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Células madre pluripotentes humanas I

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Academic year: 2020

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34 REV MED UNIV NAVARRA/VOL 47, Nº 3, 2003, 34-42 135

Células madre pluripotentes humanas I

N. López Moratalla1, I. González de la Tajada2

1Departamento de Bioquímica 2Departamento de Histología y Anatomía Patológica. Universidad de Navarra

Correspondencia: Natalia López Moratalla Departamento de Bioquímica Universidad de Navarra (natalialm@unav.es)

Resumen

En los últimos años, el extraordinario avance en campos como el de la biología molecular y del desarrollo, ha permitido un conocimiento detallado de los mecanismos implicados en la programación celular, lo que ha supuesto un avance rápido e inesperado en las estrategias de terapia celular.

Así, se han podido conocer los mecanismos implicados en la diferen-ciación celular y con ello, se ha abierto la posibilidad de poder manipular células humanas y cambiarles la trayectoria para que sustituyan la función de células afectadas por la enfermedad. Se han obtenido células madre embrionarias (ES) a partir de células del embrioblasto. A partir de células madre embrionarias de ratón, se han derivado múltiples tipos celulares, que incluyen neuronas, células de la glía, células de los islotes pancreáticos, hepatocitos, osteoblastos y adipocitos. De igual manera, se han obtenido líneas celulares, mediante la utilización de técnicas de transferencia de núcleo, capaces de generar embriones clónicos. Investigación ésta, que pretende salvar el escollo bioético haciendo hincapié en que es “clonación terapéutica”.

En este trabajo, nos proponemos analizar los mecanismos que per-miten a las células madre ser pluripotentes y debatir si la utilización de embriones es una aproximación metodológica lícita y viable para la obtención de células madre, con potencial terapéutico.

Palabras claves:Célula madre embrionaria. Clonación terapeútica. Desarrollo.

Summary

In the last few years, the great progress of certain fields, such as molecular biology and development, has allowed a detailed knowledge of mechanisms implicated in cellular programming. This has permitted a rapid and unexpected advance in therapeutic cellular strategies. Thus, it has been possible to discover mechanisms involved in cellular differentiation and therefore has opened possibilities for human cellular manipulation and function replacement of damaged cells.

Embryonic stem cells, have been obtained from the embryoblast. A lot of types of cellular lineages that include neurons, glial cells, pancreatic islets cells, hepatic cells, osteoblast and adipocytes, have been derived from mouse embryonic stem cells.

In the same way, cellular lineages have been obtained by nuclear transference techniques capable of generating embryonic clones. Some scientist intend to evade by this approach, the bioethic reproval for human cloning, emphasizing that this is a “therapeutic cloning”. In the present work, we propose to analyze mechanisms that permit stem cells to be pluripotential and discuss the ethical use of embryos as a source for stem cells with therapeutic potential.

Key words: Embryonic stem cell. Therapeutic cloning. Develop-ment.

Dinámica del desarrollo y maduración

del organismo

En los últimos años la biología celular y molecular del proceso de desarrollo embrionario y maduración del organismo ha alcanzado nuevos conceptos, que están permitiendo un avan-ce inesperado y rápido en las estrategias terapéuticas avan- celula-res. Suponen una visión dinámica de la capacidad de autoorga-nización de un sistema complejo como es un ser vivo. En efecto, la dinámica de la autoconstitución de los seres vivos, y de su funcionamiento unitario como organismo, supone que la infor-mación genética se expresa, regulada y amplificada por las interacciones con el medio intracelular y con las interacciones intercelulas; a su vez, en este dinamismo, las condiciones del medio intra y extracelular cambian con el proceso mismo de

desarrollo y maduración. En la construcción, desarrollo y madu-ración de un organismo cada una de sus células tiene informa-ción precisa, “sabe” a lo largo de la vida del viviente “quién es”, la historia de dónde procede y a dónde se dirige. En unos pocos años hemos podido conocer los mecanismos implicados en ese “saber celular” y con ello la posibilidad de poder manipular células humanas, más o menos jóvenes o más o menos adul-tas, y cambiarles la trayectoria para que sustituyan la función de células dañadas por la enfermedad.

Programación del desarrollo

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contenida en la secuencia de nucleótidos del DNA condiciona el tipo de moléculas que pueden aparecer y con ello el fenotipo celular y tipo de organismo. Ahora bien, en la dinámica del proceso vital cada gen puede expresarse o no y, hacerlo o no, en un tiempo concreto y en un lugar concreto; incluso algunos genes pueden procesarse de una forma o de otra, dependiendo del contexto celular, de tal manera que la información conteni-da en el DNA no define necesariamente una sola función. Esta compleja red de interacciones moleculares y celulares supone una ampliación de la información genética con el proceso mis-mo de diferenciación celular, desarrollo embrionario y madura-ción.

Podemos distinguir dos tipos o niveles de información genética. Un primer nivel es la dotación informática de la célu-la en ella misma; la secuencia de nucleótidos del genoma he-redado de los progenitores es igual en todas las células del organismo aunque la expresión, o represión, de cada gen, o grupos de genes, es autorregulada de forma diferente según el estadio en que se encuentre la célula1,2. A su vez el estado del

soporte material de la información genética (el DNA) cambia en las diferentes células de las diversas líneas celulares en el proceso espacio-temporal del desarrollo y maduración del orga-nismo. Uno de los cambios ocurre en la configuración y confor-mación espacial del DNA y el otro en el número de bases (que ocupan un sitio concreto en la secuencia de DNA) que sufren modificaciones químicas. Una de esta modificación, consiste en la metilación y desmetilación regulada de la base citosina, que da lugar al establecimiento de patrones de metilación que son diferentes al inicio del desarrollo que en fases más avanza-das; y es diferente de un tipo celular a otro según el sitio que han ido ocupando y en un momento u otro del proceso3,4. Se

da, de este modo, una retroalimentación de la información; lo cual hace posible que, estando el código genético entero en todas y cada una de las células de los tejidos y órganos, la información esté regulada espacial y temporalmente de manera que las células en las diferentes líneas celulares se diferencian o especializan, formando tejidos y distintos órganos. El conoci-miento de los mecanismos de esta programación nos permite abordar una “reprogramación artificial” de células inmaduras (madre o progenitoras) hacia delante o “desprogramar” hacia atrás, rejuveneciendo una célula ya diferenciada. Y ambos pro-cesos de manipulación pueden inducirse modificando la rela-ción entre los genes y los factores reguladores (la relarela-ción nucleo-citoplasma de la célula) de su expresión por un doble camino: cambio en el estado del genoma o cambio en las condiciones del medio intracelular.

Irreversibilidad natural del programa de desarrollo de cada individuo

Un conjunto de células diferenciadas, y más o menos or-denado, no es un organismo ya que no constituye una unidad funcional y vital. No basta el primer nivel de información (la expresión de forma diferencial del mensaje genético contenido en cada una de las células) para el desarrollo y maduración de un organismo. Requiere además la armonización unitaria, y al mismo tiempo diferenciada, de la emisión de su mensaje genético. Es éste, por tanto, un segundo nivel, o segundo tipo de información, que permite un programa de desarrollo: una secuencia de mensajes ordenados en el tiempo y coordinados

en el espacio orgánico. Este segundo nivel de información, o programa de desarrollo, es el que permite entender por qué cada ser vivo se va construyendo su propia vida, en diálogo molecular e interacción con su medio, abierto de modo indivi-dual, propio e irrepetible.

El conocimiento de la dinámica del desarrollo, de la ma-duración, del envejecimiento y de la muerte programada (apoptosis), nos permite intervenir en los procesos de reprogra-mación con un conocimiento nítido de qué es una simple modi-ficación de la genética y la diferenciación celular y qué es por el contrario intervenir en el proceso mismo de producción de un nuevo ser. Este conocimiento es imprescindible para abordar con rigor científico y ético la prometedora área de las terapias regenerativas con células madre. La expresión de marcadores específicos de las primeras fases del programa de desarrollo permiten reconocer con precisión si el conjunto celular que está creciendo, de forma armónica y unitaria, es un individuo que inicia su vida o, se trata simplemente de un grupo de célu-las vivas, que crecen y se estructuran por interacciones entre ellas, con una apariencia que le asemeja a un embrión de pocos días.

Reversibilidad accidental del programa de desarrollo en una célula

A su vez, va siendo conocido con mayor precisión cómo la determinación (o compromiso) y la diferenciación celular de-pende de grupos de genes asociados, que controlan cada esta-dio particular. Genes que se expresan de forma integrada funcionalmente en grupos con diferente nivel de jerarquía. De esta manera, la diferenciación de una célula hacia un estadio de alta especialización se acompaña de una perdida de la capa-cidad de proliferación, a la vez que la célula guarda memoria de su historia como parte de un organismo y su inherente carácter de progenitora, o diferenciada, o a término. Ese equilibrado balance diferenciación/proliferación se regula genéticamente, y cuando falla constituye la raíz misma de la aparición de un proceso tumoral. Esto implica que las cascadas de expresión de genes que permiten y regulan los tres procesos celulares clave para la vida de un organismo (control de la proliferación, con-trol de la apoptosis -muerte celular programada-, y diferencia-ción) están estrechamente interconectadas. Más aún, las tres cascadas de reacciones se pueden hacer reversibles en algunos de sus nudos de conexión.

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Células madre embrionarias (ES) pluripotentes

derivadas de embriones en fase blastocisto.

Células madre germinales fetales (EG)

Las células madre (o troncales) son células indiferenciadas con capacidad de proliferación prolongada para dar células en el mismo estado de indiferenciación y con potencial de formar otros tipos diferenciados. En el embrión de pocos días existen células que tienen la capacidad de dar origen a cualquier tipo celular embrionario o extra-embrionario5. Se denominan por ello

totipotentes, aunque en el embrión de dos células, tras la pri-mera división del cigoto ambas células contribuyen ya de modo específico al desarrollo posterior; una está comprometida hacia los tejidos embrionarios (la que hereda la zona de entrada del espermio al óvulo en la fecundación) dando lugar a la masa interna del blastocisto, y la otra a los tejidos extraembrionarios a través de la conversión en trofoblasto6-8.

(Figura 1) Las células de la masa celular interna (IMC) del blastocisto humano (embrión de 5-6 días) tienen el potencial de contribuir a cualquier linaje pero no cualquier tipo, y por ello se les denomina pluripotentes. Las células del trofoectodermo, por el contrario, sólo contribuyen a dar la capa del trofoblasto de la placenta9. Antes de la anidación del embrión, las células de la

masa celular interna se organizan en dos capas que darán origen al endodermo primitivo, al endodermo extraembrionario, y al epiblasto (la capa de ectodermo primitivo) que formará los tejidos del embrión y algunos tejidos extraembrionarios10. En el embrión

en desarrollo estas células son realmente sólo células progenitoras, o precursoras, es decir se multiplican limitadamente antes de diferenciarse y contribuyen con ello a todos los tejidos adultos. Sin embargo, cuando las células de la masa celular interna (MCI) se extraen del ambiente embrionario natural y se cultivan in vitro, proliferan sin limitaciones al tiempo que mantienen el potencial de generar células derivadas de cualquiera de los linajes del em-brión. Las líneas celulares pluripotentes (capaces de diferenciarse en las tres láminas embrionarias11, endodermo, mesodermo y

ectodermo, y la línea germinal12) derivadas in vitro de la MCI se

denominan células madre embrionarias (ES). Después de la anidación, cuando el embrión pasa al estadio de gástrula, las célu-las MCI se han ido diferenciando y comprometiéndose a linajes específicos, de acuerdo con el tiempo transcurrido y el lugar que ocupan en el organismo embrionario. Son células multipotentes.

Durante la etapa de gastrulación, un grupo de células proce-dentes del epiblasto forma las células germinales primordiales, que emigran hasta las crestas genitales donde darán origen a las gonadas y gametos13. Las células de ese grupo (primordiales

germinales) también dan origen a líneas celulares pluripotentes y, para distinguirlas de las ES, se denominan células germinales embrionarias (EG). Tanto las ES como las EG se replican por un periodo de tiempo prolongado, no muestran anormalidades cromosómicas, generan cultivos femeninos (XX) y masculinos (XY), expresan los marcadores típicos de células pluripotentes, y bajo estímulos adecuados son capaces de diferenciarse en tipos celu-lares de cualquiera de las tres capas germinales. Sin embargo, no solo difieren en su tejido de origen sino que su comportamiento in vitro es algo diferente. Las células aisladas del blastocisto (ES) son capaces de proliferar in vitro durante un periodo de dos años, lo que supone aproximadamente entre 300 y 450 divisiones, mien-tras que las células germinales, proliferan durante un máximo de 80 divisiones. Además las células ES, son capaces de inducir la formación de los tumores denominados teratomas, cuando se inyectan en ratones atímicos. Las ES difieren de las células lla-madas del carcinoma embrionario (EC), presentes también en el embrión temprano y que transferidas a animales se desarrollan in vivo para dar lugar a teratomas14.

Ambos tipos celulares, ES y EG, se han obtenido de ratón, se han caracterizado y se han usado como modelo para una serie de enfoques experimentales para el estudio del desarrollo en mamíferos, análisis de la expresión y función de genes du-rante la diferenciación y desarrollo, y en experimentos encami-nados a la obtención de poblaciones celulares para diseño de terapias de transplante15. Más recientemente, se han obtenido

células ES embrionarias humanas a partir de blastocistos dona-dos de clínicas de reproducción asistida11 (y también se han

Figura 1. Distribución celular y expresión génica específica durante los primeros días de desarrollo. Las células de la mórula inicial ocupan posiciones específicas conforme avanza el desarrollo embrionario. En la mórula compactada, pueden distinguirse dos tipos celulares. Las células de la masa interna, que darán lugar a ecto, endo y mesodermo, poseen una alta expresión del gen OCT-4, mientras que las células periféricas, con bajos niveles de OCT-4 darán lugar al linaje trofoectodermico

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producido a partir de embriones producidos para ello fecundan-do in vitro gametos de donantes fértiles16), y células troncales

germinales, EG, a partir de células germinales primordiales de fetos abortados17.

Células madre del blastocisto murino y humano

Del blastocisto murino se ha aislado otro tipo diferente de células madre, las del trofoblasto (TS). Usan diferentes vías de señalización que las ES para mantener la proliferación de su estadio indiferenciado, requieren diferentes factores de diferen-ciación específicos del estado y contribuyen de forma también diferente al desarrollo de la quimera cuando se inyectan a otro blastocisto. Sin embargo, las células ES pueden transformarse en cultivo en TS18 precisamente por cambio de la expresión del

gen Oct-4, que es un factor clave en la determinación de la pluripotencialidad.

El gen Oct-4 es importante en el desarrollo temprano; es un factor de transcripción relacionado con el mantenimiento de totipotencia en las células embrionarias y germinales19 y existe

una estrecha relación entre la expresión del gen Oct-4 y el grado de indiferenciación de las células. En embriones huma-nos, Oct-4 está presente en todos los estadios desde el oocito no fecundado hasta blastocisto20; la expresión de Oct-4 en las

células totipotentes de la masa celular interna es muy superior a la detectada en las células diferenciadas del trofectodermo21.

A medida que comienzan a aparecer tipos celulares diferencia-dos en el embrión, los niveles de expresión descienden hasta no ser detectable y sólo continúa expresado en las células germinales primordiales cuando migran hacia las crestas genitales. Este factor se expresa únicamente en las células que darán origen a las células germinales primordiales y más adelante, la proteína se observa solo en oocitos, y no en la línea germinal masculina destinada a la producción de espermatozoides22. Oct-4 también

está presente en células madre embrionarias (ES) humanas23.

Así pues, la expresión de Oct-4 tiene relación con el man-tenimiento de la totipotencia de las células de los primeros estadios del desarrollo embrionario regulando la determinación temprana del embrión preimplantatorio. Estos datos tienen una importancia capital en el tema que nos ocupa: si los diferentes niveles de expresión de Oct-4 permiten predecir el desarrollo hacia masa celular interna (niveles elevados de Oct-4) o hacia trofectodermo (niveles bajos de Oct-4) en embriones huma-nos24, se puede identificar si un conjunto de blastómeros posee

organización embriogénica (es decir, son un embrión), o un simple amasijo de células. Los embriones mutantes en Oct-4

inicialmente se asemejan a un blastocisto pero no expresan los marcadores de las células de la masa interna e in vitro sólo generan células del trofoblasto25; por tanto, esto indica que

Oct-4 se requiere para el desarrollo de la masa interna del blastocisto.

Mecanismos de diferenciación de las células ES y de las TS

In vivo, la presencia de células ES pluripotentes con capa-cidad de autorenovación es transitoria; si las ES se agregan a un embrión de ocho células o a un blastocisto se genera una quimera. Esto indica que las células ES son pluripotentes pero no totipotentes: a pesar de que contribuyen a todos los tejidos fetales no participan en la formación del trofoectodermo ni al endodermo primitivo26. Sin embargo, se obtienen líneas

celula-res inmortalizadas manteniendo las propiedades de células madre por cultivo in vitro de las células de la masa interna del blastocisto en presencia de la citoquina denominada factor inhibidor de leucemia (LIF)27; estas células ES se mantienen de forma

inde-finida en presencia de LIF, y expresan marcadores del estado indiferenciado pluripotente como el Oct-4. En ausencia de LIF se reprime rápidamente Oct-4 y se pierde la capacidad de rege-neración y diferenciación a múltiples tipos celulares. La vía por la que actúa el LIF para promover la regeneración de las células ES es a través de la formación de un heterodimero entre el receptor de citoquinas de tipo I con baja afinidad por LIF y una subunidad común, la gp13028. Las células ES humanas,

pare-cen ser LIF independientes, mientras que las murinas requieren la citoquina para su mantenimiento ex vivo. Debido a que el homodimero de esta subunidad, gp 130, es suficiente para pro-mover la proliferación de las ES29, se han podido establecer las

vías de señalización intracelulares que siguen a la gp130 en la regeneración de las ES:

a. gp130⇒ JAK(quinasa)⇒ STAT330

b. gp130⇒ MAP quinasa⇒ ERK1 y ERK231

c. gp130⇒ SHP2⇒ RAS⇒ ERK32

De estas tres vías, resulta crítica la que desencadena la activación de STAT3, un factor de transcripción que transloca al núcleo y da lugar a la expresión de genes implicados en el mantenimiento de la pluripotencialidad (Figura 2).

Las células TS sólo contribuyen a los linajes del trofoblasto de la placenta y por ello están restringidas a la diferentiación de esta línea y son incapaces de producir, en las condiciones en que se han estudiado, otros tipos celulares. No se conocen bien los factores clave en la determinación hacia la línea trofoec-todermo; hay varios factores de transcripción (tales como bHLH del gen Mash233, el tipo caudal del gen Cdx234, y el T-box del

gen Eomes35), cuyo patrón de expresión en las primeras fases

del desarrollo es inverso al Oct-4: se expresan en el embrión temprano y posteriormente quedan restringidos al trofoectodermo en el estado de blastocisto; pero, la mutación de estos genes individualmente no impide la diferenciación del trofoectodermo. Mash2 está implicado posteriormente en el desarrollo de la placenta36, mientras que Cdx2 y Eomes se requieren al

ini-cio37,38; ninguno de los tres solos es necesario para la

diferen-ciación inicial del trofoectodermo. Su proliferación requiere la activación de la vía de las MAP quinasas tras la interacción del factor FGF con su receptor; esta interacción es compleja y varía según el espacio y el tiempo. Un paso clave es la fosforilación del receptor que acopla la proteína FRS-2 en la vía de señaliza-ción RFGFÞ MAP quinasa39,40.

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Curiosamente, aunque las ES y las TS proceden ambas del embrión temprano, no es fácil interconvertirlas entre sí sin cam-bio de la expresión del Oct-4. El cultivo de líneas celulares ES en las que Oct-4 está reprimido no permanecen como células ES, incluso en presencia de LIF, sino que se diferencian para dar células semejantes a las gigantes del trofoblasto41. Y si las

con-diciones de cultivo pasan de ser las propias de ES a las propias de TS, se reprime Oct-4 y el resultado es la aparición de célu-las con propiedades de célu-las TS. Es decir, la represión de Oct-4

es necesaria para el desarrollo del trofoblasto in vitro, y proba-blemente in vivo, en el blastocisto42. Las ES tienen la

maquina-ria para diferenciarse a trofoblasto y sólo necesitan la inactivación de Oct-4, y los factores de estimulación apropiados, para desa-rrollarse a diferentes tipos celulares.

Aunque se supuso que los elementos que regulan la dife-renciación del embrión de ratón están plenamente conservados en los mamíferos, hay algunas diferencias en las ES de primates. Las ES humanas son independientes de LIF y puede usarse FGF en el medio de cultivo en que crecen; son pues diferentes a las ES de ratón y tienen algo en común con las TS. Las células ES humanas se pueden diferenciar a muchos tipos diferentes in vitro, que incluyen las del trofoblasto, puesto que expresan el marcador de la placenta, hCG43. Ahora bien, en todos los casos,

la expresión jerarquizada de una cascada de factores de transcrip-ción gobierna el fenotipo celular que adquiere la célula.

Así pues, parece importante el concepto de que la apertu-ra o el cierre de un gen clave puede ser la llave paapertu-ra compro-meter el desarrollo hacia diferentes linajes. Por tanto cambian-do las condiciones del medio de cultivo en que proliferan las células madre se produce un efecto enorme en sus

posibilida-des de diferenciación. Por otra parte cuando una célula madre está comprometida hacia un tipo de tejido tiene ya expresados los factores reguladores que inactivan secuencias de genes y entonces las señales extracelulares solas no son suficientes para reactivar otros linajes. Una vez conocido el regulador clave in-trínseco (el Oct-4 en el caso de la determinación en el blastocisto de los dos tejidos diferenciados, la masa interna y el trofoblasto) se podría manipular su expresión y así aumentar la potenciali-dad de plasticipotenciali-dad celular.

Control de la diferenciación de las células ES en

cultivo

in vitro

Un prerequisito para las terapias celulares que vayan a usar células madre pluripotentes es conseguir su diferenciación controlada. Cuando las células ES se aíslan del blatocisto hu-mano y se cultivan en un estrato de fibroblastos de ratón irra-diados, se multiplican y confluyen hasta la formación de dos tipos de agregados según las condiciones En un medio que per-mite el crecimiento de células neuronales, se forman “neuroes-feras” (agregados flotantes que contienen progenitores neuro-nales). Y en otros, las células de la masa interna de blastocistos forman los llamados “cuerpos embrioides”; que son agregados con apariencia de “quistes”, con las tres capas germinales44 y

en alguno de los cuales se observó la presencia de cardiomiocitos contráctiles. Las células mantienen la telomerasa45, por lo que

se replican de forma indefinida.

Se han conseguido líneas celulares a partir de las del embrión temprano que retienen las propiedades de las de éste

Figura 2. Expresión de marcadores del estado indiferenciado en presencia de LIF; mecanismo de activación del gen OCT-4. El factor inhibidor de leucemia (LIF) se une a su receptor transmembrana, activando una vía de señalización intracelular mediada por las mólecula JAK y el factor de transcripción STAT 3. Tras la activación de la vía por autofosforilación del receptor , STAT 3 transloca al núcleo y promueve la expresión del gen OCT-4.

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incluidas la capacidad de proliferar, generar teratomas in vivo, y diferenciarse a células que derivan de las tres capas germinales46. Y a partir de las líneas inmortalizadas de las

célu-las ES es posible generar linajes específicos de tejido47. Los

cuerpos embrioides ofrecen a las células ES el nicho apropiado para su compromiso a dar los linajes específicos de las tres capas embrionarias; células del tipo extraembrionario cooperan en la determinación de los linajes48.

La amalgama celular “cuerpo embrioide” no es un embrión temprano

Aunque los “cuerpos embrioides” forman agregados de va-rias capas de células diferenciadas49, presentan una cierta

or-ganización tridimensional, y pueden dar origen a todos los teji-dos de un organismo, esta organización de células pluripotentes ES no es un embrión; carece de información para generar el diseño corporal. Han perdido la memoria de la historia previa y de los lugares que han ido ocupando en el proceso de desarrollo del embrión del que proceden y no son capaces de dar lugar a la formación de los ejes del embrión temprano.

Uso potencial de las células ES y EG humanas

A partir de ES de ratón se han derivado múltiples tipos celulares, que incluyen neuronas, células de la glía, células madre neuronales, células de los islotes pancreáticos, hepato-citos, osteoblastos, y adipocitos50-61, etc. Con la adición de

fac-tores adecuados expresan genes restringidos de las células madre de las tres capas germinales46. Se ha planteado que las células

pluripotentes ES (y tal vez las EG) pueden ser de utilidad en el futuro para generar tejidos de reemplazo62, puesto que las ES

derivadas de blastocistos y las EG de las gonadas de fetos hu-manos tienen propiedades similares11,17. Podrían servir para

pro-ducir neuronas que sustituyeran las destruidas en pacientes con enfermedades degenerativas o daño medular, o para producir células de la sangre en pacientes con anemias, o productoras de insulina en pacientes con diabetes juvenil.

Este tipo de terapia ya ha sido eficaz en ratones15 en

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células madre neuronales derivadas de las ES fueron capaces de dividirse y diferenciarse en neuronas funcionales cuando se inyectaron a ratones que tenían dañado el sistema nervioso63.

Se ha descrito además la corrección de la diabetes en ratón con células productoras de insulina derivadas de ES64.

Ahora bien, estos experimentos fueron posibles porque se usaron cepas de ratón que no experimentan rechazo de injerto. Su aplicación potencial a seres humanos deberá resolver pre-viamente el problema del rechazo del injerto para no mantener necesariamente al paciente de por vida sometido a una inmu-nosupresión; las terapias inmunosupresoras tienen el peligro de no poder hacer frente a infecciones o combatir posibles tumo-res en una situación de bajas defensas del organismo. Se traba-jan diferentes vías para manipular las células antes de su posi-ble transferencia, como eliminar los antígenos MHC extraños, o reemplazarlos65.

Las células madre que más se han investigado han sido las neuronas; los ensayos con ratas han demostrado que si se insertan células pluripotenciales, tratadas previamente para que produzcan niveles altos de dopamina, se consigue una reduc-ción en los síntomas del Parkinson, una lesión neurológica ca-racterizada por bajos niveles del neurotransmisor66. No

obstan-te, la necesidad de aumentar el control de esos injertos para su uso en humanos es patente tras la comprobación del escaso efecto beneficioso que han tenido las células madre fetales in-yectadas en el cerebro de pacientes con Parkinson y los graves efectos negativos67,68. Dos problemas limitan actualmente la

uti-lización de la EG fetales; uno es la purificación de dichas célu-las del feto abortado, que hace que existan otras célucélu-las con gran capacidad transformante y otro la supervivencia de las células derivadas (también de las derivadas de las ES) produc-toras de la dopamina69.

Debe destacarse, además que las células ES, en su estado indiferenciado, si se inyectan como parte de una terapia, o bien se incluyen como contaminantes de células previamente some-tidas a un proceso de diferenciación, pueden dar origen a teratocarcinomas in vivo. Por ello será necesario garantizar la seguridad del procedimiento de transplante de células ES dife-renciadas y la identificación de cualquier posibilidad de incluir células ES no diferenciadas.

Células madre derivadas de embriones clónicos

Otra propuesta para evitar el rechazo inmunológico que presentará el paciente hacia las células, derivadas de las ES de un blastocisco ajeno, es usar la clonación (la llamada “clonación terapéutica”). Mediante transplante del núcleo de una célula del paciente a un óvulo humano, y el desarrollo a blastocisto se podrían obtener células madre, para conseguir así un linaje de células madre del embrión clonado compatible inmunológica-mente con el paciente de cuya célula se tomó el material gené-tico nuclear70. Se plantea la transferencia de núcleos de células

somáticas del mismo paciente para evitar el inconveniente del rechazo inmunológico.

No obstante, la técnica de transferencia de núcleos en mamíferos está aún en sus primeras etapas y la eficacia es muy baja. Antes de realizar la transferencia de núcleos, es necesario llevar las células a un estado quiescente (la fase G0, o de para-da del ciclo celular) para conseguir la reprogramación genética del núcleo de una célula que ya estaba programada como

adul-ta. Un primer experimento de transferencia de núcleos proce-dentes de fibroblastos de la piel o de células del cumulus oophorus a oocitos humanos71 ha tenido una eficiencia técnica muy baja

y ninguna de las células mostró capacidad de desarrollo em-brionario. De hecho el resultado de la transferencia no fue la aparición de verdaderos embriones precoces sino un simple conjunto de células resultado de divisiones celulares degenera-tivas.

La baja tasa de éxitos logrados en animales con la transfe-rencia de núcleo se debe a pérdidas que se producen en todos los estadios de desarrollo72-74. La principal razón, tanto de la

baja eficiencia en el desarrollo temprano como de la presencia de anormalidades, es la expresión alterada de una serie de genes por fallo del proceso de metilación del DNA75,76. Las

modifica-ciones en el grado y patrón de metilación dan lugar a una in-completa reprogramación del DNA del núcleo donante de for-ma que las células muestran incluso inestabilidad en el control de la expresión de los genes. Esto significa que la transferencia de un núcleo a un oocito y la estimulación de la célula (nuclóvulo) resultante no logra en muchos casos alcanzar el fenotipo cigoto, capaz de iniciar un programa de desarrollo. Por otra parte los individuos clónicos presentan modificaciones en uno de los sis-temas del control del tiempo de vida: la presencia de la enzima telomerasa, que mantiene sin recortar los telomeros de los cromosomas, “rejuvenece” las células y prolonga su capacidad de multiplicarse en cultivo celular77.

Ambos factores, la dificultad de conseguir que un nuclóvulo se reprograme a cigoto, y dé inicio al desarrollo de un blastocito, y la posible perdida del control de la proliferación de las células del individuo clónico, suponen actualmente una falta seria de eficacia potencial de la clonación terapéutica. Hoy por hoy, se precisaría la donación de cientos de óvulos para garantizar la consecución de un experimento de transplante de células deri-vadas de un embrión clónico del paciente78.

No obstante, la experimentación llevada a cabo con rato-nes sugiere que es posible de hecho la obtención de células troncales embrionarias a partir de embriones obtenidos por las técnicas de transferencia de núcleo, aunque esos embriones no hubieran alcanzado la capacidad de desarrollarse. Ha sido posible obtener 35 líneas de células madre embrionarias a partir de embriones producidos por transferencia de núcleos provenientes de células adultas (fibroblastos y células del cumulus oophorus) de varias cepas de ratones. Las células ES proliferaron en cultivo y se logró su diferenciación in vitro ha-cia una variedad de tejidos derivados de las tres capas germinales; una de las líneas se pudo diferenciar hacia neuronas dopaminérgicas79.

Células madre “humanizadas” de especies animales Una alternativa a la obtención de células troncales huma-nas mediante obtención de un embrión clónico es realizar la transferencia del núcleo de otras especies (por ejemplo, cer-dos) unida a la modificación genética de estos clones para que el hombre pueda aceptar los tejidos de estos animales. Se sabe que la alpha-1,3-galactosiltransferasa es el xenoantígeno prin-cipal que causa rechazo hiperagudo en el xenotransplante de cerdos a humanos; y se realizan esfuerzos con el objeto de lograr una disfunción de este gen. Los resultados sugieren que puede ser posible emplear esta estrategia80.

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