Validación de un método analítico por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la disolución de Ezetimiba 10 mg y Simvastatina 40 mg en tabletas

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. UI M. IC A. ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA. O. Q. TESIS II. FA. RM. AC. IA. Y. BI. “Validación de un método analítico por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la disolución de Ezetimiba 10 mg y Simvastatina 40 mg en tabletas”. DE. PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE. BI BL. IO. TE. CA. BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA. AUTOR:. GUARNIZ AGUILAR, David. ASESOR: Dr. ALVA PLASENCIA, Pedro Marcelo. TRUJILLO – PERU 2017 i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. BI. O. Q. UI M. IC A. A Dios principalmente, por sus grandes bendiciones en mi vida, y misericordia en todo momento.. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. A mis queridos padres, César y Sabina, Mis primeros maestros, consejeros y amigos. El amor y gratitud hacia ustedes, por la dedicación, tiempo y esfuerzo.. A mi amada novia Anaís, mi gran amor y motivación para este trabajo. Mi ayuda idónea para siempre.. El Autor. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACION. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO: De acuerdo con lo dispuesto con las disposiciones legales y vigentes establecidas en el. reglamento de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la. UI M. de criterio profesional, el presente informe de Tesis II:. IC A. Universidad Nacional de Trujillo, presento a vuestra consideración y elevado nivel. O. Q. “Validación de un método analítico por cromatografía líquida de alta resolución. BI. (HPLC) para la disolución de Ezetimiba 10 mg y Simvastatina 40 mg en. RM. AC. IA. Y. tabletas”. FA. Es propicia esta oportunidad para hacer extensivo mi más profundo sentimiento de. DE. agradecimiento a nuestra Alma Mater y a toda la plana docente que lo conforma, por. CA. su meritoria labor de educadores y por la formación profesional que nos han. TE. brindado a través de sus enseñanzas y experiencias. De manera muy especial. BI BL. IO. agradecemos la valiosa colaboración de los señores Miembros del Jurado.. Trujillo, Junio del 2017. GUARNIZ AGUILAR, David. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. Dr. Miranda Leyva, Segundo PRESIDENTE. IC A. JURADO DICTAMINADOR. BI BL. IO. TE. CA. DE. Dr. Aro Diaz, Ruben MIEMBRO. Dr. Alva Plasencia, Pedro MIEMBRO. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN En el presente trabajo se realizó la validación del método analítico por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la disolución de Ezetimiba 10 mg y Simvastatina 40 mg en tabletas. Se utilizaron metanol, medio de disolución y fase móvil como diluyentes y condiciones cromatográficas: 238 nm de longitud de onda, 0,7 mL/min de flujo, 20 uL de volumen de inyección y 22 minutos de tiempo de corrida. El método utilizado fue específico para el analito. El estándar, muestra y placebo fueron analizados. IC A. individualmente donde no se evidenció interferencia alguna. Los porcentajes de recuperación fueron de 100,169% y 100,051%, para el test G de Cochran se obtuvieron G. UI M. exp. menor que G tabla (0,1139 y 0,8302 ˂ 0,8709) y en el test estadístico t-Student se. Q. obtuvieron p-valor mayor que el requerido (0,097 y 0,369 > 0,05). En Prueba de filtro,. BI. O. para el análisis de varianza se obtuvieron p-valor conformes (0,859 y 0,379 > 0,05). Para. Y. Precisión, se obtuvieron DSR aceptables (< 3%) y en prueba de normalidad Anderson-. IA. Darling ningún p-valor fue superior a 0,05. En la precisión intermedia diferente analista y. AC. día, el análisis de varianza fue conforme en los 2 factores y en la interacción (p-valor >. RM. 0,05), en la precisión intermedia diferente equipo se obtuvieron en el análisis de varianza. FA. p-valor de 0,090 y 0,067 (> 0,05). La linealidad presentó coeficientes de correlación de. DE. 0,9995 y 0,9996. El parámetro de robustez por el método Youden-Steiner ningún factor superó el máximo efecto variable permitido (< 1,026 y 1,013) y por el método de análisis. CA. de varianza se obtuvieron p-valor de 0,904 y 0,862 (> 0,05). Los parámetros de validación. TE. fueron conformes y permiten dar como validado el método analítico propuesto para la. BI BL. IO. disolución de Ezetimiba 10 mg y Simvastatina 40 mg en tabletas.. Palabras claves: Simvastatina, Ezetimiba, HPLC, método analítico. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. In the present work, the analytical method was validated by high performance liquid chromatography (HPLC) for the dissolution of Ezetimibe 10 mg and Simvastatin 40 mg in tablets. Methanol, dissolution medium and mobile phase were used as diluents and chromatographic conditions: 238 nm wavelength, 0,7 mL / min flow, 20 uL injection volume and 22 minutes run time. The method used was specific for the analyte. The standard, sample and placebo were individually analyzed where no interference was. IC A. evidenced. The percentages of recovery were 100,169% and 100,051%, for the Cochran G. UI M. test, G exp. less than G table (0,11139 and 0,8302 ˂ 0,8709) and higher than required pvalue were obtained in the t-Student test (0,097 and 0,369 > 0,05). In the Filter test,. O. Q. conform p-values were obtained for the analysis of variance (0,859 and 0,399 > 0,05). For. BI. Accuracy, acceptable DSRs were obtained (< 3%) and in Anderson-Darling normality test. Y. no p-value was greater than 0,05. In the intermediate precision different analyst and day,. AC. IA. the analysis of variance was conform on the 2 factors and in the interaction (p-value > 0,05), in the intermediate precision different equipment were obtained in the analysis of. RM. variance p-value of 0,090 and 0,067 (> 0,05). The linearity presented correlation. FA. coefficients of 0,9995 and 0,9996. The parameter of robustness by the Youden-Steiner. DE. method, no factor exceeded the maximum permissible variable effect (< 1,026 and 1,013). CA. and the p-value of 0,904 and 0,862 (> 0,05) was obtained by the method of analysis of. TE. variance. The validation parameters were consistent and allow to validate the proposed. BI BL. IO. analytical method for the dissolution of Ezetimibe 10 mg and Simvastatin 40 mg in tablets.. Key words: Simvastatin, Ezetimibe, HPLC, Analytical method. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. INDICE. Pág. CARATULA .................................................................................................................... i DEDICATORIA ............................................................................................................. ii PRESENTACIÓN ......................................................................................................... iii. IC A. JURADO DICTAMINADOR....................................................................................... iv. UI M. RESUMEN .......................................................................................................................v. Q. ABSTRACT ................................................................................................................... vi. BI. O. INDICE ......................................................................................................................... vii INTRODUCCIÓN ............................................................................................08. II.. OBJETIVOS .....................................................................................................22. III.. MATERIAL Y MÉTODO ...............................................................................23. IV.. RESULTADOS .................................................................................................51. V.. DISCUSIÓN ......................................................................................................65. VI.. CONCLUSION .................................................................................................72. VII.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................73. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. I.. BI BL. VIII. ANEXOS ............................................................................................................77. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCION El control de la calidad forma parte de las Buenas Prácticas de Manufactura, en el cual se encuentran involucrados el muestreo, las especificaciones y las pruebas, así como también el procedimiento de organización, documentación y autorización que aseguren las realización de las pruebas pertinentes, y que no se autorice el uso de materiales ni la expedición de productos para su venta y provisión, sin que se haya establecido que su calidad es satisfactoria1.. IC A. El control de calidad es indispensable para garantizar que un producto farmacéutico. UI M. es elaborado con rigurosas exigencias de calidad, con ingredientes farmacéuticos. Q. activos y excipientes de una composición cualitativa y cuantitativa establecida, para. O. que el producto en las condiciones normales de uso y duración del tratamiento. Y. BI. pueda ser utilizado con los efectos previstos para preservar o mejorar la salud1.. IA. Las sustancias farmacéuticas son biológicamente activas y pueden causar también,. AC. en grado variable, efectos indeseables. El riesgo de reacciones graves y de fracaso. RM. terapéutico se acentúa cuando los productos son de calidad inferior o se administran. FA. incorrectamente. Para evitar ello, la elaboración, envasado y comercialización de. DE. productos debe sujetarse a las normas aceptadas internacionalmente2. Posterior a esto, para verificar la calidad de la manufactura del medicamento, los análisis. CA. fisicoquímico y microbiológico también deben cumplir ciertas especificaciones. IO. TE. siguiendo la normativa correspondiente para asegurar la calidad del producto.. BI BL. En la práctica la calidad es un concepto relativo, ligado al binomio productoconsumidor, en este sentido la calidad es el “grado de satisfacción que ofrece las características del producto en relación con las exigencias del consumidor”. En consecuencia se puede afirmar que la calidad no es una opinión subjetiva, sino una propiedad que posee todo producto, y si se quiere opinar sobre calidad, han de definirse sus características con parámetros cualitativos y cuantitativos3. El análisis se considera hoy en día un proceso mediante el cual obtenemos información. Se realiza millones de análisis cada día en los ámbitos más variados: análisis de productos manufacturados, análisis medioambientales, análisis clínicos, forenses, químicos y físicos, en todos ellos se requiere una confianza en los. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. resultados obtenidos. La validación de las metodologías analíticas, junto con otras actividades englobadas en el área de aseguramiento de la calidad, permiten conseguir calidad, otorgando la confianza necesaria a la vez que confieren un grado elevado de comparabilidad entre los resultados de los análisis químicos4. Según la norma ISO/IEC 17025, los laboratorios deben validar todos los métodos que se utilicen en el laboratorio, tanto los desarrollados por ellos mismos como aquellos procedentes de fuentes bibliográficas, o desarrollados por otros. IC A. laboratorios. Además, también es necesario que el laboratorio valide los métodos de referencia aunque, en ese caso, no es necesario que el laboratorio realice una. UI M. validación completa. Asimismo, el laboratorio debe validar todo el procedimiento. Q. analítico teniendo en cuenta el intervalo de concentraciones y de matrices de las. BI. O. muestras de rutina5.. Y. La validación es el proceso establecido para la obtención de pruebas documentadas. AC. IA. (evidencia objetiva), mediante estudios sistemáticos de laboratorio y demostrativos,. RM. de que un método de análisis es lo suficientemente fiable, reproducible y cumple requisitos particulares para producir el resultado previsto dentro de intervalos. FA. definidos. El proceso de validación permite el conocimiento de las características. DE. de funcionamiento del método y proporciona un alto grado de confianza en el. CA. mismo y en los resultados obtenidos al aplicarlo6, 8.. TE. La validación de los métodos analíticos es una actividad fundamental en los. IO. sistemas de calidad de los laboratorios. El proceso de validación, guarda una. BI BL. estrecha relación con la representatividad de los resultados, dependiendo del objetivo de los análisis y del tipo de muestra7. Se define como método analítico a la adaptación específica de una técnica analítica para un propósito de medición seleccionado. La validación de un procedimiento analítico es un procedimiento para establecer por medio de estudios de laboratorio una base de datos que demuestren científicamente que un método analítico tiene las características de desempeño (exactitud, precisión, especificidad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidad e intervalo, robustez) que son adecuadas para cumplir los requerimientos de las aplicaciones analíticas. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. pretendidas. Implica la demostración de la determinación de las fuentes de variabilidad y del error sistemático y al azar de un procedimiento, no solo dentro de la calibración sino en el análisis de muestras reales8. La complejidad actual de las muestras y las exigencias respecto a los límites de cuantificación, la necesidad de detectar no solamente especies químicas, sino de mantener íntegras la configuración espacial (en los compuestos biológicos), el grado de oxidación (en especies inorgánicas), la polimorfía cristalina del compuesto, la integridad de las impurezas potenciales en el producto y sus excipientes, entro otros, exigen un. IC A. trabajo intensivo de preparación de muestra y de extracción de los componentes de. UI M. interés que solamente se consiguen mediante técnicas sofisticadas que precisan de un largo proceso de preparación, en el que cada pequeño paso puede introducir. BI. O. Q. variaciones en el analito de interés9.. Y. Existen varios tipos de validación de metodología analítica que se mencionan a. AC. IA. continuación:. RM. a) Validación Prospectiva: Es la que se realiza sobre un proceso antes de que sea implementado, el cual puede darse para la fabricación de nuevos productos,. FA. cuando hay cambios fundamentales en un proceso o cuando se incorpora un. DE. equipo o sistema para uso10.. CA. Es la validación que comúnmente se elige porque nos asegura el éxito del. TE. proceso antes de su implementación, además que se pueden elegir y controlar. BI BL. IO. las variables a ensayar en el proceso10. b) Validación Retrospectiva: Es la que se realiza sobre el análisis de ensayos ya elaborados, en la cual se revisa y analiza con métodos estadísticos los parámetros físicos y los resultados analíticos de por lo menos 10 a 30 consecutivos, no debiendo existir cambios en la formulación, modificaciones sustanciales de equipo o instalaciones, ni cambios en el método de ensayo. El proceso se considera válido si al menos el 95% de los resultados analíticos cumplen con las especificaciones internas y al menos el 90% de los controles de proceso no tienen variaciones significativas11.. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. c) Validación Simultánea: Es la que se produce cuando es imposible completar la validación antes de la puesta en el mercado del producto farmacéutico. Se da si sólo se ha producido un limitado número de lotes o si los lotes no se producen frecuentemente o tal vez si la fabricación se ha producido con modificaciones y las pruebas demuestran que los parámetros estén conformes. En este caso, se incrementan las pruebas del número de análisis10. d) Revalidación: Se realiza cuando un método previamente validado ha sido. IC A. modificado en alguno de los pasos del procedimiento establecido, o se ha variado alguno de los instrumentos, reactivo, de la matriz que contiene la. UI M. muestra, de la proporción relativa del analito o material empleado. O. Q. originalmente, y se realiza en periodos establecidos10, 12.. BI. La validación empieza en la planificación, formalizada usualmente a través de un. Y. plan maestro de validación (PMV). Esta planificación incluye prever la realización. AC. IA. de todas las instancias de calibración, mantenimiento, capacitación, desarrollo de. RM. documentos, etc., que corresponda, antes de comenzar con las actividades de. FA. validación propiamente dichas10, 13.. DE. El plan maestro de validación viene a ser el desarrollo planificado y sistemático de todas las actividades relacionadas que atañe al establecimiento en su totalidad y en. CA. el que se describe que equipos, sistemas, métodos y procedimientos habrán de. TE. validarse y cuándo lo serán. En el documento deberá de especificarse la forma de. IO. presentación necesaria para cada documento de validación (IQ, OQ, PG en el caso. BI BL. de equipos y sistemas; validación de procesos; validación de métodos analíticos) e indicar que tipo de información deberá reflejarse encada momento10. Indicará también por qué y cuándo se efectuarán las revalidaciones, ya sea después de hacerse modificaciones o cambios en la ubicación de equipos o sistemas, cambios de los procesos o equipos usados en la fabricación, o cambios en los métodos de valoración o equipos utilizados en las pruebas10, 13. Las categorías de métodos analíticos más comunes son las siguientes: Categoría I: Incluye los métodos analíticos para la cuantificación de los componentes mayoritarios, actividad biológica o potencia de las materias primas o. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de los principios activos (incluyendo conservadores) en productos biológicos y productos farmacéuticos, que miden el analito presente en una muestra determinada10, 14. Categoría II: Incluye los métodos analíticos empleados para la determinación de impurezas en materias primas o productos de degradación en los productos biológicos o farmacéuticos. Pueden ser pruebas cuantitativas o pruebas de límite para determinar si la impureza está presenta en la muestra por encima o por debajo. IC A. de un valor límite especificado. Cualquiera de las dos pretende reflejar las características de pureza de la muestra. Los parámetros de validación requeridos. UI M. por una prueba cuantitativa son diferente a los de una prueba de cumplimiento de. O. Q. límite10, 14.. BI. Categoría III: Incluye métodos analíticos para la determinación de las. Y. características de desempeño (ej. disolución, liberación de principios activos) de un. AC. IA. producto farmacéutico10, 14.. RM. Categoría IV: Ensayos de identificación de productos farmacéuticos. Incluye. FA. pruebas para asegurar la identidad de un analito en una muestra10, 14.. DE. Para cada categoría de análisis, se necesita diferente información analítica.. CA. En la tabla se indica los elementos o parámetros que normalmente se requiere para. BI BL. IO. TE. cada una de estas categorías14.. Parámetros de Desempeño Categoría Analítico I Exactitud. Categoría II Análisis Pruebas Cuantitativos de Límite. Categoría III. Categoría IV. SI. SI. *. SI**. NO. SI. SI. NO. SI. NO. SI***. SI***. NO. SI***. NO. Especificidad. SI. SI. SI. SI**. SI. Límite de Detección. NO. NO. SI. *. NO. Repetibilidad Precisión. Precisión Intermedia. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Límite de Cuantificación. NO. SI. NO. *. NO. Linealidad. SI. SI. NO. SI**. NO. Intervalo. SI. SI. *. *. NO. * Puede requerirse, dependiendo de la naturaleza del método. ** Puede no ser necesaria en algunos casos. *** En casos donde la reproducibilidad ha sido realizada, la Precisión Intermedia no es necesaria.. IC A. Las características de desempeño de un método analítico se expresan en función de. UI M. los parámetros analíticos. Estos parámetros analíticos considerados en validación. Q. son:. BI. O. a) Especificidad:. Y. Capacidad de un método analítico para medir y/o identificar simultánea o. IA. separadamente los analitos de interés, de formas inequívocas, en presencia de. AC. otras sustancias químicas que pueden estar presentes en la muestra.. RM. Frecuentemente los términos ESPECIFICIDAD y SELECTIVIDAD se utilizan. FA. como sinónimos, aunque “especificidad” debería reservarse para aquellas. DE. situaciones donde la respuesta obtenida solo se puede producir con una única entidad química, algo que no es posible cuando se refiere a procedimientos. CA. analíticos que emplean instrumentación no específica. Como existen muy. TE. pocos métodos que den respuesta sólo a un único analito, el término. IO. “selectividad” es normalmente más apropiado.. BI BL. La especificidad de un método analítico se debería determinar antes de iniciar el estudio de cualquier otro parámetros de validación, dado que debe conocerse en qué grado la respuesta del método es únicamente proporcionada por el analito, sin interferencias de otras sustancias relacionadas con el de una u otra forma10.. b) Exactitud: La exactitud de un procedimiento analítico expresa la proximidad entre el valor que es aceptado convencionalmente como valor verdadero o un valor de referencia y el valor experimental encontrado10.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Se calcula como el porcentaje de recuperación de la cantidad valorada con respecto a la cantidad conocida de analito añadida a la muestra, o como la diferencia entre la media de la valoración y el valor verdadero aceptado, considerando los intervalos de confianza15. Los documentos de ICH recomiendan que se evalúe la exactitud utilizando un mínimo de nueve determinaciones sobre un mínimo de tres niveles de concentración,. cubriendo. el. intervalo. especificado. (es. decir,. tres. concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada concentración) 15.. IC A. La exactitud o bien se podría llamar “inexactitud”, debe ser tan pequeña como. UI M. sea posible para que el valor medido se aproxime al de referencia. Dicho de otro modo, la recuperación del analito debe acercarse al 100%12.. O. Q. No se debe confundir exactitud y precisión. La precisión está relacionada con. BI. la dispersión de una serie de mediciones, pero no da ninguna indicación de lo. IA. Y. cerca que está del valor verdadero. Se puede tener mediciones muy precisas. AC. pero poco exactas; sin embargo, para que un método sea exacto se requiere un. RM. cierto grado de precisión10.. FA. c) Precisión:. DE. La precisión expresa el grado de concordancia (grado de dispersión) entre una. CA. serie de medidas de tomas múltiples a partir de una misma muestra homogénea. TE. en las condiciones prescritas.. IO. La procedencia de las muestras destinadas al estudio de la precisión puede ser. BI BL. de muestras reales o preparadas en el laboratorio. El objetivo del estudio de la precisión es conocer la variabilidad o el más – menos del método de ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo método de ensayo. Como consecuencia de la existencia de estos errores, los análisis efectuados sobre muestras idénticas, en las mismas circunstancias, no conducen generalmente a resultados idénticos. Los factores susceptibles de influir sobre los resultados de ensayo no pueden ser siempre controlados (analistas, equipo instrumental, reactivos, tiempo, etc.) de aquí la importancia del estudio de la precisión10. La precisión engloba diferentes tipos de estudio:. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Fuente: Quattrocchi O., Andrizzi S., Laba R. Introducción a la HPLC Aplicación y Práctica.. IC A. 1. Repetibilidad: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de. UI M. análisis sobre la misma muestra en las mismas condiciones operativas (por. O. laboratorio y en un período de tiempo corto.. Q. un mismo analista, con los mismos aparatos y reactivos, etc.) en un mismo. BI. La repetibilidad se expresa matemáticamente por el coeficiente de. IA. Y. variación (desviación estándar relativa) de una serie de medidas.. AC. Uno de los factores que más puede influir en la repetibilidad del método de. RM. análisis es la concentración del analito, ya que la desviación estándar de las respuestas obtenidas aumenta al disminuir la concentración del. DE. FA. analito10.. CA. 2. Precisión Intermedia: Estudia la variabilidad del método efectuando una. TE. serie de análisis sobre la misma muestra pero en condiciones operativas. IO. (diferentes analistas, aparatos, días, etc.) y en un mismo laboratorio.. BI BL. En el estudio de la precisión intermedia se deben considerar aquellas circunstancias en las que se pretende desarrollar el método de ensayo. El analista debe evaluar los efectos causados al variar una serie de factores. Típicos factores a estudiar incluyen el día, el analista, el instrumento, etc. No es necesario estudiar cada uno de estos factores individualmente si no que es suficiente comprobar que la variabilidad aportada por el conjunto d factores está dentro de los límites establecidos10.. 3. Reproducibilidad: Estudia la variabilidad del método bajo condiciones operativas diferentes y en distintos laboratorios. La precisión de un método. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. analítico se expresa generalmente como el coeficiente de variación de una serie de medidas. La reproducibilidad de dicho método de análisis se determina analizando una serie de alícuotas procedentes de lotes homogéneos en diferentes laboratorios, diferentes analistas y utilizando condiciones operativas y ambientales distintas pero siguiendo el procedimiento descrito en el método10. Los documentos de ICH recomiendan que se evalúe la repetibilidad. IC A. utilizando un mínimo de nueve determinaciones que cubran el intervalo. UI M. especificado para el procedimiento (es decir, tres concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada concentración) o usando un mínimo de. BI. O. Q. seis determinaciones al 100% de la concentración de prueba15.. IA. Y. d) Linealidad e Intervalo:. AC. La linealidad es la capacidad del método para proporcionar resultados que son. RM. directamente (o por medio de transformaciones matemáticas) proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro de un intervalo establecido.. FA. Siempre que sea posible se buscará una respuesta de tipo lineal que facilitará su. DE. trazado, interpolación e interpretación. Si no se puede lograr la linealidad, se. CA. puede utilizar un modelo no lineal. El objetivo es obtener un modelo que. TE. describa con precisión la relación de concentración en función de la respuesta,. IO. ya sea lineal o no lineal10, 15.. BI BL. El Intervalo se define como el rango o amplitud entre la concentración superior e inferior de analito para el cual se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del método descrito en los extremos al igual que dentro del intervalo10, 15. Aunque el proceso lógico consistirá en evaluar cuáles son los límites de concentración en los que el método analítico pierde su linealidad, normalmente se toma como punto de partida un intervalo de concentraciones ya establecido de acuerdo con la experiencia, el conocimiento analítico de la técnica empleada y principalmente en función de las especificaciones10.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Las concentraciones por debajo del intervalo de concentración definido pueden introducir un error debido a una pobre relación señal-ruido, mientras que las concentraciones que exceden el intervalo de concentración definido pueden introducir un error debido a dispersiones múltiples15. La ICH recomienda que, para establecer la linealidad, se utilicen un mínimo de cinco concentraciones. También recomienda que se consideren los intervalos especificados mínimos que se indican a continuación: . Valoración de un Fármaco (o producto terminado): de 80% a 120% de la. Determinación de una Impureza: de 50% a 120% del criterio de. UI M. . IC A. concentración de prueba.. Uniformidad de Contenido: un mínimo de 70% a 130%. O. . Q. aceptación.. de la. BI. concentración de prueba, a no ser que se justifique un intervalo más. IA. Y. amplio o más apropiado, basándose en la naturaleza de la forma Pruebas de Disolución: ±20% por encima del intervalo especificado15.. FA. RM. . AC. farmacéutica.. e) Robustez:. DE. La robustez de un método analítico es la medida de su capacidad para. CA. permanecer inalterado ante pequeñas pero deliberadas variaciones en ciertos. TE. parámetros, proporcionando idea de su fiabilidad “estabilidad” durante su. IO. empleo en rutina.. BI BL. Es por tanto la capacidad que demuestra el procedimiento de análisis para proporcionar resultados válidos en presencia de pequeños cambios respecto de las condiciones descritas en el método, susceptible de producirse durante su utilización10. Variaciones habituales son el pH de la fase móvil, la composición de la fase móvil, diferentes lotes o proveedores de columnas, la temperatura y la velocidad de flujo15. También comprende la medida en que los analitos se mantengan estables durante todo el procedimiento de análisis, incluido su almacenamiento antes y después de éste. En general, la medición se hace comparando patrones recién. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. preparados. con una concentración. conocida con patrones similares. almacenados durante diferentes períodos de tiempo y en diferentes condiciones16. La evaluación de la robustez puede realizarse durante la fase de desarrollo del método analítico y no necesariamente durante la validación14. En la selección de variables a considerar debe utilizarse todo el conocimiento ya adquirido durante el desarrollo analítico para minimizar el número de ensayos a realizar. En un diseño normal de “una variable por vez”, el estudio. IC A. de 5 variables resultaría en 25 = 32 ensayos. Por eso, cuando los factores a. UI M. evaluar en el estudio de robustez son muchos, se recurres a un diseño global que permite agruparlos, reduciendo el número de ensayos a efectuar15.. O. Q. Un diseño muy utilizado es el de Youden y Steiner, que permite estudiar el. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. efecto de n variables en n+1 ensayos12.. Fuente: Quattrocchi O., Andrizzi S., Laba R. Introducción a la HPLC Aplicación y Práctica.. Las variables seleccionadas se indican con letras: las letras mayúsculas (A, B, C, D, E, F) corresponden al nivel alto y las letras minúsculas (a, b, c, d, e, f) al nivel bajo de la variable en cuestión. Luego se selecciona uno o más parámetros a medir y se obtienen los resultados indicados con las letras s, t, u, v, w, x, y, z. Estos resultados corresponden a uno o más parámetros en estudio: concentración hallada, resolución, asimetría, etc12.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. f) Límite de Detección y Límite de Cuantificación: Se entiende por límite de detección la mínima cantidad del analito en la muestra que se puede detectar aunque no necesariamente cuantificar bajo dichas condiciones experimentales y se expresa en unidades de concentración (%, ppm, ppb, etc.)10, 12. Se define también como la concentración mínima que puede distinguirse del ruido de fondo con un determinado grado de confianza. Para estimar el límite de detección pueden utilizarse varios métodos, todos los cuales dependen del. IC A. análisis de especímenes en blanco y el examen de la relación entre la señal y el. UI M. ruido. Por lo general se acepta un requisito mínimo de relación señal/ruido de 2/1 ó 3/112, 15, 16.. O. Q. El límite de detección es por tanto un término sólo cualitativo, no robusto y. BI. puede resultar afectado por cambios menores del sistema analítico (ej.,. IA. Y. temperatura, pureza de los reactivos, efectos de matriz, condiciones. AC. instrumentales. En ambos términos se encuentra un rango de concentraciones. RM. en las que si bien no puede cuantificarse el analito en cuestión con razonable certeza, si puede detectarse su presencia sin incurrir en falsos positivos10, 16.. FA. Se entiende por límite de cuantificación de dicho método, la mínima cantidad. DE. de analito presente en la muestra que se puede cuantificar, bajo las condiciones. CA. experimentales descritas, con una adecuada precisión y exactitud.. TE. El límite de cuantificación es por lo tanto un término cuantitativo10.. IO. Generalmente se mide la señal de fondo (relación señal/ruido); efectuando. BI BL. mediciones repetidas sobre un blanco o placebo. La relación señal/ruido habitualmente aceptable es de 10/110, 12, 15. Las formulaciones farmacéuticas son mezclas complejas que incluyen, además de un o más componentes medicinalmente activos, una serie de excipientes tales como diluyentes, desintegrantes, colorantes, y saborizantes12. La mayoría de los métodos de análisis son en los casos más favorables selectivos, pero no específicos. Por ellos, cuando se trata de muestras complejas la separación del analito de las posibles interferencias es una etapa esencial. Uno de los mejores. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. métodos para conseguir esa separación, y posiblemente, el más utilizado es la cromatografía17. La cromatografía líquida de alta performance (HPLC), es una técnica de separación constituida por una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida. Las separaciones se logran por partición, adsorción o procesos de intercambio iónico, según el tipo de fase estacionaria empleada12. Ésta es una de las técnicas cromatográficas más utilizada. Esta técnica deriva de. IC A. una evolución de la cromatografía preparativa en columna, la que se realizaba en. UI M. columnas de vidrio con diámetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm. Para que el flujo de fase móvil fue razonablemente rápido las partículas de fas. O. Q. estacionaria debían ser de gran diámetro (150 – 200 um) lo que se traducía en una. BI. separación poco eficaz y, a pesar de todo, lenta. Para aumentar la eficacia de la. Y. separación y así incrementar a la resolución era necesario emplear fases. AC. IA. estacionarias con tamaño de partícula mucho menos (entre 2 y 5 um), ya que la. RM. difusión de los solutos entre las fases móvil y estacionaria se hace más rápida. Pero ello implica la necesidad de impulsar la fase móvil con un sistema de alta presión,. DE. FA. nace así la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) 17. Las ventajas sobre esta técnica radican en su alta sensibilidad, fácil adaptación a las. CA. determinaciones cuantitativas exactas, aplicabilidad a sustancias de interés general. TE. (industria, salud, medio ambiente), en determinación de compuestos no volátiles. BI BL. IO. (alto peso molecular, iones metálicos), etc. Los compuestos a analizar se disuelven en un líquido orgánico y la mayoría de las separaciones tienen lugar a temperatura ambiente. Por lo tanto, la mayoría de las drogas, sean compuestos no volátiles o térmicamente inestables, pueden analizarse mediante esta técnica sin riesgo de descomposición. El tiempo de elución de un compuesto puede ser descrito por su factor de capacidad, ya que depende de la naturaleza química del compuesto analizado, la composición y la velocidad de flujo de la fase móvil y la composición y el área superficial de la fase estacionaria. Solo los compuestos que tienen diferentes factores de capacidad pueden ser separados por HPLC12.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Dentro de los productos farmacéuticos de nuestro medio podemos encontrar a la simvastatina y ezetimiba. La simvastatina es un fármaco hipolipemiante perteneciente a la clase de fármacos llamados estatinas se designa químicamente como [(1S, 3R, 7R, 8S, 8aR) 8- [2 - [(2R, 4R) -4-hidroxi -6-oxo-Oxan-2-Y1L] etil] -3,7-dimetil-1, 2, 3, 7, 8, 8a-hexahidronaftaleno-1-y1] 2,2-dimetilbutanoato se utiliza para el tratamiento de hipercolesterolemia. Después de la conversión de esta lactona profármaco en su forma de ácido hidroxilo, el compuesto es un potente inhibidor competitivo de la hidroximetilglutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa. IC A. que cataliza la conversión de HMG-CoA en mevalonato, paso inicial y limitante en. determinación. de. la. simvastatina,. UI M. la biosíntesis de colesterol. Diferentes métodos analíticos se han reportado para la que. incluyen. HPLC,. HPLC-MS,. BI. O. Q. espectrofotometría derivado, y técnicas voltamperométricas21.. Y. La ezetimiba, un inhibidor selectivo de colesterol intestinal y la absorción de. IA. fitosterol relacionada, se designa como 1- (4-fluorofenil) -3 (R) - [3- (4-fluorofenil). AC. -3 (S) hidroxipropil] - 4 (S) - (4-hidroxifenil) -2-azetidinona. Se evita el transporte. RM. de colesterol a través de la pared intestinal bloqueando selectivamente la absorción. FA. de colesterol de fuentes dietéticas y biliares. Esto reduce el suministro global de. DE. colesterol al hígado, promoviendo así la síntesis de receptores de LDL y una reducción subsiguiente en el suero de LDL-C. Se reportan muy pocos métodos de. BI BL. IO. TE. CA. HPLC para la determinación de la ezetimiba21.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PROBLEMA ¿Cumplen los parámetros de validación del método por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la disolución de Ezetimiba 10 mg y Simvastatina 40 mg en tabletas, con los criterios de aceptación establecidos?. OBJETIVOS:. IC A. II.. . UI M. Objetivo general:. Validar el método por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la. BI. O. Q. disolución de Ezetimiba 10 mg y Simvastatina 40 mg en tabletas.. Determinar los parámetros de validación: prueba de filtro, linealidad, exactitud,. IA. . Y. Objetivos específicos:. AC. precisión, especificidad y robustez, del método por cromatografía líquida de alta. RM. resolución (HPLC) para la disolución de Ezetimiba 10 mg y Simvastatina 40 mg. DE. Evaluar los parámetros de validación mencionados de acuerdo a los criterios de. CA. . FA. en tabletas.. BI BL. IO. TE. aceptación establecidos.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III.. MATERIAL Y MÉTODO 1. MATERIAL 1.1. MUESTRA Y ESTÁNDAR MUESTRA PARA ANÁLISIS: Nombre: EZETORIN 10/40 TABLETAS Presentación: Caja por 30 tabletas. IC A. Cantidad: 10 cajas (300 tabletas). UI M. ESTÁNDARES SECUNDARIOS:. Q. Nombre: SIMVASTATINA. BI. O. Número de análisis: S-02/16. Y. Tipo de estándar: Estándar secundario tipo A. AC. FA. Nombre: EZETIMIBA. RM. Potencia: 99,656 % tal cual. IA. Proveedor: HETERO LABS LIMITED. DE. Número de análisis: WS-15/15 Tipo de estándar: Working Estándar. CA. Proveedor: HETERO LABS LIMITED. IO. TE. Potencia: 99,580 % tal cual. BI BL. PLACEBO PARA ANÁLISIS: Nombre: EZETORIN 10/40 TABLETAS Presentación: Caja por 30 tabletas Cantidad: 01 caja (30 tabletas). 1.2. REACTIVOS Y SOLVENTES •. Agua purificada. •. Agua ultrapura. •. Metanol grado HPLC. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Acetonitrilo grado HPLC. •. Lauril sulfato de sodio grado ACS. •. Hidróxido de sodio grado ACS. •. Fosfato monobásico de potasio grado ACS. •. Fosfato monobásico de sodio grado ACS. •. Ácido fosfórico grado ACS. IC A. •. UI M. 1.3. MATERIALES DE LABORATORIO Fiolas: 25mL, 50mL, 100mL, 500mL. . Pipetas volumétricas: 1mL, 2mL, 3mL, 4mL, 5mL, 6mL. . Probetas: 50mL, 100mL, 250mL, 500mL, 1000mL. . Pipetas graduadas: 25 mL. . Vasos de precipitación: 100 mL. . Varillas de vidrio. . Espátulas. . Pizeta con agua purificada. . Termómetro. . Tapas de plástico para fiolas. . Viales para HPLC. . Tapas y septas para viales. . Filtros jeringa de nylon de 0,2 um de porosidad. . Jeringas de plástico: 5mL, 10mL, 20mL. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. . 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.4. EQUIPOS DE LABORATORIO CODIGO. EQUIPO. OBSERVACIONES Marca: THERMO SCIENTIFIC Modelo: DIONEX ULTIMATE 3000 MÓDULOS:. CC-CL-147. CROMATÓGRAFO. Pump: LPG-3400SD. LÍQUIDO DE ALTA. Autosampler: WPS-3000TSL. RESOLUCION (HPLC). Column compartment: TCC-3000 SD. IC A. UV Detector: VWD-3100 EC Detector: ECD 3000 RS. UI M. Calibración y/o verificación: Conforme. Q. Marca: HITACHI. O. Modelo: LACHROM ELITE. BI. MÓDULOS:. CROMATÓGRAFO. IA. LÍQUIDO DE ALTA. Y. CC-CL-101. Bomba: L-2130. FA. RM. AC. RESOLUCION (HPLC). Detector DAD: L-2455 Detector Conductividad:L-2470 Calibración y/o verificación: Conforme. DE. Modelo: LACHROM ELITE MÓDULOS:. CA TE. Horno: L-2350. Marca: HITACHI. CROMATÓGRAFO. Bomba: L-2130. LÍQUIDO DE ALTA. Inyector automático: L-2200. RESOLUCION (HPLC). BI BL. IO. CC-CL-55. Inyector automático: L-2200. Horno: L-2300 Detector UV: L-2400 Detector IR: L-2490 Calibración y/o verificación: Conforme Marca: HITACHI Modelo: LACHROM ULTRA. CROMATÓGRAFO CC-UC-104. LÍQUIDO ULTRA DE ALTA RESOLUCION (HPLC). MODULOS Autosampler: L:2200U Pump A: L-2160U Pump B: L-2160U Horno: L-2300 Detector DAD: L-2455U. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Calibración y/o verificación: Conforme Marca: HITACHI Modelo: LACHROM ULTRA MODULOS CROMATÓGRAFO CC-UC-103. Autosampler: L:2200U. LÍQUIDO ULTRA DE ALTA. Pump A: L-2160U. RESOLUCION (HPLC). Pump B: L-2160U Horno: L-2300 Detector UV-VIS: L-2420U. IC A. Calibración y/o verificación: Conforme Marca: HITACHI. UI M. Modelo: LACHROM MERCK HITACHI LÍQUIDO DE ALTA. Bomba:L-7100. O. Q. MODULOS. BI. CC-CL-30. CROMATÓGRAFO. RESOLUCION (HPLC). FA. RM. AC. IA. Y. Inyector automático:L-7200. Detector DAD: L7455 Calibración y/o verificación: Conforme Marca: HITACHI Modelo: LACHROM MERCK. DE. HITACHI. CROMATÓGRAFO. MODULOS. LÍQUIDO DE ALTA. Bomba:L-7100. CA. CC-CL-13. Horno: L-7350. TE. RESOLUCION (HPLC). Inyector automático:L-7200. IO. Horno: L-7350. BI BL. Detector UV: L-7400 Calibración y/o verificación: Conforme Marca: AGILENT Modelo: 1260 MODULOS CROMATÓGRAFO. ID-HP-03. LÍQUIDO DE ALTA RESOLUCION (HPLC). Bandeja: N/A Desgasificador de vacío: G1379A Bomba Isocrática: G1310A Automuestreador Líquido: G1313A Compart. Columna Termostatizado: G1316A Detector de Arreglo de Diodos: G1315B. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Calibración y/o verificación: Conforme Marca: ELECTROLAB ID-DI-03. DISOLUTOR. Modelo: DISOLUTION TESTER Serie: 1304158 Marca: OHAUS Modelo: AR2140. CC-BL-58. BALANZA ANALITICA. Serie: K171 1227140153 P Calibración y/o verificación: Conforme. IC A. Marca: OHAUS Modelo: DV215CD. CC-BL-70. BALANZA ANALITICA. UI M. Serie: 1129322623. Calibración y/o verificación: Conforme. CC-PH-65. O. Q. Marca: THERMO Modelo: ORION STAR SERIES. BI. POTENCIOMETRO. Y. Serie: 017400. AC. IA. Calibración y/o verificación: Conforme. EQUIPO DE. CC-BU-66. FA. RM. ULTRASONIDO. Serie: ENC 100733933G Calibración y/o verificación: Conforme. DE CA. Dimensiones: 150 mm x 4,6 mm Porosidad: 5 um. IO. TE. CROMATOGRAFICA. Tipo: Purospher Star RP-18 endcapped. BI BL. Lote: HX420609 Serie: 420588 Marca: Merck Dimensiones: 250 mm x 4,6 mm. COLUMNA C-004/16. Modelo: 5510E-DTH. Marca: Merck. COLUMNA. C-031/16. Marca: BRANSON. CROMATOGRAFICA (alternativa para robustez). Porosidad: 5 um Tipo: Purospher Star RP-18 endcapped Lote: HX305117 Serie: 349342. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2. MÉTODO 2.1. MÉTODO ANALITICO A VALIDAR: 2.1.1. DISOLUCIÓN DE EZETIMIBA Y SIMVASTATINA Método. : Cromatografía Líquida (HPLC). Referencia. : Técnica propia. Especificación : - Ezetimiba: No menos de 75% (Q) en 60 minutos.. SISTEMA CROMATOGRÁFICO. Q. Equipos:. UI M. IC A. - Simvastatina: No menos de 75% (Q) en 60 minutos.. BI. O.  Cromatógrafo Líquido LaChrom Merck Hitachi UV-VIS. Y.  Cromatógrafo Líquido LaChrom Merck Hitachi D.A.D. IA.  Cromatógrafo Líquido LaChrom Elite UV-VIS. AC.  Cromatógrafo Líquido LaChrom Elite D.A.D. RM.  Cromatógrafo Líquido LaChrom Ultra UV-VIS. FA.  Cromatógrafo Líquido LaChrom Ultra D.A.D. DE.  Cromatógrafo Líquido Agilent. CA.  Cromatógrafo Líquido Dionex Ultimate 3000. BI BL. IO. TE. Columna Cromatográfica: L1 (5um); 150 mm x 4,6 mm. CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS Longitud de onda. : 238 nm. Flujo. : 0,7 mL/min. Tiempo de corrida. : 22 minutos aproximadamente. Volumen de inyección. : 20 uL. CONDICIONES DE DISOLUCIÓN Medio de disolución: Solución amortiguadora de pH 6,8 conteniendo lauril sulfato de sodio al 0,5% en fosfato monobásico. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de sodio 0,01 M (disolver 30 g de lauril sulfato de sodio y 8,28 g fosfato monobásico de sodio en 6000 mL de agua y ajustar con solución de hidróxido de sodio al 50% a pH 6,8).. Volumen. : 500 mL. Aparato 2 (paletas). : 100 rpm. Tiempo. : 60 minutos. IC A. REACTIVOS. UI M. Solución Buffer: Pesar aproximadamente 3,6 g de fosfato monobásico de potasio, transferir a una fiola de 1 L, adicionar 600. O. Q. mL de agua purificada y disolver, completar a volumen con agua. BI. purificada y mezclar. Llevar a pH 4,5 ± 0,05 con hidróxido de. AC. IA. Y. sodio o ácido fosfórico.. RM. Fase móvil: Preparar una mezcla adecuada de solución Buffer y Acetonitrilo (35:65). Filtrar por membrana de nylon 0,2 µm de. DE. FA. porosidad y desgasificar por 3 minutos.. CA. PROCEDIMIENTO Estándar:. Pesar. aproximadamente. 100. mg. de. TE. Solucion. IO. Simvastatina estándar de referencia y 25 mg de Ezetimiba estándar. BI BL. de referencia, transferir a una fiola de 50 mL, adicionar 30 mL de metanol y sonicar por 10 minutos, enfriar a temperatura ambiente, completar a volumen con metanol. Transferir 1,0 mL de la solución anterior a una fiola de 25 mL, llevar a volumen con medio de disolución, mezclar. Transferir 6,0 mL de la solución anterior a una fiola de 25 mL, llevar a volumen con fase móvil, mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2 µm de porosidad descartando los primeros mililitros. (Concentración aproximada: 0,0192 mg/mL Simvastatina y 0,0048 mg/mL Ezetimiba).. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Preparación de la muestra: Terminado el tiempo de disolución, tomar de cada vaso 20 mL aproximadamente, utilizando dispositivo portafiltro y papel Whatman Nº40, filtrar la muestra a frascos de vidrio, transferir 6,0 mL del filtrado a fiola de 25 mL, completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2 µm de porosidad descartando los primeros mililitros. (Concentración aproximada: 0,0192 mg/mL Simvastatina y 0,0048. UI M. IC A. mg/mL Ezetimiba).. Q. 2.2. RECOLECCION DE DATOS. O. 2.2.1. CÁLCULOS. BI. Para los parámetros de Prueba de filtro (Ver Anexo N° 5),. IA. Y. Precisión (Ver Anexos Nº 8, 10, 12, 14, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26). AC. y Robustez (Ver Anexo Nº 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39). FA. RM. Se utilizaron las siguientes fórmulas:. 𝐴 𝑚𝑝 𝑊 𝑠𝑡 1 6 𝑃𝑜𝑡%𝑡/𝑐 500 25 × × × × × × × 100 𝐴 𝑠𝑡 50 25 25 100 10 6. TE. CA. 𝑋=. DE. CÁLCULOS PARA EZETIMIBA. IO. Donde:. BI BL. X. : Porcentaje de principio activo disuelto por tableta. A mp. : Área de la muestra problema. A st. : Área del Estándar de referencia. W st. : Peso del Estándar de referencia, en mg. Pot%t/c : Potencia del estándar en porcentaje de droga tal cual. CÁLCULOS PARA SIMVASTATINA 𝑋=. 𝐴 𝑚𝑝 𝑊 𝑠𝑡 1 6 𝑃𝑜𝑡%𝑡/𝑐 500 25 × × × × × × × 100 𝐴 𝑠𝑡 50 25 25 100 40 6. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Donde: X. : Porcentaje de principio activo disuelto por tableta. A mp. : Área de la muestra problema. A st. : Área del Estándar de referencia. W st. : Peso del Estándar de referencia, en mg. Pot%t/c : Potencia del estándar en porcentaje de droga tal cual. IC A. Para el parámetro de Exactitud (Ver Anexo Nº 3). UI M. Se utilizaron las siguientes fórmulas: Para Simvastatina:. O. Q. 𝐴 𝑚𝑝 𝑊 𝑠𝑡 1 6 𝑃𝑜𝑡%𝑡/𝑐 25 × × × × × 500 × 𝐴 𝑠𝑡 50 25 25 100 6. BI. 𝑋=. Y. Para Ezetimiba:. IA. 𝐴 𝑚𝑝 𝑊 𝑠𝑡 1 6 𝑃𝑜𝑡%𝑡/𝑐 25 × × × × × 500 × 𝐴 𝑠𝑡 50 25 25 100 6. RM. AC. 𝑋=. FA. Estas son fórmulas reducidas, debido que se necesita hallar porcentaje de recuperación, y solo se hace uso de estándar (materia. CA. DE. prima) y placebo.. TE. Para el parámetro de Linealidad (Ver Anexo Nº 30). IO. Se realizaron los cálculos según las diluciones hechas y. BI BL. concentraciones halladas.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.3. PARAMETROS DE VALIDACION14 2.3.1. ESPECIFICIDAD Se analizó por separado estándar y placebo según el método analítico. Preparación del estándar: Se realizó según indica el método analítico. Preparación del placebo: Se realizó 01 ensayo de disolución con 06. IC A. muestras de placebo siguiendo las indicaciones del método analítico. UI M. en “preparación de la muestra”.. Q. Se realizaron 05 inyecciones para el estándar y 01 inyección por. IA. 2.3.2. PRUEBA DE FILTRO. Y. BI. O. cada muestra de placebo, asimismo la fase móvil y diluyente.. AC. Se realizó 01 ensayo de disolución con 06 muestras siguiendo las. FA. RM. condiciones según método analítico.. analítico.. DE. Preparación del estándar: Se realizó según indica el método. CA. Preparación de las muestras: Se tomaron 05 alícuotas de 20 mL. TE. aproximadamente de cada vaso de disolución y se filtró cada una por. BI BL. IO. 01 tipo de filtro, obteniéndose 05 muestras por cada vaso y en total 30 muestras. Se realizaron 05 inyecciones para el estándar y 01 inyección por cada muestra.. 2.3.3. EXACTITUD Se realizó mediante la adición de una concentración conocida de los principios activos Ezetimiba y Simvastatina al placebo. Preparación del estándar: Se realizó según indica el método analítico.. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Concentración final de Ezetimiba: 0,0048 mg/mL. Concentración final de Simvastatina: 0,0192 mg/mL. Se realizaron 05 inyecciones. Preparación de las muestras: La adición de las cantidades de principio activo se hicieron en tres niveles de concentración: 80%, 100% y 120%.. IC A. Muestra 80%: Pesar aproximadamente 8 mg de Ezetimiba, 32 mg. UI M. de Simvastatina estándares de referencia tal cual y 360 mg de placebo. Transferir dichas cantidades al vaso de disolutor. O. Q. (previamente llenado con medio y temperado a 37°C) e iniciar el. BI. ensayo de disolución siguiendo las condiciones del método analítico.. Y. Terminado el tiempo de disolución, tomar del vaso 20 mL dispositivo. IA. utilizando. portafiltro. y. papel. AC. aproximadamente,. RM. Whatman Nº40, filtrar la muestra a frascos de vidrio, transferir 6,0 mL del filtrado a fiola de 25 mL, completar a volumen con fase. FA. móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2 um de. DE. porosidad. Se prepararon 03 muestras. Se realizaron 02 inyecciones. CA. por muestra.. TE. Muestra 100%: Pesar aproximadamente 10 mg de Ezetimiba, 40. IO. mg de Simvastatina estándares de referencia tal cual y 350 mg de. BI BL. placebo. Transferir dichas cantidades al vaso de disolutor (previamente llenado con medio y temperado a 37°C) e iniciar el ensayo de disolución siguiendo las condiciones del método analítico. Terminado el tiempo de disolución, tomar del vaso 20 mL aproximadamente,. utilizando. dispositivo. portafiltro. y. papel. Whatman Nº40, filtrar la muestra a frascos de vidrio, transferir 6,0 mL del filtrado a fiola de 25 mL, completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2 um de porosidad. Se prepararon 03 muestras. Se realizaron 02 inyecciones por muestra.. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Muestra 120%: Pesar aproximadamente 12 mg de Ezetimiba, 48 mg de Simvastatina estándares de referencia tal cual y 340 mg de placebo. Transferir dichas cantidades al vaso de disolutor (previamente llenado con medio y temperado a 37°C) e iniciar el ensayo de disolución siguiendo las condiciones del método analítico. Terminado el tiempo de disolución, tomar del vaso 20 mL aproximadamente,. utilizando. dispositivo. portafiltro. y. papel. IC A. Whatman Nº40, filtrar la muestra a frascos de vidrio, transferir 6,0. UI M. mL del filtrado a fiola de 25 mL, completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2 um de. O. Q. porosidad. Se prepararon 03 muestras. Se realizaron 02 inyecciones. Y. BI. por muestra.. RM.  REPETIBILIDAD. AC. IA. 2.3.4. PRECISION. FA. Preparación del estándar: Se realizó según indica el método. DE. analítico. Se preparó por duplicado.. CA. 1er Estándar aplica para los Ensayos 1, 2, 3.. TE. 2do Estándar aplica para los Ensayos 4, 5, 6.. IO. Concentración final de Ezetimiba: 0,0048 mg/mL.. BI BL. Concentración final de Simvastatina: 0,0192 mg/mL. Se realizaron 05 inyecciones por cada estándar. Preparación de las muestras: Se prepararon 06 ensayos de disolución con 06 muestras cada uno siguiendo las condiciones según método analítico. Se realizó 01 inyección por muestra.. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación.  PRECISION INTERMEDIA DIFERENTE ANALISTA Y DIA: El ensayo se realizó de la misma manera que la Repetibilidad pero ejecutado por otro analista calificado y cada uno en días diferentes.. DIFERENTE EQUIPO: Se realizó solo con 01 ensayo de disolución, siguiendo el procedimiento analítico, pero analizado. IC A. en los siguientes equipos HPLC:  HPLC LaChrom Merck Hitachi UV-VIS (CC-CL-13). UI M.  HPLC LaChrom Merck Hitachi D.A.D (CC-CL-30). Q.  HPLC LaChrom Elite UV-VIS (CC-CL-55). BI. O.  HPLC LaChrom Ultra UV-VIS (CC-UC-103). Y.  HPLC LaChrom Ultra D.A.D (CC-UC-104). IA.  HPLC Agilent 1260 (ID-HP-03). FA. RM. AC.  HPLC Dionex Ultimate 3000 (CC-CL-147). DE. 2.3.5. LINEALIDAD. CA. Se trabajó dentro del intervalo de 50% a 150% de la concentración de trabajo.. TE. Para el estudio de linealidad del sistema se prepararon soluciones a. BI BL. IO. partir de los principios activos Ezetimiba y Simvastatina que contengan concentraciones de 50%, 75%, 100%, 125% y 150% de las concentraciones finales (0,0048 mg/mL Ezetimiba y 0,0192. mg/mL Simvastatina). Preparación de la Solución Stock: Pesar aproximadamente 48 mg de Simvastatina y 12 mg de Ezetimiba estándares de referencia tal cual, transferir a una fiola de 100 mL, adicionar 60 mL de metanol y sonicar por 10 minutos, enfriar a temperatura ambiente, completar a volumen con metanol y mezclar.. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Preparación de las concentraciones: Concentración 50%: Transferir 2,0 mL de la Solución Stock a una fiola de 100 mL, completar a volumen fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon de 0,2 um de porosidad. Se prepararon 02 muestras. Se realizaron 02 inyecciones por muestra.. IC A. Concentración 75%: Transferir 3,0 mL de la Solución Stock a una fiola de 100 mL, completar a volumen fase móvil y mezclar. Filtrar. UI M. por membrana de nylon de 0,2 um de porosidad.. Q. Se prepararon 02 muestras. Se realizaron 02 inyecciones por. BI. O. muestra.. IA. Y. Concentración 100%: Transferir 4,0 mL de la Solución Stock a una. AC. fiola de 100 mL, completar a volumen fase móvil y mezclar. Filtrar. RM. por membrana de nylon de 0,2 um de porosidad. Se prepararon 02 muestras. Se realizaron 02 inyecciones por. DE. FA. muestra.. Concentración 125%: Transferir 5,0 mL de la Solución Stock a una. CA. fiola de 100 mL, completar a volumen fase móvil y mezclar. Filtrar. TE. por membrana de nylon de 0,2 um de porosidad.. BI BL. IO. Se prepararon 02 muestras. Se realizaron 02 inyecciones por muestra. Concentración 150%: Transferir 6,0 mL de la Solución Stock a una fiola de 100 mL, completar a volumen fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon de 0,2 um de porosidad. Se prepararon 02 muestras. Se realizaron 02 inyecciones por muestra.. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.3.6. ROBUSTEZ Se realizó siguiendo el procedimiento de Youden y Steiner, para lo cual se mencionan los factores y sus variaciones. VARIACION. 0,7 mL/min. 1,4 mL/min. 6,8. 9,5. 500 mL. 900 mL. 20 uL. IC A. Flujo pH medio de disolución Volumen de medio de disolución Volumen de inyección Columna cromatográfica. ESTANDAR. UI M. FACTOR. L1; 250 mm x 4,6 mm. O. Q. L1; 150 mm x 4,6 mm 25°C. 35°C. Tiempo 0. 72 horas. BI. Temperatura Horno. AC. IA. Y. Estabilidad. 40 uL. RM. Se tomaron 07 factores reales (variables). Se hicieron 08. FA. determinaciones (disoluciones) con 06 muestras cada una, realizando 01 inyección por muestra, que incluyó una combinación aleatoria de. CA. DE. los factores según el modelo factorial construido.. Ensayos. Determ. 1 Determ. 2 Determ. 3 Determ. 4 Determ. 5 Determ. 6 Determ. 7 Determ. 8. BI BL. IO. TE. MODELO FACTORIAL FACTORES O VARIABLES. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Flujo. pH medio. Vol. medio. Vol. inyección. Columna. T° Horno. Estabilidad. 1,4 mL/min 0,7 mL/min 1,4 mL/min 0,7 mL/min 1,4 mL/min 0,7 mL/min 1,4 mL/min 0,7 mL/min. 9,5 9,5 6,8 6,8 9,5 9,5 6,8 6,8. 500 mL 500 mL 500 mL 500 mL 900 mL 900 mL 900 mL 900 mL. 20uL 40uL 40uL 20uL 20uL 40uL 40uL 20uL. 150 x 4,6 250 x 4,6 150 x 4,6 250 x 4,6 250 x 4,6 150 x 4,6 250 x 4,6 150 x 4,6. 35°C 35°C 25°C 25°C 25°C 25°C 35°C 35°C. 0 horas 72 horas 72 horas 0 horas 72 horas 0 horas 0 horas 72 horas. 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.4. ANÁLISIS DE DATOS19,20 Los datos obtenidos en cada parámetro fueron sometidos a análisis estadístico (se utilizó el programa de estadística Minitab versión 17) para verificar el cumplimiento de cada uno con los criterios de aceptación y de esa manera tener confiabilidad en los resultados.. 2.4.1. CALCULOS. Y. PRUEBAS. ESTADÍSTICAS. PARA. UI M. PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN. IC A. EXACTITUD. Cálculo utilizado para obtener la recuperación en porcentaje en cada. %𝑀𝑅 × 100 %𝑇𝐼𝐴. AC. IA. Y. %𝑅𝑒𝑐. =. BI. O. Q. nivel de concentración trabajado.. Donde: %𝑀𝑅: %𝑇𝐼𝐴:. FA. RM. Porcentaje de muestra recuperada. Porcentaje teórico de insumo agregado.. DE. Determinando el Porcentaje de muestra recuperada: 𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑎 × 100 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑟. TE. CA. %𝑀𝑅 =. BI BL. IO. Determinando el Porcentaje teórico de insumo agregado: %𝑇𝐼𝐴 =. 𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 𝑎𝑔𝑟𝑒𝑔𝑎𝑑𝑜 × 100 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑟. Si: %𝑅𝑒𝑐. =≥ 98% − 102% ≥ ⟶ aceptable. %𝑅𝑒𝑐. =< 98% − 102% < ⟶. Porcentaje. de. recuperación. Porcentaje de recuperación no. aceptable.. 38 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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