Identificación de un secuencia parcial del Gen NPR1 en Persea americana var hass "palto"

Texto completo

(1)DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE OTORGAN EL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. UN IC. RECTOR. CO. M. Dr. Orlando Velásquez Benites. VICERECTORA ACADEMICA. ÁT. IC. A. Y. Dr. Vilma Julia Méndez Gil. RM. VICERECTORA ADMINISTRATIVA. DE. IN FO. Dr. Flor Marlene Luna Victoria Mori. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAD BIOLÓGICAS. SI ST. EM. AS. Dr. Hermes Escalante Añorga. SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. IO. N. DE. Dr. Cesar Augusto Jara Campos. Dr. Segundo Eloy López Medina. DI. RE. CC. DIRECTOR DE LA ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Y. Dr. Danilo Gastañadui Rosas. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. MIEMBROS DEL JURADO. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. PRESIDENTE. SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. Dr. Gina Zavaleta Espejo. Dr. José Saldaña Jiménez VOCAL. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ASESOR El que suscribe, profesor asesor de la presente tesis, declara que ésta ha sido. AC IÓ. N. ejecutada de conformidad con su correspondiente proyecto y con las debidas orientaciones brindada al tesista. En cuanto al informe, este ha sido revisado y acoge. Dra. Fátima Zavala De La Cruz Asesor. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. las observaciones y sugerencias correspondientes.. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que la. AC IÓ. N. presente tesis ha cumplido los requisitos formales y fundamentales siendo aprobada. A. Y. CO. M. UN IC. por unanimidad.. ÁT. IC. Dr. Danilo Gastañadui Rosas. Dra. Gina Zavaleta Espejo SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. PRESIDENTE. Dr. José Saldaña Jiménez VOCAL. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. DEDICATORIA. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. A Dios, el camino y la luz que guía mi vida; por ser mi fortaleza diaria de ayer, hoy y siempre; y por darme su inmenso amor, por ayudarme a cumplir todos mis logros.. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. A mis padres Cristóbal y Rosa, por su apoyo incondicional; por su amor y paciencia; por enseñarme a nunca claudicar, luchando siempre por alcanzar mis objetivos y sueños; y sobre todo, por confiar en mí.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. A mis hermanos Johnny, William, Michael, Omar; por apoyarme y comprenderme; por compartir las alegrías de una familia, y por mantenernos unidos siempre.. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. A los profesores por sus enseñanzas, consejos, apoyo incondicional que me ayudaron a alcanzar esta meta.. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. A mis amigas y amigos, por los momentos de felicidad que compartimos.. Fiorela. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. A ti Paul, por llegar a mi vida y soñar en ella, por estar conmigo en los momentos buenos y malos, por compartir tu tiempo y sobre todo por darme tu cariño. Te Amo.. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO Expreso mi más sincero agradecimiento a los profesores Dr. Fátima Zavala De La. AC IÓ. N. cruz y Dr. José Saldaña Jiménez, por su apoyo desinteresado, por tenerme la paciencia necesaria, sus consejos e inapreciables aportes para cumplir con los. CO. M. UN IC. objetivos programados en el presente trabajo de tesis.. Y. En general quisiera agradecer a todas y cada una de las personas que me brindaron. IC. A. su apoyo y colaboraron en la realización de esta tesis y que no necesito nombrar. ÁT. porque tanto ellas como yo sabemos que desde lo más profundo de mi corazón les. RM. agradezco su apoyo y aliento en esos momentos difíciles de trabajo, gracias por su. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. amistad y cariño.. DI. Fiorela Hazel Lujan Gonzales. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. PRESENTACIÓN. UN IC. AC IÓ. Señores Miembros del Jurado:. M. Cumpliendo con el reglamento interno de la Facultad de Ciencias Biológicas de la. CO. Universidad Nacional de Trujillo; para la obtención de grados y títulos, someto a. A. Y. vuestra consideración y elevado criterio la tesis titulada: Identificación de una. ÁT. IC. secuencia parcial del gen NPR1 en Persea americana var hass “palto”. Con la que. RM. pretendo optar el Título de Biólogo.. IN FO. Esperando que vuestro criterio sea de comprensión por errores u omisiones. EM. AS. DE. cometidos en la elaboración del presente trabajo, me someto a vuestro dictamen.. Br. Fiorela Hazel Lujan Gonzales.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. Trujillo, 21 de Setiembre del 2012.. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ÍNDICE ii. MIEMBROS DEL JURADO. iii. AC IÓ. N. AUTORIDADES UNIVERSITARIAS. iv. UN IC. DEL ASESOR APROBACIÓN. CO. M. DEDICATORIA. Y. AGRADECIMIENTO. IC. A. PRESENTACIÓN. RM. ÁT. ÍNDICE. IN FO. RESUMEN ABSTRACT. ix x xi xii. EM. SI ST. 14 21. DE. DISCUSIÓN. viii. 8. AS. MATERIAL Y MÉTODOS RESULTADOS. vi. 1. DE. INTRODUCCIÓN. v. 25 26 36. IO. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. CC. N. CONCLUSIÓN. DI. RE. ANEXOS. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN El gen NPR1, denominado también NIM1 (non-inducible immunity 1) codifica una. AC IÓ. N. proteína involucrada en Resistencia Sistemica Adquirida (SAR) (Resistencia de amplio espectro) en plantas que sobreexpresan una batería de genes (PR). UN IC. relacionadas a patogénesis. NPR1 es un regulador en la ruta de transducción de. M. señales que inducen el SAR. Investigaciones respecto al secuenciamiento de regiones. CO. de este gen en cultivo de palto son nulos. Por tal motivo, se identificó una secuencia. A. Y. parcial del gen NPR1 de Persea americana var hass “palto”. Para el efecto, se extrajo. ÁT. IC. el DNA de hojas tiernas de 43 individuos, se determinó la calidad de éste mediante. RM. espectrofotometría y electroforesis, se realizó la amplificación del ADN utilizando el. IN FO. juego de primers NPR1-R1, NPR1-L2 y 18S, se secuenciaron los fragmentos amplificados y finalmente se comparó con la de otras especies mediante el análisis en. DE. BLAST. Los resultados mostraron una calidad del ADN comprendida entre un valor. AS. de 1.4 y 2.6 (A260/A280), siendo 25 muestras las que presentaron valores. SI ST. EM. comprendidos en el rango óptimo de 1.7 a 2.0 con bandas electroforéticas definidas. Con respecto a la amplificación del ADN por PCR, se observó amplificación en 31. DE. muestras y 12 no amplificaron. La ausencia de amplificación probablemente sería. IO. N. por lisis ineficiente debido a la elevada concentración de polisacáridos en la muestra. CC. o por posibles alteraciones en la secuencia nucleotídica en la región de anillamiento. RE. de los primers. En referencia al secuenciamiento, se logró determinar una región. DI. parcial del gen NPR1 constituída por 420 pb con 100% de similitud con especies vegetales de importancia económica. Palabras claves: Persea americana var. Hass, gen NPR1, region parcial.. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT The NPR1 gene, also called NIM1 (non-inducible immunity1), encodes a protein. AC IÓ. N. involved in Systemic acquired resistance (SAR) as a broad-spectrum resistance in plants and which is associated with the upregulation of a battery of pathogenesis-. UN IC. related (PR) genes. NPR1 is a key regulator in the signal transduction pathway that. M. leads to SAR. Molecular researches in sequencing of NPR1 gen on avocado are null.. CO. In this survey a partial sequence of NPR1 gen from Persea americana "avocado" var. A. Y. Hass was identified. DNA from young leaves of 43 plant individuals was extracted. ÁT. IC. and its quality was performed by optical spectrophotometer and horizontal agarose. RM. gel electrophoresis. In addition, DNA amplification using NPR1-R1, L2 and 18S-. IN FO. NPR1 primers was sequenced and the sequenced fragments were compared by BLAST analysis. Results showed that DNA quality values were comprised between. DE. 1.4 and 2.6 (A260/A280) from which 25 samples had optimal DNA quality values. AS. ranging from 1.7 to 2.0 by contrasting with conspicuous electrophoresis bands. Gene. SI ST. EM. amplification was observed in 31 samples and no amplification in 12. Absence of amplification is probably due to inefficient cell lysis and increased concentrations of. DE. polysaccharides in the plant samples, although alterations concerning nucleotide. IO. N. sequences in regions of primers annealing is not discarding. A partial region of. CC. NPR1 gene of 420 pb and 100% of similarity with other plants species was. DI. RE. determined.. Key words: Persea americana var. Hass, NPR1 gene, gene partial region.. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN Persea americana “palto” pertenece al género Persea de la familia Lauráceas. AC IÓ. N. de la división Magnoliophyta, que comprende poco más de 50 géneros y unas 2,200 especies nativas de América central y se originó en México extendiéndose hasta. UN IC. Colombia, Venezuela, Ecuador y Perú1,2.. CO. M. El palto posee valiosas propiedades alimenticias por su alto contenido de aceites y proteínas; además de su contenido de hidratos de carbono, vitaminas y. A. Y. minerales que le confieren grandes posibilidades en el aumento de su consumo en la. RM. ÁT. IC. dieta humana e industrialización3.. IN FO. En el Perú, el cultivo de palto ha experimentado un gran crecimiento, en la superficie cosechada desde el año 1994 en que se registraron 6,368 ha, hasta que en. DE. el año 2007 se registraron 13,603 ha; y en el año 2010 se produjeron 148,900. AS. toneladas de los cuales 59,4 mil toneladas se exportaron, convirtiéndose en uno de. SI ST. EM. los cultivos alternativos de gran preferencia e importancia económica4. Existen diversas variedades de palto en el Perú, tal como criolla, dedo costa,. DE. fuerte, naval costa, villa campa costa, siendo la más importante la variedad Hass, por. IO. N. su buena de calidad y sabor frente a otras variedades5. Sin embargo, existen grandes. CC. limitaciones a nivel de producción, generada por diversos factores tanto bióticos. RE. como abióticos. En la actualidad, se recurre a prácticas de manejo químico, cultural y. DI. biológico; sin embargo, los controles químicos y culturales no han sido efectivos resultando muy costosos y difíciles de aplicar, por lo que se busca contrarrestar las enfermedades utilizando estrategias que no dañen al medio ambiente y minimizen el control químico6. 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Los organismos están formados por una variedad de moléculas, dentro de ellas, el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN) que llevan la información genética y tienen una estructura básica compuesta por un azúcar,. AC IÓ. N. grupos fosfato y bases nitrogenadas. El ADN es la mólecula central para el control. UN IC. celular ya que éste regula y dirige la mayor parte de las actividades fundamentales de la célula, por lo tanto, es fundamental contar con métodos adecuados de aislamiento. CO. M. y purificación de la misma, que permitan la obtención de ADN de alto peso. Y. molecular de excelente calidad7.. IC. A. Las técnicas moleculares basadas en el análisis del DNA, tal como la PCR. ÁT. (reacción en cadena de la polimerasa) constituyen herramientas poderosas que. IN FO. RM. permiten establecer las relaciones filogenéticas8, la identificación de especies9, búsqueda o creación de variedades resistentes, identificación de secuencias génicas. DE. involucradas con la resistencia, para posterior selección de individuos resistentes10.. EM. AS. La resistencia es definida como la capacidad de una planta que impide o. SI ST. retrasa el desarrollo de un patógeno o algún otro factor que cause daño, dependiendo en parte de la presencia de barreras preformadas y la respuesta activa que induce el. DE. patógeno11, por lo que su reconocimiento es el paso inicial en cualquier interacción. IO. N. directa planta-microorganismo. Por ello, la resistencia genética es la herramienta más. CC. importante que puede encontrar el hombre para la protección de sus cultivos debido a. RE. que se pueden obtener variedades mejoradas que presenten resistencia más. DI. duradera12. Cada planta contiene cientos de genes R (resistencia) específicos para patógenos de origen viral, bacteriano, fúngico y nemátodos. En la década actual, se. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. han podido clonar alrededor de 40 genes de resistencia en plantas dicotiledóneas (Solanáceas, Cucurbitáceas, Leguminosas) y en monocotiledóneas utilizando técnicas de clonamiento posicional, mutagénesis mediante transposones y mediante. AC IÓ. N. amplificación por PCR de dominios conservados. Dichos genes, codifican proteínas R que presentan alta variabilidad en su especificidad, lo que ha permitido a las. UN IC. plantas defenderse frente a la aparición de nuevas razas de patógenos13.. CO. M. Los fitopatógenos provocan anualmente daños por miles de millones de. Y. dólares en los cultivos a nivel mundial. Por consiguiente, se ha puesto énfasis a la. IC. A. investigación centrada en la capacidad innata de la planta de resistir la invasión por. RM. ÁT. patógenos14. La capacidad defensiva es potenciada por un elicitor ambiental. IN FO. específico, por el cual las defensas innatas de la planta son activadas contra objetivos bióticos subsecuentes. Este estado potenciado de resistencia es efectivo contra un. DE. amplio rango de patógenos, incluyendo hongos, virus, bacterias, nématodos,. AS. parásitos de plantas e incluso insectos. Las dos formas más claramente definidas de. EM. resistencia inducida son la resistencia sistémica adquirida (SAR) y la resistencia. SI ST. sistémica inducida (SIR), las cuales se diferencian en la naturaleza del elicitor y las. DE. rutas de regulación15,16.. IO. N. Hasta hace pocos años, la identificación de genes reguladores para defensa en. CC. plantas, generó evidencia de que estas usan varios mecanismo de defensa para evadir. RE. diferentes patógenos. Los mecanismos de defensa son caracterizados por las. DI. moléculas de señalización que son cruciales para la regulación de expresión de proteínas de defensa17.. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La Resistencia Sistémica Adquirida (SAR), es una respuesta de defensa duradera que se induce por infecciones localizadas y que le otorga protección a las plantas contra un amplio espectro de patógenos. Siendo el gen NPR1 (non-expressor. AC IÓ. N. of PR1) el que desempeña un papel fundamental en este tipo de resistencia,. UN IC. controlando la expresión de genes que codifican a las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) y que responde al ácido salicílico (SA) y al ataque por patógenos;. CO. M. por ejemplo, las plantas de algodón que contienen este gen resultan resistentes a. Y. cuatro enfermedades fúngicas causadas por los hongos Verticillium dahliae,. IC. RM. ÁT. así como al nematodo Rotylenchulus reniformis18.. A. Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum, Rhizoctonia solani, y Alternaria alternata,. IN FO. Diferentes estudios han demostrado que este gen está implicado en la respuesta de defensa tanto a nivel local como la respuesta del SAR. La proteína. DE. NPR1 se localiza en el citoplasma en forma oligomérica inactivo, estabilizada por. AS. puentes disulfuro, teniendo que ser activada por el ácido salicílico. En situaciones de. EM. inducción por cambios redox citoplasmáticos, el NPR1 se disocia a un estado. SI ST. monomérico al reducirse los puentes disulfuro19,20 y es transportado al núcleo donde. DE. interacciona con factores de transcripción de la familia TGA (factores que se unen a. N. la secuencia TGACG de ADN) /OBF (octopine synthase (ocs)-element-binding. CC. IO. factor) bZIP (basic leucine zipper), estos factores de transcripción se unen. RE. específicamente a elementos CIS presentes en los promotores de genes PR-1 en. DI. respuesta al ácido salicílico21,22,23. La familia de proteínas bZIP es muy grande y diversa, y ha sido una de las. familias de factores reguladores de la transcripción más estudiada, habiendo estudios bioinformáticos han identificado sus dominios estructurales más importantes, los 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. cuales posteriormente han sido caracterizados funcionalmente mediante ensayos in vitro e in vivo. Los factores bZIP participan en múltiples procesos relacionados con el desarrollo y con procesos fisiológicos en respuesta a fenómenos tan diversos como. AC IÓ. N. la luz, la anaerobiosis, el ataque de patógenos, la desecación o las fitohormonas24.. UN IC. El NPR1, también llamado NIM1 (non-inducible immunity1) es un gen que codifica para una proteína de 65 Kd que contiene repeticiones de ankyrina y cuya. CO. M. función es requerida para el establecimiento de la resistencia Sistémica adquirida. Y. (SAR), por lo que se ha propuesto que NPR1 interactuaría a través de repeticiones de. IC. A. ankyrina con otras proteínas, posiblemente factores de transcripción. Apoyando esta. NPR1. Los factores TGA estarían reconociendo la. IN FO. que interactuarían con el. RM. ÁT. hipótesis, se identificaron factores de transcripción de la familia TGA de tipo bZIP. secuencia TGACG presente en el promotor de genes de defensa como proteínas. DE. relacionadas con patogénesis (PR) y glutatión-S-transferasa (GST), que ayuda a. AS. proteger a las células vegetales contra el estrés oxidativo. Mutantes de NPR1 en que. EM. se ha eliminado el dominio ankyrina, pierden la capacidad de unir algunos TGA, lo. SI ST. que se traduce en la pérdida de la capacidad de inducir la expresión de PR, por eso. DE. los mutantes NPR1 de Arabidopsis son más susceptibles y algunos no son capaces de. IO. N. activar la expresión de genes de defensa PR en respuesta del SAR.. CC. Utilizando silenciamiento génico postranscripcional, mediado por virus. RE. (VIGS), se determinó que el NPR1 es un factor esencial para la ruta de defensa. DI. mediada por el receptor N en tabacos resistentes al virus del mosaico tabaco (TMV) la sobre expresión del gen NPR1, bajo un promotor constitutivo (35S del CaMV) aumenta la resistencia a varios patógenos bacterianos; siendo interesante destacar. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. que se puede obtener resistencia a patógenos, aumentando la expresión de una proteína intermediaria (Ej.: NPR1) 25,26,27. N. Las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) se acumulan en las células. AC IÓ. durante y después de una infección. Son proteínas de bajo peso molecular, resistentes. UN IC. a las proteasas que se localizan en compartimientos extracelulares con valores de pH extremos. Algunas de las PR poseen actividades tal como de β-1,3-glucanasas (PR-2). CO. M. y quitinasas (PR-3), sugiriendo que la alta expresión de éstas tiene una función. A. Y. importante en la defensa contra patógenos que contienen β-1,3 glucano y quitina28.. ÁT. IC. NPR1 es necesario no sólo para la respuesta SAR sino también para la. RM. respuesta SIR (resistencia sistémica inducida) asociada a rizobacterias y confiere. IN FO. resistencia frente a bacterias y hongos en la parte aérea de la planta. Además; NPR1 está implicado en la señalización cruzada (cross-talk) entre la ruta del ácido salicílico. DE. (SA), la del ácido jasmónico (JA) y la del etileno, confiriendo resistencia frente a. EM. AS. insectos y patógenos necrótrofos29. La función de NPR1 parece estar conservada. SI ST. entre especies monocotiledóneas y dicotiledóneas, ya que se ha demostrado que la sobreexpresión de NPR1 en arroz confiere una mayor resistencia frente a la bacteria. DE. Xanthomonas oryzae pv.oryzae30 Por lo tanto, el estudio de la expresión del gen. IO. N. NPR1 puede conducir a la identificación de nuevos componentes y mecanismos. Por lo tanto, existiendo genes como el NPR1, que aún cuando sus productos. DI. RE. CC. importantes para la activación de la respuesta de defensa de la planta31.. no poseen una actividad antibiótica directa, codifican para proteínas que participan en la señalización de la respuesta defensiva, regulando etapas de la cascada de señalización32,33; habiendo sido identificado en diferentes especies vegetales; tales. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. como Capsicum annum34, Ipomoea batatas35, Musa acuminata. 36. , Nicotiana. glutinosa37, Oriza sativa38, Populus trichocarpa39; excepto en Persea americana var hass “palto”, por lo que se identificó una secuencia parcial del gen NPR1 en Persea. AC IÓ. N. americana var hass “palto”, lo que en el futuro facilitará la búsqueda de ejemplares. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. genéticamente resistentes a patógenos.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y MÉTODOS 1. Material Biológico. AC IÓ. N. El material biológico correspondió a hojas tiernas de Persea americana var hass “palto” de un tamaño aproximadamente de 8 a 10 cm que fueron. UN IC. recolectados mediante un muestreo aleatorizado simple de los lotes 2025 y. M. 2026 del fundo Fruzol de la empresa agroindustrial Camposol, ubicado en. CO. Virú, y que fueron transladas en bolsas de polipropileno, depositadas en un. ÁT. IC. A. Y. cooler a condiciones de -0°C (Anexo1).. RM. 2. Métodos y Técnicas. IN FO. 2.1 Diseño de primers Degenerados. Se realizó tomando en cuenta las secuencias de los genes de interés. DE. NPR1 ya publicados en la base de datos del National Center for. AS. Biotechnology Information (NCBI). 40. de diferentes especies como Musa. SI ST. EM. acuminata, Ipomoea batatas, Capsicum annum, Nicotiana glutinosa, Oriza sativa, Populus trichocarpa; luego las secuencias se guardaron en formato. DE. FASTA, para realizar un alineamiento múltiple de éstas en el programa. N. MEGA 5, posteriormente se identificó las regiones altamente conservadas,. CC. IO. las que se llevaron al programa PRIMER 341 para obtener los iniciadores. DI. RE. candidatos a condiciones de 55-65°C de Temperatura de melting y 40-60% de concentración de guanina. Posteriormente, se llevo al programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)42 para comprobar el grado de similitud con las secuencias de la base de datos.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla N°1. Iniciadores diseñados mediante el programa Primer 3 para amplificar una secuencia parcial del gen NPR1 en Persea americana var hass “palto”. Gen en estudio. N. Secuencia 5' - 3'. AC IÓ. Sentido L(Left) R(Right) L R. AACACGTNAAGAGRATACAYAGRGC CYCTTCTTTCWGCTTGCTCYA. NPR1. UN IC. Nombre del iniciador NPR1-L2 NPR1-R1. CO. M. 2.2 Extracción de ADN de hojas de Persea americana vas hass “palto”. Y. El ADN fué extraído de hojas tiernas siguiendo el protocolo de. IC. A. extracción de ADN genómico a pequeña escala (CIP 1997, modificado), para. ÁT. lo cual, se colocó 0.1 gr en un mortero agregándole nitrógeno líquido y. RM. macerándose hasta su pulverización durante un tiempo de 3 minutos; luego. IN FO. fueron colocados en un microtubo eppendorf de 1.5 ml y se agregó 750 µl. DE. Buffer de extracción CTAB 2X (bromuro de hexadecil-trimetil-amonio). AS. (Himedia) para precipitar polisacáridos; y 2µl de β-mercaptoetanol (Gibco). EM. luego, se incubó a 65°C durante 1 hora en baño María modelo WNB7 marca. SI ST. Memmert y se dejó enfriar a temperatura ambiente por 5min. Posteriormente, se agregó 700 µl de una solución de Cloroformo : Alcohol Isoamílico (24:1). DE. (Merck) homogenizando ligeramente y se centrifugó a 14000 rpm durante 15. IO. N. min en una centrifuga (Mini Spin Eppendorf AG). Se transfirió el. DI. RE. CC. sobrenadante a un nuevo microtubo agregándose 75µl CTAB 10X (0.5M EDTA, 1M NaCl, 1M Tris HCl). Se agregó 700 µl de Cloroformo Alcohol Isoamílico (24:1) (Merck) homogenizando suavemente, se centrifugó a 14000 rpm x 15 min, se transfirió el sobrenadante a un nuevo microtubo eppendorf de 1.5 ml; luego se agregó 500 µl de Isopropanol (Merck), agitándose. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. suavemente, se incubó a -20°C durante 1 hora volviéndose a centrifugar a 14000 rpm durante 10 min. Se decantó el Isopropanol con cuidado de no eliminar el pellet. El ADN fue precipitado con 400 µl de Etanol al 70%, se. AC IÓ. N. centrifugó a 14000 rpm durante 10 min, se eliminó cuidadosamente el Etanol. UN IC. (Merck), se secó el pellet durante 10 min y el ADN fue resuspendido en 50 µl de buffer TE (10:1) previamente calentado a 65°c... CO. M. El ADN fue tratado con 1 µl de ARNasa (Sigma) e incubado a. Y. 37°C en un termostato (Marca Merck Modelo Thermo Stat plus) por 1 hora. ÁT. IC. A. para eliminar todo resto de ARN (Anexo2).. RM. 2.3 Determinación de la Calidad y cuantificación del ADN de Persea. IN FO. americana var hass “palto”. cuantificación. del. ADN. se. realizó. mediante. el. AS. La. DE. 2.3.1 Cuantificación de ADN total. EM. espectrofotómetro (Genesys 10 Bio Thermo Scientific), utilizando el rango. SI ST. de luz UV. Debido a los anillos presentes en las bases nitrogenadas del. DE. ADN, esta molécula tiene absorbancia máxima a 260 nm. Para determinar. N. pureza, se utilizó la razón de ADN/proteínas. La abundancia de proteínas. (calidad y pureza) es aquel cuya razón ADN/proteínas (A260/A280) es de 1.7 a 2.0.. DI. RE. CC. IO. residuales se determinó midiendo absorbancia a 280nm. Un buen ADN. Para el efecto se transfirió 2µl de ADN a un microtubo eppendorf y se añadió 98 µl de T.E (Tris-Edta) y se homogenizó ligeramente, luego se agregó 100 µl de T.E como una solución blanco a una de las celdas del 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. espectrofotómetro y 100 µl de la muestra a la otra celda y así se determinó la absorbancia de cada muestra a 260 y 280 nm (Anexo3).. AC IÓ. N. 2.3.2 Electroforesis de ADN en gel de agarosa La calidad y la integridad del ADN se determinaron mediante el. UN IC. corrido electroforético utilizando un gel de agarosa 1%, un control de. M. extracción con todos los reactivos, pero sin ADN molde, se usó para. Y. CO. determinar una posible contaminación en las muestras amplificadas.. IC. A. Preparación de Gel Agarosa 1%. RM. ÁT. Fueron pesados 1.2gr de agarosa (Seakem®) en una balanza. IN FO. analítica (Radwag, modelo XA 160) y luego fueron diluidos en 120 ml de TAE (Tris + Ac. Glacial acético + EDTA) (Promega). Se llevó al. DE. microondas (Samsung) por 1.5 min aproximadamente. Se dejó enfriar 20. AS. minutos a T° ambiente. Se agregó 6µl de Bromuro de Etidio (Promega), se. EM. homogenizó y se virtió el contenido en un molde evitando la formación de. SI ST. burbujas. Se dejó solidificar por 30 min aprox.. DI. RE. CC. IO. N. DE. Visualización de bandas electroforéticas Para el efecto se tomó 5 µl de ADN genómico y 1µl de 6X DNA. Loading- Dye (Fermentas), luego se cargó a un gel de agarosa al 1%. El corrido electroforético se realizó en cámaras horizontales (Labnet) a 80V durante 30 min y fuente de poder (Consort) (EV243), se utilizó como tampón de corrida una solución TAE 1X, y se observó en el transiluminador UV (Biometra UV Star 312nm). El ADN de buena calidad. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. apareció como una banda compacta de alto peso molecular sin restos de degradación. (Anexo 4). AC IÓ. var hass “palto” por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). N. 2.4 Amplificación de la secuencia parcial del gen NPR1 de Persea americana. UN IC. Para la amplificación se utilizaron los primers degenerados NPR1-. M. R1; NPR1-L2; se trabajó en un volumen de 50 μl para cada reacción PCR.. CO. Este consistió en mezclar 5 μl de PCR buffer [10X/μl ], 6 μl de MgCl2 [. A. Y. 25 mM/μl ],1 μl de dNTPs mix [10 mM/μl ], 1 μl de primer forward [ 30. ÁT. IC. pM/μl ],1 μl de primer reverse [ 30 pM/μl 34.75 μl de agua ultra pura, 0.25. RM. μl de Taq DNA polimerasa [ 5 U/μl ] y 1μl de ADN; en efecto, se siguió el. IN FO. mismo procedimiento para 18S (control interno), control negativo (todo el mix sin ADN). La amplificación se realizó en un termociclador (Veriti 96-. DE. Applied Biosystems) y las condiciones del programa fue 95 °C por 5. EM. AS. minutos seguido de 40 ciclos de 95°C por 40 segundos, 58°C por 45. SI ST. segundos, 72°C por 45 segundos seguido de una extensión de 72°C por 9 minutos, finalmente a 4°C, las muestras fueron conservadas a -20°C hasta. DE. su posterior uso (Anexo 5).. DI. RE. CC. IO. N. Tabla 2. Especificaciones de la amplificación de ADN de Persea americana vas hass “palto” por la reacción de la cadena de la polimerasa (PCR).. Etapas Desnaturalización inicial Desnaturalización Annealing Extensión Extensión final ciclo. Temp( °C) 95 95 58 72 72. Programa Tiempo 5 min. 40 seg. 45 seg. 45 seg. 9 min. 40. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.5 Electroforesis de la secuencia parcial del gen NPR1 La separación electroforética se realizó en un gel de agarosa al 1,5% en un buffer TAE 1X corrido a 80 volts por 45 minutos. Se utilizó. AC IÓ. N. marcador de peso molecular (100 pb) al igual que controles positivos. UN IC. (18S) y negativos (todo el mix sin el ADN). Estos geles fueron visualizados en un transiluminador de luz UV y documentados mediante. CO. M. un fotodocumentador Biorad® Modelo Universal Hood III.. Y. 2.6 Preparación de la muestra para la secuenciación. IC. A. Los productos obtenidos de la amplificación y separados por. ÁT. electroforesis fueron diluidos en agua ultrapura a una concentración de. RM. 1/10, 1/6 en función a la intensidad del amplicón observado en el gel de. IN FO. agarosa; luego, fueron enviados para el secuenciamiento respectivo junto. DE. con los primers, a la compañía Macrogen Corp. en Maryland, E.U.A. Los. AS. resultados fueron remitidos vía correo electrónico en formato pdf (Anexo. EM. 6, 7). La lectura y el análisis de la secuencias se realizaron con los. SI ST. programas Blast Nucleotide and National Center for Biotechnology. DI. RE. CC. IO. N. DE. Information (NCBI) disponible en http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/ .. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS Los resultados obtenidos del análisis espectrofotométrico realizados a cada. AC IÓ. N. una de las muestras de ADN extraída se muestran en la (tabla 3), donde la calidad del ADN estuvo comprendida entre un valor 1.4 y 2.6 (A260/A280). Siendo los. UN IC. individuos 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31. 32, 33, 34, 37, 38,. M. 39, 40, 41, 42 y 43 los que presentaron valores comprendidos en el rango óptimo de. CO. 1.7 a 2.0.. A. Y. En la figura N°1 se observa el patrón de bandas de ADN de 43 muestras de. ÁT. IC. hojas de Persea americana var hass “palto” separados por electroforesis, en donde se. RM. muestran bandas definidas , con ausencia de degradación, en los individuos 1, 11,. IN FO. 13, 14, 24, 25, 27, 29, 30, 31, 38, 39, 40, 41, 42 y 43; así también, bandas tenues de. DE. los individuos 2,3, 4, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 16, 26, 28, 32, 33, 34, 35, 36 y ausencia de. AS. bandas en los individuos 5, 6 , 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 37.. EM. En la figura Nº 2 se muestran las bandas electroforéticas de la amplificación. SI ST. del ADN por PCR obtenidas con los juegos de primers NPR1-R1 , NPR1-L2 y 18S. DE. donde se observa que hubo amplificación del ADN de 31 individuos, de los cuales. N. los individuos 1, 3, 4, 7, 9, 10, 24, 28, 35 y 36 mostraron bandas tenues. También se. CC. IO. observó que no amplificó ninguno de los controles negativos. El tamaño de los. DI. RE. fragmentos obtenidos estuvo en el rango de 355 y 450 pb. En la figura N° 3 se muestra la secuencia parcial del gen NPR1 que consta de. 420 pb.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. El análisis en BLAST muestra un 100% de similitud de la secuencia parcial del gen NPR1 en estudio con genes NPR1 de diferentes especies de plantas como. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. Nicotiana glutinosa, Carica papaya, Theobroma cacao, Oriza sativa (Figura 4).. N. Vitis vinífera, Brachipodium tabacum, Nicotiana tabacum, Capsicum annum,. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla N°3: Valores de. Pureza de ADN extraídas de hojas de Persea. americana var hass “palto” obtenidos por espectrofotometría. 8.70 4.25 5.55 4.80 1.20 3.00 11.25 5.90 5.50 5.45 11.60 12.40 28.55 7.70 12.0 31.65 3.90 3.25 3.95 3.40 9.50 3.15 7.40 9.15 21.15 23.20 19.05 14.60 21.30 22.45 20.65 12.25 10.50 11.90 11.90 9.85 4.40 22.10 8.70 10.30 8.90 6.50 18.10. CO. Y A IC ÁT. RM. IN FO DE. AS. EM SI ST DE N IO CC RE DI. AC IÓ. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43. Ratio 260/280 2.17 2.40 2.52 2.52 1.40 1.60 2.29 2.26 2.20 2.66 2.00 2.00 1.98 1.86 1.89 1.97 1.60 1.66 2.57 2.40 2.33 1.65 2.17 1.96 1.81 1.93 1.90 1.88 1.99 1.98 1.97 1.85 1.86 2.00 2.43 2.00 1.6 3 1.75 1.95 1.83 1.86 1.86 1.93. UN IC. Conc. ug/ml. M. Muestra. N. expresadas en la razón de absorbancia 260/280.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. M. UN IC. AC IÓ. N. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 ….. ….. ….. …. ….. ….. ….. ….. …. ….. ….. …. ….. ….. ….. …. ….. ….. …. …... 39 ……….. 40 41 ………. ………. 42 ………. 43 ……... C.E ……….. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. 37 38 ……….. ………. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 ……. …… …… ….. ….. ….. …… …… ….. …… ….. …… …… ……. …… ……. Figura N°1: Calidad de ADN extraído de hojas Persea americana var hass “palto” de 43 muestras mediante la técnica de electroforesis en un gel de agarosa al 1%. C.E= control de extracción.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2. 3. 4. 5. 6. 21. 22. 23. 36. 37. 7. 8. 9. 25. 26. 10. 11 12. 13 14 15. 16. 17. 18 19. 20. 24. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. AS. 35. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 18S. C.E. C.N. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. MP. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. MP. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. MP 1. Figura N°2: Amplificación de ADN por PCR con el primer NPR1-R1 , NPR1-L2 y el control interno 18S en un gel de agarosa al 1.5% , MP (Marcador de peso molecular 100pb), C.E(control de extracción ), C.N( control negativo carente de ADN molde). 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) UN IC AC I. Ó. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. SI ST. EM. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC A. Y. CO. M. ACACGTGAAGAGGATACACAGGGCTCTTGATTCTGATGATGTCGAACTATTGAGG ATGTTGCTGAAGGAGGCACCAATTACTTTGGACGATGCATATGCACTGCACTATGC AGTGGCATATTGTGACTCAAAAGTTACCGCAGAACTTCTAGATATCGGGCTTGCTG ACGTTAATCATAAAAATCCTAGGGGATACACCGTACTCCACTTAGCTGCTATGAGG AGAGACCCTAAAATCATTGTGTCTCTTCTAACAAAGGGGGCTCGGCCATCGGAGCG CACCTCAGATGGAAGGAATGCACTTCAAATATCCAAGAGGCTCACCAAGTTTGCG GATTACTACACGCCTACTGAAGAAGGAATGGCTTCTCCAAAGGACCGATTGTGTAT AGAGATTTTGGAGCAAGCAGAAAGAAGAGA. DI RE. CC I. O. N. DE. Figura N°3: Secuencia parcial del gen NPR1 en Persea americana var hass “palto”constituido de 420 pb.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) SI ST. EM. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC A. Y. CO. M. UN IC AC I. Ó. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DE. Figura N°4: Similitud de la secuencia parcial del gen NPR1 de Persea americana vas hass “palto” con los genes NPR1 de diferentes. DI RE. CC I. O. N. especies de plantas mediante el análisis del programa bioinformático BLAST.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSIÓN El desarrollo de métodos moleculares ha llevado a la necesidad de desarrollar más simples y eficientes pero a. su vez. AC IÓ. N. metodologías de extracción de ADN. UN IC. adaptadas a la especies en estudio.. En referencia a la calidad de ADN de Persea americana var hass “palto”. CO. M. mostrado en la tabla Nº 3, se observa que las muestras de los individuos 1, 2, 3, 4, 7,. Y. 8, 9, 10, 19, 20, 21, 23 y 35 presentan valores superiores a 2.0, lo que significaría. IC. A. que hay ARN disperso; en tanto las muestras de los individuos 5, 6, 18 y 22. ÁT. presentan valores inferiores a 1.7; lo que indicaría, contaminación con proteínas,. RM. fracciones de membranas o fenol. De otro lado, en el resto de los individuos se. IN FO. encontraron valores óptimos de 1.7 a 2.0 en relación a la Absorbancia a 260 nm y. DE. 280 nm; lo que reflejaría el buen estado de pureza del ADN, libre de contaminantes. AS. celulares43.. EM. La visualización de bandas electroforéticas de ADN con mayor intensidad así. SI ST. como tenues mostrado en la Figura 1, está directamente relacionado con la calidad,. DE. pues , a mayor tamaño de banda y definición en el gel entonces la calidad del ADN. N. extraído es mayor; bandas de tamaño pequeño y difuminadas en el gel indican mala. CC. IO. calidad del ADN y un alto grado de degradación (Smear)44; lo que se debería a. RE. factores que afectan la calidad del ADN como las variaciones del pH, temperatura,. DI. actividades nucleasas (que pueden llevar a una escisión de los fragmentos del ADN),. errores en la etapa de lisis y en la remoción de contaminantes como proteínas, polisacáridos, componentes fenólicos (que actúan como inhibidores de la extracción) y contenidos grasos de las hojas45,46;es por ello, que diversos autores han resaltado la. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. importancia de la selección de un método adecuado de extracción del ADN para obtener resultados confiables en los estudios de variación molecular en plantas47.. N. La amplificación de la secuencia parcial del gen NPR1 en Persea americana. AC IÓ. var hass “palto” está determinado por factores como la temperatura de hibridación y. UN IC. el número de ciclos. La temperatura de hibridación es específica para cada pareja de. M. primers en base a su composición nucleotídica. A elevadas temperaturas se. CO. disminuye la estabilidad de la hibridación entre el ADN molde y el primer; en. Y. cambio, a bajas temperaturas, ambas moléculas se alinean de manera más estable,. IC. A. pero permite hibridar secuencias que no sean complementarias, lo que proporcionará. RM. ÁT. amplificaciones inespecíficas. Por lo cual, es necesario tener el conocimiento teórico. IN FO. de la temperatura de hibridación de los primers48.. DE. En consecuencia, para evitar resultados negativos debido a inhibiciones de la reacción de amplificación o degradación de la muestra, se introduce un juego de. EM. AS. primers 18S que es el gen de la unidad ribosomal 18S que amplifica una región de. SI ST. ADN que está presente en todos los individuos49. También se emplean controles negativos, como el control de extracción, que permite evaluar eficiencia en la. DE. extracción de ADN y el control de PCR, que, en este estudio, muestra ausencia de. CC. IO. N. bandas en el gel de agarosa, lo que indica la ausencia de contaminación50.. RE. En la amplificación del ADN por PCR con el juego de primers NPR1-R1,. DI. NPR1-L2, mostrado en la figura 2, se observa que las muestras de los individuos 1, 3, 4, 7, 9, 10, 28, 35 y 36 presentan una amplificación disminuida evidenciado por bandas electroforéticas tenues, esto se debería a diversos factores como a la baja estabilidad del ADN, lisis insuficiente de los tejidos, desnaturalización de la ADN. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. polimerasa o quelación de los iones magnesio requeridos en la reacción 51. Por otro lado, están los contaminantes procedentes del propio proceso de extracción de ADN. N. que pueden llegar a inhibir las reacciones de PCR.. AC IÓ. De otro lado, las bandas electroforéticas bien definidas, con mayor grosor e. UN IC. intensidad de las muestras de los individuos 11, 12, 13, 14, 15, 16, 24, 25, 26, 27, 29,. M. 31, 32, 33, 34, 38, 39, 40, 41, 42 y 43 (figura 2) evidencian una buena amplificación. CO. del ADN la que está relacionada a condiciones adecuadas de los componentes del. Y. master mix y a una buena extracción de ADN. Es por ello que la calidad y cantidad. IC. A. de ADN son condiciones indispensables para garantizar la correcta amplificación de. RM. ÁT. la secuencia parcial del gen NPR152.. IN FO. La no amplificación del ADN de los individuos 5, 6, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23,. DE. y 37 que se evidencia por la ausencia de bandas electroforéticas (figura 2) se debería a la falta de material genético por errores en el proceso de la extracción de ADN. EM. AS. (figura 1) como es una probable lisis ineficiente debido a la elevada concentración de. SI ST. polisacáridos de la muestra53.. DE. La no amplificación del ADN de los individuos 2, 8 y 30 que se evidencia por. N. la ausencia de bandas electroforéticas (figura 2), a pesar de tener material genético. CC. IO. (figura 1), probablemente se debería a alteraciones de la secuencia nucleotídica en la. RE. región flanqueada por los primers usados en la identificación de la secuencia parcial. DI. del gen NPR1 , lo que conllevaría a la ausencia de anillamiento específico con una consecuente ausencia de amplificación de ADN. Estas alteraciones o mutaciones afectarían a la capacidad inherente de la planta a la resistencia a patógenos, tal como se demostró en Arabidopsis en el que se identificó un gen NPR1 mutante incapaz de. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. activar la expresión de genes de defensa PR haciendo a las plantas más susceptibles a patógenos. 26. .. N. La secuenciación de los productos de PCR tiene por objetivo identificar. AC IÓ. diferencias en la cadena de oligonucleótidos que permita distinguir la especie en. UN IC. estudio, lo que requiere la utilización de programas bioinformáticos, necesarios para. M. la secuenciación de los fragmentos generados por el juego de primers NPR1-R1,. CO. NPR1-L2 considerados en este estudio. Dicha secuenciación permitió identificar la. Y. secuencia parcial del gen NPR1 en Persea americana var hass “palto” , la que se. IC. A. encuentra constituída por 420 pb (figura 3) y que comparativamente es menor al. RM. ÁT. tamaño completamente secuenciados de genes NPR1 en Vitis vinífera (1989 pb)54,. IN FO. Brachipodium tabacum (1752 pb)55, Nicotiana tabacum (2027 pb)56, Nicotiana glutinosa (1935 pb)37, Nicotiana attenuata (1767 pb)57, Capsicum annum (2191. DE. pb)34, Theobroma cacao (4880 pb)58 y Oriza sativa (4279 pb)38.. EM. AS. Cuando se comparó esta secuencia parcial del gen NPR1 en Persea. SI ST. americana var hass “palto” con secuencias de otras especies, mediante el programa bioinformático BLAST, se observó la similitud en un 100% con Vitis vinífera,. DE. Brachipodium tabacum, Nicotiana tabacum, Capsicum annum, Nicotiana glutinosa,. IO. N. Carica papaya, Theobroma cacao, Oriza sativa (figura 4), Por lo tanto las bandas. CC. (amplicones) observados realmente correspondieron a la secuencia parcial del gen. DI. RE. NPR159.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIONES. AC IÓ. consta de 420 pb utilizando el juego primers NPR1-R1, NPR1- L2.. N. La secuencia parcial del gen NPR1 de Persea americana var hass “palto”. La secuencia parcial del gen NPR1 de Persea americana var hass “palto”. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. muestra similitud con los genes NPR1 de diferentes especies vegetales.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Tenorio M, Manual para el cultivo del Palto. CIDAB-SB379.A9-T4m Perú:. AC IÓ. N. INICTEL –UNI; 2007.. UN IC. 2. Cronquist Arthur, Botánica Básica, Editorial Continental. México; 1978.p. 256 –. CO. M. 267.. A. Y. 3. Vidal Fernández J. Efecto de factores Físico Químicos sobre la actividad. ÁT. IC. microbiana de la rizósfera del Aguacatero (Persea americana Mill) para el. RM. control de Phytophthora cinnamomi (Rands). [Tesis Doctoral]. México:. IN FO. Universidad de Colima; 2002.. AS. SI ST. EM. Agricultura; 2002.. DE. 4. Maza y Silipú S. Estudio de palta en el Perú y el Mundo, Ministerio de. 5. Sánchez Pérez J. Identificación de marcadores asociados a la resistencia del. DE. aguacate raza mexicana (Persea americana mill. var. drymifolia) al oomiceto. IO. N. Phytophthora cinnamomi rands. [Tesis Doctoral]. México: Universidad. RE. CC. Michoacana de San Nicolás de Hidalgo (UMSNH); 2007.. DI. 6. Tamayo J, Enfermedades del Aguacate. POLITÉCNICA No. 4 Medellín, mayojulio de 2007, pp. 51-70.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 7. Aguilar rivera X, Optimización del protocolo de extracción de ADN de Mycosphaerella fijiensis Instituto tecnológico de Costa Rica-Corporación. AC IÓ. N. Bananera Nacional S.A, 2006.. CO. M. 16S. 2008 Universidad Nacional Autónoma de México.. UN IC. 8. Mauricio J M, Herrera C. Filogenia bacteriana mediante el análisis del RRNA. Y. 9. G.A. Llano, E. Álvarez, J.E. Muñoz, M. Fregene. Identificación de genes. IC. A. análogos de resistencia a enfermedades en yuca (Manihot esculenta Crantz) y su. ÁT. relación con la resistencia a tres especies de phytophthora. ACAG Vol 53, No 1. IN FO. RM. (2004). DE. 10. Rivas F. Análisis de la expresión del gen PR-1, mediante la técnica de PCR en. AS. tiempo real (RT-PCR), en tomate (Solanum lycopersicum) infectado con. EM. Phytophtora infestans [Tesis Pregrado].España: Escuela politécnica del ejército. SI ST. 2010.. DE. 11. Bernaola Alvarado L. Caracterización molecular de la resistencia al tizón tardío. IO. N. en Solanum paucissectum ochoa (Solanaceae) mediante el uso de la técnica NBS. de San Marcos; 2008.. DI. RE. CC. y marcadores para loci candidatos. [Tesis Pregrado]. Perú: Universidad Mayor. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 12. Colon L, Budding D, Keizer P, Pieters M. Components of resistance to late blight P. infestans in eight South American species. European Journal of Plant. AC IÓ. N. Pathology; 1995, 101:441-456. UN IC. 13. Stange C, Briceño E, Latorre B, Johnson P. Interacción planta-patógeno Chile. CO. M. capitulo XIII 2007. Y. 14. Federspiel N, Lammers A, Liu L, Bates S, Westerlund C, Fitch J, inventors;. IC. A. Agrinomics LLC. Generation of plants with improved pathogen resistance and. RM. ÁT. drought tolerance. US patenten 7834241. 2010 Nov 16.. IN FO. 15. Simbaqueba J, Aplicada mapeo de genes candidatos involucrados en inducción. DE. de resistencia sistémica y promoción de crecimiento por Trichoderma. EM. AS. koningiopsis (th003) en tomate. [Tesis Magistral].Colombia: Unimilitar ; 2009.. SI ST. 16. Maleck K, Levine A, Euglem T, Morgan A, Schmid J, Lawton A et. al. The transcriptome of Arabidopsis thaliana systemic acquired resistance. Nature. IO. N. DE. Genetics 2000; 26:403-10.. Engineering disease resistance in plants. ISBN 2007; 90-8504-567-3. DI. RE. CC. 17. Custers JH, General introduction: engineering disease resistance in plants. En:. 18. Hui C, Glazebrook J, D Clarke J, Volko and Dong , The Arabidopsis NPR1 Gene That Controls Systemic Acquired Resistance Encodes a Novel Protein Containing Ankyrin Repeats. Cell Press 1997 Jan10; 88,(1):57-63.. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 19. Moreno A. Aplicaciones biotecnológicas del gen afp (Antifungal Protein) de Aspergillus giganteus para la protección de plantas frente a infección de. UN IC. AC IÓ. N. patógenos. [Tesis Doctoral].España:2006.. 20. Kinkewa M, Fan W, Dong X. Nuclear Localization of NPR1 is required for. Y. CO. M. Activation of PR gene expression. The plant cell, 2000, vol 12,2339-2350.. RM. ÁT. plantas. San josé, C.R;(IICA); 2010.p.63-73.. IC. A. 21. Riveros A, Moléculas señalizadoras involucradas en la resistencia inducida en. IN FO. 22. Fan W. and Dong X. In vivo interaction between NPR1 and transcription factor. EM. AS. Cell 2002; 14, 1377-89.. DE. TGA2 leads to salicylic acid-mediated gene activation in Arabidopsis.. Plant. SI ST. 23. Rangel S, Castro M, Beltrán, Reyes H y García Pineda E. El ácido salicílico y su participación en la resistencia a patógenos en plantas. Biológicas, Diciembre. CC. IO. N. DE. 2010; 12(2): 90 – 95.. DI. RE. 24. Nieva B, Aislamiento y caracterización funcional de dos factores de transcripción bZIP de maíz [Tesis Doctoral] España: Universidad de Barcelona División de Ciencias Experimentales y Matemáticas; 2003.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 25. Stange C. Interacción planta-virus durante el proceso infectivo. Cien. Inv. Agr. 2006; 33(1): 3-21.. UN IC. AC IÓ. N. 26. Dong X. NPR1 all things considered. Elservier 2004,7:547-552.. 27. Jordán M, Casaretto J. Hormonas y Reguladores del Crecimiento: Etileno, Ácido. CO. M. Abscísico, Ediciones Universidad de La Serena, La Serena, Chile (2006) 16:06. IC. A. Y. Capítulo XVI.. ÁT. 28. Madriz, Ordeñana K. Mecanismo de defensa en las interacciones planta-. IN FO. RM. patógeno. Manejo integrado de plagas 2002; 63:22-32.. DE. 29. Zacarés L. Nuevas aportaciones al metabolismo secundario del tomate.. Pseudomonas. syringae. pv.tomate. [Tesis. Doctoral].. España:. EM. con. AS. Identificación y estudio de moléculas implicadas en la respuesta a la infección. SI ST. Universidad Politécnica de Valencia; 2008.. DE. 30. Chern M, Fitzgerald HA, Canlas PE, Navarre DA and Ronald PC.. IO. N. Overexpression of rice NPR1 homolog leads to the constitutive activation of the. 2005 jun; 18(6):511-520.. DI. RE. CC. defense response and hypersensitivity to light.2005. Mol. Plant Microbe Interact;. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 31. Diqiu Yu, Chunhong Chen, and Zhixiang Chen. Evidence for an Important Role of WRKY DNA Binding Proteins in the Regulation of NPR1 Gene Expression.. AC IÓ. N. The Plant Cell; 2001 July, Vol. 13, 1527–1539.. UN IC. 32. Diaz R , Tonello U, Martinez G, Salazar S, Chalfoun N, Vellicce G and et al. Aproximaciones biotecnológicas para un manejo sustentable del estrés fúngico. CO. M. en la agricultura. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 2009 parte V.cap8.. IC. A. Y. p.467-480.. ÁT. 33. Gil Morrió MJ. Disección genética del mecanismo de resistencia frente a. RM. patógenos biótrofos mediado por el gen CSB3 en Arabidopsis thaliana [Tesis. DE. IN FO. Doctoral]. España: Universidad Politécnica de Valencia; 2005.. AS. 34. Luo H, Duan C, Chen B, Tang J and Feng J. Cloning of full length cDNA of its RNAi expression vector and its. EM. pepper CaNPR1 gene, construction of. SI ST. transformation for pepper. College of Life Science and Technology, Guangxi. DE. University, 75 Xiuling Road, Nanning, Guangxi 530005,P.R.China ,2006.. IO. N. 35. Chen G, Zhou Y and Pan D. Cloning of full length cDNA of sweet potato NPR1. DI. RE. CC. gene. College of Life Science, Fujian ;2006.. 36. Endah R, Beyene G, Kiggundu A, van den Berg N, Schluter U, Kunert K. and Chikwamba R. Elicitor and Fusarium-induced expression of NPR1-like genes in banana. Plant Physiol Biochem, 2008; 46 (11), 1007-1014.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 37. Zhang Y, Shi J, Liu JY, Zhan Y, Zhang JD and Guo XQ. Identification of a novel NPR1-like gene from Nicotiana glutinosa and its role in resistance to. AC IÓ. N. fungal, bacterial and viral pathogens. Plant Biol (Stuttg), 2010;12 (1), 23-34. UN IC. 38. Feng JX, Cao L, Li J, Duan CJ, Luo XM., Le N et al; Involvement of OsNPR1/NH1 in rice basal resistance to blast fungus Magnaporthe oryzae. Plant. Y. CO. M. Pathol. 2011 131 (2), 221-235.. IC. A. 39. Tuskan GA, Difazio S, Jansson S, Bohlmann J, Grigoriev I, Hellsten U, and col,. ÁT. The genome of black cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. & Gray) Science. IN FO. RM. 2006; 313 (5793), 1596-1604.. 04. de. Marzo. del. 2012].. URL. disponible. en:. AS. acceso. DE. 40. National Center for Biotechnology Information (NCBI) nucleotide; [fecha de. SI ST. EM. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/. 41. Primer 3 (v.0.4.0) Pick primers from ADN sequence [fecha de acceso 10 de. IO. N. DE. Marzo del 2012].URL disponible en :http://www.frodo.wi.mit.edu/primer3/. DI. RE. CC. 42. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), nucleotide blast [Fecha de acceso 12. de. Marzo. del. 2012].. URL. disponible. en. :. URL:http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(45) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 43. Huescas Minerva, Comparación de diferentes técnicas de extracción de ADN aplicadas a Quercus eduardii Trel. [Tesis Pregrado] México: Universidad. AC IÓ. N. Autónoma Chapingo, 2004.. UN IC. 44. Almeida I, Gratero L, Osorios G, Ramis C, Bedoya A, Figueroa R, Molina S, Infante D, Método modificado de obtención de ADN genómico en orquídeas. CO. M. (Cattleya sp.) para amplificación con marcadores moleculares. Bioagro 23(1):. IC. A. Y. 27-34. 2011.. ÁT. 45. Palacios David. Comparación de diferentes métodos de extracción de ADN para. RM. la detección de transgénicos en alimentos mediante la tecnología PCR [Tesis. DE. IN FO. Magistral] España: Universidad de Burgos 2008.. AS. 46. Solano F, Márquez C, Schuler I. Optimización de la extracción de ADN de. EM. Passiflora ligularis para el análisis por medio de marcadores moleculares;. SI ST. Universitas Scientiarum, 2009, Vol. 14 N° 1, 16-22.. DE. 47. Andreu L, Luna M, López R. Determinación del método de extracción de ADN. IO. N. óptimo para el desarrollo de la técnica RAPD en megagametófitos de Pinus. DI. RE. CC. Hartwegii Lindl. Foresta Veracruzana 2003, año/vol.5, número 001 pp.43-48.. 48. Chacón L, Barrantes K, García C, Achí R; Estandarización de una PCR para la detección del gen invA de Salmonella spp. en lechuga. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología 2010; 30:18-23.. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(46) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 49. Arango J, Análisis de expresión de los genes de la ruta biosintética de carotenos, y cuantificación de carotenos en hojas y raíces de plantas de yuca a diferentes. La reacción en cadena de la polimerasa a dos décadas. UN IC. 50. Rodríguez I, Barrera H,. AC IÓ. N. edades. [Tesis Pregrado] Colombia: Pontificia Universidad Javeriana 2006.. CO. M. de su invención, Ciencia UANLvol.VII, nº 3, julio-septiembre 2004.. Y. 51. Rodríguez M, Utilización de técnicas genéticas (PCR y PCR cuantitativo en. IC. A. tiempo real) e inmunológicas (Elisa), para la detección y cuantificación de. ÁT. diferentes especies animales en Foie Gras. [Tesis Doctoral] España: Universidad. IN FO. RM. Complutense de Madrid ISBN: 84-669-2689-5. 2004.. DE. 52. Bustamante J, Astudillo M, Pazos A, Bravo L, Evaluación de dos métodos de. AS. extracción de ADN a partir de Biopsias fijadas en formalina y embebidas en. SI ST. EM. parafina en condiciones no óptimas. Acta biol. Colomb., 2011Vol. 16 N.º 2.. 53. Dorado G, Amplificación de DNA mediante PCR (Reacción en cadena de la. CC. IO. N. DE. Polimerasa) Severo Ochoa, 2010, 14071-Córdoba.. DI. RE. 54. National Center for Biotechnology Information (NCBI) nucleotide; [fecha de acceso 21 de Agosto del 2012]. PREDICTED: Vitis vinifera regulatory protein NPR1-like (LOC100250996), mRNA. Accesión: XM_002281439.2 URL disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..