PARA CARACTERIZAR LOS MODELOS DE TRANSPORTE 'EN

JERIKA SOFIA P I E D U S RZNTERIA 80332314 BLANCA EST3LA RIVERA BERME0 79232445 CARREBA DE BIOLOGIA

L l C

/AREA

DE CONCEITRACION

r n ~

BIO~OGIA EXPWIMENTAL _* TRINESTRE 85/0

20 h o r a s semanales

LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y BIOFISICA (S-251 y S-253) DEPARl'AE¡E!JTO DE CIENCIAS DS LA SAllJD

DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE L A SALUD

DEL 20 DS FEBREEO DE

1985

,/

AL 20 DE AGOSTO D9

19%

UNIVERSIDAD A U K " METROFOLITANA-IZTAPALAPA

,AUTOR: A?. en C. L I G I A G. TORO CALZADA

Prof. Asociado I C '

DEPARTAMFITTO DE CIENCIAS DE L A SALUD DIVISION DE C.

B.

S.

UNIVERSIDAD AUTOPIOMA li'íETRO

POL

ITANA- IZTAPAL APA JASESOR: M. en

c.

WZ~EYA TORO CALZADA

Prof. Titular ' B '

DEPARTAMTiTO

D9

CIETJCIAS DE L A SALUD DIVISION DE C. B. S.

UN

NE?

S IDAD AUTO:JO

MA

METRO

POL

ITAN

A-

I Z TAPAL

APA

JESTUDIO COBTPiUlATIVO DS 'PRES PROPI~IDADES FISICOQUII~TCAS

DE

LOS

COIyfpLXTOS NIGWICWA-Ca*+ Y A23187-Ca2+ COPiO HERüANIENTAS PARA CARACTERIZAR LOS MODELOS DE

Agradecemos CL

nuestras

tutor,n.s

M.

e3 C.

Ligia

G.

Toro

Celzada y ?F. e n C. Yireya Iroro C e l z a k

ESTUDIO COlYIPARILTNO

DE TRES PROPIEDADES

FISICOQUIMICAS

DE LOS

COMPLEJOS NIGWICINA-Ca2+ Y A23187-Ca2+ COMO HHBRAMIENTAS

PARA

CARACTERIZAR

LOS

MDDELOS

DE

TRANSPORTE

EN

IaEa2BRANAS NATURALES

El

?resent? t r a b a j o es M cstudio de i n v s s t i g a c i 6 n bá- sicr;

en

e1 Arm c?e bioqufmic?. y b i o f f s i c a .

61

se es

-

tudiaron cowxirat ivaiient e

nro

Tic6 ;ides f i s i c oquf nicas (c~->icic!nd d.e formnción

del

c o m i r j o , esnectros de a'+ sorción en e!. ü:I y de 'ii-i?:.?:) _*e l o s comdejon

form-

dos n o r 1 0 s innbforos nigericin:3. y A-23127 con

el

cati6n d i v a l e n t e : c a l c i o .

h b o s iondforos son nroducdos naturales de actinomice- t o s , que tienen l a canacidal &e trcinsiortar iones a

trs

vks

d e nenibrwas. Ih.do que dichQs ioiióforos se hnn _->o-

d i 6 0 a . i s i a r y m r i f i c z r , conociéndose i n c l u s i v e su es- tructura, qufxica, constituyen un sistenu

en

e l cual s e y~u..d.en ? e ? i n i r y rnodificm lcts v a r i z b l e s fisicocpfinicas.

Tor

l o t r a t o , se t i e n e una herramienta

m r a

determinar l o s f;.ctor-.s que influyen en IC c a p w i c k 6 de interacci6n ión-ionóforo, l i g a d o a su h i b i l i h i de t r m s a o r t e . Dado

l o a c t w i o r , r e s u l t a evidente l a fuente de informaci6n que e s t e sistema renresenta

n n a

d x r l u z a l o s mecanis- mos iie t r w s q o r t e en membranas naturales.

Asiniimo, cabe señalar que 13. iin-aort.-acia d e l estudio

sobre e l t r m o n o r + e fie iones a tr?.vés de ze::tbrm:.ic n:ztu r d e s , se i c r i v a fie T'U i..n?licacibn en e l t r m s n o r t e fie metebolitoo, conservación y trzist!ucc.i6n de energía,, asf como e::i 1-1 regulaci6il i:etnb6lica 2s eiversos nrocesos b i o l b g i c o s .

- 2 -

WTRODUCCION

La

c é l u l a

es

una estructura a u t o d e l i x i t a d a en l a que tienen 1ug-m- numerosos vrocesos metab6licos como _{l a} de- ~ r a ü : x i 6 n y moduccibn de material. o r g h i c o ; estos mo- cesos requieren de un intercambio c o n t i m o de metaboli- t o s

uam.

nantener l a i n t e g r i d a d celulczr. La d.isposici6n

t e e l l o s e s t 6 determin::.dc n o r sus r e s p e c t i v o s moviinien- t c s a t r a v k s de In membrmn, ya sea ~ l a s í n 5 f i c a o Se l o s orgrzneios c e l u l a r e s

(1).

su v e z , e l trnnsqorte de ne- t d x l i t o s hidrófobos est& r e p l a d o 3or

el

t r a i s p o r t e de iones a t r a v é s de l a :nembrnns? c e l u l a r . Asigisrno, mblti-

nies

nrocesos t a l e s como

i n

c o n t r a c t i l i d a d muscular ( p ) ,

l a trmismisión s i n á n t i c a

(3),

i n

f e r t i l i z a c i ó n

( 4 ) ,

y

i s tr~isd.u.cción eneq5ética ( 5 ) denenden directamente de l a s di,ferenci=s de concentracibn i ó n i c a entre

el

exte- r i o r y e l i n t e r i o r d e l comaartimiento.

Dade l a estructura qufmicc: de l a nembr-aa biolngicp., bicana ' f o s f o l i d d i c a , é s t a reqresenta una barrera natu- r a l

zl

a m o de iones. Por l o t m t o , se r e q u i e r e de l a

m e s e n c i a de moléculas translocadoras e s n e c f f i c a s que Termitan e i transporte y

ie

cornuiicación entre dos com-

partimientos. Dichos trcaslocadores o s n e c f f i c o s v e d e n

s e r de d o c t i n o s : a) moléculas que abGarcan todo e l gro-

sor de

la

membrana y conunicm e l e x t e r i o r con e l inte- r i o r , llamadas canales i ó n i c o s y b)

moléculas

n ó v i i e s o acarreadores, que t r a n s f i e r e n iones a t r z v F s de 12 fase hidrófoba membrmal. Aunque ya h m sido i d e n t i f i c a d o s g r a n b e r o de sistenias de trans?orte, e l cnnociniento

- 3 -

tanto n o t o r i a e im-nortante la u t i i i d a ? que t i e n e n

iioié-

cülas trzas1ocadora.s que se emilea1 como acarreadores modelo, ionóforor;, yr? que c211.o se mencionó Lnteriormen- t e , constituyen sisteinz~s d e f i n i d o s cuyas proaiecades f i

-

sicoqu.imicas nueden ser czn3iiz.ndas COI? n i y o r exc,xtitud..

-UTTEXSDX?

TE3

XL descubriniento de 1,rtuzr;loczdores iiiodelo contribuyó en gran med.ida a l o s avances

en el

estudio

C e

In. perme2 b i l i d m l

c?e

I n s b?,rrer,?.c rciergeticrzs

( 7 ) .

Su en-?leo i i : ~

sid3 c?e gma u t i l i d a d 7arn estu.blecer

el

n n n e l de

un

i ó n e s n e c f f i c o en: a ) fuiwionec c e l u l m e s (,?); b) 12, de

-

terminación d e l v o t r n c i a l transrnembrmal de cklulns y o r g m e i o s

( 9 ) ;

c )

la

determinación

del

aanei

del

voten-

c i a 1 e i c c t r o q u í n i c o

en

vrocesos c e l u i a r e s ;

a)

i c secTe- c i d n ?.e hornon2.s y t r m s T o r t e d e e n z i m s

( i o ) ;

e )

el

a n & i s i s de l o s n e c r a i m o s r?,e trmxducci6n 8.e ionss y; f )

el

estsbIeci;.iiento de modelo:: de t r m s p o r t e a n i v e l molecular (11).

cono

F:C) mencionó en la sección z n t e r i o r ,

l o s trcrnsloc?xlores n o c e l o nueclen s e r de ~3.0s t i a o s ; cans l e s i ó n i c o s y acarreadores

mdviles

o ionóforos.

Los cenales son moiécuics cuya estructura tridimensio-

nal abarca

el

grosor de l a bicana i i d d i c a de Ir^ rnenibrs na, 7ermitiendo e l T)L!SO de iones y agua. >1 wmento en 13, coizductancirc implicado SF) l l e v a c2 cabo mediante

-1-

nos u n i t a r i o s (12).

Los acarrcndorns mdviles o i o n ó f o r o s fornnn c o n i ~ l e j o r , i6n-ionóforo linosolu-bles, que tienen l a caF:xidad de moverse a travks de l a matriz hiclrhfobe 6 e 1s- membrann.

- 4 -

s i ó n tLe eventos: 1) formación d e l cornalejo ión-ionóforo

en

IC.

i n t e r f a s e de

1%

nembrma, 2 ) t r m s n o r t e del. coa- a e j o a travds dc e l l a ,

3)

d i s o c i a c i ó n d e l complejo y

Ubercvci6n d e l i6n,

4 )

tr'uzsporte de regreso d e l acarrea Cor a t r a v é s de l a menibran,? (13). -41

lz

f i g u r a I se

muestran los esquenns de l o s modelos de transporte de ionóforos.

a

b

Figura

I.

Idodelo de transaorte de ionbforos.

a ) Neutros y b) Carboxflicos monovalentes. I: i o n ó f o r o s _C: catión.

Los i o n ó f o r o s se dividen en dos clases: neutros y car-

boxflicos. Los neutros poseen una estructura cerrada y cm-ecen de gruqos i o n i z a b l e s ,

sus

gruaon nolsres s e en- c u e n t r m orientados h z c i a e l i n t e r i o r de

1 ~ .

nolkculn e interaccionaz con el ibn, mientras que hclcia el e x t e r i o r

de l a :r.ismc: s e orientan lo:: gruqos no golares que inte-

-_I____-- _ - - . -.-.".-.,-

- 5 -

eniantinas (15).

En

In. f i g u r a

If

se muestran l a s estruc

turas de l o s iondforos neutros y ca-rboxflicos.

A

B

Figura II. %quem2 de estructura de ionóforos. 8: ITeutros y 13: Carboxflicos.

Por

su. p z r t e l o s i o n ó f o r o s c a r b o x f l i c o s son rnolécules de cedens e b i e r t a que yoseen

un

g r u ~ o c a r b o x f l i c o en

un

ex tremo y un h i d r o x i l o en e l o t r o , que a l formar puentes

de hiorógeno entre s í , adquieren una estructura c í c l i c a

con una cavided aara c l a t r a r a l i b n y wesentan su exte r i o r hidrdfobo s o l u b l e en l a membrana

(13).

Ejemvlos de

e s t e t i n o de ionáforo son la n i g e r i c i n n (ió), rnonensinil

(17), dianenicina

(18),

g r i s o r i x i n a

(lg),

X-537 (¿rei60 i a s e i ó c i d o ) (20), y A-23187 ( c a l c i n i c i n a ) (21), que coordinan ya

scz

cationen monovnienten y/o divD.ientcs y t r i v n i e n t e s

(3,g).

'& general ia t r L m s i n c ~ c i 6 n de un c a t i d n mediante un i o

-

nóforo neutro yenera c o r r i e n t e e l é c t r i c a , es d e c i r , es

-

- 6 -

electrogénico; en caiibio, l a t r a s l o c a c i ó n üe un c a t i ó n medi,ante un ionóforo c a r b o x f l i c o es en general, e l 6 c t r i

-

carente s i l e n c i o s o .

Ti

prinero üe e s t o s dos ionóforos r e v e c e n t a

un

tr,uneaorte de t i n o sim3orte y e l segundo, un antinorte _(22).

91 e l nrzsente trilbajo s e rstudiaron dos ionóforos c u - b o x f l i c o s : l a n i g e r i c i n a y e l 8-23157.

La

nicccricina

se a i s l a a p c v t i r de c u l t i v o s de StreDto- ayces hggrosconicus ( U ) , c o n s t i t u y e e l e j e m l o c l á s i c o de l o s ionóforos cnrboxflicoo, es un i o l i e t e r ( C €1

.

40

6 8

O )clue c i i s t a l i z c z en forrin octnrrórnbica ( 1 6 ) y a l ce-

ll

-

r r w s e c l a t r a e.1 c a t i ó n uor medio _dc l o s oxfgenoc 2,

5,

6 , 7 y

ii

(18).

i a fi,-ra 111 muestra 1.3 estructura qui. rnicL3 dc &te ionóforo.

I

Figura 111. Tstructura q u h i c n d e l iondforo Yigericina. Presenta UT.? selectivid2.d de trniis7orLe cue corresnonde

(1.

IC.

s e r i e V 6.e Xiscnmnn ( 2 3 , 2 6 1 : IC >3b ??Ir. >Ce > L i

,

e s t a se1cctivid;:id e s t a d i C a en base a l a ca-xiciionC del eultibi6tico m1-3 tr?nsnortnr CE l o s iones a t r n d s de

n e n ü r m w artif i c i z l e s .

3 ciotenas a t i f i c i a i e s y b i o l ó g i c o s , t a l e s como los

- 7 -

sistemas de dos fases, microsomas, livosomas, e r i t r o c i -

t o s y Strentococus f a e c a i i s f u é demostrcido que

i;i

nige- r i c i n 3 _a concentraciones entre y 10

_id

actfi3 _cono

intercsmbiador K

/H

e l é c t r i c a x e n t e s i l e n c i o s o de t i n o antiporte. COTO consecuenciz de e s t e coimortemiento se

ha demostrado que en nitocondria d t e r r .

zl

corinonente qulmico

A?ii

y no a i comoonente e l é c t r i c o

AV,

de la f u e r

-

zzi ?rot6n-n!otriz genera& nor l a f o s f o i i i a c i ó n oxideti-

va.

(27,28).

Sin

ernbargo, a concentraciones aayores de 1 0 fi:, e l gruno de wrtradz-0. observó que l a n i g e r i c i n a tnnbiEn n o s i f i c a

~1

con?aonente e l 6 c t r i c o por l o que d.e- sacorile

la

f o s f o r i i a c i 6 n o x i d a t i v e . De hecho, resulta-

dos del inismo gruoo de t r a b a j o indican que 2 a l t a s con-

c e n t r x i o n e s de n i s e r i c i n a (mayores de

E - ~ x ) ésta efec

-

tivrzniente transaorta c,orga neta, l o que e x n l i c a

el.

desn conizniento

entre

e l t r m s o o r t e &e electrones y

la

sín- t e s i s de ATP rnitocondrial. _{D a t o s} de nuestro gruno

h a

xostrado que ir. molécula n i g e r i c i n a se asocia

en

dínieros o trimeros dewndiendo d e l

DH

del

nedio

(16,17,1S,23);

asimismo se ha encontraCo que l a s e l e c t i v i d a d de t r m s - Forte como non6rneros o dlmeros sigue l a s e r i e

V

de

Eisenman

(K

sRb > N a z C s 7 L i ) (23-26) y cono trfmero

c m b i a a l a s e r i e I V de .Tisenman (E+,Rb+>Cs 7 N a 7 L i ).

Como se observa, l a n i g e r i c i n a no t i e n e canacidad n-ae transportar L i en ninguna <?e

Ins

condiciones exneri- mentdes estuaradas, y:i que t a n t o en l a s e r i e

iV

C O E O en l a s e r i e

V,

e l L i ocuua el último s i t i o . II:istc. e i

m o m e n t o se hr.ibf:? asu2ido que l a interacci6n inn-ionófo-

r o i m n i i c ~ b s . e l t r m s n o r t e d e l i6n. For i o tanto, se nenseba que e l hecho de que l a n i g e r i c i n z no trcuisoorta

- 8 -

r a ~1 l i t i o s e debfa a que no s e formara e l comulejo. Siii embargo, diZtos de nuestro grupo d.e trabajo indican

que e?. parámetro de t r a s n o r t e no es indicador de la a-

s o c i - ~ i ó n d e l i o n ó f o r o (30). Tspecfficamente, s e encon- t r ó que e x i s t e i n t e r a c c i ó n n i g e r i c i n a - l i t i o , y a que en- contramos cambios d r á s t i c o s en su espectro de ‘H-Xi3J con respecto a l d e l ácido l i b r e de n i g e r i c i n a . Asiniismo e s t e %A<O

fuk

corroborado -2 c u m t i f i c L w i i t i o en r i comqiejo n i g e r i c i n i - L i

,

uor absorción stóinica, _ya que se cncontro

m a

estequiometria ionóforo-c~.tión de

i:i

(31).

For o t r o

laclo

e l ionóforo 11-23187, tsribién 1laziad.o calcirnicinsl 2s

un

ionóforo c a r b o x f l i c o eislado d e l a c t i

-

nomic eto Streatoxyc es chartreusis

.

Su

ectruc

tura se muestra en

la

f i g u r a 111.

+

H

F i g r a IV. 3structura u d e l ionóforo A-23137

I

( c d c i m i c i n a ) .

La estructura quínica ce e s t e ionóforo ha sido m a i i z a -

- 9 -

energética (32), de transnorte de c a t i o n e s d i v a l e n t e s

(33)

y en e l estudio de d t i 9 i e s procesos f i s i o i ó g i c o a t a l e s como l a l i b e r a c i d n de histamina de

10s

n a s t o c i t o s

(34).

Presenta _una mayor s e l e c t i v i d a d por el que

por e l Ca2'

(35)

y también presenta s e l e c 3 i v i d n d

nor

c a t i o n e s monovalentes:

Li

7Ha 7 K 7 Rb zCs (36). FYI pres.-

c i a de magnesio, deseconla e l t r m s w r t e de e l e c t r o n e s de $a f o s f o r i i a c i ó n en c l o r o @ a s t o s y a concentraciones mayores de 10-21i- también l o hace en aresencia de

R

(33).

Se sabe que l a estequio4etrfa d e l iondforo uni2.o

a metales a l c a l i n o s e s

i:l.

Prtra c a t i o n c s d i v a l e n t e s e l complejo puede s e r n o s i t i v o o neutro _(36), degendiendo

del

UH. Se p l m t e a que m e d e asociarse a c a t i o n e s nono y divelentes con d i s t i n t a s estequionetrias debido a que wresentz

un

número iinoortatnte d e ,grados de l i b e r t a ? pa-

r a _{l a} r o t a c i ó n ce l a cadbnc..

(37).

La f i g u r a V muestra un rzodelo para e l t r a s n o r t e de c a l

-

cia oromovido

nor

e s t e ionóforo (36). Se ha promesto que e l uaso l i m i t a n t e parr, Ir, e f i c a c i a d e l tr;uis?orte es

la

dearotonación siendo asf e l p€i

un

re,wiador fune mental de e s t e mecanismo.

Ti Ca2+ e s

un

i ó n

r e l e v a n t e dentro de l o s procesos bio- i ó g i c o s , t i e n e e f e c t o regulndor y activador de diversos procesos t a l e s como: l a . i n h i b i c i ó n de Yrocesos enzinati

-

C O S , cono e s e l caso de l a succfnico deshidrogennm, a i

-

ruvr-to cinasa, z l i c e r o f o s f a t o deshidro,zenzsa y i n n i n i - vrrto deshidro.ienasa f o s f a t n fosfatzrsa

(38-41)

; l a ac-bi-

v i s a d de l o s sistenaa c o n t r k t i l e s de i - i i n f i b r i l l a s del miísculo esr:uelético y l i s o _(42-45); reguia.ci6n hormond como en a i _caso de ia i i b e r a c i 6 n de vasopresina e insu-

2+

+

+

+

i.-l.

-

10

-

i n t e r f a a e i n t e r f a a e

F i g w a

V.

ItBüeio de tr:msaorte de

ca2+

mediado

por

A--23187.

l i n e

(46,47);

y transnisi611 hormonal,

en

l a l i b e r a c i ó n d e l neurotransnisor (43,49). ?b estos procesos, e l con- t r o l por parte d e l c a l c i o s e manifiesta cuando ocurre

un cambio de concentraci6n de c a l c i o citoplasmático, desde n i v e l e s normcíles de 10 y 1 0

M

h a s t a ’ n i v e l e o eg t i v a d o s que meden aicanzar una concentración de 10 M.

Finnlmente 12s p r i n c i n a l e s notivaciones d e l trabajo son:

-3

-7

-5

hg.ber encontrauo

en

l:i

l i t e r a t u r a que i o n ó f o r o s que se co:isiderabcm exclusivos m r a iones nonovalentes t i e - nen camciOnd 9x-a form-r con-olejos con n e t a l e s a l c a l i - noterreos, es?ecffic:imeiite l a valinornicinn. con _Ca2+ (SO),

-

11

-

y que nor l o tanto no s e esperaba que fueran clatrados. OBJETIVO

Tl o b j e t i v o d e l oresente trabajo e s estudiar comoarati-

vamente oroaiedñdes fisicoquímicas (canacidad de forma- c i ó n d e l comolejo, esqectros d e ~ . b s o r c i b n en e l

UV

y de

IH-zrn)

~ e i

presunto cornqiejo nigericinS,-Ca*+

con

respec_

t o L 12,s d e l

A23187-Ca

2+

.

MATERIAL

I e m t i.vo s :

Clnrof'ormo grado r e a c t i v o a n a l í t i c o Blerck

caco

Deuterocloroformo esvectrosc6oico

IIc1-

El0

CaV12 'I r e z c t i v o 3nn.iitico Baker

ITaV1 >I II 11 11

h t i q i r i l a z o I11 'I 11 1 1

Aciido

n f c r i c o <I I I I t 11

?I It I< n

II

3

sunra-ro

I1 O I,

<I <I 1 1 0 11

3

Nerck

b i d e s t i l e d a y desionizada Acetileno

Oxido n i t r o s o ITitrógeno

(e)

?Zetabornto de l i t i o

Nieericina-H obsequio d e l

+

Dr.

Wrstley de l o s Lab. 1.Ioffmzn-Ls ibcize, Xutley, Yen Jersey.

A-231?,7-3+ Sigma

-

1 2

-

Crisol.cs de g - d i k o !I ' I n i m i e l

Pino::.:: n"ir3 c r i s o l V i 22. e E:

A4nizratos :

1. ~ o o e c t o f o t ó m e t r o 6c resontunciz mcr,p%ica nuclear de

orotones (V!i-%TT) de 90 II3Ffz de r e ~ o i u c i d n , nzrcao

V.!.RIiUí

:no?,. lE-~!I. U t i l i z q d o s e n colcboracibn con e l

Dr. Jorge

Cerbón 8 . d Dqzrtemento de DioEuí:nic2, d e l Centro c7-c Inves

-

t i ~ c i ó n y %tua.ios Avrunzndos &e

IF,!

(CI3VECTAJ- IPN).

2. L i o f i l i z a u o r z P r e r z n o b i l c

11,

Virtls

Co. Inc. d e l De- Ta-tamento de Dioquímica d e l CTY'JYSTAV-IR,7.

3.

~ s a e c t r o f o t d m e t r o de Absorci6n ~ t 6 m i c a V M I A X

serie

AAl475.

4. Centrifuga c i í i i i c a SOLBilT.

5.

:;tm-a.

6. Es-ectrofotdmrtro de l u z u l t r a v i o l e t a y v i s i b l e marca

MII'CO.

7.

TsTx?CtrOfOtbmtrO de l u z u l t r a v i o l e t a y v i s i b l e ACTA 7

;

.

IV 73EciifLUI.

METODOS

I-. Obtencidn de l o s comolejos iiigericinu,Ca y

A23187-

Ca

.

pnrz mayor entendimiento de esta t é c n i c a v e r

ia

fip;ur:t

VI.

Nigericina-Ca

.

2+

2+

2+

i. Se oesü.n 1 0 n;: de iondforo ácido l i b r e en un tu00 cónico (I) y s e disuelven en 2

ml

de cloroformo.

-

13

-

ii)

3

+

CaCO

+

CaCO

i)

'1on6f

oro

(33.3

eq)

a g i t a r

3'

agitar

3'

_____) __I) ___d

iondforo (10

mg)

+

CHC13

(2 id.)

___3

Centrifugar

15'

a 3,000 rpm

CHci3(2

mi)

x

5 v e c e s n a s t i l l a

(2 E&)

agitar

3'

vigorosamente

I

evaporar con N2(g) a baño maría a l a

mitiid d e l volumen

de j a r sedimentar

vu

p a s t i l l a

O

sobrenadant e

tl

I

evanorar con N2(g) a bazo

mc...rfn.

a la

mitad d e l voluinen

3 f i n d se habr&n agregado 500 equivalentes de C3CO a l a n i g e r i c i n a y se habrB _lnv?do 25 veces.

Figura VI. Protocolo para

la

?repar,n.ci6n de

los

complejos REPETiR todo e l nrocedimiento desde e l paso ii)

5

veces. Al

2+ 2+

IJigericina-C,? y

k23187-Ca

.

-

14

-

Los 100 equivzlentes se a d i c i o n a l en t r e s m r t e s , a g i t e

do

3

TLin. cada vez. Se centrifug.2

15

min. a

3,

O00

ram.

sobrenidkmte se ricas;‘ a xi tubo lininio (11) y

la

p a s t i l . l a d e l tubo (I) se l , w a con 2 n i t de.cloroforn!o, a- gitando

3

min. en un v o r t e x ?. l a mnyor v e l o c i d a d m s i b l e .

Se deja sedimentar. iii.

iv.

i1 tubo

I1

se evxnorcz con nitr6,yeno a b a l o marfa h-stn 1 ml y s e l e agrega e l cobrenaiir?nte d e l tubo I

(cloroformo coil l o s que se lav6 l a y z s t i l l n ) .

v. Ti ?aso iii s e r e p i t e 5 veces, es d e c i r , e l tubo I se

lm=.

5

veces.

vi.

.\4

el

tubo

I1

s e r e n i t e desde e l paso ii

5

veces (en tot,d se van a t e n e r

5

tubos). Solo que en e l c i c l o cinco que se s e h l a ( e )

en

l a f i g u r a , e l sobrensdante se

liltr?, a t r a v é s de

un:?.

membrana I"i1linorn y se 'recibe en

una c z T o l l e t a n m 9 l i o f i l i z a r y e v i m c n t e -es&a.

Por

o t r a m r t e , l a p a s t i l l a obtenida (+) también debe lavar-

se 5 veces v i r t i e n d o l o s lavados en dicha amnolleta. To- do l o cpe s e r e c i b a en l a mr-ol1et-t deber5 h^ber sido f i l t r a d o . La p a s t i l l a que se obtien? en

el ?aso

( e ) de

la

figura, también deberá l a v a r s e

5

veces 9610 que en

lg

s:ir

de h i c a x e n t e c j v secimentar, _se debe c e n t r i f u g a r P o r

1 5 nin.

i? 3,000 rnm, su sobren?.d,?ynte nrevimnente f i l

trade c e r e c o l e c t a er: l a amnoiieta. R

-

v i i . Pvanorar e l s o l v m t e de

la

-nollet& Con.L;el:?-r

la

n i u ~ n tra con

IT

( 1

i o )

mrz

i i o f i i i z a r l , ? ~ y :tsf ciixiina,r

re-

siduos de ::,p.= tmbicntal.

2 -

2+

A23187-CP.

Se s i g u i 6 l a t é c 2 i c a r n t e r i o r oero e l i w z d o ? e

1~~

n,?.nti

110 r e s u l t m t e d e l nz.80 ( + ) de l a f i p r a , 3610 se l a v z

-

1 5

-

una v e z

en

cada c i c l o .

B)

Espectrogcoa-fa ultrrzvioletrz-viEible.

a) b t i o i r i i m o 111.

Se u t i l i z ó e l indicndor metaiocrómico a n t i o i r i i a z o

I11

para determinar l a formación de l o s comTlejos, 13 K y 1a.s e s t e q u i o o e t r i a s ioaóforo-catión a t r a v é s de l a c u m

-

t i f i c m i b n d e 13, x c t i v i d a d de Ua

en

soluci6n.

E

!

.

ran-

go de s e n s i b i l i d a d v a de 10 a

150pl"

de concentrcmi6n de c a l c i o

(53).

Se h i z o un barrido de esqectros d-iferen

-

c i z ~ l e s Tndicador v s Indicrxdor-Ca

en

un nie?.io de cons- tante dieikctric;?"

5

= 37 (dioxano-agua a i 45:6) ajustarlo

a

oH

4 con Xi. La concentración d e l m t i n i r i l a z o I11

fu6 de 50 uhL

b ) Yxgerimentos de #?os f a s e s con & i d o a f c r i c o .

G L ~niktoto s? u t i l i z ó a l i g u a l que e l w t e r i o r pzri. de- termin:?.r li. forn,?.ción c?e l o s comnlejos,

la

K l a este- quiometrfa y ,adern5.s d e t e c t m i r canscidad cie trrlns?or-i;e de l o s c o a d e j o s a,

tr:?.vér,

de i n s e i k i que e l & i d o -€cri

-

co da en e i u i t r n v i o i e t a

(54).

Es importante

sehior

que e s t e método

sólo

será e f e c t i v o s i

el

comnlejo que s e

forme entre e l i o n ó f o r o y

el

c a t i ó n t i z n e carga p o s i t i v a .

Por

l o t a t o , l a s mediciones s e

ha

-

rán en l a s cone-iciones (concentración y grndo ?.e -roton3

-

ción)

en

i a s ope l o s com-ilejos ion6foro-Ca gresen-ha c m-p n o s i t iva,.

f 2+ 2+ *.l.

f'

2+

i. ?ara coniarobar la :-ctivid:.id d e l & i d o d c r i c o , se -4.

].en é s t e a una concentraci6n ae

1

X 1 0 1i: a l a s lon;.;itu

t e 3 de onda de 356 y 470 nn e l c o c i e n t e de Esta rel:3uci6.1

aebm-5.

s e r d e

G.25

mr:i 7o(.er u m r e l 5cid.n ?€cric0 ciii

error.

___I-

-

--

-

16

-

ii. % un tubo cónico s e colocan 4 zl de agua deeionL

zncia que contenga 50

x!,,l

d e l hidrdxido d e l cat-ión

(Ca(0H) ) y d e hcid.0 p f c r i c o . 2

iii.

.U

mismo tubo se l e a5aden

5

X o 5

X

loq4

M

(lei ionóforo d i s u e l t o s en

₄

nilde dioxano. La

fase

~ C L I ~

sa

züquiere

u?

c o l o r amarillo y l a f a s e or,gánica es in- colora..

iv. Se a,yitc? vigorosamente e n v o r t e x , 2urante

3

min.

En e s t e y t o cuando ambas

fases

entran en contacto s e

form el comaiejo ion6foro-cati6n con c a r p . n e t . n o s i t i v a (+); a e s t e c o m i c j o (+) s e asoci?"

el

m i ó n n i c r a t o

form/tndose

e i

p z r i ó n i c o (ion6foro-catibn) picrato.

Como e l ionóforo s o l o es soluble en l a fEse orgánica,

a i setmrarse l a s fases,

éste

va n a r r a s t r a

zi

p i c r a t o

a

la

fase or-;Cnicn.

De

e s t a manera,

el

solvente no DO-

lar

adquiere e i c o l o r arnarii1.0 c a r a c t e r f s t i c o d e l p i c r a

-

to.

+ -

v.

Se c e a t r i i u , p . 9- 3,000 rnm. %to es 7~:j.r~. s e p a r a r

l a s 20s fzses de rnnnera más e f e c t i v a .

vi.

s e toma una a i i c u o t a de

la

f a s e or&ica y s e l e e a 1s l o n g i t u d de onza c a r n c t e r f s t i c a

del

Dicrato

(356

nm).

c )

Ultravioleta..

Este método se u t i l i z a urna d e t e c t a r l a formación d e l

comnlejo nigericinn-Ca comnarando e s t e esvectro con e l de nigcricina-ii

.

Se hace un barrido en 12. regihn de1 u l t r z v i o l e t a (¿IC 200

2. 400 nm), de los conniejos niEericin:3.-Ca y n i g e r i c i -

n;Ii.-H en etanol.

2+

+

2+

+

-

17

-

gste

método se emnlea nara c u a n t i f i c a r

al

c a t i 6 n divalen t e en e l comnlejo niEericina-Ca2+; de e s t a manera s e pug

de .determinar

l a

estequiometría de los cornnonentes. La

c u ? ~ t i f i c a c i b n d e l c a t i d n

por

e s t e método s e puede r e a i i

z a r directamente s i

la

muestra e s soluble en agua o en una mezcls etanol-agua que no rebase d e l 70% de etanol;

o bibn, s i e l comnlejo es solamente soluble en solventes org,bicos se nuede u t i l i z a r un a,ditmento d e l aoarato de medición Darn solventes no w l z r e s . lb e l caso que el

comnlejo no r e s u l t e soluble en agua o en l a mezcla eta- noi-agua mencionda, se t r a t a r 5 de s o l u b i l i z a r , _ya que

e l apara.to al que s e t i e n e acceso para e f e c t u a r l a s

me-

ciones no t i e n e e l accesorio gars solventes org'hicos. La s o l u b i l i z a c i 6 n se uuede r e a l i z c z r c a l c i n a i d o

la

rrmes- t r a y solubilizando l a s cenizas o hidrolizando a l connle jo. De e s t a manera e l c a l c i o e s l i b e r a d o d e l comalejo ( s o l u b l e en soLvente o r g h i c o ) a

Is

soiuci6n a.cuosii, ua- r a su neCici6n directa.

9) Obtencidn de cenizas. a ) Con fundente.

Se u t i l i z a como fundente rnetaborato de l i t i o (LiBO ) que

a y u b EL c a l c i n w l a . muestra fundiendo a 900 C y e v i t a

que ht:?, a o j e a i c r i s o l manteniendoia conaacta en

un bo-

tdn. 180s c r i s o l e s que se u t i l i z a n T a r a e s t e idtodo

son

de g r a f i t o que r e s i s t e n tenoeraturas h-sta de 1300 _C. i. Se nemn 0.5

m.;

de

la

muestra (comniejo 2 i g e r i c i n a - Ca

f i t o . Para conocer e l e r r o r exqerirnental, s e i.greg::

_nde-

F.& de

la

mucstra, una c:?.wtidad conocida de cobre (0.07

n~

de CUCO

1.

Se t i e n e n como controles; un c r i s o l ,3610 y 2

O

O

2+

) y 3.66 1n~5 de LiB02 directamente en e l c r i s o l Cc gra

-

I__-

-

1 8

-

un blanco de r e a c t i v o s ( 3.66

mg

de L i s 0 y ₂ 0.07 rng de

cuco

).

3

ii. Idos c r i s o l e s se introducen en una m f l a a

un%

teinnc O

ratura de 975 C durante

1 5

minutos.

iii.

Ei

arimer c r i s o l s e saca rAnidamonte, e l botón f o r - mado Eie v i e r t e en

7

m i _de

HTJo

al

57% en un va70 de preci- nitados d.e 25

d..

. i l l entrar en contacto e l botón con l a soluci.bn, é s t e se fractura. P o s t e r i o r m n t e se a g i t a d.u- rnnte

5

minutos a t e m e r a t u r a ambiente.

3

iv.

Se nfora a 1 0

PI

con agua desionizads.

V. iios nasos iii y i v s e siguen nara l o s dernCis c r i s o -

l e s .

vi.

Se l e e en e l espectrofotdmetro de absorción atómica a un.2 l o n g i t u d de onda de 422 nm, con una mezcla de ga- s e s de a c e t i l e n o y óxido n i t r o s o .

b) T i i n fundente.

Se utilizcan c r i s o l e s de nfquei que so7ortm temuernturas hasta de 700 O

_C.

i. :;e 1:ivan los c r i s o l e s con

fiT0

y IICl sunrapuro.

3

ii. Se nonen

e.

neso constante. Ts d e c i r , se meten a una.

m f l a durnnte 1 hora a 600

c.

Se s a c m rápidanente y se

meten a un desecador. Cuando s e e n f r h n , s e uesan e v i t q

do a i máximo e l contacto con e l a i r e . Este nrocedimiento se r e p i t e tmt8.8 veces como sea necesario h m t a obtener

e l niism peso.

iii. Se ? e s m 2.0 n,.: de l a muestrc. en e l c r i s o l y s e

in-

troducen :i 1.- nnifln d u r m t e 3 horas ?+ 600

c.

o

O

iv.

Los c r i s o l e s s e sac~an de 1~1. I n f l a y l a s cenizas s e nonzn a prso const:i.ntc.

-

19

-

vi. Se a f o r a a 1 0 l;ilcon ak%a desionizada.

vii.

Se l e e a 422 nn en

el

es~3ectrofotómctro de absorción tónica con una mezcla de gases de a c e t i l e n o y óxido ni-

troso.

B) H i d r ó l i s i s &ida.

Consiste en h i d r o l i z a r l a muestra o r g h - i c a con & i d o s f u e r t e s como HCI y ~itT0 (adenás altamente oxi&ante).

₃

i. Se l a v a oerfectamente l a cantidad de v i a l e s necesa- r i a vara r e a l i z a r

el

exoerimento con: a . 9 : ~ desionizada,

I.TIT0 y NC1.

3

ii. Se msan 2.0 m,: de 13 muestra en un v i a l .

iii. Se

_ztiade

IICl concentrado de mmers que l a solución f i n a i i o conten,Fa Lai

55

( s e a d i c i o n v l 78G.75pl).

O

iv. Se d.igiere en bxlo marfa a 6 8 C durante 1

hora

agi- tando constantemente.

v. Se ?.fora a 1 0 ml. con agua desioniznda y s i es nece- s a r i o se filtr-. a t r a v é s de una membrane. m i l l i n o r e de

o.

5

p".

vi. L e e r n une l o n g i t u d de ondrr de 422 nm

en

un

esnectro

-

fotómetro de absorción atómica con una mezcla de gases d.e a c e t i l e n o _y óxido nitroso.

RBSULTAWS

1. Formación de l o s c o n o l e j o s nigericina-Ca*+ y A23187-Ca 2+

.

2+

?conialejo 823187-Ca i

c a reoortada en Ti:ateeriales y Flétodos. La orenaración d e e s t e c l a t r a t o no ~ r e z e n t ó nroblema alguno. For

el

contra r i o >ara obtener un buen rendimiento (-100%)

del

con712

j o nigericina-Ca2+, hubo l a necesidad de au;nentnr

el

nil-

mero de 12-vados como se 3eiiaia en ?:aterieles y PTé-toüos.

s e n r e n ~ x ó de acuerdo a I r l . tkcni

-

-

20

-

1 I 1

o

I

-

21

-

La fi;j;ura V I 1 1 muestra e l es-?ectro d e l c o n d e j o

A23187-

C a

,

que c o i n c i d e con e l reoortndo en l a 1 i t e r L t u r a

(57).

Los cambios a r i n c i a d e s observados en e l esnectro con r c s m c t o al d e l & i d o l i b r e , se presentan en l a s

se

2+

s e mhatnn; H se alarga y e n s m c b - y

H

s e acha-

tzi y n d e l p z , ~ . Adern& 1;’s s e k l e s a 8.105 p-m

a

5.206 ppm (no asignad?”) y

7.617

ppm (no asirjnada) desa- narecen, n i e n t r w que -un->.receil o t r a s a 2.613 ynm (no _a- s i g n r i h y L. 8.004

onri

(no asignz.da).

Estos

c,ainbios ücuireil s i n desnlszami ento s si,gnif i c a t iv o s.

y

Y5

3

3

*

I 1 1 b I _{L I 1 I}

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

O

Figura V I I I . Yspectro de ‘13-2LT7 de R23187-Ca2+, obtenido

en

un esvectrofotónetro Variin modelo

EKb390

go

1m.Z.

-

22

-

travils de cambios en 1:is s e f í d e s de l o s esnectroc de 'H-RhN d e l o s presuntos comalejos ionóforo-catión con

resnecto a los d.el ionóforo-3

.

b)

Esoectros de Xigericinn-H y Iligericina-Ca

.

La

f i g u r a

Ix

muestra e i e m e c t r o de n i g e r i c i n n & i d o ii- bre (n,igericina-H ). %I e s t e esnectro s e Tudieron mi%-

nar l a s señales d e l rirotbn 21

(H

) a 4.024 pym, del me- t i l o

35

(lie ) n 1.419 m m y d.el nietoxilo 40 (KeO ) a

3.312 m m .

+

+

2+

f

21

35 40

r a I I I

10

9

8

7

6 5 4 3 2 1 O

f

F i g u r s IX. Tsnectro *H-REf de nigericina-H

,

obtenido

en

un esnectrofot6metro Vzriai inodelo '?,?t-330 da

go

EHz.

La

aciznación do estas s e i l d c s e s imoortnnte y a que D I uueden u t i l i z a r cono i-ionitores de la for!x,cibn 5.e co:!r42 jos e:itre l a n i y e r i c i n i i y d x n s cationes, c0:30 l o ha si- do m r a el caso d e l i ó n

K+

(56); m e s t o que e l i! o s ve

-

21

cincii al 0 el F e a i O y e l Oll:Ze40 que narticirin. d .

-

23

-

rectmiente

en

ia

c i a t r a c i h d e l cati6n

(56).

La f i g u r a X nuestra

el

es-oectro de?. coninlejo n i g e r i c i n a - Ca2+.

Los

ca.mbios i d s s i g n i f i c a t i v o s que s e observan

correnponden a l a desanarici6n de una se521 a 2.106

-om

y t. i : r a r ~ a r i c i 6 n de o t r a s e t a l a 1.208 pnn, no es nosi-

b l e e s n e c i f i c a r a qué gru3os ciuimicos perteiecen debido a 12 baja ~-eoolucióiz Sei annrato (90 XHz). Además2ailn

cumdo n o hay deE-ol:?.zarnie.ntos s i g n i f i c a t i v o s en l a s se-

I

I I 1 I I I I I

10

9

8

7

6 5 4 3 2

1

0

2+

Figura X. l o n e c t r o de

*H-XJT

de nigericina-Ca

,

obteni- do

en

un esqectrofotónetro Varim modelo

F&90

go Y H Z .

f i d e s monitor FI (4.012 u-om), Ke

(1.413

?-om) y 01iICe40

21

35

(3.309 onm) con resyecto a 1 : ~ s d e l & c i d 0 l i b r e de n i g e r i

-

tina (Figura

Ix),

s e

mede v e r q,ue l a s senales d e l O ITe

11 40 y Ne s e ach&cuz. Los c m b i o s en 1i.s se5:d.es dr e s t e eg

aectro demuentrzn i n forinaci6ri cicl comniejo n i g c r i c i n a -

35

2+

Ca

.

-

2 4

-

a) hsl.ntificaci6ii de C a l c i o y Detecci6n d e l Comvlejo Me- diante e l Agente Ketslocr6mico A n t i - r i r i l a e o 111.

Cono fase i n i c i a l . aara üeterninnr _{l a} vc..lidez d e l ULO ?.el

a n t i p i r i i a z o Iii nara c u a n t i f i c a r a i

i6ii

Ca2+, s e deter-

Eina s i l a r e i a c i 6 n de deiisiditd óotica. vs concentrncidn de c z l c i o , en nuestrm condiciones exaerimentales (coli- centrz.cibn

del

ioii6for0, qIi, ) sigue k~ l e y 2e L m b e r t

-3eer

(58).

En

1,? figiri. XI se i m e s t r m l o s .?saectros Ciierenci?Les

en 18. regi6n

d4.

v i s i b l e

del

a n t i 7 i r i i a z o 111 vs cntini-

r i l a z o 111-Ca

,

a v:wim concentraciones de cilicio (10,

20, 30 y 40 JET)").

2+

y

-I

I

I

6 30 690

770

Figura

XI.

3arrid.o en lz re,@ii d e l v i s i b l e . b t i a i r i l a

-

zo 111 v s a n t i n i r i l a z o III-Ca2+. Densscad

6 o t i c z 0.5, $1

7

g c o n s t a i t ? d i e l k c t r i c a ( & )

37

9

Cono

:;e

ob~ierv=-

e!i

ia

f i s u r a

XI1

17- rci:i-*:i6n densi?:?,<

6atic:i V L conccntración

?.e

c a l c i o no es l i n e a l n

l a

i o n ,oitudes de onda ze.'íila(!-.s (640, 660, 680, 690, 700, 710, 720 y 730 nm). Dado e s t e comnortaniento se decid.i6 cui:Tti

f i c m c a l c i o

nor

otro:: rcktodor.

-

.- I__

-

25

-

D.O.

660

/c

b) Cutintificaci4n do C a l c i o y Deteccidn d e l Conolejo PÍle- d i m t e .kcid0 P í c r i c o .

Como

f a s e i n i c i a l nara Ceterminrir

'IC:

v a l i d e z d e l uso del &ciao n í c r i c o

oars

c u a n t i f i c a r a i

i6n

Ca

,

oe deterrnincr s i

la

r e i e c i ó n de densidad d ~ t i c a a

356

nn

vs

densidad 6-crtica a 450 nrn t i e n e un v a l o r dntino de 6.25 corno s e sz

5alz en ? a t e r i a l y Y6todos.

Las r e i z c i o n e s B para d i f e r e n t e s concentraciones de _Ca se muestra en 13. t a b l z 1.

d i f i e -

Como ::e v e on l:?, t z b l a 1 13s r e l a c i o n e s

Ten de

la

r e i x i ó i 67tinc de 6.25.Dcldo que e s t a r c i a c i 6 n no s e cumnii6, ne o7t6 n o r buscar otro niétodo vara deter

-

2+

350 %+

-

26

-

de .!cid0 d c r i - :t 1-. 5 X

10

R ,2 difcrentDs conc:ntr:icio:~:; &?

3

5 4G

'

'

₅

O

~?,hl:t, 1. ~ ~ : . ~ o r ? c cir 1 ', r ? l x i 6 n .i

-6

c a l c i o . Solución acuosc?.

A

/A

356 450 B

?.+

356 4 50

C 2

A

1.5

X Id 0.C378 0.0065 5.31538

0.0032 6.

s

3730

0.005 5.46600

-6

-6

4.5

X 1 0

_{12 0.0273}

7.5

r; 10

X

0.0193

1.05X

IO-'

I;; 0.0113

o.

O02 5.65375

1.5

X bl 0.025 0.001 ?5.C,GOCO

minm 1.. c o n c e n t r x t ó n de c a l c i o .

c ) 3et;eccibn d e l ComrJlejo Rigericino-% IJedbnte Absor

-

c i 6 n

e:i

l a Región d e l U l t r a v i o l e t a .

L o s m q e c t r o s &e nigericina-H y nigericina-Ca2+ en eta-

n o l , II:riuestr?a en

lo

iigurr.

XIII.

2+

+

B

F i g u r a ~111. P s w c t r o s en

la

r e g i ó n d e l u l t r a v i o l e t a .

+

2+

A)

';iScricina-H y 3) iiigericinz-Ca

.

O. j

-

27

-

C ) Deterains.ci6n de

1:::

R e l x i 6 n Ystequiom6trica ITigericL

nit

: ca 2+

.

E r a obtencr est-i rel;aci6n se curintifics, a l cati6n nreuen t e en cl con-lejo TIT abcorci6n zt6micli, de -cuerdo a

i.zs si-iuientes c onsi?.cr-.c iones:

-

'o. de moles IíiC;ericina

110. de moles Cct

-

-

3 e1 2.c i 6n e s t e qui om6 t r i c ;:-

2+

donde:

Peso ea gin Y i g e r i c i n n

P.

hi. ?.e !!igeric~ina. anidnicz

No. cle moles d e Y i z e r i c i n a =

2+

No. de nolen de Ca = Determinniio Vor absorción

atómica.

Peso en

gm

de >iigericin:a =

Peno

(gm) d e l comnlejo

-

2+ Peso (gm) d e Ca

.

PCm7 determinar ei núnero dc

Toien de

cit2+,

inicizilnente s e trcs.tó la imestrn con u3 fundente p::xz 1,?- obtencidn de

cenizas c030 ne i n i l i c i en m-terin,len y Y k t o d o s . 9ste m&

-

29

-

se;í;,,lc!$

z

1.203 9-m y 2.10G nrml coil res-qecto a l CciCo 7 i b r e ? e ni,rrbricina (IigLiri.

IX),

son &bidos a

la

cl;?,tr:>.

-

c i ó n ? e l Ca

.

%tii nfirrn~,ci6n se fundmenta en e l hecho

üe o , u ~

e?

esnectro de lH-XZ d e l c o m l e j o A23187-Ca

Trcscrita cambios coi1 r 7ccto 2.1

del

$cid0 l i b r e ( f i g u r n VII), _y.? que estudios de c r i s t n l o j r ? f f s de r a y o s

X

han comirobah que

el A23137 forme connlejo con

Ca

(57).

Aun

m&,

e l esoectro de uitri..violeta d e l comniejo n i g e r i

-

cin.+<:n2+ d i f i e r e con resnecto d e l esnectro de n i g e r i c i - na-Ii ( f i g u r a X I I I ) . Ts bien sabido que cnmbios en e l es

-

w c t r c . 6.2 r?bsorcibn d o una mol6cula i n d i c z cambios en SU cstrrrctur:t

( 5 8 ) ,

cono nor cjennlo l o s canbios en el es-

-vctro de c l t r a v i o l n t ? . del a o l i e t e r K C J I I I cuctn6o RCOII-

d e j a

K

(60). Por otr:: w r t e , l o s ca:::bios ?.e ?.bsorcibn

2+

2+

2+

4-

+

-

30

-

centra.ci6n de ionbforoa, ya que l o s nicos n:$xi:nos úe :"b- sorción de i n n i c e r i c i n i se desnlazei? o. r i i s t i n t : w c o i c e 2 trg.ciones d e l nisino; t e comortnniento se

h?.

renortnc1.o tanbikn nLzrE? el. n o l i e t e r I L W I I I ( 6 0 ) . 0s n o r e s t o que E

r a conocer 1:x r e l a c i ó n estequiométrica nigericincxCa

,

fie r e q u i e r e de deterr1in.n- concentrncioics de c?,l.cio ? o r ab sor ci i

6n

-t t d mic a.

ietro que s e r l a i m o r t z n t e n-i.rn c a i i f i c : n e i 2+

2c

grado de interacci6n ni$Zericinn-Ca es

1

:

:

.

deterzinación de 13 c o n s t m t e de fol'1?1;2ciOii C.el com71ejo (7: ).

f

CONCLUSIONES

Este estudio a p o r t a datos q ~ i e coliomebm q7.e

la

ni.zeric&

na forma comniejo con k 2 + , v o r i o t a t o n o c s un i o n ó f g

r o

exclusivo nara c:xtiones m n o v d r n t e s . % t e hecho di. un nuevo c r i t e r i o cis c l ~ . s i f i c n c i ó n a tocas 10s ioii6foros.

Fsto e ~ , los ion6foroc c l a s i f i c s d o s como tr?-noloci.?.ores

de c.~~.:;ioncs mono y/o d i y trivc?lentes, deberfui rrcoi1::id.e

-

r w s e et1 cu:.r.nto a su c:i-in.c.iiiad.

fie

c1stri.r c z t i o i i c s que

no transaorten. % t e hecho es im-iort:.mte t e n e r l o en cue2 t a cu:m?.o se r e n l i z 3 n ?::oerimentos en s i s t e m s b i o l 6 g i - cos e n los que vodríz, & x s e la c I a t r a c i 6 n T o r n z r t e d e l ionOforode o~bros c . - t i o i i e s clue no tr::Lnsqorte, ya Pue este hecho no excluye

I,!

vocibilic1n.t d.e f o r

c i 6 n

?.e o u C ~ E -

trato. 7s n o r e s t ? q~1.s :u.y~-i!nos e l estudio con o t r o s i o nes divT,ientes, t r i v d e n t e o y de t r m s i c i d n , ,-.sf c m 0 t m b i d n cgn iondforos (1, !.on cjuc s e

les

considere e:cclusi v o s drt 11,";ki t i % de i6n.

-

est- trabajo se dexuestra

1':~

f o r m c i b n $.el com-ii.ejo

2+ nigericina-Ca

.

A

In

fecha se consider?l clue

la

niznricinri s610 f o r m c o c p l e j o s con iones que transnorti* como e l

K

.

A su v e z se aswile, que no f o r m complejo con iones que no tr-asloca como e l L i y e l _Ca

.

Sin embargo Cirrtas r e c i e n t e s 6.::

nuestro gnino iildican que 1.i. nigericinu: cl:.ytrr a l L i

,

?or

l o ' q u e s e deciS.i6 estudiar l a n o s i b l e formacibn d e l complejo nigericinn-Ca

.

Lon

r e s u l t i d o e obtenidos con *Ii-ZX?T y es?ectrcscoafn de ü ~ t r m i o i o t a indican que efectivnmznte e s i s t - interacción

entre ia n i g e r i c i n n y e i ~ a * + . y s o e c i f i c n m n t e , e i

24-

t r o de *€I-I?MI nigericina-Ca obteniao a 90

MHz,

m e s t r a l a desaaaricibn d.e

un:>.

s e l a l a 2.2

m m

y l a aparición de

una b:mcia a. 1.2 n i m . Por o t r o 1 , - ~ d 0 ,

el.

esqectro de absoz c i ó n en

el

U.V. d e l ácido l i b r e de l a n i g e r i c i n a nresea-

t a ma a.bsorci6n

::dxim

a 208

nr,,

:nientras que e l di? 1:i. n i 7 e r i c ina-c d c i n ?I-? s ent a abs o r c i one s xim.zs ;:I, 215

230 y 373

nm.

Por l o tFato c s t o s reaultzdon indican que

la

n i g e r i c i n n e s canaz de c i a t r m 21 i6n Ca2+ afin cumdo no l o transiorta.

+

+

2+

+

2+

EVIDENCIA ESPECIXOSCOPICA SmRE La IIWEWCICRJ DE LA NIGERICINA "4

IONES QüE _NO TRANSPOIlrA: LITIO, W I O Y PRASEODIMEO. 'Rivera, B., Piedras, E., Alva, R., Arzt, E., Toro, M., T o m , L., &I%&, J.* y

Estrada-O.S., Cepto. Ciencias de l a Salud UAM-Iztapalapa y

*

Cepto. de Sicquímica. CINVESTAV del IPN.

A diferencia de su elevada capacidad para formar amplejos nbviles con

K '

, el ion6foro nigericina no se ha mostrado capaz de transportar ca-

tiones monovalentes cam el l i t i o , divalentes ccmu el calcio o triva-

lentes ccrm el praseodimio, a través de mmbranas biológicas o siste- mas de rresofases (1-3).

h el presente trabajo, encontranus de m e r a inesperada quI l a nige-

ricina p ~ d e formar CQnPlejos con l i t i o , amque no l o transporte. E l espectm de 1H-FM3. miristra alteraciones en las señales del H21, Pk35

y O l l W 4 0 del canplejo nigericina-litio respecto a l espectro del ácido

libre de l a nigericina, indicando interacción ion15forc-iitio. Estos

hallazgos nos condujeron a considerar l a hipótesis de que el ion6foro

podría tener un p e r f i l de selectividad de interacción iónica, mucho

más a p l i o que e l supuesto hasta ahora

-

de W-Vis proporcionan evidencia de l a interacción entre e l ionóforu

y estos dos cationes. Específic-te, el espectro de I H - W nigerici-

na-Ca2+ obtenido a 90 MHz, muestra l a desaparición de ma señal a 2.2

ppn y l a aparición de una banda a 1.2 ppm; a s i m i m , el de nigericina-

Pr3+ presenta un corrimiento

debido a las propiedades paramagnéticas del catión trivalente. Por

-

otro lado, e l espectro de absorciÚn en e l U.V. del ácido Libre de l a

nigericina presenta una absorción rriáWna a 208 nm, mientras qw e l & l a nigericina-calcio presenta absorciones n6x.ims a 216, 230 y 278rmi. Además, las señales que presenta e l Pr3+ libre en e l espectro visible

(446, 470 y 482 m)

,

desaparem a l formarse e l m l e j o de nigerici-

na Pr3+; por otro lado, en e l U.V. se obtiene un ensanchamiento del

espectro que abarca & 200

-

400 nm, ccn un m á x h a 222.

h base a los resultados presentados, se considera posible que e l io-

nófom estudiado forms complejos con m a anplia variedad de cationes,

ya sea mm-,di- y trivalentes, sin transportarlos, debido a ma ele-

vada afinidad y estabilidad de los canplejos formados entre ellos.

quI, por tanto, podría tmbién fomar c a p l e j o s con

caz+

y Pr 3r

.

as

espectros de ~ H - M y

y ensanchamiento de todo e l espectro,

1 .

2.

3 .

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-

1 9 8 0 .

A l e g r í a , G. T r a n s p o r t e CatiÓnico Mediado p o r N i g e r i c i n a en Membra-

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