“Cinética de crecimiento de Salmonella typhi en leche pasteurizada bajo condiciones de refrigeración”

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. DE. CI EN. CI. Cinética de crecimiento de Salmonella typhi en leche pasteurizada bajo condiciones de refrigeración. TESIS. TE. CA. PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO. IO. Autor : Br. Christian Eduardo Sipirán Abanto. BI. BL. Asesor : Dr. Luis Alberto Llenque Díaz TRUJILLO - PERÚ 2017. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. AS. Dr. Orlando Moisés Gonzáles Nieves. BI. O. LO. G. IC. RECTOR. AS. Dr. Rubén Cesar Vera Véliz. DE. CI EN. CI. VICE-RECTOR ACADÉMICO. SECRETARIO GENERAL. BI. BL. IO. TE. CA. Dr. Steban Alejandro Ilich Zerpa. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. IC. Dr. Freddy Rogger Mejia Coico. AS. BI. O. LO. G. DECANO. Dr. William Elmer Zelada Estraver. TE. CA. DE. CI EN. CI. SECRETARIO. Dra. Bertha Soledad Soriano Bernilla. BI. BL. IO. DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA.. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN Señores Miembros del Jurado:. AS. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y Títulos. IC. de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología de la Facultad de. G. Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración. LO. y criterio el presente trabajo de tesis titulado: “Cinética de crecimiento de Salmonella typhi. O. en leche pasteurizada bajo condiciones de refrigeración” con el cual pretendo obtener el. Trujillo, Junio del 2017. DE. CI EN. CI. AS. BI. Título Profesional de Biólogo Microbiólogo.. BI. BL. IO. TE. CA. Br. Christian Eduardo Sipirán Abanto. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MIEMBROS DEL JURADO Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido ejecutada en concordancia con lo establecido con las normas de la Escuela Académico Profesional de. O. LO. G. IC. AS. Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.. Dra. María Nelly Vásquez Valles SECRETARIA. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. PRESIDENTE. BI. Dra. Icela Marissa Rodríguez Haro. Dr. Luis Alberto Llenque Díaz VOCAL v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran que el presente Informe de Tesis titulado: “Cinética de crecimiento de Salmonella typhi en leche. AS. pasteurizada bajo condiciones de refrigeración”, ha cumplido con los requisitos formales. O. LO. G. IC. y fundamentales, siendo APROBADO por UNANIMIDAD.. DE. CI EN. CI. AS. PRESIDENTE. BI. Dra. Icela Marissa Rodríguez Haro. SECRETARIO. BI. BL. IO. TE. CA. Dra. María Nelly Vásquez Valles. Dr. Luis Alberto Llenque Díaz VOCAL. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CERTIFICACIÓN DEL ASESOR. El que suscribe, profesor asesor de la tesis titulada:. AS. “Cinética de crecimiento de Salmonella typhi en leche pasteurizada bajo condiciones de. G. IC. refrigeración”. LO. Certifica que ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de. O. Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad con su. BI. correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado acogiendo las observaciones y. AS. sugerencias alcanzadas.. CI. Por lo tanto, autorizo al Br. Christian Eduardo Sipirán Abanto continuar con el trámite del. Trujillo, Junio del 2017. TE. CA. DE. CI EN. reglamento correspondiente.. Dr. Luis Alberto Llenque Díaz. BI. BL. IO. ASESOR. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. Dedico este trabajo principalmente a Dios, por haberme dado la vida y permitirme el haber llegado. AS. A mi abuelita Otilia López Gutiérrez por ser el ángel que cuida a mi familia porque. IC. su amor fue infinito nosotros tus hijos. Gracias por enseñarnos la importancia que es el. G. estudio.. LO. A mi madre Blga. Delia Herliza Abanto López por demostrarme siempre su amor y. O. apoyo en todos los momentos de mi vida.. BI. A mi padre Blgo. Victor Fernando Sipirán Fernández que a pesar de nuestras diferencias de opiniones, siempre creyó en mi te doy gracias por siempre estar cuando más. AS. te necesito.. CI. A mi hermana Melissa Sipirán Abanto por haber hecho mi niñez la más feliz de todas,. CI EN. a mi hermano Victor Sipirán Abanto que a pesar de todo te amo con todo mi corazón. Al amor de mi vida Mblga. Ivett Guevara Sánchez por enseñarme el significado de lo que es amar y haber emprendido juntos este largo camino que es el vivir además de ser mejor. DE. cada día.. CA. A mis sobrinos Ramiro, Angelina y Adrianita Isabel porque son el tesorito más grande que tengo, a mis abuelos, tíos, primos por darme la oportunidad de formar parte de una gran. TE. familia.. IO. A mis amigos Billi, Cinthia, Ana Cecilia, Rosmery, Darwin, Carmen, Cynthia, Glenda, Criss, Janice, Arturo, Yuseff, Omar, Carlos, Ana María, Flor, Lurdes, Lanny y Gloria por. BI. BL. acompañarme en esta aventura universitaria.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO A mi asesor de tesis, Dr. Luis Alberto Llenque Díaz, por su dedicación, apoyo incondicional y por haberme brindado la orientación necesaria para desarrollar de la mejor manera la. IC. AS. realización de esta investigación.. A Carlos Alberto Guzmán Delgado, encargado del departamento técnico del área de. G. Microbiología y Parasitología, por su amistad, apoyo y motivación para el desarrollo de mi. O. LO. formación profesional.. BI. A la Mblga. Ivett Katherine Judith Guevara Sánchez por su paciencia, sus consejos, su apoyo. AS. incondicional y hacer de esta vida universitaria y profesional una de las etapas más hermosas. CI EN. CI. de mi vida.. A Todos mis Profesores que contribuyeron con sus conocimientos, experiencias y consejos en mi vida profesional en especial a la Dra. Ícela Rodríguez Haro, la Dra. Eva Villanueva. DE. Tarazona y al Dr. Aníbal Quintana Díaz.. CA. Finalmente, a la Universidad Nacional de Trujillo por abrirme sus puertas y permitirme ser. BI. BL. IO. TE. parte de ella, hoy y siempre. Gracias. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ÍNDICE. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ............................ ii. AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS .............................. iii. IC. PRESENTACIÓN .................................................................................................................. iv. LO. G. MIEMBROS DEL JURADO ...................................................................................................v APROBACIÓN ...................................................................................................................... vi. BI. O. CERTIFICACIÓN DEL ASESOR........................................................................................ vii. AS. DEDICATORIA ................................................................................................................... viii. CI. AGRADECIMIENTO ............................................................................................................ ix. CI EN. ÍNDICE .....................................................................................................................................x RESUMEN ............................................................................................................................ xii. DE. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................1 OBJETIVOS .............................................................................................................................7. CA. Objetivo General ...................................................................................................................7. TE. Objetivos Específicos. ..........................................................................................................7. MATERIAL BIOLÓGICO............................................................................................8. BL. 1.. IO. MATERIAL Y MÉTODOS .....................................................................................................8. MÉTODOS ....................................................................................................................8. BI. 2.. PROCEDIMIENTO .................................................................................................................8 2.1. Reactivación de Salmonella typhi ..........................................................................8. 2.2. Verificación de la pureza de las colonias ...............................................................9 x. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Recolección, transporte y Pasteurización de la muestra ........................................9. 2.4. Determinación de los parámetros físicos- químicos de la leche ............................9. 2.5. Preparación del inóculo bacteriano de Salmonella typhi .....................................10. 2.6. Implementación del sistema de ensayo ................................................................11. 2.7. Curva de crecimiento de Salmonella typhi ...........................................................11. IC. AS. 2.3. LO. G. RESULTADOS ......................................................................................................................12. O. DISCUSIÓN ...........................................................................................................................16. BI. ENUNCIADO RESUMEN ....................................................................................................19. AS. RECOMENDACIONES ........................................................................................................20. CI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................21. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. ANEXOS ................................................................................................................................25. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN Se determinó la cinética de crecimiento de Salmonella typhi en leche pasteurizada a temperatura de refrigeración. El cultivo puro se reactivó mediante siembra por estría en agar nutritivo y se incubó a 37ºC durante 14 horas. Luego se sembró en agar Mac Conkey y se. AS. realizó una coloración Gram; así mismo las pruebas bioquímicas de fermentación de azúcares. IC. y descarboxilación de la lisina en un TSI/LIA. El inóculo se preparó colocando en 10 mL de Solución Salina Fisiológica Estéril (SSFE) una suspensión bacteria equivalente a 3 x 108. G. cel/mL, comparándolo con el tubo número uno del nefelómetro de Mac Farland. Se midió 99. LO. mL de leche fresca, se colocó en un frasco estéril y se calentó a 65 ºC por 30 min, se dejó. O. enfriar. Posteriormente se le adicionó un mL de inoculo bacteriano, se homogenizó y luego se. BI. le acondicionó al sistema de temperatura de refrigeración (4-5ºC). Posteriormente se extrajo 0.5 mL de muestra, cada 2 horas hasta las 14 horas, a partir de la cual se realizaron diluciones. AS. sucesivas y se sembró por superficie las dos últimas diluciones en Agar Mac Conkey incubándose a 37 °C por 24 horas. Se realizó el recuento bacteriano (ufc/mL) y con ello se. CI. elaboró la curva crecimiento dando como resultado la fase de latencia de 0 hasta las 2 horas,. CI EN. fase logarítmica de 2 hasta las 10 horas y la fase de muerte hasta las 14 horas de evaluación. Finalmente se linealizó la fase log y se calculó los parámetros cinéticos. La velocidad específica de crecimiento de la bacteria a temperatura de refrigeración fue de 0.53. BI. BL. IO. TE. CA. DE. generaciones/h y el tiempo de generación de 1.30h.. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN. La leche ha sido recomendada por la Organización de las Naciones Unidas para las Agricultura y por la Organización de las Naciones Unidas para la Educación (FAO y UNESCO,. AS. respectivamente)1, como un alimento de primera necesidad de gran demanda por su alto valor nutricional que se refleja en sus componentes; es considerada un alimento básico en la dieta de. IC. niños, ancianos, enfermos, y en general de toda la población; químicamente, es uno de los fluidos. LO. G. más completos que existen2.. El término “sólidos totales” en la leche se usa ampliamente para indicar todos los. O. componentes con exclusión del agua y el de “sólidos no grasos” cuando se excluye el agua y la. BI. grasa. El agua representa aproximadamente entre un 82% y un 82.5% de la leche, los sólidos totales. AS. alcanzan habitualmente la cifra de 12% hasta un 13% y los sólidos no grasos casi siempre están muy próximos al 9.4 %, y por ser un alimento muy completo, es un medio ideal para el crecimiento. CI. de microorganismos, los que, si no son eliminados, pueden convertirse en un riesgo para los. CI EN. consumidores. Así mismo la leche puede ser un vehículo de enfermedades que pueden afectar a los consumidores, si no se realizan los controles de calidad necesarios en los procesos de la industrialización que parten en la granja y culminan en el consumidor final 2. La composición de la leche es un factor que determina su valor nutricional y calidad industrial que afecta directamente. DE. la rentabilidad y competitividad de los sistemas de producción de leche, y es el reflejo de múltiples. CA. factores que pueden ser modificados en el sistema a través de diferentes prácticas de manejo3. La leche es un líquido complejo que contiene elementos en diferentes estados de dispersión,. TE. Constituye un fluido con gran variedad de componentes, destacando como principal el agua que alcanza hasta un 88% en la leche de vaca el resto comprende lípidos, proteínas, carbohidratos y. IO. componentes menores provenientes de la sangre o sintetizados por la glándula mamaria4, contiene. BL. numerosos componentes con un alto valor nutritivo. Las proteínas son de alto valor biológico, su grasa muy digestible rica en calcio y fósforo, además, aporta notables cantidades de vitaminas y. BI. contiene un gran número de aminoácidos esenciales para el hombre. La leche de vaca contiene 5,3 g/Kg de nitrógeno, de los cuales 95% se encuentra en forma de proteínas verdadera y de estas aproximadamente el 80% corresponden a caseínas siendo el resto a proteínas del suero5. Su Composición promedio de la leche para los principales componentes lácteos es: 3,6% materia grasa, 3,2% proteína y 4,7% lactosa. Existen minerales y vitaminas presentes en la leche que derivan directamente del flujo sanguíneo, entre las cuales destacan por su importancia nutricional: 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. calcio y vit. B 12; y con respecto de los carbohidratos, el principal carbohidrato de la leche es la lactosa, un disacárido compuesto de glucosa y galactosa. La lactosa es el componente más constante de la leche, su concentración es del orden de 4,6%. Además de la lactosa, en la leche se encuentran otros carbohidratos: monosacáridos, azúcares, oligosacáridos, glucosa y galactosa. AS. libres, etc6. La leche recién ordeñada se debe refrigerar a 4 ºC, antes de 4 horas de ser emitida y. IC. conservarse a esta temperatura para obtener un grado óptimo para los procesos industriales. G. posteriores. La leche recién ordeñada, si se mantiene a 25 ºC, durante 2 horas, se produce una. LO. cristalización parcial de la partícula de grasa, por lo que para evitarlo es necesario, como mínimo, conservarla a 10 ºC; también es necesaria una ligera agitación de la leche para que se mantenga la. O. emulsión7. La viscosidad de la leche aumenta significativamente con la refrigeración, la estabilidad. BI. coloidal de las micelas es mucho mayor y, por tanto, la leche coagula con dificultad. Para que estos. AS. cambios se realicen debe conservarse un mínimo de 24 horas a 4 ºC, con un calentamiento posterior, para que la betacaseína vuelva a las micelas y la cantidad de fosfato cálcico coloidal. CI. aumente de nuevo7.. CI EN. Microorganismos como Escherichia coli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Aeromonas hydrophila, Yersinia enterocolitica, Plesiomonas shigelloides y Clostridium sp. han sido reconocidos como los principales patógenos trasmitidos por la leche y. DE. sus derivados; estos se han identificados en diferentes eslabones de la cadena de producción lechera, pero con mayor frecuencia al nivel de la leche cruda8. E. coli y Salmonella sp causan. CA. gastroenteritis, con fiebre, diarrea, dolor abdominal, náuseas y dolor de cabeza, y suelen ser autolimitantes. La gastroenteritis es causada por diversas cepas del género Salmonella: S.. TE. typhimurium (antes S. enterica), S. enteritidis, S. arizonae, S. braenderup, entre otras. A su vez,. IO. cada especie posee una gran diversidad antigénica (lipopolisacáridos, fimbrias, cápsulas, sistemas de secreción) que permite caracterizar cepas según su serotipado; y donde los reservorios más. BL. habituales resultan ser animales del sector agroalimentario como aves, ganado porcino y vacuno .. BI. 9. Salmonella sp perteneciente a la familia enterobacteriaceae, son bacilos Gram negativos,. anaerobios facultativos, asporógenos, utilizan citrato como única fuente de carbono y poseen metabolismo de tipo oxidativo y fermentativo10. S. typhi es una bacteria anaeróbica facultativa, que puede en ocasiones sobrevivir en bajas condiciones de oxígeno. Pertenece al serotipo 9,12; en base a los epítopes de la tivelosa, el azúcar repetida en su antígeno O. El antígeno flagelar "d" es 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. el más preponderante, aunque algunas cepas de Indonesia poseen otro antígeno denominado "z"; lo que significa que expresan un flagelo muy diferente en secuencia de aminoácidos al encontrado en las cepas de otras regiones del mundo. Además de los antígenos O y H, tiene en su exterior una cápsula de polisacáridos denominada Vi (por antígeno de "virulencia"). La mayoría de las cepas son móviles debido a que poseen flagelos peritricos, que rodean a la célula. Interesantemente,. AS. existen cepas no móviles en Indonesia, en donde la incidencia de la fiebre tifoidea es más alta. S.. IC. typhi produce ácido a partir de glucosa, maltosa y sorbitol, sin la producción de gas; pero no fermenta la lactosa, sacarosa, ramnosa y otros azúcares, reduce nitratos a nitritos y también. LO. G. produce ácido sulfhídrico. Su temperatura óptima de crecimiento es de 37ºC 11.. O. Salmonella typhi produce la salmonelosis en vacas lecheras que puede presentarse con. BI. enteritis aguda y severa, y se expresa bajo los signos de diarrea, deshidratación, anorexia, fiebre, disentería, tenesmo ocasional y severa depresión del sensorio, entre otros. Esta enfermedad está. segundo lugar sólo después de E. coli. 12. AS. clasificada como la causa bacteriana más importante en diarrea de vacas lecheras, y se halla en . S. typhi puede encontrarse en diversos lugares. CI. principalmente en heces las cuales si están secas pueden vivir hasta varios meses, Se dice que en. CI EN. las heces se puede encontrar 106 de salmonelas por gramo8. En los bovinos tiene distintas manifestaciones, casi siempre agudas, desde procesos digestivos, pasando por septicemias, hasta cuadros respiratorios o genitales13.. DE. En los seres humanos S. typhi es responsable de diferentes cuadros clínicos como la fiebre tifoidea, paratifoidea y salmonelosis, la salmonelosis fue identificada a finales de la década de los. CA. años 1880. Los síntomas clínicos generalmente aparecen 18-36 horas después de la ingestión del alimento contaminado con salmonelas. La enfermedad se caracteriza por una diarrea grave,. TE. acompañada de fiebre, y con frecuencia de dolor de cabeza y malestar general. Su duración varía. IO. desde unos pocos días a algunas semanas. Además, existen personas que sufren una infección asintomática y otras que son portadoras sanas transitorias o crónicas (presentan el agente patógeno. BL. pero no sufren la infección) y que son responsables de la diseminación de los bacilos. La mayoría. BI. de las cepas colonizan el íleon, se fijan o adhieren al epitelio y producen enterotoxinas. Algunas son patógenas y causan diarrea sanguinolenta pero pocas cepas invaden los tejidos subepiteliales y producen una enfermedad más grave14. La leche, desde su extracción, almacenamiento en el tanque de refrigeración y hasta su llegada a la industria está expuesta a numerosas fuentes de contaminación 8. La principal ruta de transmisión de Salmonella es la ruta fecal-oral, tras su entrada por vía oral; Salmonella es capaz 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. de colonizar el tracto gastrointestinal y aparecer en heces en un periodo de tiempo muy corto, que puede ser inferior a los 60 minutos. En la fase aguda de la infección, Salmonella es excretada en concentraciones muy elevadas, que pueden alcanzar las 107 UFC/g en heces, lo que facilita la contaminación del ambiente y la transmisión entre animales alojados en el mismo lugar. Teniendo en cuenta que la dosis infectiva para las infecciones naturales está en torno a 103 UFC/g entonces. AS. la infección por Salmonella se transmitirá con gran facilidad en condiciones de campo a través de. IC. la ruta fecal-oral. Según algunos autores, la eliminación fecal disminuye con el tiempo en. G. intensidad, hasta convertirse en una eliminación intermitente18. El proceso de contaminación no. LO. es sistemático ni totalmente previsible. Sin embargo, los riegos se incrementan sustancialmente en la medida que la leche entre en contacto con superficies contaminadas y que las condiciones de. O. acondicionamiento resulten propicias para el desarrollo bacteriano, especialmente la. BI. temperatura14.. AS. La temperatura es el parámetro ambiental más importante en el crecimiento de los microorganismos de los alimentos a medida que disminuye la temperatura por debajo de la óptima. CI. de crecimiento aumenta la duración de los tiempos de generación y de latencia y en consecuencia. CI EN. se lentifica el crecimiento. Los cambios de velocidad de crecimiento a medida que disminuye la temperatura, así como la temperatura mínima de crecimiento, varían de unas especies bacterianas a otras14. La vida útil de los productos refrigerados está determinada por los efectos acumulativos de la temperatura durante el manejo de las materias primas, en los procesos productivos y en todas. DE. las etapas de almacenamiento y transporte requeridas para su comercialización. Los abusos de temperatura se reflejan en serios problemas de estabilidad microbiológica. Para la mayoría de los. CA. alimentos, se recomienda que la cadena de frío se mantenga dentro de un rango de temperatura entre -1 y 2 °C y que no sea superior a 5 °C. Desafortunadamente, los sistemas de producción y. TE. los canales de distribución no siempre cuentan con el equipamiento necesario para cumplir con. IO. esta recomendación. Por ejemplo, en muchos supermercados los estantes refrigerados se encuentran programados para operar entre 7 y 10 °C, y es todavía más grave cuando estos equipos. BI. BL. se apagan durante la noche15.. La leche recién ordeñada al enfriarse a 4 ºC, se puede mantener durante varios días. Los. sistemas de enfriamiento dependen del tipo de explotación ganadera, la zona de recogida y el grado de industrialización de la misma. En granjas pequeñas se sigue utilizando el sistema de inmersión en cántaras con agua helada. También es un medio muy frecuente el empleo de tanques de enfriamiento, donde se mantiene la leche hasta la recogida en camiones cisterna, de aquí pasa a 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. centros de recogida instalados por las propias industrias o directamente a las centrales lecheras, donde unos enfriadores de placas alcanzan la temperatura de conservación, y de aquí a los “silos”, donde permanecen hasta su procesado7. Para un organismo determinado, el tiempo de generación en cultivo depende del medio de crecimiento y de las condiciones de cultivo. Muchas bacterias tienen tiempos de generación comprendidos entre 0.5-6 horas, pero unas cuantas crecen. AS. rápidamente y se dividen en menos de 20 minutos mientras que otras tardan varios días o incluso. IC. semanas. El aumento en número de células que se produce en un cultivo bacteriano creciendo. G. exponencialmente es una progresión geométrica de base 2.. LO. Existe una relación directa entre el número de células presentes inicialmente en un cultivo y el número presente tras un período de crecimiento exponencial que puede expresarse. O. matemáticamente: N = N0 2n donde N es el número final de células, N0 es el número inicial de. BI. células y n es el número de generaciones que ha ocurrido durante el período de crecimiento. AS. exponencial. El tiempo de generación (g) de la población celular exponencial es t/n, donde t indica los días, horas o minutos de crecimiento exponencial. Por tanto, sabiendo el número inicial y final. CI. de células en una población que está creciendo exponencialmente, es posible calcular n, y. CI EN. conociendo n y t, calcular el tiempo de generación, g. El tiempo de generación también se puede calcular de la pendiente de la recta obtenida en la representación semilogarítmica del crecimiento exponencial.. DE. La mayoría de los microorganismos unicelulares crecen exponencialmente pero las velocidades del crecimiento exponencial (número de generaciones por hora) son muy variables.. CA. La velocidad de crecimiento está influenciada por las condiciones ambientales (temperatura, composición del medio de cultivo) así como por las características genéticas del organismo. Por. TE. lo general, los microorganismos procariotas crecen más rápido que los eucariotas y los eucariotas pequeños lo hacen más deprisa que los mayores16. Salmonella puede duplicar su número cada. IO. 20 minutos si la temperatura es elevada (superior a 20° C), y más significativamente, si la. BL. temperatura ambiente supera los 30ºC, ya que su temperatura óptima de crecimiento es de 30-37ºC. BI. y siendo su Velocidad específica de crecimiento 2.10 generaciones/h 17. La calidad de leche es un aspecto fundamental en la ganadería vacuna lechera, así mismo es. insustituible en la alimentación de las personas perteneciendo a la canasta básica familiar18,19. Constituye un hábitat ideal para el desarrollo bacteriano, ya que consta. de grasa. emulsionada, azucares, sales, proteínas, vitaminas y minerales disueltas en agua, por tanto su inocuidad es importante como prioridad de la salud y estudios del crecimiento microbiano durante sus diferentes etapas de producción son necesarias teniendo en cuenta que a pesar de que la leche se 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. conserva a 4°C antes de ser procesada, para detener cualquier tipo de crecimiento bacteriano, esta temperatura muchas veces podría ser insuficiente porque las bacterias pueden sobrevivir y seguir en crecimiento sobre todo las Gram negativas al poseer más capas de fosfolípidos como es el caso de S. typhi un microorganismo de amplia difusión en la producción lechera el cual provoca cuadros entéricos y/o septicémicos que son comunes en la recría de terneros lecheros en condiciones de. AS. manejo intensivo20,21,22. Por tanto se debe estudiar los parámetros cinéticos de S. typhi en condiciones. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. de refrigeración para comprender el comportamiento de crecimiento de la bacteria en 4°C.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. OBJETIVOS. AS. Objetivo General. IC. Describir la cinética de crecimiento de Salmonella typhi en leche fresca pasteurizada bajo. LO. G. condiciones de refrigeración.. AS. BI. O. Objetivos Específicos:. 1. Describir la curva de crecimiento de Salmonella typhi en leche bajo condiciones de. CI EN. CI. refrigeración.. 2. Determinar la velocidad especifica de crecimiento de Salmonella typhi en leche bajo. DE. condiciones de refrigeración.. CA. 3. Determinar el tiempo de generación de Salmonella typhi en leche bajo condiciones de. BI. BL. IO. TE. refrigeración.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y MÉTODOS. 1. MATERIAL BIOLÓGICO. AS. Cultivo de Salmonella typhi, proporcionado por el Departamento técnico de la. IC. escuela de Microbiología y Parasitología, Trujillo – Perú.. Moche. Región La. G. Leche fresca procedente del establo “René”, Distrito de. LO. Libertad.. BI. O. 1.1 Criterios de inclusión de la muestra. Leche fresca proveniente de reses recién ordeñada.. . Leche fresca proveniente de reses sanas.. CI. AS. . CI EN. 1.2 Criterios de exclusión de la muestra. Leche fresca proveniente de reses en tratamiento con antibiótico.. . Leche fresca guardada en depósitos por más de 1 hora.. CA. DE. . 2. MÉTODOS. IO. TE. PROCEDIMIENTO. BL. 2.1 Reactivación de Salmonella typhi. BI. El cultivo puro conservado en refrigeración a -4°C (Anexo 1) fue reactivado mediante siembra por estría en Agar Nutritivo e incubado a 37º C durante 12 horas (Anexo 2), luego se hizo una tinción de Gram23 y se sembró en un medio diferencial Agar Mac Conkey. Finalmente se realizó las pruebas de fermentación de azucares y descarboxilación de la lisina en un TSI/LIA (Anexo 3).. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.2 Verificación de la pureza de las colonias. A partir del cultivo reactivado se realizó una tinción de Gram y una observación. AS. microscópica (Anexo 4).. IC. 2.3 Recolección, transporte y Pasteurización de la muestra. G. Se recolectó 2 L de leche en frascos estériles, se acondicionó en un cooler con bolsas. LO. de hielo, luego se transportó al laboratorio de Fisiología y Genética Microbiana en la escuela de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo,. O. donde fueron procesados.. BI. Se colocó 99 mL de leche fresca en frascos estériles y se pasteurizó en baño maría a. AS. 65 ºC por 30 min (Anexo 5 y 6).. Determinación de la densidad. CI EN. 2.4.1. CI. 2.4 Determinación de los parámetros físicos- químicos de la leche. Se midió de 250 mL de leche en una probeta, luego se introdujo el. DE. lactodensímetro en la leche y se determinó la temperatura. Luego se efectúo la lectura en la espiga del lactodensímetro en el punto más alto que alcanza el. CA. menisco.. La determinación de la densidad se reportó a 15°, y en función a la temperatura. TE. registrada se procedió a corregir el valor de la densidad agregando o restando por. BL. IO. cada grado por encima o debajo de 15°C el factor de corrección 0.0002 (Anexo. BI. 2.4.2. 7 a y 8 ).. Determinación del pH. Se tomó 50 mL de muestra en un vaso de precipitación y se colocó el sensor de pH en el pH-metro y se hizo la lectura directamente (Anexo 7 b y 8).. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.4.3. Determinación acidez titulable. En un matraz se agregó 20 mL de leche y se añadió 2 a 3 gotas de fenolftaleína al 0.1% luego se tituló con NaOH 0.1N hasta la visualización de una coloración ligeramente rosada la cual persistió por lo menos 30 segundos. Los mL gastados. AS. de NaOH 0.1N se multiplicó por 9 y se dividió por 10; y el cociente expresa la. Determinación de la grasa. O. 2.4.4. LO. G. IC. acidez titulable de la leche (Anexo 7 c y 8).. BI. Se vertió 10 mL de H2SO4 en el butirómetro y se tomó 11 mL de leche, se apoyó la pipeta en la pared del cuello del butirómetro, formando un ángulo de 45° para. AS. que caiga suavemente sobre el ácido, se adicionó 1 mL de alcohol amílico. Luego. CI. se colocó el tapón de caucho asegurando que estuviera bien cerrado. Con el tapón hacia arriba, se agitó el butirómetro vigorosamente hasta que el coágulo. CI EN. quedó disuelto completamente. Después se invirtió por lo menos cuatro veces para homogenizar el contenido del butirómetro y el contenido del bulbo y vástago graduado. Luego se. colocó inmediatamente el butirómetro en la. DE. centrífuga a 60°C y se centrifugo durante 4 minutos.. CA. Se retiró el butirómetro de la centrífuga y se colocó con el tapón hacia abajo en un baño termostático a 65±2°C durante 5 minutos, debiendo quedar todo el. TE. contenido del butirómetro sumergido, manteniendo siempre el butirómetro en. la columna de grasa hasta que coincidiera con una marca principal de la columna del butirómetro y se hizo la lectura del porcentaje de grasa. (Anexo 7d y 8).. BI. BL. IO. posición vertical y sin agitarlo, se retiró del baño y se secó rápidamente. Se ajustó. 2.5 Preparación del inóculo bacteriano de Salmonella typhi. A partir del cultivo reactivado se realizó una suspensión del cultivo en 10 mL de Solución Salina Fisiológica Estéril (SSFE), hasta obtener una concentración de 3 x 108 cel/mL, comparándolo con el tubo número uno del nefelómetro de Mac Farland. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.6 Implementación del sistema de ensayo. A Cada frasco con 99 mL de leche pasteurizada se adicionó un mL de inóculo bacteriano, se homogenizó por movimiento rotatorio por un minuto y posteriormente se refrigeró a una temperatura estable de 4 a 5ºC (Anexo 9).. AS. Del sistema de ensayo se extrajo 0.5 mL de muestra cada 2 horas hasta las 14. IC. horas a partir de la cual se realizaron diluciones sucesivas en tubos de 13 x 100mm que contenían 4.5 mL de SSFE, según el siguiente protocolo a las 0. G. horas, 10-4 y 10-5; 2 horas, 10-4 y 10-5; 4 horas, 10-5 y 10-6; 6 horas, 10-5 y 10-6; 8. LO. horas, 10-6 y 10-7; 10 horas, 10-6 y 10-7; y 12 horas, 10-7 y 10-8; y 14 horas, 10-7 y. O. 10-8. A partir de las dos últimas diluciones se sembró 0.1 mL por superficie en. BI. agar Mac Conkey y se incubó a 37ºC por 24 horas. Luego se realizó la enumeración de las unidades formadoras de colonias por mL (Anexo 10). Cada. CI. AS. ensayo se realizó tres veces consecutivas.. CI EN. 2.7 Curva de crecimiento de Salmonella typhi. Con los datos obtenidos en ufc/mL de los recuentos (Anexo 11) se graficó la curva de crecimiento bacteriano. Los datos experimentales de la fase. DE. logarítmica fueron linearizados utilizando el programa EXCEL 2013, luego se determinó los valores promedios de la velocidad específica de crecimiento (µ). BI. BL. IO. TE. CA. y el tiempo de generación (tg) (Tabla 01).. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS. AS. En la Figura 1, se observa la curva de crecimiento experimental de Salmonella typhi a temperatura de 4-5°C, se determina que la bacteria tiene una fase adaptativa comprendida entre. IC. 0 a 2 horas, una fase logarítmica de 2 hasta las 10 horas y posteriormente presenta una fase de. O. LO. G. muerte hasta las 14 horas de evaluación.. BI. En la Figura 2, se observa que la fase logarítmica de Salmonella typhi a temperatura de. AS. 4-5 °C, fluctúa entre las 2 a 10 horas, existe un crecimiento exponencial por un periodo de 8. CI EN. CI. horas en el cual hay un incremento 2 ciclos logarítmicos.. DE. En la Tabla 1, se observa los parámetros cinéticos de crecimiento promedio de Salmonella typhi a temperatura de 4-5°C, observándose que la velocidad específica de crecimiento fue de. BI. BL. IO. TE. CA. 0.53 generaciones/h y el tiempo de generación fue de 1.30 horas.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. LO O. 3.00E+08. 3.00E+07. 2. 4. 6. CI EN. 0. CI. AS. BI. ufc/mL. G. IC. 3.00E+09. 8. 10. 12. 14. DE. Tiempo (Horas). BI. BL. IO. TE. CA. Fig. N° 1. Curva de crecimiento experimental de Salmonella typhi a temperatura de 4-5°C.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC. 6.01E+09. G. 3.00E+09. BI. ufc/mL. O. LO. 2.08E+09. 7.21E+08. AS. 3.00E+08. CI EN. CI. 2.50E+08. 8.66E+07. 3.00E+07 2. 4. 6. 8. 10. 12. Tiempo (Horas). CA. DE. 0. BI. BL. IO. TE. Fig. N° 2. Fase logarítmica de Salmonella typhi a temperatura de 4-5°C.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla N° 1. Parámetros cinéticos de crecimiento promedio de Salmonella typhi a temperatura de. Desviación estándar. Media de error estándar. LO. Valor promedio. 0.004. 0.002. 0.012. 0.007. AS. 0.532 generaciones/h. 1.304 h. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Tiempo de generación (Tg). CI EN. CI. Velocidad especifica de crecimiento ( µ). BI. O. Parámetros cinéticos. G. IC. AS. 4-5°C. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSIÓN. La leche es un alimento muy completo con un gran contenido rico en nutrientes, elevado valor. AS. energético ya que es fuente de calcio, fósforo, magnesio, proteína lactosa, grasas, vitaminas, minerales y enzimas. Estos constituyentes difieren entre sí por el tamaño molecular y por su. IC. solubilidad, convirtiéndole en un sistema físico-químico; las moléculas menores representadas por. G. las sales, lactosa y vitaminas hidrosolubles se presentan en un estado de solución verdadera; en. LO. tanto que, las moléculas mayores (lípidos, proteínas y enzimas) aparecen en estado coloidal, los cuales son esenciales para el desarrollo y con cantidades relativamente pequeñas de este alimento crecimiento de cualquier tipo de. O. se pueden cubrir una cantidad importante para el. BI. microorganismos24, 25. Además los valores mínimos de pH, actividad de agua y temperatura para el crecimiento de algunas bacterias como Salmonella son 3.8; 0.94 y 5.2 °C respectivamente 26.. AS. Por todo lo anterior se puede explicar que Salmonella typhi encontró las condiciones para su. CI. desarrollo y crecimiento (Fig. N° 1) a pesar que la temperatura de refrigeración significa la reducción en la velocidad metabólica a tal punto que se hace imperceptible, pero suficiente para. CI EN. mantener el microorganismo vivo.. A pesar de que existe bibliografía que afirma que la mayoría de los microorganismos patógenos. DE. no pueden multiplicarse a temperaturas de 4 °C o menores27 además de normativas como la Norma Técnica Peruana Para Leche y Productos Lácteos NTP 202.00128 que establece la temperatura para. CA. el manejo adecuado de Leche fresca, determinando que ésta es la temperatura mínima aceptable; todos ellos aseguran que si los refrigeradores se mantienen en estas condiciones se evitará el. TE. crecimiento de microorganismos sin embargo se demostró en esta investigación que S. typhi bajo estas mismas condiciones de temperatura puede crecer tal como se puede observar en la Fig. N° 1. IO. en el cual se visualiza una fase adaptativa comprendida entre 0 a 2 horas, un crecimiento hasta las. BL. 10 horas, y luego se observa una reducción población hasta las 14 horas de evaluación.. BI. En la curva de crecimiento experimental de S. typhi a temperatura de refrigeración (4 a 5ºC) (Fig. N° 1), se observó que la fase de latencia empezó desde 0 hasta las 2 horas de evaluación con un recuento inicial 4.08 x107 ufc/ml durante esta fase existe un aparente reposo, porque, el valor no cambia sustancialmente de 4.08 x107 a 8.63 x107 ufc/mL (Anexo 11) pero la bacteria ya está sintetizando las enzimas necesarias para la actividad metabólica, interiormente las células trabajan activamente adaptando el equipo enzimático al medio de cultivo. La bacteria se prepara para hacer uso de los nutrientes que este medio le aporta, por lo tanto es la fase de adaptación al medio, con 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. aumento de la masa celular. La razón por la cual S. tiphy tiene la capacidad de tolerar la temperatura de 4 °C se debería a algunas de las adaptaciones por las que la bacteria toleran la refrigeración como son la producción de enzimas resistentes al frío, sistemas de transporte adaptados a bajas temperaturas, el aumento de la concentración de ácidos grasos en la cadena de fosfolípidos de la membrana celular, esta última, para que continúe el estado semifluido de la membrana y evitar la. AS. congelación29.. IC. El crecimiento exponencial o fase logarítmica de S. typhi comenzó a partir de las 2 hasta las 10. G. horas de evaluación con una población de 8.63 x 107 ufc/mL y aumenta hasta 5.57 x 109 ufc/mL,. LO. durante esta etapa cada bacteria es capaz de duplicar su masa y dividirse a intervalos regulares, la velocidad de crecimiento es constante y máxima significando el incremento de la población. O. bacteriana en 2 unidades logarítmicas (Fig. N° 1). La velocidad de crecimiento comenzó a. BI. disminuir hasta hacerse nula cuando alcance la fase estacionaria, ya que cambios en la composición. AS. y concentración de nutrientes entre el cultivo del inóculo y el medio fresco pueden desencadenar. CI. el control y la regulación de la actividad enzimática, no presento fase estacionaria. Finalmente el crecimiento de S. typhi culminó con la fase de muerte (Fig. N° 1) a partir de 10. CI EN. horas con un valor de 5.57 x 109ufc/mL hasta las 14 horas de evaluación, se pudo evidenciar que hubo una disminución poblacional hasta 1.57x108. Esta fase se presenta por agotamiento del. DE. suministro de los nutriente esenciales y por acumulación de productos metabólicos tóxicos30, 31. En Fig. N° 2 la Fase logarítmica de S. typhi a temperatura de refrigeración fue linealizada, en esta. CA. fase se cambió la pendiente de la curva de crecimiento exponencial a una línea recta, La tendencia lineal de la fase exponencial demuestra que los resultados obtenidos son consecuencia de la. TE. interacción de los factores de temperatura, concentración de nutrientes, pH, y concentración del microorganismo resultando en un efecto sinérgico sobre los parámetros cinéticos y en la. IO. evaluación del comportamiento de la curva de crecimiento por lo que la velocidad de crecimiento. BL. es máxima y el tiempo de generación es mínimo31.. BI. El número de nuevas bacterias que aparecen por unidad de tiempo es proporcional a la población actual. Si el crecimiento no se limita, la duplicación continuará a un ritmo constante, por lo tanto el número de células de la población se duplica con cada período de tiempo consecutivo. Se verifica la fase logarítmica experimental de S. typhi en condiciones de refrigeración fluctúa entre las 2 a 10 horas, además se de observar que existe un crecimiento exponencial por un periodo de 8 horas en el cual hay un incremento 2 unidades logarítmicas32, 33. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A partir de la curva de crecimiento corregida se puede calcular los parámetros cinéticos de crecimiento; μ y tg son conceptos diferentes pero que reflejan la capacidad intrínseca de un microorganismo para crecer en ciertas condiciones además de ser parámetros que permiten interpretar el comportamiento de S. typhi llegando a la conclusión que en tiempo de refrigeración la cinética disminuye si la comparamos con otras condiciones de temperatura más elevadas pero. AS. aun así en refrigeración de 4 a 5°C continua el crecimiento en valores considerables34. Los. IC. parámetros μ y tg se presentan en Tabla N° 1 y fueron calculados utilizando la formula 𝑡𝑔 =. 𝑙𝑛2 μ. G. una formula sencilla de mucha ultilidad35. La velocidad específica de crecimiento de S. typhi a. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. temperatura de refrigeración fue de 0.53 generaciones/h y el tiempo de generación de 1.30 horas.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ENUNCIADO RESUMEN. La presente investigación permitió determinar la cinética de crecimiento de Salmonella typhi en leche pasteurizada a temperatura de 4-5°C; la bacteria presenta una fase adaptativa en un periodo. AS. de dos horas, posteriormente una fase logarítmica desde las 2 hasta las 10 horas con un. IC. incremento de dos ciclos logarítmicos, para luego presentar una disminución de la población hasta las 14 horas de evaluación. Así mismo la velocidad específica de crecimiento a temperatura. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. de refrigeración fue de 0.532 generaciones/h y un tiempo de generación de 1.304 horas.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RECOMENDACIONES - Monitorear la variación del pH cada media hora en paralelo a la medición del crecimiento. AS. bacteriano de Salmonella typhi.. IC. - Realizar ensayo con diferentes rangos de temperatura.. - Evaluar la variación de la cantidad grasas totales cada hora en paralelo a la medición del. LO. G. crecimiento bacteriano de Salmonella typhi.. - Evaluar la variación de la densidad cada hora en paralelo a la medición del crecimiento. BI. O. bacteriano de Salmonella typhi.. AS. - Evaluar la variación de las proteínas totales cada hora en paralelo a la medición del. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. crecimiento bacteriano de Salmonella typhi.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. AS. 1. Fuentes G., Ruiz R., Sánchez J., Ávila D., Escutia J. Análisis microbiológico de leche de. IC. origen orgánico: atributos deseables para su transformación. Rev. Agricultura, Sociedad y. G. Desarrollo. 2013; 10(1): 419-432.. LO. 2. Agudelo D., Bedoya O. Composición nutricional de la leche de ganado vacuno. Rev.. BI. O. Lasallista de Investigación. 2005; 2(1): 38-42.. CI. Cienc Anim. 2012; 5(1) :73-85. AS. 3. Calvache I., Navas A. Factores que influyen en la composición nutricional de la leche. Rev.. CI EN. 4. Briñez W., Valbuena E., Castro G., Tovar A., Ruiz J., Román R. Efectos del mestizaje, época del año, etapa de lactancia y número de partos sobre la composición de leche cruda de. DE. vacas mestizas. Rev. FCV-LUZ. 2003; 8 (6):490-498. 5. Briñez W., Valbuena E., Castro G., Tovar A. y Ruiz-Ramírez J. Algunos parámetros de. CA. composición y calidad en leche cruda de vacas doble propósito en el municipio de Machiques. TE. de Perijá estado Zulia, Venezuela. Rev. FCV-LUZ. 2008; 8 (5): 490-498.. BL. 2.. IO. 6. Morales M. Factores que afectan la composición de la leche. Rev. Tecno Vet. 1999; 5(1): 1-. BI. 7. Salvio P. Procesado industrial de la leche. IMC Real Academia de Ciencias Veterinarias. Madrid 2006.. 8. Ponce C., Armenteros A., Villoch C., Montes de Oca N., Carreras J. Evaluación de riesgos microbiológicos y químicos de la activación del sistema lactoperoxidasa en leche cruda. Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, CENSA, 2005; 9 (5):1-2 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 9. Sevilla M., Sánchez A. Evolución de brotes epidémicos causados por Salmonella sp. Rev. Nutr. Clin. Diet. Hosp. 2015; 35(2):80-90. 10 Parra M., Durango J., Mattar S. Microbiología, patogénesis, epidemiología, clínica y. AS. diagnóstico de las infecciones producidas por Salmonella. Rev. MVZ-Córdoba. 2002;. IC. 7(2):187-200.. LO. G. 11. Martínez E., Martínez J. Microbios. Centro de investigación de nitrógeno. Universidad. O. Nacional Autónoma de México. México 2004.. BI. 12 Delgado A., Sandoval R., Uribe E., Montenegro M. Salmonelosis en vacas lecheras en el Perú.. AS. Actualidad ganadera. Fecha consultada martes 26 enero 2016. Disponible en:. CI. http://www.actualidadganadera.com. CI EN. 13 Díez A., Rejas J. Procesos entéricos en vacunos. Rev vet. 2008; 3(7):1-2. 14 García A. Evaluación del comportamiento de Salmonella sp en carne molida de res y cerdo, a. DE. tres diferentes temperaturas. Puebla, Universidad Autónoma de Puebla. México 2007.. CA. 15 Tirado J., Paredes D., Velázquez G., Torres J. Crecimiento microbiano en productos cárnicos. TE. refrigerados. Rev. CyTA. 2009; 5(1): 66-76. 16 Madigan M., Parker J. Biología de los Microrganismos de Brock. 12º ed. Edit. Prentice Hall.. BL. IO. España 2009. Pp 197-201.. BI. 17 Paulín R. Producción de biomasa de Salmonella typhi para la obtención de porinas. Instituto Politécnico Nacional. México D. F, 2008. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 18 Argüello R. Salmonelosis porcina en España factores de riesgo en reproductores, estrategias de control en cerdos de cebo y la importancia del sacrificio. Dialnet. Universidad Nacional de León. España 2013. Calidad fisicoquímica,. AS. 19 Brousett M., Torres A., Chambi A., Mamani B., Gutiérrez H.. IC. microbiológica y toxicológica de leche cruda en las cuencas ganaderas de la región Puno –. LO. G. Perú. Rev. Scientia Agropecuaria.2015; 6 (3): 165 – 176.. 20 Odriozola E., Montone P., Moreno G., Navarro M., Villa M., Moreira AR. Salmonelosis en. BI. O. hembras lecheras. Reunión Científica y Técnica de la Asociación Argentina de Veterinarios. AS. de Laboratorio de Diagnóstico. Argentina 2008.. CI. 21 Koneman E., Allen S., Janda W., Schreckenberger P., Winn W. Diagnóstico microbiológico.. CI EN. Texto y atlas color. 5º ed. Edit Médica Panamericana. Buenos Aires, 2008. Pp. 20-23. 22 Pulido A. Estadística para la Biología y Ecología. Universidad Jorge Tadeo Lozano.. DE. Colombia, 2007.. CA. 23 Murray P., Rosenthal K., Pfaller M. Microbiología Medica.6º ed. Edit Elsevier. España 2009.. TE. 24 Hernández M., Vélez J. Suero de la leche y su aplicación en la elaboración de alimentos. IO. funcionales. Rev. Temas Selectos de ingeniería de Alimentos. 2004; 8(2):13-22. BL. 25 Zavala J. Aspectos nutricionales y tecnológicos de la leche. Dirección general de promoción. BI. agraria. Perú, 2005.. 26 Jay M. Modern Food Microbiology. 7° ed. Edit Springer, New York 2005. Pp 36-42. 27 Russel S. Contaminación bacteriana de los sistemas de refrigeración alimentaria. Rev Scielo. 2003; 3(45):27-36 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 28 González A. Refrigeración de alimentos Fundamentos del manejo adecuado de temperatura. Rev. Cubana de Química. Mexico, 2013. 29 Sánchez C., Constanza L., Corrales R. Congelación bacteriana: Factores que intervienen en. AS. el proceso. Rev. Nova Publicación Científica. 2005; 3 (3):115-120. Colombia, 2013.. LO. 31 Guzmán R. Microbiología Clínica. ASMC News. Colombia,2004. G. IC. 30 Benintende S., Sánchez C. Crecimiento bacteriano. Universidad Jorge Tadeo Lozano.. BI. O. 32 González N., Zamora J., Pérez C. Modelación de la influencia del pH y la temperatura en la velocidad de crecimiento de Tsukamurella paurometabola C-924. Rev. Cubana de. CI. AS. Química.2010; 12(3):26-29.. CI EN. 33 Mossel D. Microbiología de los Alimentos. 2° ed. Edit Acribia. España 2004. Pp 634- 637. 34 Martino N. Influencia del pH en el crecimiento bacteriano en alimentos. Italia, 2015. 35 Ruberto M., Adolfo L., Cormack M. Conocimiento didáctico del contenido (CDC) en la. DE. enseñanza universitaria de Biotecnología. El caso de la velocidad específica de crecimiento. BI. BL. IO. TE. CA. microbiano. Rev. Eureka sobre Enseñanza y Divulgación de las Ciencias. 2012; 9 (3):353-360. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. ANEXOS. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Anexo 1. Cultivo puro de Salmonella typhi. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Anexo 2. Colonias de Salmonella typhi en Agar Mac Conkey. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) TSI. LIA. Anexo 3. Cultivo puro de Salmonella typhi en TSI y LIA.. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. Anexo 4. Observación microscópica de Salmonella typhi mediante la tinción de Gram con objetivo 100x.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. Anexo 5. Baño maría utilizado para pasteurizar la leche fresca a 65°C.. Anexo 6. Acondicionamiento de la leche fresca para el ensayo en el baño maría.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. B. C. D. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. A. BI. Anexo 7. Determinación de los parámetros físico-químico de la leche fresca. A). Determinación de la densidad (g/mL). B). Determinación del pH. C). Determinación de la acidez (%). D). Determinación de la grasa (%). 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) pH. 6.0. Acidez (%). 0.157. Grasa (%). 3.7. IC. 1.025. O. LO. G. Densidad (g/mL). AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 9. Frascos de vidrio (sistema de ensayo) en refrigeración.. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. Anexo 8. Parámetros físico-químicos de la leche fresca utilizada como muestra. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(45) BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 1. CA. DE. 4.48E+07 7.00E+07 1.28E+08 5.00E+08 1.36E+09 3.20E+09 5.00E+08 1.00E+08. ufc/mL 2. 3. Promedio. 2.00E+06 2.90E+07 3.10E+08 7.00E+08 4.00E+09 5.00E+09 5.00E+08 1.00E+08. 7.55E+07 1.60E+08 3.50E+08 9.00E+08 2.50E+09 8.50E+09 3.00E+08 2.70E+08. 4.08E+07 8.63E+07 2.63E+08 7.00E+08 2.62E+09 5.57E+09 4.33E+08 1.57E+08. BL. IO. TE. Tiempo horas) 0 2 4 6 8 10 12 14. CI EN. CI. AS. Anexo 10. Colonias de Salmonella typhi en Agar Mac Conkey a temperatura refrigeración.. BI. Anexo 11. Unidades formadoras de colonias de Salmonella typhi desde las 0 hasta 14 horas en leche pasteurizada a temperatura de refrigeración.. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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