lo cual se aportara de gran manera dejando un precedente de las propiedades presentes en dicha especie.

1.2 Propósito del Proyecto

 Determinar la composición físico-química del aceite esencial.

 Determinar la actividad biológica del aceite esencial frente a cepas bacterianas y fúngicas.

1.3 Componentes del Proyecto

Los resultados que se esperan son:

 Aceite esencial de H. strigosum.

 Propiedades fisicoquímicas del aceite esencial.

 Concentración mínima inhibitoria (CMI) para bacterias y hongos.

1.4 Hipótesis de Proyecto

(23)

FIN, PROPOSITO Y COMPONENTES DEL PROYECTO

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H0: El aceite esencial de Hedyosmum strigosum Si inhiben el crecimiento bacteriano y fúngico.

H1: El aceite esencial de Hedyosmum strigosum No inhiben el crecimiento bacteriano y fúngico.

1.5 Análisis Estadístico

Los análisis se realizaron por triplicado a cada uno de los aceites, obteniendo resultados de los nueve aceites esenciales de Hedyosmum strigosum con el fin de establecer resultados confiables. Figura 1

Figura 1. Diseño Experimental

Elaboración: La autora

Hedyosmumstrigosum

Recolección 1

Recolección

2 Recolección3

Destilación I Destilación II Destilación III

Destilación I Destilación II Destilación III

Destilación I Destilación II Destilación III

Propiedades Físicas Propiedades Químicas

(24)

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

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Capítulo II.

(25)

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

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2.1 INTRODUCCIÓN

Los productos naturales, como es el caso de las plantas aromáticas y medicinales, han sido ampliamente utilizados desde tiempo atrás, bien sea como alimento, medicamento, agente conservante, etc.1 Aunque los avances tecnológicos y de síntesis orgánica fina han ido desplazando cada vez más su uso por sustancias artificiales, hoy por hoy, los consumidores han percibido que los compuestos naturales son más inocuos y por ello los prefieren; de esta manera, se observa cómo crece su consumo y utilización, lo que ha dado paso a un desarrollo importante de la agroindustria de plantas aromáticas y medicinales a nivel mundial.2

Muchos de los extractos de plantas utilizados por la medicina occidental se descubrieron porque ya se empleaban en sociedades tradicionales, aunque no siempre con el mismo fin. Sin embargo, también es importante aprovechar la etnobotánica para ayudar a las comunidades a descubrir nuevos productos, útiles para la humanidad, derivados de las planta.3-4

La gran mayoría de los principios activos se han obtenido sintéticamente en laboratorios, para su posterior uso en la preparación de medicamentos químicos. Con el paso de los años el consumo de medicamentos sintéticos se incrementó, desplazando cada vez más el uso directo de plantas medicinales alejándose así de la medicina tradicional.5

1

Lahlou, M., Methods to study the phytochemistry and bioactivity of essential oils, Phytother. Res., 2004, 18, pp. 435-436.

2

Castañeda M, Muñoz A, Martinez J. Estudio de la composición química y la actividad biológica de los aceites esenciales de diez plantas aromáticas Colombianas. Scientia et Technica Año XIII, No 33, Mayo de 2007. UTP. ISSN 0122-1701.

3

García. M, & Morales C. Análisis de la literatura sobre plantas medicinales en costa rica (1930-2001). Lankesteriana. 2005. 5(1); 3-40.

4

OMS • UICN • WWF. Directrices sobre conservación de plantas medicinales. ISBN 2-8317-0138-4. 1993.

5

(26)

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

Universidad Técnica Particular de Loja

6

El uso de las plantas con fines terapéuticos es de gran utilidad, ya que de ellas son obtenidas innumerables sustancias químicas, vegetales que pueden considerarse fármacos y son empleados en diferentes países. De ellas el 74% fue descubierto a partir de su empleo en medicina tradicional. La investigación en este sentido brinda la oportunidad de encontrar nuevos agentes activos desde el punto de vista farmacológico, a partir de una fuente de materia prima más económica y natural como son las plantas medicinales.6

Los aceites esenciales, o esencias, son compuestos del metabolismo vegetal; mayoría de ellos son volátiles y son responsables del olor del vegetal. Característica de las esencias la presencia de terpenos, fundamentalmente mono sesquiterpenos, que pueden estar asociados o no a otros componentes.7

Los aceites esenciales son fracciones liquidas volátiles, generalmente destilables por arrastre con vapor de agua, que contiene las sustancias responsables del aroma de las plantas. La mayoría de los alimentos deben su sabor y olor a sustancias químicas que se encuentran presentes en el orden de partes por millón. En la naturaleza, algunas especies evolucionaron con niveles muchos mayores de estas sustancias químicas que otras.8

Con el descubrimiento de la destilación se hizo posible separar del material botánico estas sustancias o sus mezclas, dando lugar al nacimiento de los aceites esenciales como producto comercial.8

La composición química de una esencia está permanentemente variando, modificándose las proporciones de sus constituyentes o transformándose

6 Aricapa, D., Actividad antimicrobiana de plantas sobre microorganismos cariogénicos, 2009, 147: p12.

7 Moreno, S., Crecente, O., Ortiz, S., Quintero, M., Composición química y actividad tóxica del aceite esencial de Simsia pubescens Triana, 2009, 745-747: 745.

(27)

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

Universidad Técnica Particular de Loja

unos constituyentes en otros, según la parte de la planta, el momento de su desarrollo, o el momento del día. Más aún, debe tenerse en cuenta que dada su normalmente compleja composición, presenta una alta probabilidad de sufrir modificaciones fisicoquímicas por reacciones entre sus propios constituyentes o entre éstos y el medio (la luz, la temperatura, presencia de enzimas, los componentes del reservorio donde se almacena la esencia.9

Desde la producción de penicilina, en 1941, hasta la actualidad, los antibióticos han curado millones de infecciones que pudieron haber sido letales. Sin embargo, el uso indiscriminado y muchas veces erróneo ha contribuido a la selección de microorganismos resistentes.10

Todos los antibióticos usados en la actualidad, incluyendo los nuevos agentes, tales como estreptograminas y la nueva generación de fluoroquinolonas, están sujetos a la aparición de resistencia. La urgente necesidad de hacer frente al problema de la resistencia ha llevado a investigadores y a la industria farmacéutica a buscar nuevas sustancias con actividad antimicrobiana.11

Las plantas superiores han constituido durante siglos la principal fuente de agentes medicinales, y muchas de ellas fueron útiles como quimioterápicos. El enfoque etnomédico ha demostrado ser el más efectivo de todos para el descubrimiento de nuevas drogas.12

Las bacterias patógenas de la época preantibióticos eran raramente resistentes. Actualmente 70% de las bacterias responsables de las

9

Rubio.M, Rezusta. A, Tomás. G, Ruesca. R. Perspectiva micológica de los dermatofitos en el ser humano. Rev Iberoam Micol 1999; 16: 16-22.

10

Chambers, H, Sande, M. -Fármacos antimicrobianos. En: Goodman & Gilman - Las bases farmacológicas de la terapéutica. Novena edición. McGraw-Hill- Interamericana, México, 1998, Vol. II, pág. 1095.

11 Toribio. M, Oriani. D, Fernández, J.G1; Skliar. M. Actividad antimicrobiana de

Verbesina encelioides. InVet v.7 n.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ene./dic. 2005

12

(28)

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

Universidad Técnica Particular de Loja

8

infecciones nosocomiales son resistentes al menos a uno de los antibióticos más comúnmente utilizados para tratarlas.13

El uso irracional de los antimicrobianos ha contribuido al aumento en la resistencia bacteriana.13 Las bacterias se adaptan rápidamente a las condiciones de su medio, aun en la presencia de estos fármacos.14

Los antibióticos difieren de los otros medicamentos porque no sólo ejercen un efecto terapéutico sino que alteran también la ecología de la microflora del cuerpo y del medio externo. La gran capacidad adaptativa de las bacterias es el resultado del efecto combinado de rápidos índices de crecimiento, de mutaciones genéticas y de la selección de las mismas, así como de su habilidad para intercambiar material genético.15

En el mes de marzo del 2006 la Sociedad Americana de Enfermedades Infecciosa (IDSA) publicó una “lista de choque” para enfatizar sobre la importancia de seis gérmenes de alto riesgo no sólo por su virulencia sino por ser resistentes a la mayoría de antibióticos que disponemos. Estos microorganismos multiresistentes son el Staphylococcus aureus resistente a oxacilina, Escherichia coli, Klebsiella spp, Acinetobacter baumanni, Aspergillus spp, Enterococcus faecium y Pseudomonas aeruginosa.16

Entre los organismos patógenos causantes de múltiples enfermedades infecciosas y que se evaluaran en la presente investigación se encuentran bacterias Gram positivas Para la evaluación antibacteriana se emplearon 2 cepas Gram positivas:Enterococcus faecalis (ATCC®29212) y Staphylococcus

13

Huges VM, Dotta N. Conjugative plasmids in bacteria of the "pre-antibiotic" era. Nature 1983; 302:725-726.

14

Behra-Miellet J, Calvet L, Mory F, Muller C, Chomarat M, Bézian MC et al. Antibiotic-resistance among anaerobic gram-negative bacilli: Lessons from a french multicentric survey. Anaerobe 2003;9:105.

15

Benavides. M, Aldama. A, Vázquez. H. .Vigilancia de los niveles de uso de antibióticos y perfiles de resistencia bacteriana en hospitales de tercer nivel de la Ciudad de México. 2005. V.47 n.3.

16

(29)

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

Universidad Técnica Particular de Loja

aureus (ATCC®259235) y 5 cepas Gram negativas: Pseudomonas aeruginosa (ATCC® 27853), Klebsiella pneumoniae (ATCC® 9997), Proteus vulgaris (ATCC®8427), Escherichia coli (ATCC®25922) y Salmonella typhimurium (LT2) mientras que para la evaluación de la susceptibilidad fúngica se evaluaron 2 organismos fungicos: Trichophyton rubrum (ATCC® 28188), Trichophyton mentagrophytes (ATCC® 28185).

Los dermatofitos son un grupo de hongos taxonómicamente relacionados que tienen capacidad para invadir el tejido queratinizado (piel, pelo y uñas) del hombre y animales y producir una infección, dermatofitosis, llamada comúnmente tiña. Las infecciones por dermatofitos de la piel no presentan una única manifestación clínica, su apariencia depende en gran medida de la zona del cuerpo afectado. Actualmente hay más preparaciones de antifúngicos que en cualquier otro momento de la historia.17

17

(30)

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

Universidad Técnica Particular de Loja

10 2.2 ANTECEDENTES

Existen alrededor de 250000 especies de plantas medicinales, de las cuales solo conocemos en parte el 10%, lo que indica lo mucho por investigar y el gran potencial de futuros medicamentos.18

El Ecuador posee una gran tradición cultural en el aprovechamiento de especies vegetales con fines terapéuticos. Al momento se registran alrededor de 5172 especies útiles, incluidas en 238 familias botánicas. El 60% de las plantas se utilizan con fines medicinales.19

El género Hedyosmum, está representado aproximadamente por 40 especies de árboles y arbustos aromáticos que crecen en las montañas y solo se encuentra en América y una especie en Asia. En el Ecuador este género está representado por 16 especies.20

En varios países latinoamericanos las hojas aromáticas de arbolitos de varias especies son usadas como bebidas refrescantes o como sustituto del café y té y para calmar varias dolencias.21

Hedyosmun strigosum es una especie nativa del Ecuador que se encuentra localizada en las provincias de Cotopaxi, Imbabura, Napo, Pichincha, Sucumbíos, Tungurahua y Loja a una altura entre 2000-3500 m.s.n.m. (Fig 2)

18 E. Palacios. Economía y plantas medicinales. Facultad de Ciencias Económicas, Universidad

Nacional Mayor de San Marcos. 2005.

19 T. Carrillo, G. Moreno. The importance of medicinal plants in health care in three small villages of the

Santa Ana county at Trujillo state, Venezuela. Departamento de Biologia y Química. Revista de la Facultad de Farmacia. 2007. Vol. 48 (2).

20

G. Ordaz, H. Armas, D. Yáñez & S. Moreno. Composición química de los aceites esenciales de las hojas de Helicteres guazumifolia (Sterculiaceae), Piper tuberculatum (Piperaceae), Scoparia dulcis (Arecaceae) y Solanum subinerme (Solanaceae), recolectadas en Sucre, Venezuela. Departamento de Ciencias, Sección de Química, Núcleo de Monagas, Universidad de Oriente. 2010. Vol. 59 (2): 585-595.

21

(31)

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

Universidad Técnica Particular de Loja

Conocida comúnmente como quinillo (castellano) y olloco (lengua no especifica). Usualmente es una planta comestible, donde la infusión de las hojas se bebe como agua aromática, además de ser alimento de aves, se usa como combustible y el tallo maderable se utiliza para la construcción de cercas.22

Hedyosmum strigosum

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase:Magnoliopsida

Orden: Chloranthales

Familia: Chloranthaceae

Género: Hedyosmum

Especie: strigosum

Habito: Arbusto

Altura: 2000-3500 m.s.n.m.

22

L. Castillejos. Modificación de la fermentación microbiana ruminal mediante compuestos de aceites esenciales. Tesis doctoral. Universidad autónoma de Barcelona. Departamento de ciencia animal y de los alimentos. Barcelona, España. 2005.

Fig 2b. Muestra in vivo de Hedyosmum strigosum

Elaboración. La autora

Fig 2a. Muestra de herbario de Hedyosmum strigosum

(32)

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

Universidad Técnica Particular de Loja

12

Investigaciones científicas reportan que el género Hedyosmum presenta

nuevas estructuras químicas como el caso de H.brasiliense en donde se la

conoce popularmente como "cidrão" y en la medicina popular, esta especie

aromática se utiliza ampliamente como un calmante / tranquilizante y para

tratar trastornos del sueño. Su interés se basó en determinar las propiedades

neuroquímicas del extracto de etanol (EEHb), fracciones y compuestos de

hojas frescas de Hedyosmum brasiliense y el efecto antidepresivo de los

aislados sesquiterpeno lactonas podoandin y

13-hidroxi-8,9-dehydroshizukanolid, donde los resultados sugieren que EEHb presenta

actividades psicofarmacológicos, como ansiolíticos,efectos antidepresivos e

hipnóticos.23

La presente investigación constituye un aporte al estudio fisicoquímico del

aceite esencial de H. strigosum y la evolución de la actividad biológica frente a

cepas bacterianas y fúngicas, mediante el método de microdilución en caldo.

No se reporta la composición química del aceite esencial en publicaciones

científicas.

23

(33)

Capítulo III

(34)

MATERIALES Y MÉTODOS

Universidad Técnica Particular de Loja

14 3. Metodología

La metodología empleada en la investigación se indica a continuación:

Figura 3.Esquema de los análisis realizados

Elaboración: La autora

Recolección

Destilación

Prueba químicas

(35)

MATERIALES Y MÉTODOS

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3.1 Recolección del material vegetal

El material vegetal de H. strigosum fueron recolectados en el cantón Saraguro, límite con la parroquia San Lucas, con las siguientes coordenadas: 692104E; 9593236N, 2190 m.s.n.m.

La recolección de la muestra se realizó en tres salidas de campo en un lapso de quince días, posteriormente la muestra fue transportada al Departamento de Química para su tratamiento postcosecha el mismo que consistió en seleccionar el material vegetal, es decir, eliminar la materia deteriorada e impurezas; se realizó cortes del material vegetal para conseguir una mayor superficie de contacto al momento de la destilación, es decir para permitir que el vapor de agua ingrese por todos los espacios existentes, todo este tratamiento con el fin de obtener mejores resultados en cuanto al rendimiento del aceite esencial.

Figura 4. Área de estudio de la especie Hedyosmunstrigosum de la provincia de Loja

(36)

MATERIALES Y MÉTODOS

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16 3.2 Destilación del aceite esencial

Figura 5. Proceso de destilación

Elaboración: Aromaticas.tripod.com

Se procedió a obtener el aceite esencial por hidrodestilación, dicho proceso consiste en separar sustancias orgánicas insolubles en agua y ligeramente volátiles, de otras no volátiles que se encuentran en la mezcla en este caso la obtención el aceite esencial mediante el vapor de agua seguida de la condensación. (Figura 5)

La materia vegetal fue destilada en seco, para ser sometida a destilación donde el tiempo óptimo es de 2 horas, pasado este tiempo la cantidad de aceite esencial obtenido es mínimo e inapreciable.

(37)

MATERIALES Y MÉTODOS

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aceite esencial fue almacenado en refrigeración, todo ello para mantener el aceite en buenas condiciones y evitar que se degrade por efecto de la luz. (Figura 6)

Figura 6 a) Obtención del aceite de H. strigosum. b) Frasco ámbar con aceite para refrigerados

Elaboración: La autora

3.2.1 Determinación de la Humedad

Se determinó la humedad (Figura 7) con una parte del material vegetal recolectado a ser destilado, se realizaron cortes en las hojas y luego se procede según el Anexo I.

Figura 7. Humedad

(38)

MATERIALES Y MÉTODOS

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18 3.2.2 Determinación del rendimiento

El rendimiento del aceite esencial depende mucho del estado fenológico y las condiciones en las que la materia vegetal es sometida a destilación. (Anexo II).24

3.3 Determinación de las Propiedades Físicas

3.3.1. Densidad relativa

La densidad del aceite es la relación entre su peso y volumen y es dependiente de la temperatura. Se determinará según la norma ANFOR NFT75-111 (Anexo III), realizando tres repeticiones, obteniendo una densidad promedio de cada una de las muestras. (Figura 8).

Figura 8a. Material para determinar la densidad b) Picnómetro con aceite de H. strigosum

c) Balanza analítica para determinar el peso

Figura 8: Material para densidad, Picnómetro, Balanza.

Elaboración: La autora

24

(39)

MATERIALES Y MÉTODOS

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3.3.2 Índice de Refracción

El índice se determinó según la norma ANFOR NF 75-112 25 utilizando un refractómetro ABBE (anexo IV).

Figura 9. Determinación del Índice de Refracción.

Elaboración: La autora

3.4 Determinación de la Composición química del aceite esencial

La identificación de los componentes químicos del aceite esencial de

Hedysomum strigosum se realizó mediante cromatografía de gases

acoplada a espectrometría de masas CG-MS, y acoplada un detector de ionización de llama CG-FID, dichas corridas cromatografías se hacen en una columna no polar DB-5MS.

3.4.1 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas

La cromatografía gaseosa es una técnica de separación y análisis de mezclas de sustancias volátiles basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija y otra móvil. En cromatografía gaseosa, la fase móvil es un gas que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.25

25

(40)

MATERIALES Y MÉTODOS

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20 3.4.2 Cromatografo de gases

Para el análisis del aceite esencial de H. strigosum se utilizó un Cromatógrafo de Gases Agilent serie 6890N, acoplada a un Espectrómetro de masas Agilent serie 5973 inert, dotado con un sistema de datos MSD-Chemstation D.01.00 SP1, cuenta con un inyector automático split/splitless serie 7683, y dos columnas capilares. (Figura 10)

Figura 10. Cromatógrafo de gases

Elaboración: La autora

3.4.3 Características de las columnas

Tabla1. Características de las columnas capilares

Columna Longitud (m)

Diámetro Interno (mm)

Película (um)

Temperatura Limite (°C)

DB-5MS 30 0.25 0.25 325

Fuente: Laboratorio de Análisis Instrumental- Departamento de Química- UTPL

Elaboración: La autora

(41)

MATERIALES Y MÉTODOS

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Figura 11. Esquema de la identificación de la composición química del aceite esencial.

Elaboración: La autora, 2012.

Preparación de la muestra de HC y los 9

aceites esenciales

Corrida cromatográfica de los HC, seguida de las

muestras en GC-MS

Corrida cromatográfica de los HC, seguida de las

muestras en GC-MS

Columnas DB-5MS

Datos Wiley 7n.1

Determinación de los índices de Kovats

Identificación cualitativa y cuantitativa de los compuestos del aceite

esencial

Corrida cromatográfica de los HC, seguida de las

muestras en GC-FID

Datos Wiley 7n.1

Identificación cualitativa y cuantitativa de los compuestos del aceite

esencial

Bibliografía

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MATERIALES Y MÉTODOS

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22

3.4.4 Preparación de las muestras para el análisis

Es de vital importancia tener en cuenta que todo el material debe estar completamente limpio y en buen estado para evitar contaminaciones y obtener resultados óptimos. (Figura 12)

Figura 12. Preparación de muestras

Elaboración: La autora

Para la preparación de las muestras se realizó una dilución de 990 uL de diclorometano grado HPLC y 10 uL de aceite esencial de H. strigosum. Además se realizó la inyección de Hidrocarburos del C10 a C25

comercialmente conocido como TPH-6RPM de CHEM SEVICE, los

hidrocarburos se inyectaron en DB-5MS con la finalidad de obtener los índices de Kovats, importantes para determinar la composición química del aceite. (Figura 13)

Figura 13. Inyección cromatográfica.

(43)

MATERIALES Y MÉTODOS

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3.4.5 Corrida cromatográfica de las muestras de la columna DB-5MS Una vez preparadas las muestras del aceite esencial e hidrocarburos se procede a inyectar en el cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas en la columna capilar con los siguientes parámetros. (Figura 14)

Figura 14. Parámetros operacionales de la columna DB-5MS

Elaboración: La autora

o Espectrómetro de Masas o Temperatura: 250 °C o Gas: Nitrógeno

DETECTOR

o Modo: Split

o Radio de partición: 50:1 o Temperatura inicial: 250 °C o Gas: Helio

INYECTOR (SPLIT/SPLITTES

S

o Temperatura inicial: 50° C o Temperatura final: 210 °C o Rampa: 2.5 °C

HORNO

o Columna capilar DB-5MS, modelo Agilent 122-5532 de 0.25mm*30m*0.25um o Temperatura máxima: 350

°C

o Flujo constante

o Flujo inicial: 0.9ml/min o Presión inicial: 11.10psi o Velocidad promedio: 24

cm/seg

o Presión de salida: Ambiente

(44)

MATERIALES Y MÉTODOS

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24 3.4.6 Obtención de cromatogramas

Es la representación gráfica de la señal en función del tiempo una vez que la muestra es inyectada a un sistema cromatografico. Para obtener este cromatograma a la salida de la columna se coloca un sistema de detección y registró, que permite responder a una propiedad de la solución que contiene el analito o del propio analito en función del tiempo.26

El tamaño de los picos se corresponde con el porcentaje del compuesto de la muestra. El tiempo de retención es el tiempo que tarda el compuesto en atravesar la columna. Si las condiciones de la columna y todas las condiciones de funcionamiento son constantes, un compuesto determinado siempre tendrá el mismo tiempo de retención.27 (Figura 15)

Figura 15. Cromatograma típico del aceite esencial d H. strigosum

Fuente: Librería WILEY 7n.1

Elaboración: La autora

26

Universidad Central De Venezuela Escuela De Química Facultad De Ciencias Instrumental Analítico. Guía de Cromatografía. Caracas 2008.

27

(45)

MATERIALES Y MÉTODOS

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3.4.7 Determinación de los Índices de Kovats

Es un método de cuantificación de los tiempos de elución relativa de los diferentes compuestos en cromatografía de gases, de forma que ayuda a identificar los componentes de una mezcla. El método aprovecha la relación lineal entre los valores del logaritmo del Tr, log ( tr'), y el número de átomos de carbono en una molécula. El valor del índice de Kovats suele representarse por IK en las expresiones matemáticas. Su aplicación se limita a los compuestos orgánicos. 28

Para determinar los índices de kovats se comparan los tiempos de retención de los hidrocarburos obtenidos con el tiempo de retención de los compuestos del aceite esencial en base a la siguiente fórmula:

Dónde:

IK= Índice de retención de kovats

n= Número de átomos de carbono en el n-alcano

tRx= Tiempo de retención del compuesto analizado, que eluye en el centro de

n-alcanos.

tRn= Tiempo de retención n-alcano que eluye antes del compuesto analizado. tRN= Tiempo de retención del n-alcano que eluye después del compuesto

analizado.

3.4.8 Identificación cualitativa y cuantitativa de los compuestos químicos del aceite esencial con base en los índices de kovats y los espectros de masas.

28

(46)

MATERIALES Y MÉTODOS

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26

El tamaño de los picos y el tiempo de retención se usan para la determinación cuantitativa y cualitativa de un compuesto respectivamente.

La identificación de los compuestos químicos de Hedyosmum strigosum se realizó con la ayuda de la librería WILEY 7n la misma que nos proporciona el Numero de CAS de cada uno de los compuestos con tres posibilidades, posteriormente se determinó el índice de Kovats de cada uno de los compuestos del aceite esencial detectados en la columna DB-5 MS.

Se realiza la comparación de los índices de Kovats obtenidos experimentalmente en las dos columnas con lo reportado en la literatura; el tiempo de elución nos permitió calcular el índice de kovats de cada uno de los compuestos, de tal manera que los índices calculados fueron indispensables para identificar los compuestos presentes en una mezcla.

3.4.9 Corrida cromatográfica de las muestras por CG-FID en la columna capilar DB-5.

El detector de ionización de llama consiste de una llama hidrógeno/aire y una placa colectora. Las muestras que salen de la columna pasan a través de la llama, la cual rompe las moléculas orgánicas y produce iones. Los iones son colectados en un electrodo parcial y produce una señal eléctrica. 29

Los aceites esenciales fueron inyectados en DB-5 (CG-FID) bajo las siguientes condiciones: (Figura 16)

(47)

MATERIALES Y MÉTODOS

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Figura 16. Parámetros operacionales de la columna DB-5 (CG-FID)

Elaboración: La autora

o Temperatura: 250 °C o Gas: Nitrógeno o Llama: Encendida

o Modo: Split

o Radio de partición: 50:1 o Temperatura inicial: 250 °C o Gas: Helio

INYECTOR (SPLIT/SPLITTES

o Temperatura inicial: 50° C o Temperatura final: 210 °C o Rampa: 2.50 °C/min

HORNO

o Columna capilar DB-5-FID, modelo Agilent 122-5532 de 0.25mm*30m*0.25um

o Temperatura máxima: 350 °C o Flujo constante

o Flujo inicial: 0.9ml/min o Presión inicial: 11.10 psi o Velocidad promedio: 24

cm/seg

o Presión de salida: Ambiente

(48)

MATERIALES Y MÉTODOS

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28 3.5 Evaluación de la Actividad Biológica

El método empleado (CMI) nos permite medir la susceptibilidad de los microorganismos frente a agentes antimicrobianos y antifúngicos determinando así la potencia inhibitoria de la sustancia, lo que dependerá de la susceptibilidad de un microorganismo a concentraciones conocidas de una droga de origen vegetal.

3.5.1 Microorganismo de Prueba

Para la evaluación de la actividad bacteriana se emplearon 2 cepas Gram positivas: Enterococcus faecalis (ATCC® 29212) y Staphylococcus aureus (ATCC®259235) y 5 cepas Gram negativas: Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853, Klebsiella pneumoniae (ATCC® 9997), Proteus vulgaris (ATCC® 8427), Escherichia coli (ATCC®25922) y Salmonella tiphymurium (LT2) mientras que para la evaluación de la susceptibilidad fúngica se emplearon 2 organismos: Trichophyton rubrum (ATCC® 28188), Trichophyton mentagrophytes (ATCC® 28185).

3.5.2 Preparación del Aceite Esencial

Se empleó una dilución de 20mg/ml de aceite esencial + 980ul de DMSO, esta dilución fue utilizada para bacterias y hongos.

3.5.3 Preparación de los Medios de Cultivo

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y peptona a la que se añadirán otros ingredientes.

Los medios de cultivo se realizaron de acuerdo a las bacterias y hongos utilizados.

(49)

MATERIALES Y MÉTODOS

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3.5.3.1 Bacterias

3.5.3.1.1 Caldo de Cultivo Muller Hilton

Es el principal medio utilizado para las pruebas bacterianas donde se realizaron cálculos previos con el fin de elaborar el medio necesario, se tomó en cuenta el número de pocillos, el número de aceites y el número de bacterias a utilizar.

3.5.3.1.2 Cultivo Overnight

Consistió en la elaboración de una serie de medios de cultivo en los cuales se realizó el inoculo de las bacterias, entre los medios utilizados se encuentran Caldo tripticasa: Staphylococcus aureus, Klepsiella, Pseudomona y Escherichia coli; Caldo Oxoid: Salmonella tiphymurium; Caldo Infusión Cerebro: Enterococcus faecalis y Caldo Muller Hinton: Proteus vulgaris.

Luego se procedió a esterilizarlos mediante autoclave, posteriormente se realizó el inoculo de las bacterias en los medios correspondientes.

3.5.3.1.3 Preparación de la suspensión de Inóculos

Para evaluar la actividad biológica en bacterias, fue cultivado el microorganismo a 37°C por 24 horas, de éste cultivo se tomó 150-300μL en

7mL de suero fisiológico (NaCl), ajustando el inoculo a una concentración equivalente a 0,5 en la escala de McFarland, de ésta suspensión se llevó a

140μL inoculando en 7 mL de caldo Muller Hinton para ajustar a una población

bacteriana de 1x107 CFU/mL; 100μL de ésta suspensión se utilizó para

completar 200μL del volumen final de la placa de cultivo, ajustando la población

(50)

MATERIALES Y MÉTODOS

Universidad Técnica Particular de Loja

30 3.5.3.2 Hongos

3.5.3.2.1 Caldo Sabouroud

Es el principal medio utilizado para las pruebas de actividad fúngica, para ello se realizaron cálculos previos con el fin de elaborar el medio necesario, tomando en cuenta el número de pocillos, el número de aceites y el número de hongos.

Luego se preparó los medios de cultivo los cuales fueron esterilizados con la ayuda de autoclave junto con el material necesario, todo ello con el fin de evitar contaminaciones, posteriormente los medios fueron almacenados en la estufa.

3.5.3.2.2 Preparación de la Suspensión de Inóculos

El inoculo fúngico se realizó a partir de las cepas en reserva criogénica mantenidas a -80°C.

Se tomó 14ul en 7ml de Caldo Sabouroud. 100 µL de esta suspensión se usan para completar a 200µL el volumen final de la placa de cultivo, de esta manera se ajusta la población fúngica a 5x104 esporas/ml.

Los valores de CMI en hongos se determinaron usando una concentración final de 5x104 esporas/mL de Trichophyton mentagrophytes (ATCC 281885), y Trichophyton rubrum (ATCC 28188). Se encubaron a 28°C por cinco días. Se utilizó el antimicótico Itraconazol (1mg/mL) como control positivo y DMSO como control negativo.

3.5.4 CMI Antibacterianos

Figure

Tabla 1. Características de las columnas capilares…………………………    20

Tabla 1.

Características de las columnas capilares………………………… 20 p.10
Table 2. Chemical composition (%) of essential oil of H. strigosum determined for CG/MS and comparison CG/MS-FID

Table 2.

Chemical composition (%) of essential oil of H. strigosum determined for CG/MS and comparison CG/MS-FID p.16
Figura 1. Diseño Experimental Elaboración: La autora

Figura 1.

Diseño Experimental Elaboración: La autora p.23
Fig 2a.  Muestra de herbario de

Fig 2a.

Muestra de herbario de p.31
Figura 3.Esquema de los análisis realizados Elaboración: La autora

Figura 3.Esquema

de los análisis realizados Elaboración: La autora p.34
Figura 4. Área de estudio de la especie Hedyosmun strigosum de la provincia de Loja Elaboración: La autora

Figura 4.

Área de estudio de la especie Hedyosmun strigosum de la provincia de Loja Elaboración: La autora p.35
Figura 5. Proceso de destilaciónElaboración : Aromaticas.tripod.com

Figura 5.

Proceso de destilaciónElaboración : Aromaticas.tripod.com p.36
Figura 7 Elaboración. Humedad La autora

Figura 7

Elaboración. Humedad La autora p.37
Figura 6 a)  Obtención del aceite de H. strigosum.         b) Frasco ámbar con aceite para refrigerados Elaboración: La autora

Figura 6

a) Obtención del aceite de H. strigosum. b) Frasco ámbar con aceite para refrigerados Elaboración: La autora p.37
Figura 8:  Material para densidad, Picnómetro, Balanza. Elaboración: La autora

Figura 8:

Material para densidad, Picnómetro, Balanza. Elaboración: La autora p.38
Figura 8a. Material para determinar la densidad

Figura 8a.

Material para determinar la densidad p.38
Figura 9. Determinación del Índice de Refracción. Elaboración: La autora

Figura 9.

Determinación del Índice de Refracción. Elaboración: La autora p.39
Figura 10. Cromatógrafo de gases

Figura 10.

Cromatógrafo de gases p.40
Tabla1. Características de las columnas capilares
Tabla1. Características de las columnas capilares p.40
Figura 11. Esquema de la identificación de la composición química del aceite esencial

Figura 11.

Esquema de la identificación de la composición química del aceite esencial p.41
Figura 12 . Preparación de muestras Elaboración: La autora

Figura 12 .

Preparación de muestras Elaboración: La autora p.42
Figura 13. Inyección cromatográfica. Elaboración: La autora

Figura 13.

Inyección cromatográfica. Elaboración: La autora p.42
Figura 15. Cromatograma típico del aceite esencial d H. strigosumFuente: Librería   WILEY 7n.1 Elaboración: La autora

Figura 15.

Cromatograma típico del aceite esencial d H. strigosumFuente: Librería WILEY 7n.1 Elaboración: La autora p.44
Figura 17. Placa TCElaboración96 La autora

Figura 17.

Placa TCElaboración96 La autora p.51
Tabla 2. Humedad media de H. strigosum

Tabla 2.

Humedad media de H. strigosum p.54
Tabla 3. Rendimiento promedio de H. strigosum

Tabla 3.

Rendimiento promedio de H. strigosum p.55
Tabla 5. Índice de refracción

Tabla 5.

Índice de refracción p.56
Tabla 4. Densidad (g/cm 3)

Tabla 4.

Densidad (g/cm 3) p.56
Tabla 6. Composición y Comparación Química del Aceite Esencial de H. strigosum

Tabla 6.

Composición y Comparación Química del Aceite Esencial de H. strigosum p.58
Figura 19. Compuestos mayoritarios de la especie Fuente. Librería WILEY 7n.1 Elaboración

Figura 19.

Compuestos mayoritarios de la especie Fuente. Librería WILEY 7n.1 Elaboración p.62
Figura 18. Cromatogramas de H. strigosum

Figura 18.

Cromatogramas de H. strigosum p.62
Figura 20 Espectros de los compuestos mayoritarios Fuente: Librería WILEY 7n.1

Figura 20

Espectros de los compuestos mayoritarios Fuente: Librería WILEY 7n.1 p.66
Tabla 8. Concentración Mínima Inhibitoria para Hongos

Tabla 8.

Concentración Mínima Inhibitoria para Hongos p.67