Actividad leishmanicida in vitro de los extractos de la hoja de clinopodium taxifolium (kunth) govaerts (chinininga) sobre leishmania (v) peruviana”

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(1)IC. A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UÍ. M. “ACTIVIDAD LEISHMANICIDA in vitro DE LOS EXTRACTOS DE LA. O Q. HOJA DE Clinopodium taxifolium (Kunth) Govaerts (Chinininga). Y. BI. SOBRE Leishmania (V) peruviana”.. AC. IA. TESIS II. DE. DE. FA. RM. PARA OPTAR GRADO ACADEMICO. TE CA. BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUIMICA AUTORES:. BI BL I. O. BELTRÁN SALDAÑA, VANESSA CONSUELO. CAVERO BERNAL, MARÍA YOVANA. ASESOR: M.Sc. HUGO ENRIQUE CASANOVA HERRERA COASESOR: DRA. MBLGO. JUDITH ROLDÁN RODRÍGUEZ TRUJILLO – PERÚ 2011. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTO. A ti PADRE CELESTIAL, nuestro creador, nuestro guía y nuestro ángel. A. por tu inmenso amor,. UÍ. M. IC. por haber iluminado nuestro camino,. O Q. por cuidarnos incansablemente. Y. BI. y por brindarnos fuerzas. FA. RM. AC. IA. para enfrentar adversidades.. BI BL I. O. TE CA. DE. VANESSA y YOVANA. A nuestro asesor:. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. M.Sc. Hugo E. Casanova Herrera Nuestro agradecimiento, respeto y estima, por sus consejos cuando más eran necesarios, los cuales han sido vitales en la realización. A. de este anhelado trabajo de investigación.. M. IC. Gracias por enseñarnos AMAR nuestra. O Q. UÍ. Profesión.. IA. Y. BI. A nuestra co-asesora: Por su colaboración desinteresada y. apoyo incondicional en la realización del trabajo de investigación.. TE CA. DE. FA. RM. AC. Dra. MBLGO. Judith Roldán Rodríguez. BI BL I. O. A LOS SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO Nuestro agradecimiento por su comprensión y ayuda en la elaboración de este informe.. DEDICATORIA. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A NUESTROS PADRES. Quienes nos enseñaron la ética y el rigor que guían nuestro transitar por la vida, por brindarnos la oportunidad de crecer en un hogar lleno de respeto y amor,. A. por ayudarnos a salir adelante.. UÍ. M. hemos llegado a realizar una de nuestras. IC. Porque gracias a su cariño y apoyo incondicional. O Q. tantas metas por cumplir,. Y. BI. por todo ello y mucho más,. AC. IA. estaremos eternamente agradecidas.. BI BL I. O. TE CA. DE. FA. RM. VANESSA y YOVANA. A NUESTRAS FAMILIAS. Por su amor, cariño, comprensión, porque creyeron en nosotras, porque admiramos su fortaleza, porque en gran parte, gracias a ellos vemos realizados nuestros sueños. VANESSA y YOVANA. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A MI HERMANA. HORTENCIA del PILAR Por estar siempre a mi lado, brindándome confianza, ayuda en los momentos más difíciles. Por su cariño y apoyo incondicional,. A. por estar siempre a mi lado,. IC. por compartir mis triunfos y tristezas.. BI BL I. O. TE CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O Q. UÍ. M. Te quiero mucho hermanita.. A FIORELA VANESA Y VICTOR HUGO. Mis grandes amigos incondicionales, siempre acompañándome en las buenas y en las malas, gracias por ser aquellos seres maravillosos que son capaces de inyectarme fuerza y brindarme apoyo, cariño y comprensión.. YOVANA. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A MI HERMANITOS LESLIE Y DAVID Por ser los mejores amigos, siempre aconsejándome y brindándome su amistad. A. y respaldo en cada sueño,. UÍ. M. IC. en cada meta.. O Q. A MIS HERMANOS. a seguir, por estar presentes. en lo buenos y malos momentos,. alentándome a seguir mis sueños.. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. Por ser mi respaldo y ejemplo. TE CA. A MIS AMIGOS. BI BL I. O. Erick, Lucía, Karina, Marcos, John y Natty por ser unas personas maravillosas. Agradezco a Dios por ponerlos en mi camino.. VANESSA. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. JURADO DICTAMINADOR.  M.Sc. GILMER ZARI GIL………………………………PRESIDENTE. O Q. UÍ. M. IC. A.  M.Sc. SEGUNDO RUIZ REYES………………………….MIEMBRO. BI BL I. O. TE CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI.  M.Sc. HUGO CASANOVA HERRERA…………………..MIEMBRO. PRESENTACIÓN. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR. Dando cumplimiento y conformidad a las disposiciones emanadas por el Reglamento de Grados y Títulos vigente de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, queda a vuestra consideración y elevado criterio el presente Informe de Tesis II:. A. “ACTIVIDAD LEISHMANICIDA in vitro DE LOS EXTRACTOS DE LA HOJA. IC. DE Clinopodium taxifolium (Kunth) Govaerts (Chinininga) SOBRE. O Q. UÍ. M. Leishmania (V) peruviana.”. Aprovechamos la oportunidad para expresar nuestros más sinceros agradecimientos a la. BI. plana docente y administrativa de la Facultad de Farmacia y Bioquímica, cuyas. IA. Y. enseñanzas vertidas han contribuido a nuestra formación profesional. También. AC. agradecemos, el apoyo desinteresado de quienes nos han brindado las facilidades y. RM. recursos necesarios para la culminación de este trabajo.. FA. En consecuencia, Señores Miembros del Jurado Dictaminador sometemos el presente. DE. Informe de Tesis II para su respectiva evaluación y veredicto, esperando sea de interés y. TE CA. gran utilidad para la facultad y la sociedad.. BI BL I. O. Trujillo, Agosto del 2011. Atte. Los autores.. RESUMEN. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El presente trabajo de investigación pretende determinar la actividad leishmanicida de la especie Clinopodium taxifolium (Kunth) Govaerts (chinininga) in vitro, para lo cual se seleccionaron ejemplares en óptimas condiciones, de las cuales se obtuvo el extracto de las hojas para luego obtener diluciones al 1, 10, 20, 30% con Dimetil sulfóxido, realizándose el enfrentamiento sobre la cepas de Leishmania (V ) peruviana a una concentración de 1x106 parásitos/mL de acuerdo al método descrito por Muñoz. Se realizaron lecturas microscópicas a las 1, 2, 3, 12 y 24 horas después del. A. enfrentamiento. Observándose buena actividad leishmanicida a partir de la dilución al. UÍ. O Q. 20% y 30% tuvieron buena actividad durante las 24 horas.. M. IC. 10% del extracto alcohólico de hoja a la primera hora del enfrentamiento, las diluciones al. Los resultados que obtuvimos del enfrentamiento in vitro se evaluaron. BI. estadísticamente mediante la Prueba de Probabilidad Exacta de Fisher, según la cual. IA. Y. encontramos los valores de p = 0.004 y p = 0.0476; los cuales nos indican que los. AC. resultados poseen significancia estadística dado que el valor de p < 0.05.. RM. Finalmente concluimos que el extracto de hojas de la especie Clinopodium. FA. taxifolium (Kunth) Govaerts (chinininga) tiene actividad leishmanicida in vitro sobre. BI BL I. O. TE CA. DE. Leishmania (V) peruviana.. PALABRAS CLAVES: Actividad leishmanicida, leishmaniasis, Leishmania (V) peruviana, Clinopodium taxifolium, plantas medicinales.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. This research work was determined the lishmanicidal activity of species Clinopodium taxifolium (Kunth) Govaerts (chinininga) in vitro, for which samples were selected in optimal conditions, which was obtained an extract of the leaves and then obtain dilutions of 1, 10, 20, 30% with dimethylsulfoxide, performing the showdown over the trains on cepas Leishmania (V) peruviana to a concentration of 1x106 parasites/mL. A. according to the method described by Muñoz. Microscopic readings were realized at 1,. IC. 2, 3, 12 and 24 hours after the confrontation good leishmanicial activity observed from. UÍ. M. the 10% dilution of the alcoholic extract of leaf to the first hour of confrontation,. O Q. dilutions 10, 20 and 30% had good activity during 24 hours.. BI. The results we obtained from confrontation in vitro were assessed statistically. Y. using Fisher’s Exact Test, in which we find the values of p= 0.004 and p= 0.0476,. AC. IA. indicating that the results have statistical significance because the value p < 0.05.. RM. Finally it was concluded that the leaf extract of species Clinopodium taxifolium. FA. (Kunth) Govaerts (chinininga) has in vitro leishmanicidal activity on Leishmania (V). BI BL I. O. TE CA. DE. peruviana.. KEY WORDS: Leishmanicidal activity, Leishmaniasis, Leishmania (V) peruviana, Clinopodium taxifolium, medicinal plants.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE Páginas Preliminares: AGRADECIMIENTO…………………………………………………………………...ii DEDICATORIA………………………………………………………………………...iv JURADO DICTAMINADOR……………………………………………………….....vii PRESENTACIÓN……………………………………………………………………..viii RESUMEN……………………………………………………………………………...ix. IC. A. ABSTRACT……………………………………………………………………………..x. UÍ. M. I. ....................................................................................................................... IN. O Q. TRODUCCIÓN…………………………………………………………………1 1. Planteamiento del problema……………………………………………………12. Y. BI. 2. ................................................................................................................ O. IA. bjetivos………………………………………………………………………..12. AC. II....................................................................................................................... M. RM. ETODOS Y PROCEDIMIENTO……………………………………………….14. FA. 1. ........................................................................................................... M aterial……………………………………………………………………21. DE. 2. ........................................................................................................... M. TE CA. étodos……………………………………………………………………22 2.1. Procesamiento de la hoja……………………………………………...14. BI BL I. O. 2.2. Obtención de los extractos………………………..…………………...14 2.2.2. Obtención de las diluciones……………………………………....14. 2.3. Determinación de la Actividad Leishmanicida in vitro……………….15 2.3.1. Obtención de promastigotas……………………………………...15 2.3.1.1. Cultivo………………………………………………….15 2.3.1.2. Preparación de las concentraciones del parásito……….15 2.3.2. Ejecución de la prueba in vitro…………………………………..15 2.3.3. Lecturas………………………………………………………….16 2.4. Identificación de metabolitos secundarios…………………………...16. III. .................................................................................................................... R ESULTADOS……………………………………………………………………19. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV. .................................................................................................................... DI SCUSIÓN……………………………………………………………………….39 V. ...................................................................................................................... C ONCLUSIONES…………………………………………………………………40 VI. .................................................................................................................... R EFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………….41. BI BL I. O. TE CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O Q. UÍ. M. IC. A. ANEXOS. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCION:. Las leishmaniasis son un grupo de enfermedades crónicas, de baja patogenicidad, alta morbilidad, metaxénicas y parasitarias-zoonóticas. de. distribución mundial transmitidas al ser humano por la picadura de alrededor de 30 especies de flebótomos infectados por protozoos del genero Leishmania (Sarcomastigophora, Kinetoplastida) que son capaces de producir. varios tipos de manifestaciones clínicas. de acuerdo con la. capacidad del parasito de proliferar en tejidos profundos o cerca de la. A. superficie y transmitida por hematófagos del género Lutzomyia en el Nuevo. M. IC. Mundo y Phlebotomus en el Viejo Mundo; tiene como reservorio a animales. UÍ. vertebrados como roedores y perros; su ciclo de vida es digenético y/o. O Q. dimórfico, en el que existe un periodo de vida extracelular llamado. BI. promastigote que se multiplica en el tracto alimenticio del mosquito vector,. Y. con 15-25µm de longitud por 2-3 µm de ancho ,y se caracteriza por presentar. AC. IA. un flagelo en la parte anterior. Dentro del hospedero. vertebrado, los. promastigotes inoculados por el vector invaden el sistema. de células. RM. fagocíticas mononucleares (monocitos/macrófagos) presentes en el sitio de la. FA. infección al igual que las células reclutadas durante la respuesta inflamatoria. DE. o que son fagocitadas por ellas. Unas vez intracelulares, los promastigotes se. TE CA. transforman en amastigotes para así sobrevivir y multiplicarse dentro del fagolisosoma de su célula hospedera. Esta forma amastigota tiene un flagelo rudimentario, presenta forma ovalada o redondeada, con un diámetro de 1.5-. BI BL I. O. 5 µm, reside y se multiplica en vacuolas fagolisosómicas de sus macrófagos hospederos. Así destruye a la célula y se liberan las formas infectivas para invadir más células y continuar el ciclo. (Figura A.) 1, 2,3, 4.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 4 5 3 6. 2. 7 1. 9. M. IC. A. 8. UÍ. 15. O Q. 10. 11. IA. Y. BI. 14. 12. AC. 13. FA. RM. Figura A: Ciclo de Leishmania en los hospedadores vertebrado e invertebrado. 2 1.- Promastigotes en capilares sanguíneos después de la picadura del flebótomo. 2.- Fijación y. DE. fagocitación de los promastigotes en un macrófago. 3.- Fusión del fagosoma y lisosoma. 4.Diferenciación del promastigote en amastigote. 5.- Multiplicación de amastigotes en la vacuola. TE CA. parasitófora. 6.- Multiplicación intravacuaolar de amastigotes. 7.- Ruptura del macrófago y liberación de amastigotes. 8.- Fagocitosis de amastigotes libres por otros macrófagos. 9.- Ingestión. O. de macrófagos parasitados cuando el flebótomo ingurgita sangre. 10.- Ruptura del macrófago y. BI BL I. liberación de amastigotes en el tracto digestivo del flebótomo. 11.- Multiplicación de amastigotes y diferenciación en promastigotes. 12.- Multiplicación de promastigotes e inserción de flagelos entre las microvellosidades del endotelio digestivo. 13.- Multiplicación en región pilórica e íleo con flagelos fijándose en la pared. 14.- Promastigotes con los flagelos unidos a la cutílica del intestino interior. 15.- Promastigotes infectivos libres.. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS, 2002); se estima que 350 millones de personas sufren la enfermedad, presentándose anualmente entre 1.5 y 2 millones de nuevos casos, de los cuales solo 600.000 son reportados, de los cuales 1,5 millones corresponden a leishmaniasis cutánea transmitida por dípteros hematófagos. Se estima que el número de personas infectadas sobrepasa los 12 millones. Sin embargo, los datos oficiales. subestiman. la. realidad de. la afección humana por estos. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. protozoarios debido a que gran parte de estos se obtienen exclusivamente a partir de la detección pasiva, numerosos casos no son diagnosticados, y existen un gran número de casos asintomáticos. 5,6,7 Para llegar al diagnóstico de leishmaniasis, primero se debe considerar los antecedentes epidemiológicos. Es importante conocer el lugar de procedencia del paciente, residencias anteriores considerando la permanencia o la visita a áreas endémicas de leishmaniasis, antecedentes ocupacionales. Después de considerar los antecedentes, el otro diagnóstico es clínico, que de acuerdo a. A. las características mencionadas nos inclinaran a definir si se puede tratar de. M. IC. una leishmaniasis cutánea o mucocutánea. Finalmente, para confirmar si se. UÍ. trata de leishmaniasis se procederá al diagnóstico de laboratorio, los cuales se. O Q. agrupan en métodos directos (métodos parasitológicos) y los métodos de. BI. diagnóstico indirecto que son los métodos inmunológicos. El parásito puede. Y. ser demostrado a través del frotís, cultivo, histopatología y a través de la. AC. IA. inoculación en animales. Los métodos indirectos se basan en la detección de la enfermedad a través de la respuesta inmune celular y/o de la respuesta. RM. inmune humoral a través de anticuerpos específicos desarrollados como. FA. consecuencia de la enfermedad: estos incluyen la intradermorreacción de. DE. Montenegro (leishmanina), el método de ELISA/ DOT-ELISA y la. TE CA. inmunofluorescencia indirecta (IFI). Otro aspecto que agrava esta enfermedad es la extrema pobreza en la que viven la mayoría de nuestras comunidades en las zonas rurales y selváticas, donde la presencia de la enfermedad, en las. BI BL I. O. comunidades campesinas y aborígenes es alarmante, situación que favorece la presencia del vector transmisor de esta parasitosis.8 ,9, 10 (Ver ANEXO Nº 01) Por otra parte las políticas gubernamentales para los casos de leishmaniasis son declaración obligatoria en solo 32 países de los 88 clasificados como cosmopolitas o endémicas. En el continente americano, se encuentra en 22 países entre los que se destacan Brasil, Bolivia, Perú, Ecuador, Colombia, México, Nicaragua y Costa Rica. En el viejo mundo se han presentado casos en España, Francia, Grecia e Italia. De igual forma, Afganistán, India, Irán, Siria, Arabia Saudita, son considerados también países endémicos de esta parasitosis (OMS, 2003). 8, 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En el Perú se. han. encontrado. cinco. especies. de. Leishmania:. L.. peruviana, L. braziliensis, L. guyanensis, L amazonensis y L. lainsoni, siendo la de mayor importancia epidemiológica la Leishmaniasis cutánea andina "UTA" y la Leishmaniasis selvática "ESPUNDIA". El Perú posee una variedad topográfica y diversidad de climas que favorecen la existencia de numerosas plantas, poco conocidas, por lo que su estudio puede otorgarnos posibilidades de aplicación práctica en la terapéutica médica especialmente. aquellas. que. tienen. actividad. leishmanicida.. Las. A. investigaciones llevadas a cabo en las dos últimas décadas en bioquímica y. IC. biología molecular en estos tripanosomatídeos, han mostrado numerosos. UÍ. M. "blancos" terapéuticos potenciales pero muy pocos compuestos han sido. al tratamiento. humano. de. la. Tripanosomiosis. africana,. BI. restringida. O Q. seleccionados para uso clínico. Uno de ellos la Eflomithina, está. Y. algunos azoles y el Alopurinol para las Leishmaniasis y la enfermedad. IA. de Chagas aunque su desarrollo no ha pasado de los ensayos clínicos. AC. .En nuestro país, la leishmaniasis es la segunda endemia de tipo tropical y la. RM. tercera causa de morbilidad por enfermedades transmisibles luego de la. FA. malaria y la tuberculosis, y se presenta en dos formas: el 75% de los casos reportados corresponden a la forma cutáneo-andina o «uta» (L. braziliensis. DE. peruviana) y el 25% a la forma cutáneo mucosa (L. braziliensis braziliensis).. TE CA. (Ver ANEXO Nº02). 4, 11. Morfológicamente las distintas especies de leishmania no se pueden. BI BL I. O. identificar. Para llegar a la clasificación de las especies del género leishmania se debe considerar ciertas características: biológicas: morfología, tipo de desarrollo en el flebótomo vector, crecimiento en los medios de cultivo, desarrollo en el hospedador vertebrado; bioquímicas: electroforesis de isoenzimas, análisis del ADN del núcleo y del cinetoplasto; inmunológicas: reactividad del parásito con anticuerpos monoclonales y serotipificación del factor de excreción y taxonomía numérica para definir mejor la evolución molecular y la relación filogenética de los parásitos del género leishmania. Incluyen. cambios. transformación. de. morfológicos promastigotes. y genéticos no. que. infectivos. (prococíclicos) en promastigotes infectivos. o. desencadenan poco. la. infectivos. (metacíclicos) en el insecto. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. vector, lo que les permite vivir en el ambiente del hospedero; este proceso es lo que se conoce como metaciclogénesis. Dentro del género Leishmania se agrupan dos subgéneros según su desarrollo en el intestino de los flebótomos vectores: el subgénero. Leishmania cuyas especies se desarrollan en el. intestino medio o anterior de los flebótomos, y el subgénero Viannia que agrupa los organismos cuyo ciclo dentro del vector se desarrolla en el intestino posterior, medio y anterior de los flebótomos, a la altura del triangulo pilórico, donde son llevados a cabo los procesos por el parasito, en. A. el tracto digestivo del vector. (Ver ANEXO Nº 03). 2,12. M. IC. La leishmaniasis, que constituye un serio problema de salud pública incluso. UÍ. en los países desarrollados (coinfección con VIH), no tiene vacuna y, aunque. O Q. hay tratamiento, éste induce efectos secundarios en pacientes tratados, lo. BI. cual, además de la aparición de cepas resistentes, hace necesaria la. Y. búsqueda de nuevos medicamentos para su control. Esta enfermedad. AC. IA. protozoaria, tienen un impacto significativo en el desarrollo de los países que se encuentran en las regiones tropicales y subtropicales del planeta. Los. eficacia. toxicidad,. Aunque. la. esquemas. situación. de. prolongados. y vías. de. la quimioterapia de la. DE. administración.. y. FA. cuanto a. RM. tratamientos actuales para esta enfermedad presentan inconvenientes en. TE CA. leishmaniasis es más promisoria, aún no se dispone de un medicamento adecuado, por lo que es necesario encontrar nuevos medicamentos que aporten al control de la enfermedad. El núcleo quinolínico se encuentra en. BI BL I. O. muchos agentes farmacológicamente antipalúdicos,. antibacterianos,. antihipertensivos, agentes. activos,. como. leishmanicidas,. antiinflamatorios,. inhibidores de. la. antiasmáticos,. tirosincinasa. y. antitripanosoma, entre otros.11,13 La leishmaniasis es una enfermedad que se encuentra dentro del grupo llamado enfermedades huérfanas, debido al poco interés que genera para la industria farmacéutica en el desarrollo de medicamentos para estas enfermedades. Desde hace 70 años, el tratamiento se basa en el empleo de sales de antimonio; no obstante, su eficacia ha disminuido ostensiblemente por la aparición de cepas resistentes, lo cual al parecer se asocia con tratamientos incompletos. Por estas razones se hace necesario continuar con. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. la búsqueda de nuevos medicamentos que brinden alternativas para el tratamiento de la leishmaniasis. Los productos naturales constituyen una fuente esencial de metabolitos para el desarrollo de medicamentos. Es por ello que muchos investigadores se han volcado a la realización de estudios etnobotánicos, con el fin de obtener sustancias bioactivas con actividad leishmanicida. Desde mediados de los años ochenta del siglo XX, se inició la investigación formal y constante sobre los metabolitos naturales con actividad leishmanicida y antiparasitaria. 6, 13. A. Hasta el presente son numerosos los productos naturales que se han evaluado. y acetogeninas.. La. familia. Annonaceae,. UÍ. alcaloides. M. IC. para demostrar la actividad sobre protozoos, incluidas naftoquinonas, más. conocida. O Q. popularmente como la familia de la guanábana, comprende cerca de 2 500. BI. especies agrupadas en 130 géneros, constituidos por árboles, arbustos y. Y. lianas, distribuidas en las regiones tropicales de América, Asia y Madagascar.. AC. IA. La familia Annonaceae se caracteriza por la presencia de numerosas sustancias bioactivas de diversa naturaleza química en hojas, raíz, frutas y. flavonoides,. acetogeninas. FA. terpenoides,. RM. semillas. De esta familia se han caracterizado y reportado alcaloides, y aceites. saponificables.. La. DE. bioactividad de este tipo de metabolitos de plantas anonáceas está asociada a. TE CA. su efecto como insecticidas, actividad citotóxica, antitumoral, antibacterial, pesticida, antimalarial, antileishmaniasis y propiedades antihelmínticas. 14, 15. O. Reportes del uso de plantas en la medicina tradicional han hecho del. BI BL I. estudio de compuestos derivados de este recurso una aproximación importante en. la búsqueda de nuevos agentes. terapéuticos. En. investigaciones realizadas por diversos grupos se ha demostrado que las plantas de la familia Rutaceae se caracterizan por la producción de metabolitos como cumarinas, alcaloides y limonoides, lo que, sumado a los reportes obtenidos de su uso en la medicina tradicional, postulan a las especies pertenecientes a esta familia como fuente promisoria para la búsqueda. de. nuevos. agentes terapéuticos,. en. particular. para. el. tratamiento de enfermedades infecciosas. En los últimos años se ha evidenciado una disminución en la eficacia de las formulaciones empleadas para su tratamiento, debido al incremento en el desarrollo de. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. resistencia por parte del parásito a los medicamentos utilizados y a la elevada toxicidad que estos inducen en. los. individuos. tratados. Diversas. investigaciones demostraron que el grado de inmunocompetencia del huésped es fundamental para el control efectivo del parásito, por lo cual, para el desarrollo de nuevas alternativas terapéuticas, es fundamental la búsqueda de compuestos con actividad antileishmania que, además, modulen favorablemente la respuesta inmune del huésped. 1, 13 La clasificación adoptada para la especie en estudio, está basada. en el. A. sistema de clasificación filogenético de ADOLF ENGLER publicado en la. M. IC. XII Edición del Syllabus Der Pflanzenfamilien del año 1954 – 1964. El. UÍ. Clinopodium taxifolium (Kunth) Govaerts se caracteriza por ser un arbusto. O Q. perenne, aromático, sus tallos y ramas generalmente de 4 ángulos, sus hojas. BI. son opuestas, rara vez alternas, simples y sin estípulas. Su principal. IA. Y. procedencia es Sinchigual. Distrito de Incahuasi. Ferreñafe. Lambayeque. 16. AC. Hasta el momento, se utiliza el antimoniato meglumina (Glucantime), una (SbV). como medicamento de. RM. sal derivada de antimonio pentavalente. FA. primera linea , la pentamidina y la Anfotericina B son medicamentos de segunda línea y se emplean en pacientes que no responden al tratamiento con. DE. antimonio pentavalente. La pentamidina, por excretarse en. forma. TE CA. prolongada, permite, a diferencia de los SbV, su administración en días alternos, pero tiene el inconveniente de ser más tóxica y más costosa que el. O. SbV, por su parte, la Anfotericina B es muy efectiva para cualquiera de las. BI BL I. formas clínicas, pero debido a su toxicidad se requiere una administración intrahospitalaria, aunque existe una formulación liposomal de Anfotericina B menos tóxica, su costo es mayor, lo que dificulta su consecución. Estos medicamentos antes mencionados han sido el tratamiento de elección para todas las formas de leishmaniasis. Sin embargo, el empleo de dichos fármacos tiene desventajas como alto costo, duración del tratamiento y efectos colaterales como mialgia, pancreatitis, insuficiencia renal, neuropatía periférica, hepatotoxicidad, y cardiotoxicidad, que promueven la falta de cumplimiento del tratamiento y la aparición de resistencia a los medicamentos. Estas desventajas han estimulado la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas para el manejo de la leishmaniasis cutánea; así,. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. surge un tratamiento alternativo que se basa en la incapacidad del parásito para sintetizar el grupo HEME, lo cual hace que éste se convierta en un requisito alimenticio para el parásito, que debe ser adquirido desde el huésped. De esta forma, los nuevos derivados porfirinoides (agentes fotosensibilizadores) y. los sistemas de. transporte y liberación de las. porfirinas como preparaciones liposómicas y polímeros biodegradables, con eficacia y selectividad basadas en el mecanismo de acción celular, podrían adaptarse apuntando selectivamente para que el parásito los tome. A. en lugar del HEME, con una posterior interrupción del metabolismo de. IC. Leishmania, causando daño, deterioro y finalmente su muerte. En la. UÍ. M. actualidad existen varias drogas que han sido ensayadas para el tratamiento. O Q. quimioterápico de Leishmaniasis cutánea pero muchas de ellas son nuevas. BI. formulaciones de drogas diseñadas hace 50 años; además se ha presentado. Y. resistencia a las drogas clásicamente empleadas, lo cual hace necesaria la. IA. búsqueda de nuevos medicamentos que reemplacen o complementen el 6, 14,17. AC. tratamiento actual. (Ver ANEXO Nº 04). RM. Para el tratamiento de (Lc y Lm) se utilizan antimoniales pentavalentes, que a. FA. pesar de ser eficaces en más del 90% de los casos, no dejan de presentar. DE. múltiples inconvenientes por ser de uso prolongado, de difícil accesibilidad. TE CA. (uso restringido), aplicación por vía parenteral y a demás causa efectos adversos como nefro y hepatotoxicidad . A partir del 2002 la Organización Mundial. de. la. Salud. autorizó. la. utilización. del. miltefosine. BI BL I. O. (hexadecilfosfocolina) para el tratamiento de leishmaniasis visceral en la India, siendo también utilizada para leishmaniasis cutánea, observándose un 97% de efectividad. Sin embargo, el medicamento provoca graves efectos secundarios, que se manifiestan en vómito, diarreas, si se administra por vía oral. Si la aplicación es tópica se produce prurito frecuente, enrojecimiento, sensación de tirantez, piel seca y descamación. Todo esto, nos lleva a buscar nuevas herramientas para la formulación de medicamentos, que conservando los compuestos activos reduzcan considerablemente los efectos colaterales antes mencionados. Esto se puede lograr con la producción de compuestos de inclusión y/o asociación con ciclodextrinas, sustancias inocuas para la salud aprobadas por la FDA, que mejoran las propiedades organolépticas,. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. farmacocinéticas y de bio-distribución de los medicamentos pudiéndose disminuir así la cantidad de medicamento a aplicar y también optimizar la vías de administración, cambiando la aplicación parenteral por vía oral o tópica. 7, 17 La necesidad de encontrar medicamentos que superen las desventajas que ofrecen los que están disponibles en el mercado sustenta la búsqueda y el desarrollo de nuevos compuestos para el tratamiento de la enfermedad. Los productos naturales o compuestos derivados de ellos proporcionan una. A. fuente valiosa de medicamentos gracias al contenido de numerosas moléculas. M. IC. con una variedad de actividades farmacológicas. La inmensa diversidad. UÍ. química y el amplio rango de actividades biológicas de las plantas han. O Q. permitido el desarrollo de miles de drogas farmacológicas. Es así como en. BI. los últimos 25 años, de 1010 nuevas sustancias aprobadas para el manejo. Y. clínico de diferentes enfermedades, 490 (48,5%) son de origen natural. Ya. AC. IA. que gran cantidad de científicos han encontrado en el uso terapéutico de flores, raíces, hojas y frutos de las plantas un valioso aliado, que ayudan, de. RM. forma contundente, a combatir todo tipo de trastornos sin que, por ello,. FA. aporten ningún tipo de contraindicación o efecto nocivo para la salud. 1, 4. DE. La medicina tradicional o alternativa usa desde hace mucho tiempo diversos. TE CA. tipos de plantas para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades; para el tratamiento de Leishmaniasis, se usan por ejemplo, de acuerdo a la. O. zona, plantas tan diversas como maíz, eucalipto, sábila, llantén, malva,. BI BL I. matico, taya y muchos otros. La “Taya” (Caesalpinia spinosa (Mol.) O. Kuntz), también conocida como “Tara”, es una leguminosa muy utilizada para estos fines, sobre todo en los departamentos de Amazonas, Cajamarca y San Martín; esta planta es muy utilizada en la actualidad en la industria por sus altas concentraciones de tanino y ácido gálico, es conocida además por su alto poder astringente por coagular las albúminas de las mucosas y de los tejidos, creando una capa aislante y protectora que reduce la irritación y el dolor; por tal motivo son usados externamente para detener pequeñas hemorragias locales; en inflamaciones de la cavidad bucal, catarros, bronquitis, quemaduras, hemorroides, e internamente contra la diarrea, enfriamiento intestinal, afecciones vesiculares, y como contraveneno en caso. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de intoxicación por alcaloides vegetales. La maca (Lepidium peruvianum) es una Brassicaceae de los andes peruanos en la cual se ha determinado la presencia de alcaloides imidazólicos, benzil glocosinolatos, taninos, flavonoides y saponinas, compuestos, todos ellos, muy activos frente a Leishmania; el efecto leishmanicida podría deberse a la presencia de isotiocianatos biológicamente activos: benzil-isotiocianato y p-metoxibenzil isotiocianato. 4, 18 Considerando a la leishmaniasis una enfermedad en la cual quedan aún. A. muchas interrogantes por resolver. No existe vacuna y para su tratamiento se. M. IC. usan aún terapias de principios de siglo que consisten en saturar al cuerpo con. UÍ. inyecciones de antimonio. Además, por las características geográficas de la. O Q. enfermedad (valles interandinos y selvas) está más difundida en gente de. BI. bajos recursos económicos sobre todo en niños y personas de avanzada edad,. Y. que llegan a causar, en la mayor parte de los casos, efectos secundarios. AC. IA. graves mermando su salud y economía; también causa indirectamente problemas psicológicos (baja autoestima) por las deformaciones que genera.. RM. Se han reportaron que en la actualidad en el Perú, pobladores de la sierra y. FA. tribus selváticas como los Ashaninkas utilizan plantas con propiedades. DE. curativas contra la leishmaniasis, siendo de gran interés el valor de éstas. TE CA. como fuentes de agentes medicinales debido a sus constituyentes químicos , específicamente los metabolitos secundarios. 18, 19. O. Las poblaciones de nuestros países, y no solamente las amazónicas, se. BI BL I. amparan cada vez más en el uso de la gran variedad de plantas con propiedades. medicinales, complementando. o. solucionando,. en. gran. medida, sus problemas de salud, pues el acceso a los medicamentos convencionales. resulta. difícil. o. imposible. por. su elevado costo.. Consideramos de importancia el estudio de las plantas medicinales utilizadas. como antiparasitarias por los pobladores. Los conocimientos. empíricos étnicos son un primer paso para la evaluación de la actividad antiparasitarias in vitro, y el estudio químico para identificar de manera cualitativa. los. principales. metabolitos secundarios de. las especies. vegetales, para posteriormente realizar estudios de actividad terapéutica y poder elaborar fitofármacos que puedan contribuir a resolver en parte, los. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. problemas de salud de la población económicamente menos favorecida y más alejada de la modernidad con limitadas posibilidades de curarse. 19, 20 Los estudios in vitro de pueden realizar con las diversas cepas existentes por citar un ejemplo se realizó una Evaluación antileishmanial in vitro de extractos provenientes de Citrus limetta, Cucurbita maxima y Rhoeo spathacea, en este trabajo se utilizó una cepa de Leishmania amazonensis agente causal de la leishmaniasis cutánea. Se determinó la actividad de los extractos frente a los estadios de promastigote y amastigote del parásito, así. A. como frente a macrófagos peritoneales de ratón, para valorar su posible. M. IC. toxicidad; los extractos provenientes de Curcubita maxima y Rhoeo. UÍ. spathacea fueron los que mostraron un mayor porcentaje de inhibición del. O Q. crecimiento frente a promastigotes. Frente a amastigotes también mostraron. BI. una buena actividad antileishmanial, mientras que su citotoxicidad fue. IA. Y. moderada. 21.. AC. En la Universidad Nacional de Trujillo se han realizado variedad de estudios. RM. para determinar los metabolitos secundarios de las plantas utilizadas como. FA. medicina tradicional como por ejemplo el de: Beltrán V. (2011) titulado: Determinación de metabolitos secundarios de los extractos de las hojas de. DE. Clinopodium taxifolium (kunth) Govaerts. (chinininga) en el cual se. TE CA. obtuvieron fenoles,flavonoides, taninos, quinonas, cardenólidos, esteroides, leucoantocianidinas, alcaloides y saponinas; estos metabolitos secundarios. O. poseen acción farmacológica en leishmaniasis y teniendo como base que ya. BI BL I. se han realizado estudios in vitro de otras plantas utilizadas como antileishmanicidas en la provincia de Santa Cruz, departamento de Cajamarca como por ejemplo tenemos el de: Carranza D (2011) titulado: Determinación del efecto leishmanicida in vitro de los extractos del tallo de Croton alnifolius “ Tunga” en Leishmania (V) peruviana y el de Rabanal E(2009) titulado: Determinación in vitro del efecto leishmanicida del látex de Euphobia Weberbaueri “La Lechera” sobre Leishmania (V) peruviana obteniendo como resultado que dichas plantas poseen efecto leishmanicida a partir de la concentración de 10% y 3.6% respectivamente. 22, 23, 24. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Es por este motivo que en algunas comunidades de la provincia de Santa Cruz, departamento de Cajamarca se viene utilizando en medicina tradicional los extractos de la hoja Clinopodium taxifolium (Kunth) Govaerts (Chinininga) como una alternativa para el tratamiento de la Leishmania (V) peruviana cutánea, conocida por los pobladores como “uta”. (Ver ANEXO Nº 05). La población utiliza el decocto de las hojas de esta planta aplicándolo directamente sobre el área infectada. Es esta razón que motiva el interés de estudiar esta planta y determinar la actividad leismanicida in vitro de los extractos de la hoja de Clinopodium taxifolium (Kunth) Govaerts. IC. A. “Chinininga” sobre Leishmania (V) peruviana, con lo cual se podrá. de su uso tradicional. Por todo lo antes mencionado nos. O Q. científicos. respaldos. UÍ. M. evidenciar el potencial terapéutico de esta especie y existan. BI. planteamos el siguiente problema de investigación:. Y. ¿Tendrán, los extractos de la hoja de Clinopodium taxifolium (Kunth). AC. IA. Govaerts, actividad leishmanicida sobre Leishmania (V) peruviana en. RM. condiciones in vitro?. FA. Lo que nos llevó a plantearnos el siguiente objetivo:. DE. Determinar la actividad leishmanicida in vitro de los extractos de la hoja de. BI BL I. O. peruviana.. TE CA. Clinopodium taxifolium (Kunth) Govaerts (Chinininga) sobre Leishmania (V). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II.. MATERIAL Y MÉTODO. 2.1. MATERIAL:. 2.1.1. Material Biológico 2.1.1.1.. Material vegetal: Hojas de la especie de Clinopodium taxifolium. (Kunth) Govaerts “Chinininga”, se recolectaron en los campos de cultivo de la Zona Reserva Chancay Baños, localizada en la provincia de Santa Cruz, Departamento de Cajamarca. La identificación de esta especie. A. botánica se realizó mediante el método tradicional o clásico. de. M. IC. herborización, se seleccionó el material en el campo, verificando que esté. UÍ. en buenas condiciones; la clasificación de llevó a cabo en el Herbarium. O Q. Truxillensis y Museo Botánico de la Universidad Nacional de Trujillo.. Y. BI. (Ver ANEXO Nº 06). AC. IA. 2.1.1.1.1. Cepas de Leishmania (V) peruviana: Utilizamos cepas de Leishmania (V) peruviana aisladas de pacientes del caserío de Litcán. RM. localizada en la provincia de Santa Cruz, Departamento de Cajamarca;. FA. las cuales fueron identificados en el Laboratorio de Parasitología de la. TE CA. DE. Facultad de Ciencias Biologías de la Universidad Nacional de Trujillo. 2.1.2. Material usado en la preparación del medio de cultivo . O. Agar B.H.I. BI BL I. . Infusión Cerebro Corazón (B.H.I.). . Caldo B.H.I. . Sangre desfibrinada. 2.1.3. Medicamentos: . Gentamicina 160mg/ml amp.. . Penicilina Sódica 1000000 UI. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2. MÉTODOS Y PROCEDIMIENTO: 25,26 2.2.1. Procesamiento de la hoja: Recolectamos aproximadamente 1 Kg. De. hojas. de Clinopodium taxifolium (Kunth) Govaerts “Chinininga” en. óptimas condiciones de conservación, limpiándolas adecuadamente con alcohol de 70º, dejándola libre de polvo y de otros contaminantes; se. A. dejaron secar a una temperatura aproximada de 40°C.(Ver ANEXO Nº7). M. IC. 2.2.2. Obtención de los extractos:. O Q. UÍ. A partir de 200 g. de hojas secas y molidas de Clinopodium taxifolium. BI. (Kunth) Govaerts realizamos una maceración con hexano por 48 h, luego. Y. destilación reflujo por 3 h, y se procedió a filtrar en caliente, a este. AC. IA. filtrado se le denomina extracto hexánico. Al residuo que se obtuvo en. RM. el papel de filtro se deja evaporar totalmente el hexano, para luego. FA. macerarlo por 48 h con alcohol etanólico de 96º, realizamos la. DE. destilación reflujo por 3 h para ser filtrado en frío, luego, eliminamos el. TE CA. solvente para concentrar el extracto, al cual se le añadió agua destilada y. O. se filtró, el residuo que obtuvimos en el papel de filtro corresponde al. BI BL I. extracto alcohólico y el filtrado al extracto acuoso.25 2.2.2.1. Obtención de las diluciones (concentraciones): A partir del extracto alcohólico de las hojas de la especie de Clinopodium taxifolium. “Chinininga” que obtuvimos, procedimos a realizar. diluciones teniendo como disolvente al Dimetil Sulfóxido (DMSO). A 10 mL del extracto alcohólico que se encuentra en el fondo del tubo añadimos DMSO en proporción adecuada obteniendo las siguientes concentraciones 1, 10, 20, 30%. 25. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.3. Determinación de la Actividad Leishmanicida in vitro: 2.2.3.1. Obtención de promastigotas: 2.2.3.1.1. Cultivo: A partir de un cultivo madre procedimos a realizar sub-cultivos en medio BHI y suplementamos con gentamicina. Luego rrealizamos evaluaciones hasta que el cultivo. A. alcanzó la fase logarítmica, siendo, éstas las que utilizamos para el. M. IC. ensayo in vitro. (Ver ANEXO Nº8) 27, 29. O Q. UÍ. 2.2.3.1.2. Preparación de las concentraciones del parásito:. BI. Tomamos una alícuota del cultivo y se llevó inmediatamente a la. IA. Y. cámara de Neubauer para su respectivo conteo. Se contaron los. AC. parásitos que se encontraron en la totalidad de los cuadrantes. Así. RM. determinamos el número de parásitos presentes en cada mililitro y. DE. FA. empleamos la siguiente fórmula:. TE CA. N° parásitos/mL = N° células x factor de dilución x factor de Conversión de cámara.. O. Después de conocer el número de parásitos presentes por cada. BI BL I. mililitro, ajustamos a la concentración de 1x106 parásitos/mL en. caldo B.H.I.23. 2.2.3.2. Ejecución de la prueba in vitro: Introducimos en una placa de poliestireno de 96 pocillos fondo plano, con una micropipeta 70 uL de caldo B.H.I. conteniendo parásitos a una concentración de 1x106 p/mL a cada pocillo, inmediatamente añadimos 40 uL de cada una de las diluciones del extractos alcohólico de hoja (1, 10, 20, 30%), con los 40 uL de medio que contiene parásitos, al mezclarlos ambos, obtuvimos. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. diferentes concentraciones (0.064; 3.636; 5.455; 7.596 respectivamente) las que denominamos, concentraciones de enfrentamiento. Luego flameamos la cubierta de las placas y de inmediato las cubrimos con parafilm. Cada concentración de enfrentamiento probada la realizamos por quintuplicada para disminuir errores en la lectura. Realizamos dos controles, en el control I para la Gentamicina se sustituyó la droga con. A. la misma cantidad de antibiótico; el control II para el disolvente DMSO. M. IC. sustituimos la droga con la misma cantidad de disolvente empleado en. O Q. UÍ. la disolución del extracto, luego, flameamos la cubierta de las placas. BI. antes de cubrir las mismas para luego llevar a estufa de cultivo a 28ºC.. Y. Realizamos las observaciones microscópicas a 1, 2, 3 y 24 horas de. AC. IA. realizado el enfrentamiento. 26, 27. Lecturas: Las lecturas las realizamos colocando muestra de. RM. 2.2.3.3.. FA. cada pocillo a la cámara de Neubauer, haciendo uso del microscopio a. TE CA. DE. diferentes tiempos y teniendo en cuenta la movilidad del parásito.. O. 2.2.4. Identificación de metabolitos secundarios: Procedimos a identificar los. BI BL I. metabolitos secundarios existentes en el extracto etanólico, el cual posee actividad in vitro, utilizando reactivos de coloración y precipitación. Las reacciones utilizadas fueron las siguientes: 27, 28  Reacción de gelatina sal: Se preparó una mezcla de solución de NaCl 5% con solución de gelatina 1% y agregamos una porción del extracto. Un precipitado es indicativo de la presencia de taninos.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación.  Reacción con Tricloruro Férrico: Presenta coloración frente a cualquier compuesto fenólico, la aparición de un color verde oscuro sugiere la presencia de un derivado de catecol y de un color azul de un derivado pirogalol. La reacción positiva indica presencia de compuestos fenólicos, flavonoides, taninos.  Reacción de Shinoda: A la muestra problema agregamos un. A. trozo de cinta de magnesio seguido por gotas de HCl cc, las. M. IC. coloraciones roja (flavonas), roja a crimson (flavonoles), crimson. O Q. UÍ. a magenta (flavononas) y algunas veces azul o verde, son. BI. consideradas positivas.. IA. Y.  Reacción de Liebermann – Burchard: Tomamos 0.5 ml de la. AC. solución y se agregamos 0.5 ml de anhídrido acético, luego. RM. agregamos 2 a 3 gotas de acido sulfúrico concentrado y se vuelve. FA. a mezclar. La reacción será positiva si aparece color azul o verde. DE. naranja indicando presencia de esteroides.. TE CA.  Reacción de Borntrager: Mezclamos la muestra agitando. O. suavemente con 5 ml de NaOH 10%. La reacción es positiva si la. BI BL I. fase acuosa toma un color rojo indicando la presencia de. antraquinonas y naftoquinonas..  Reacción de Baljet: Mezclamos una parte de solución etanólica de ácido pícrico con una parte de NaOH 10%, luego agregamos gotas de esta mezcla a la muestra problema. Las lactosas  ,  insaturados dan coloración rojo claro a oscuro y presencia de cardenólidos.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación.  Reacción de Hager: La solución acuosa saturada de acido pícrico produce con los alcaloides picratos cristalinos de color amarillo. Observar al microscopio.  Reacción de Mayer: Este reactivo da con casi todas las soluciones de alcaloides, precipitados de color blanco, blanco amarillento o amarillo limón claro.. A.  Reacción de Dragendorff: Este reactivo (yoduro de bismuto y. M. IC. potasio) reacciona con los alcaloides en solución débilmente. O Q. UÍ. acidulada, precipitados de color rojo o anaranjado.. BI.  Reacción de Espuma: En un tubo de ensayo colocamos 2 ml de. IA. Y. la muestra y agitamos fuertemente durante 15 segundos. Si a los. AC. 15 minutos persiste la espuma con una altura mayor de 5 mm. FA. saponinas.. RM. entonces la reacción se considera positiva indica presencia de. DE.  Reacción de Molish: A 1 mg de muestra le agregamos 1-2 gotas. TE CA. de α-naftol 5%/Etanol, luego se agregamos por las paredes H2SO4. O. cc. Si se observa un anillo violeta que indica la presencia de. BI BL I. carbohidratos de las saponinas.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III.. RESULTADOS. CUADRO Nº 01: Determinación preliminar de la actividad in vitro de los extractos de la hoja Clinopodium taxifolium (Kunth) Govaerts “Chinininga sobre Leishmania (V) peruviana.. EXTRACTO. TRATAMIENTO. 6 12. 24. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. 1. %. O Q. -. ++. ++. ++ ++ ++. ++. ++. ++. ++ ++ ++. ++. ++. ++. ++ ++ ++. ++. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. 8. Y. ETANOLICO. RM. AC. IA. Govaerts. 8. TE CA. DE. FA. ACUOSO. GENTAMICINA (160mg/100ml). 0.0581. BI BL I. O. CONTROL I. CONTROL II. LEYENDA:. DIMETILSULFOXIDO (DMSO). ++ Buena actividad - No actividad. M. -. BI. Clinopodium taxifolium (Kunth). -. 8. HEXANICO. -. 3. IC. -. 2. A. ESPECIE. UÍ. HORAS. 36.36. Ninguna movilidad (parásitos/mL) Buena movilidad (parásitos/mL). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. CUADRO Nº 02: Actividad Leishmanicida in vitro del extracto etanólico de las hojas de. Clinopodium taxifolium (Kunth) Govaerts “Chinininga” sobre. Leishmania (V) peruviana en diversas concentraciones y tiempo.. ESPECIE. CODIGO. %. HORAS. % 1. 2. 3. 12. 24. +. ++. ++. -. -. +. ++. ++. -. -. +. ++. ++. -. -. +. ++. ++. -. -. +. ++. ++. -. -. +++. +++. +++ +++. +++. +++. +++. +++ +++. +++. +++. +++. +++ +++. +++. +++. ++. ++. +++. +++. +++. ++. ++. +++. +++. +++. +++. +++ +++. +++. +++. +++. +++ +++. +++. +++. +++. +++ +++. +++. EC4. +++. +++. +++ +++. +++. EC5. +++. +++. +++ +++. +++. ED1. +++. +++. +++ +++. +++. ED2. +++. +++. +++ +++. +++. +++. +++. +++ +++. +++. ED4. +++. +++. +++ +++. +++. ED5. +++. +++. +++. +++. ENFRENTAMIENTO. IC. A. EA1. EA3. 0.064. O Q. 1. BI. EA4. Y. EA5. EB2. EB5. (Kunth). EC1. TE CA. Govaerts. DE. taxifolium. RM. EB4. 3.636. FA. Clinopodium. 10. AC. IA. EB1. EB3. EC2. BI BL I. O. EC3. ED3. UÍ. M. EA2. 20. 30. 5.455. 7.596. +++. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. CONTROL I. C1. -. -. -. -. -. (Gentamicina. C2. -. -. -. -. -. 160mg/100ml). C3. -. -. -. -. -. C4. -. -. -. -. -. C5. -. -. -. -. -. CONTROL II. T. -. -. -. -. -. DIMETILSULFOXI. T. -. -. -. -. -. DO. T. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. 0.0581. 36.36. IC. A. T. -. O Q. UÍ. M. T. BI. LEYENDA: 0 parásitos/mL. EA: Extracto a una concentración del 1%. ++ Regular actividad. 1 – 29 000 parásitos/mL. AC. IA. Y. +++ Buena actividad. ≥ 58 000 parásitos/mL. FA. No actividad. EC: Extracto a una concentración del 20%. ED: Extracto a una concentración del 30%. BI BL I. O. TE CA. DE. -. RM. + Mínima actividad 29 001 – 57 999 parásitos/mL. EB: Extracto a una concentración del 10%. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. CUADRO Nº 03: Diferencias entre los niveles de Actividad Leishmanicida de cada par de Tratamiento según 1 hora post-enfrentamiento, aplicando la Prueba de Probabilidad Exacta de Fisher.. ACTIVIDAD/ TIEMPO. PRUEBA DE PROBABILIDAD. 1 HORA. EXACTA DE FISHER. EA (1%). EB (10%). Mínima Actividad. 5. 0. Buena Actividad. 0. 5. EA (1%). EC (20%). Mínima Actividad. 5. 0. Buena Actividad. 0. 5. Buena Actividad. 0. AC. RM. 5. No Actividad. IC M UÍ. P= 0.004. 5. EA (1%) Mínima Actividad. O Q. 0. Y. 5. IA. Mínima Actividad. P= 0.004. ED (30%). BI. EA (1%). A. P= 0.004. C 0. P= 0.004. 5. EB (10%). EC (20%). P= N.S. 5. 5. ( No Significativo). EB (10%). ED(30%). P= N.S. 5. 5. ( No Significativo). EB (10%). C. Buena Actividad. 5. 0. No Actividad. 0. 5. EC (20%). ED (30%). P= N.S. 5. 5. ( No Significativo). EC (20%). C. Buena Actividad. 5. 0. No Actividad. 0. 5. ED (30%). C. 5. 0. DE. FA. 0. BI BL I. O. Buena Actividad. TE CA. Buena Actividad. Buena Actividad. Buena Actividad. P= 0.004. P= 0.004. P= 0.004. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. No Actividad. 0. 5. CUADRO Nº 04: Diferencias entre los niveles de Actividad Leishmanicida de cada par de Tratamiento según 2 horas post-enfrentamiento, aplicando la Prueba de Probabilidad Exacta de Fisher. PRUEBA DE PROBABILIDAD. 2 HORAS. EXACTA DE FISHER. EA (1%). EB (10%). Regular Actividad. 5. 2. Buena Actividad. 0. 3. EA (1%). EC (20%). Regular Actividad. 5. 0. Buena Actividad. 0. 5. EA (1%). ED (30%). Regular Actividad. 5. BI. Buena Actividad. 0. A M. O Q. UÍ. P= 0.004. Y. P= 0.004. IA. 5. 2. 0. AC. C. RM. P= 0.0476. 5. EB (10%). EC (20%). 2. 0. 3. 5. EB (10%). ED (30%). Regular Actividad. 2. 0. 3. 5. EB (10%). C. Regular Actividad. 2. 0. Buena Actividad. 3. 0. No Actividad. 0. 5. EC (20%). ED (30%). P= N.S. 5. 5. ( No Significativo). EC (20%). C. Buena Actividad. 5. 0. No Actividad. 0. 5. ED (30%). C. Regular Actividad. TE CA. Buena Actividad. DE. FA. 0. O. No Actividad. ( No Significativo). 0. EA (1%) Regular Actividad. P= N.S. IC. ACTIVIDAD/ TIEMPO. BI BL I. Buena Actividad. Buena Actividad. P= N.S ( No Significativo). P= N.S ( No Significativo). P= 0.004. P= 0.004. P= 0.004. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Buena Actividad. 5. 0. No Actividad. 0. 5. CUADRO Nº 05: Diferencias entre los niveles de Actividad Leishmanicida de cada par de Tratamiento según 12 horas post-enfrentamiento,aplicando la Prueba de Probabilidad Exacta de Fisher. PRUEBA DE. ACTIVIDAD/ TIEMPO. 12 HORAS. PROBABILIDAD EXACTA. EB (10%). No Actividad. 5. 0. Buena Actividad. 0. 5. EA (1%). EC (20%). No Actividad. 5. 0. Buena Actividad. 0. 5. IC M UÍ. O Q. IA. 0. P= 0.004. 0. 5. FA. Buena Actividad. P= 0.004. Y. RM. 5. P= 0.004. ED (30%). AC. EA (1%) No Actividad. A. EA (1%). BI. DE FISHER. C. P= N.S. 5. 5. ( No Significativo). EB (10%). EC (20%). P= N.S. 5. 5. ( No Significativo). EB (10%). ED (30%). P= N.S. 5. 5. ( No Significativo). EB (10%). C. No Actividad. 0. 5. Buena Actividad. 5. 0. EC (20%). ED (30%). P= N.S. 5. 5. ( No Significativo). EC (20%). C. No Actividad. 0. 5. Buena Actividad. 5. 0. ED (30%). C. TE CA. No Actividad. DE. EA (1%). O. Buena Actividad. BI BL I. Buena Actividad. Buena Actividad. P= 0.004. P= 0.004. P= 0.004. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. No Actividad. 0. 5. Buena Actividad. 5. 0. CUADRO Nº 06: Metabolitos secundarios presentes en el extracto etanolico de las hojas de Clinopodium taxifolium (Kunth) Govaerts “Chinininga” COLORACIÓN (COL). Clinopodium. PRECIPITACIÓN. taxifolium. (Pp.). (Kunth) Govaerts. GELATINA. Precipitado. Taninos (+). TRICLORURO FÉRRICO. Col: Azul, verde, negro. UÍ. M. IC. A. REACCIÓN. BI. O Q. Compuestos fenólicos, flavonoides, taninos (+) Col: Rojo, azul o verde Flavonoides (+). IA. Y. SHINODA. Col: verde, azul verdoso COL: Rojo. Esteroides (+). BALJET. Cardenólidos (+). MAYER. Col: Rojo (clarooscuro) Pp. : picratos cristalinos Pp. : blanco a crema. DRAGENDORFF. Pp. : Rojo - naranja. Alcaloides (+). COLORACIÓN (Col). Clinopodium. PRECIPITACIÓN. taxifolium. (Pp.). (Kunth) Govaerts. Altura:5 mm Duración > 15 min Col: anillo violeta. Saponinas (+). RM. FA DE. Quinonas (+). Alcaloides (+) Alcaloides (+). BI BL I. O. TE CA. HAGER. AC. LIEBERMANNBURCHARD BORTRÄNGER. LEYENDA: Presencia (+). REACCIÓN. ESPUMA MOLISCH. Saponinas (+). LEYENDA: Presencia (+). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV.. DISCUSIÓN. En la obtención de los extractos de las hojas la especie Clinopodium. A. taxifolium (Kunth) Govaerts “Chinininga”, se utilizó hexano, agua y etanol;. M. IC. siendo el extracto etanólico el que posee la actividad leishmanicida, tal como. UÍ. se observa en el Cuadro Nº 01, debido a que el etanol de 96º es un solvente. BI. O Q. de polaridad intermedia, que llega a solubilizar fitoconstituyentes afines;. Y. tiene la capacidad de formar enlaces de hidrógeno y de ceder pares de. AC. IA. electrones, y por poseer un extremo lipofílico que ayuda a la solvatación de. RM. sustratos orgánicos, además su labor se ve facilitada por la secuencia del. FA. procedimiento: el aumento de temperatura la cual permite una mejor. DE. capacidad extractiva del solvente, debido a que el efecto de la temperatura. TE CA. conlleva a que los enlaces químicos se dilaten y su efecto en las interacciones químicas entre las moléculas se rompan, facilitando así la penetración del. BI BL I. O. solvente y la mejor extracción de los metabolitos secundarios. Además, la temperatura contribuye al desplazamiento de la constante de equilibrio de saturación y aumenta la eficiencia del proceso y aumenta la eficiencia del proceso, mayor superficie de contacto con el solvente y la agitación que hace que nuevas cantidades de solvente, pobre en las sustancias extraíbles, entre en contacto con el sólido y un nuevo punto de equilibrio de saturación sea alcanzado. 30, 31,32. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En el Cuadro Nº 02, podemos afirmar que el extracto etanolico de hojas de Clinopodium taxifolium (Kunth) Govaerts “Chinininga” posee actividad leishmanicida in vitro sobre Leishmania (V) peruviana, partir de la concentración al 10 % (concentración de enfrentamiento al 3.6 %) a todos los tiempos leídos 1, 2, 3, 12 y 24 horas respectivamente, aumentando la actividad a medida que aumenta la concentración del extracto (20 % y 30 %); en cuanto a. A. la concentración de dilución al 1% (concentración de enfrentamiento al 0.06. M. IC. %) se observa que en la primera hora de lectura se estaría evidenciando la. O Q. UÍ. mínima actividad del parasito, pero conforme el tiempo avanza, los parásitos. BI. van recuperando su total movilidad a partir de las 12 horas.. Y. Se conoce, que el efecto de una sustancia depende de la cantidad administrada,. AC. IA. es decir, de la dosis. En el caso de elegir una dosis que no es suficiente para. RM. sobrepasar las concentraciones del umbral crítico (dosis por debajo del umbral),. FA. el efecto no aparece. Dependiendo de la naturaleza del efecto en cuestión, dosis. DE. crecientes lograrán un efecto perceptible cada vez más intenso y es posible. TE CA. establecer una relación dosis-efecto. Las lecturas obtenidas por observaciones. O. microscópicas a 2 horas posterior al enfrentamiento denotan el estrés post-. BI BL I. enfrentamiento que sufren los parásitos es así que los parásitos no afectados por los metabolitos secundarios, presentes en la dilución del extracto, recobran su movilidad en las concentraciones 10 %, 20%, no pudiendo soportar la dilución al 30 % que se entiende ofrece una mayor carga de metabolitos secundarios. Las dosis empleadas se consideran apropiadas debido a que se está diluyendo una sustancia con un alto porcentaje de agua y parénquima por lo tanto se puede calificar de eficaz la acción observada, y potente si se consideraría al conjunto de los metabolitos secundarios como un todo. 33. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.