MICROBIOLOGIA DE LAS LESIONES PULPARES
CAMILO ANDRES CORREDOR BUSTAMANTE ALBEIRO FERNANDO TORRES ABRIL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCAS
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
MICROBIOLOGIA DE LAS LESIONES PULPARES
CAMILO ANDRES CORREDOR BUSTAMANTE ALBEIRO FERNANDO TORRES ABRIL
Trabajo de grado
Presentado como requisito parcial Para optar al título de
NOTA DE ADVERTENCIA:
Artículo 23 de la resolución No.13 julio de 1946.
MICROBIOLOGIA DE LAS LESIONES PULPARES
CAMILO ANDRES CORREDOR BUSTAMANTE ALBEIRO FERNANDO TORRES ABRIL
APROBADO
_
________________________ Dra. Margarita Chaves Clavijo
Bacterióloga MSc Directora.
______________________ ______________________
Dr. Fredy Gamboa Dra. Mery Santaella Bacteriólogo Ph. D. Bacteriòloga
MICROBIOLOGIA DE LAS LESIONES PULPARES
CAMILO ANDRES CORREDOR BUSTAMANTE ALBEIRO FERNANDO TORRES ABRIL
APROBADO
__________________________ ______________________ Ingrid Schuler. Janeth Arias
Bióloga Ph. D. Bacterióloga M.Sc=M. Ed
AGRADECIMIENTOS
Especialmente a nuestros padres, hermanas y amigos que apoyaron nuestro trabajo a través de nuestra carrera.
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Microfotografía al Microscopio Electrónico de Barrido mostrando.
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La pulpa es un tejido blando de origen mesenquimatoso con células especializadas, los odontoblastos, que se colocan periféricamente en contacto directo con la matriz dentinal. La íntima relación entre los odontoblastos y la dentina es una de las razones por la que la dentina y la pulpa deben considerarse como una entidad funcional, a veces denominada complejo dentino pulpar. (Cohen, 2006).
La pulpa constituye un sistema microcirculatorio cuyos componentes vasculares más grandes son las arteriolas y las vénulas. Ninguna arteria o vénula sale o entra de la pulpa. El tejido pulpar está protegido en su parte externa por el esmalte y la dentina y la dentina a nivel coronal, a nivel radicular por la dentina y cemento. Cuando algún agente externo genera una lesión a estos tejidos puede comprometer la integridad de la pulpa y ocasionar cambios inflamatorios o degenerativos a nivel de este tejido que puede variar en magnitud y severidad (Rodríguez 2008)
La pulpitis hace referencia a un estado inflamatorio de la pulpa que puede ser agudo o crónico y en distintas formas evolutivas según criterios clínicos o histopatológicos (Regezi , 2000)
La gran variedad anatómica y tisular existente en la cavidad oral, entre otros factores, hace posible la convivencia de diferentes ecosistemas microbianos, cada uno con características metabólicas y nutricionales específicas y todos ellos conviviendo dentro de un delicado equilibrio ecológico (Gutiérrez, et al 2004)
Ahora bien como comenta Rodríguez , (2008) ante el hallazgo de muerte pulpar y posterior daño a tejidos del periápice se cuestiona el origen de estos mismos a partir de factores iatrogénicos bacterianos o químicos, por tanto ellos determinaron cuales son los microorganismos que se hallan en estos dientes y pudiendo establecer su procedencia. Por esto mismo es de vital importancia y de conocimiento, saber que son propios de la enfermedad pulpar microorganismos que se ven vinculados en la etiología tales como:
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! y muchos otros.
La naturaleza polimicrobiana de las infecciones en la cavidad oral, permite que se produzcan fenómenos de simbiosis y de sinergia bacteriana. Hasta el inicio de la pulpitis, las bacterias implicadas serán principalmente aerobias; sin embargo su proliferación originará condiciones de anaerobiosis y la necrosis vasculonerviosa pulpar, creándose así condiciones favorables para el crecimiento de bacterias anaerobias facultativas y, posteriormente, de anaerobias estrictas principales responsables de los procesos infecciosos (Gutiérrez, 2004).
más importante sea la invasión bacteriana, en poco intervalo de tiempo, mayor será la respuesta inflamatoria reactiva. Sin embargo, más que el número, tiene mayor relevancia la capacidad que tengan las bacterias de multiplicarse (Canalda=Brau, 2006); Por tanto las bacterias pueden utilizar diversas puertas de entrada hacia la cavidad pulpar. En función de su magnitud y proximidad, la patología se instaura rápidamente o de forma prolongada.
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Realizar una revisión bibliográfica del tema: “Microbiología en lesiones pulpares”, y las metodologías aplicadas para la identificación de estos microorganismos relacionados en esta patología.
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Revisar las especies de microorganismos más frecuentes en lesiones pulpares.
Describir las características microbiológicas y ecológicas de los microorganismos presentes en lesiones pulpares.
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La cavidad oral se compone de un conjunto de tejidos, asociados a numerosos microorganismos constituyendo ecosistemas, con modificación constante. Según la composición de la microbiota y los tejidos se dividen en saliva, superficie epitelial del surco crevicular, superficie dental del surco crevicular, dorso de la lengua y epitelio bucal. Cuando este sistema ecológico esta en equilibrio se denomina eubiosis, y cuando se altera dicho equilibrio se conoce como disbiosis, correspondiendo a una boca enferma a partir de la cual puedan iniciarse procesos que desencadenen la destrucción del diente y o sus tejidos de soporte. (Fraile, 2003).
En la cavidad oral se pueden aislar más de 500 especies de microorganismos; la mayoría corresponde a la microbiota transitoria o de paso, quedando como microbiota residente o habitual unas 20 especies y predominado entre ellas la microbiota Gram positiva, principalmente los estreptococos del grupo componiendo el 90% de la microbiota oral. El resto de microorganismos presentes se distribuyen entre cocos Gram negativos como $ ; bacilos Gram positivos anaerobios ramificados como # ! bacilos Gram positivos como % y
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La flora bacteriana se instala en la cavidad oral en forma progresiva desde el nacimiento. El niño nace con una cavidad oral estéril y la primera contaminación se produce en el parto por las bacterias de la flora vaginal. Los siguientes microorganismos que colonizan son los que se encuentran en el ambiente en estado libre o que se trasmiten al niño por personas más cercanas a él. A los tres meses de vida aun se pueden encontrar en el 95% de la población. Con la erupción de los primeros dientes aparecen también nuevos hábitats para la colonización, como el esmalte dental y el surco gingival. Esto permite la aparición de nuevas
bacterias como ! # ' . En esta etapa los
anticuerpos maternos ya han desaparecido del suero del niño y este empieza a crear sus propias defensas inmunológicas, constituidas por inmunoglobulinas séricas IgA secretadas en la saliva. Cuando se produce la erupción de dientes permanentes, el período de recambio se acompaña de fenómenos inflamatorios, que permite que se favorezca la colonización de bacterias potencialmente patógenas. La conformación de la flora oral definitiva se concreta desde la adolescencia, en donde los cambios hormonales permiten el crecimiento de la mayoría de & La
prevalencia de y " es
especialmente elevada, pero la prevalencia de # y
7 7
La pulpa dental es el tejido blando localizado en el centro del diente; forma, soporta y está rodeado por dentina. En general, se considera a la pulpa como un tejido blando laxo especializado. La pulpa dental alberga un gran número de elementos titulares, incluido los nervios, el tejido vascular, fibras de tejido conectivo, sustancia fundamental, líquido intersticial, los odontoblastos, los fibroblastos y otros componentes celulares menores. (Walton, 1996).
La función primaria de la pulpa es formativa, debido a que de ahí surgen los odontoblastos que forman la dentina. En el desarrollo temprano del diente, los odontoblastos también interactúan con las células del epitelio dental para formar esmalte. Después de la formación dental la pulpa proporciona varias funciones secundarias relacionadas con la sensibilidad, hidratación y defensa del diente. (Walton, 1996).
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Durante toda su vida la pulpa lleva a cabo cinco funciones:
Inducción:
Formación
Los odontoblastos forman dentina; estas células altamente especializadas participan en la formación de dentina de tres maneras: a) al sintetizar y secretar matriz orgánica; 2) al transportar de manera inicial componentes inorgánicos a la matriz de nueva formación. 3) al crear un ambiente que permita la mineralización de la matriz. Durante el desarrollo temprano del diente, la dentogènesis primaria por lo general es un proceso rápido después de completar la maduración dental, la formación de dentina continúa de una forma mucho más lenta y en un patrón menos simétrico. (Walton, 1996).
Nutrición
Por medio de los túbulos dentinarios, la pulpa suministra nutrientes que son esenciales para la formación de dentina e hidratación. (Walton, 1996).
Defensa
La pulpa también tiene la capacidad de producir una respuesta inflamatoria e inmunológica en un intento por neutralizar o eliminar la invasión de la dentina por microorganismos causantes de caries y sus productos. (Walton, 1996).
Sensibilidad
A través del sistema nervioso la pulpa trasmite las sensaciones mediadas por el esmalte o dentina a los centros nerviosos más altos, estos estímulos se expresan a nivel clínico como dolor, aunque estudios fisiológicos y psicofisiológicos indican que la pulpa también siente temperatura y tacto. También trasmite sensaciones de dolor profundo causado por enfermedad, principalmente de tipo inflamatorio. (Walton, 1996)
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La exposición pulpar directa, sea de origen traumático, como la fractura coronaria o iatrogénica causada por procedimientos operatorios, rompe la barrera física impuesta por las estructuras dentarias, poniendo la pulpa en contacto con el ambiente séptico de la cavidad oral (Estrela, 2005)
Debido a la exposición de la pulpa a la flora oral, ésta y su dentina circundante
suele dar a lugar al desarrollo de lesiones perirradiculares y, en ocasiones laterales. (Cohen, 1999)
Si la pulpa queda expuesta, como ocurre por ejemplo en la caries esta queda expuesta a toda flora oral. Los estreptococos alfa=hemolíticos, los . Y % . Son los que se encuentran con más frecuencia. A medida que aumenta el espesor de la pulpa necrótica, se establece un mayor número de especies anaeróbicas obligadas, entre las cuales se incluyen los cocos anaeróbicos Gram positivos y los bacilos Gram negativos, que son favorecidos por la baja concentración de oxigeno existente en las zonas necróticas de la pulpa (Cohen, 2002)
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*+'-Se producen a través de la interface existente entre el material de restauración y el diente. Errores en la técnica operatoria, como adaptaciones inadecuada en los márgenes de la corona a la línea de terminación del tallado, errores en el manejo de los materiales de obturación, o la fatiga o alteraciones de los mismos que se produce con el paso del tiempo, pueden dar lugar a discrepancias significativas en el material de restauración y la estructura dentaria restaurada. (Liébana, 2002).
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Independientemente de las vías de entrada, una vez que han penetrado en el tejido pulpar, las bacterias colonizan, se multiplican y contaminan todo el sistema radicular. Dependiendo del nivel de la concentración de oxigeno y de la presencia o ausencia de los nutrientes esenciales en el sistema radicular, existen grupos específicos de bacterias que sobreviven y forman la flora de los canales radiculares infectados. (Adriaens, 1988)
Las bacterias anaerobias producen ácidos grasos de cadena corta, como el ácido propiónico, butírico e isobutírico. Estos son factores de virulencia que afectan la quimiotaxis de los neutrófilos y la fagocitosis. Estas bacterias están en un estado dinámico influido por la interacción entre las bacterias y el hospedero. Aunque esta microbiota es menos compleja que la microbiota subgingival, se produce una serie de relaciones ecológicas interbacterianas. (Walton, 1996).
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El acceso de microorganismos a la estructura pulpar se puede dar básicamente por el acceso vía túbulos dentinarios y a través de vías periodontal y hematógenas.
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numerosos túbulos expuestos. La lentitud de la invasión de la dentina viable por las bacterias pueden deberse a la presencia de factores de resistencia naturales en la dentina y tejido pulpar. (Liébana, 2002).
Hoshino (1992) utilizaron procedimientos anaeróbicos para comprobar la rápida invasión bacteriana de las pulpas dentales no expuestas, las cuales se cubrían con dentina clínicamente sana por debajo de las lesiones producidas por caries. Seis de cada nueve dientes sufrían invasión bacteriana, siendo los organismos predominantes los anaerobios obligados.
La presencia de bacterias, de sus productos derivados y de otros irritantes en los túbulos dentinales suelen generar respuestas inflamatorias en el tejido pulpar. La inflamación de la pulpa también puede producirse cuando los túbulos dentinales transportan sustancias irritantes desde las caries incipientes a la pulpa o cuando los túbulos contienen y permiten el paso de los microorganismos existentes bajo los materiales dentales de restauración o cerca de las bolsas periodontales. (Cohen, 2006).
La eliminación del cemento durante el tratamiento periodontal puede exponer numerosos túbulos dentinales a la flora oral, lo que en ocasiones permite que los microorganismos penetren el tejido pulpar. La producción de un barrillo dentinario durante la manipulación de la raíz, así como los iones de calcio y fósforo de la saliva, pueden retardar la invasión de los túbulos dentinales por los microorganismos orales. (Cohen, 2006).
radiculares se instrumentan durante el tratamiento endodóntico, siempre se forma esa capa en las paredes del canal.
La mayoría de autores opinan que las bacterias productoras de ácido invaden los túbulos y desmineralizan las paredes. Las especies proteolíticas, que actúan sobre la matriz orgánica, la cual es denudada en los túbulos dentinales ensanchados, los ácidos, metabolitos y productos tóxicos se difunden más rápidamente que las bacterias, con lo cual los odontoblastos resultan afectados y, posiblemente, destruidos. Si las bacterias pueden ser eliminadas en su avance, es posible conseguir la curación. La caries dental es la causa más común de las lesiones pulpares, y muchas reacciones de la pulpa pueden ser infecciones prolongadas de los túbulos dentinales, que se originan desde el fondo de la cavidad y las paredes como consecuencia de la filtración de materiales de relleno. Si no se tratan, las bacterias acaban por afectar el tejido pulpar y dan lugar a la inflamación. El número de bacterias aumenta, los leucocitos neutrófilos polimorfonucleares se infiltran y se forma un absceso, provocando la muerte del tejido pulpar. (Cohen, 2006)
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Muchas veces tenemos una injuria y/o compromiso pulpar en dientes con ausencia de caries (coronas íntegras) y con presencia de restauraciones. Las piezas dentarias comprometidas periodontalmente, suelen sufrir una invasión microbiana proveniente de microorganismos presentes en las bolsas periodontales y que tiene acceso a la pulpa mediante los conductos laterales, conductos accesorios y a través del delta apical, (De Lorenzo 2004., Liébana, 1997).
Existen múltiples anastomosis entre vasos sanguíneos y linfáticos de la pulpa y del periodonto, lo que facilita el pasaje de los microorganismos. (Liébana 1997).
Adriaens (1988) examinaron la presencia de bacterias en la dentina de dientes con complicaciones periodontales y las comparó con la dentina de dientes sanos, encontrando más microorganismos en la dentina y pulpa de los dientes con compromiso periodontal. La eliminación del cemento durante un tratamiento periodontal puede exponer numerosos túmulos dentinarios a la flora oral, permitiendo que los microorganismos penetren hasta la pulpa.
como ( , les garantiza las condiciones ecológicas para llegar hasta la pulpa y eventualmente colonizarlas.
Existe una relación causa=efecto entre la infección del canal radicular, lesiones perirradiculares o laterales y la penetración de las bacterias en la dirección opuesta (hacia la pulpa). Teóricamente, los canales laterales limpios y el foramen apical adyacente a las bolsas periodontales deberían proporcionar el acceso a los microorganismos orales al sistema del canal radicular. Cuando se infecta la pulpa a través del foramen apical, un requisito previo parece ser siempre la existencia de un mal estado de la pulpa para que se produzca la infección. Grossman (1967) aplico
sobre la encía labial de dientes de perros y monos, y los traumatizo con una pesa metálica. Al encontrar este microorganismo en el tejido pulpar, llego a la conclusión de que el ligamento periodontal proporcionaba una vía para el paso de estos organismos hacia el tejido pulpar. (Cohen, 1999)
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Cuando la pulpa se infecta a través de cualquiera de los mecanismos explicados, el mal estado de ésta es prerrequisito para que se produzca dicha infección. Cuando tienen lugar infecciones retrógradas, generalmente están involucradas pocas especies bacterianas (Liébana, 2002).
En los casos de necrosis asépticas (que se puede producir por la supresión de la irrigación sanguínea) motivada por un traumatismo, el tejido necrótico se mantendrá libre de bacterias hasta su posterior infección, la cual se puede dar por cualquiera de las vías antes ya expuestas. (Adriaens, 1988)
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Ha sido reconocido ampliamente que los microorganismos juegan un papel fundamental en el desarrollo y mantenimiento de las patologías pulpares y periapicales. Normalmente la pulpa dental es un tejido estéril y está principalmente involucrada en la producción de dentina y en la sensibilidad del diente. (Kettering J, 1999).
Cualquier lesión de la pulpa puede desencadenar una respuesta inflamatoria de la misma. Si bien los irritantes pueden ser de naturaleza física, térmica o química, los microorganismos son considerados el principal agente etiológico. Las patologías pulpares y periapicales suelen ser un resultado directo o indirecto de la presencia de bacterias y otros microorganismos en el medio bucal. (Dahlen 2000).
periapical, las respuestas de los tejidos ante estos agresores y los métodos utilizados para controlar y erradicar las infecciones del sistema de conductos radiculares. (Love . 2002).
La pulpa y la dentina forman un complejo funcional el cual es protegido tanto por sustancias exógenas de la cavidad bucal como por estructuras dentarias (el esmalte y el cemento). Cuando el complejo dentino=pulpar es infectado, los tejidos reaccionan en contra de los microorganismos invasores a fin de erradicarlos. La capacidad de este complejo de realizar esta función no ha sido subestimada, ya que los tejidos están dotados con procesos inmunocompetentes. Sin embargo, en términos clínicos, si la infección no es erradicada a través de esos procesos naturales o procedimientos operatorios, los microorganismos invaden el complejo dentino=pulpar venciendo las defensas y causando la enfermedad pulpar, e infectando la cámara pulpar y el sistema de conductos radiculares. (Love . 2002).
El sistema de conductos radiculares está en abierta comunicación con los tejidos periapicales (ligamento periodontal, cemento y hueso alveolar) por las vías del foramen apical, conductos laterales y accesorios. Los metabolitos y productos tóxicos son producidos principalmente por las bacterias presentes dentro del sistema de conductos radiculares y se difunden a los tejidos periapicales desencadenando la respuesta inflamatoria (periodontitis apical), la cual se caracteriza por resorción del hueso alveolar. La enfermedad periapical inducida por microorganismos por lo general comienza como una inflamación de tipo crónico y se manifiesta histopatológicamente como un granuloma. (Love 2002).
de caries, procedimientos restauradores o periodontales, fisuras de esmalte o dentina, o traumatismo dental. (Peters . 1995). El avance de las bacterias del proceso carioso traerá como consecuencia la infección de la pulpa dental y del sistema de conductos radiculares y el consecuente desarrollo de lesión perirradicular. Sin embargo, las bacterias asociadas a la caries dental difieren de las asociadas a la infección pulpar. (Love . 2002)
2 =
El medio endodóntico es un sistema complejo y dinámico. Complejo, púes tenemos el conducto radicular, con sus características particulares en cuanto a forma y a distribución (conductos amplios, atrésicos, curvos, rectos, bifurcados, conductos accesorios, conductos laterales, deltas apicales) conforman una red amplia de “microambientes” de difícil acceso y que favorecen (por contener tejido necrótico como fuente de nutrientes) el crecimiento de microorganismos. Dinámico, pues los microorganismos implicados en una lesión inicial de la pulpa no serán los mismos que se encuentren en una necrosis pulpar, en la que se forma un ecosistema radicalmente diferente. En este medio ambiente particular, que es el endodóntico, cobra importancia el concepto de sucesión microbiana (Liébana, 1997).
Con la evolución del proceso infeccioso, estas bacterias van consumiendo gradualmente el oxígeno presente en el medio y las condiciones en el interior del conducto se van paulatinamente alterando, favoreciendo el desarrollo de bacterias anaerobios estrictos, siendo la mayoría de éstas Gram negativas y proteolíticas. (De Lorenzo 2004, Kawashima, 1996).
La particularidad de estas bacterias, tales como: !
, es su ubicación inicial en el periápice, región de la cual pueden obtener fácilmente el exudado rico en contenido proteico y en donde las condiciones de anaerobiosis son las más propicias. Con el desarrollo de la necrosis, éste exudado pasa a todo el canal, aportando el contenido proteico y permitiendo el predominio de estas bacterias a lo largo de todo el sistema endodóntico. (De Lorenzo 2004, Kawashima, 1996). Toda infección endodóntica es de carácter polimicrobiana. (Brook . 1996).
Los anaerobios no son encontrados en cultivos puros porque su naturaleza sinérgica requiere de nutrientes específicos para su crecimiento, los mismos que son aportados por otro tipo de microorganismos. (Sundqvist, 1992).
> 2 7 7 =
Para que un microorganismo logre su objetivo deben darse ciertos requerimientos:
Los microorganismos deben estar presentes en cantidades suficientes para iniciar y mantener una lesión periapical
Deben localizarse espacialmente en el canal radicular para que sus factores de patogenicidad alcancen los tejidos periapicales
El canal radicular debe permitir la supervivencia y crecimiento de los microorganismos.
Las relaciones antagónicas entre los microorganismos no deben darse o presentarse en baja proporción.
El huésped debe defenderse, inhibiendo la diseminación de la infección, éste proceso puede resultar en daño del tejido periapical. (Siqueira . 2002).
Los microorganismos que componen la microflora oral, coexisten en ecosistemas primarios que están regulados por una serie de factores conocidos como determinantes ecológicos que son de cinco tipos: (Liébana, 1997).
Fisicoquímicos
De adhesión, agregación y coagregación Nutricionales
Protectores del huésped Antagónicos interbacterianos
- /*4 06 /*-,
a) Humedad
b) pH
En la cavidad oral en condiciones normales oscila entre 6.7 y 7.5, pero constantemente esta sometido a variaciones que afectan el metabolismo bacteriano. (Liébana, 1997).
c) Temperatura
La temperatura oral está próxima a los 37º C pero tiende a variar transitoriamente por la ingesta de alimentos calientes o fríos por lo que se eliminan microorganismos de forma transitoria. (Liébana 1997).
d) Potencial de óxido=reducción
El hábitat de los gérmenes anaerobios tiene una baja tensión de oxígeno y un potencial de óxido reducción disminuido, resultado de la actividad metabólica de los microorganismos que consumen oxígeno mediante su respiración. (Liébana 1997).
/(* '- 3' 3?'- 5+@ ' / 5+ A * ' / 5+
a) 3?'- 5+
Es la interrelación que se da entre los microorganismos y el huésped, lo que permite la colonización de los tejidos.
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Unión entre bacterias de la misma o diferente especie
respectivamente que les permite acumularse y formar colonias. (Liébana 1997).
coagregarse con la mayoría de las bacterias orales (Sundqvist G. 1992).
( / *+
'-La microbiota oral obtiene sus nutrientes de tres fuentes distintas: de los tejidos o secreciones del huésped (fuentes endógenas), de otros microorganismos (fuentes interbacterianas) y de la dieta alimentaría (fuentes exógenas). (Liébana, 1997)
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Son todos aquellos factores que limitan por parte del huésped el ingreso penetración y colonización bacteriana tales como: Integridad de mucosas y del tejido dental, masticación, deglución, tejidos linfoides, y la saliva por su acción mecánica, química e inmunitaria. (Liébana, 1997).
+( 5+ /*- +(' 6 / *
+*-A nivel microbiano se dan relaciones entre especies bacterianas que determinan la supervivencia de unas y la eliminación de otras lo cual llega a establecer un tipo de microflora determinado. (Liébana, 1997).
2*3' *- 3' ' / 5+ 6 / * +
a) ' / *+' .* ( )
-on relaci-ones en que dos microorganismos obtienen ventaja de la asociación. Entre las relaciones positivas destaca el mutualismo o simbiosis. (Liébana, 1997).
b) ' / *+'- +' ( -
En esta relación, ninguna de las especies se ve afectada, se puede obtener ventaja de una de ellas pero sin perjudicar a la otra. Entre ellas el comensalismo, en la que se destaca la presencia de anfibiontes, los cuales son microorganismos que mantienen una relación comensal con otro, pero que en determinadas condiciones , como por ejemplo una disminución en la capacidad de defensa del hospedador, pueden llegar a establecer una relación de parasitismo.(Liébana,1997).
c) ' / *+'- +' ( )
-Se dan cuando uno de los microorganismos se ve perjudicado por la relación con otro microorganismo. La principal relación negativa es la antibiosis o antagonismo que se da cuando un microorganismo impide el crecimiento de otro, obteniéndose de esta forma una ventaja ecológica ya que se disminuye la competencia. Esto se da por la producción de bacteriocinas que son sustancias inhibitorias del crecimiento de otras bacterias, entre las que se pueden citar las mutacinas que son bacteriocinas producidas por algunas cepas de orales. (Liébana, 1997).
el parasitismo en que una de las especies vive en o sobre la otra obteniendo beneficio del hospedador a costa del perjuicio de éste. Un ejemplo de relación negativa es la que se da cuando determinadas especies de estreptococos orales que producen peróxido de hidrógeno, ejercen una acción tóxica sobre otras bacterias que carecen de sistemas detoxicantes. (Liébana,1997).
Los lactobacilos y los estreptococos son importantes productores de bacteriocinas, que juegan un papel muy importante en la ecología de la microflora de la mucosa oral. Esta producción de bacteriocinas puede inhibir el acceso de bacterias exógenas a la cavidad oral y al tracto respiratorio. (Sundqvist G. 1992).
De esta forma se ha observado que, las interacciones microbianas tanto positivas como negativas, pueden regular significativamente la presencia de diferentes especies microbianas en un mismo nicho (Sundqvist G. 1992).
Se han reportado varias asociaciones bacterianas en conductos radiculares de dientes necróticos, entre ellos: con
, ! y
. es afín a
! y
; mientras que se ha observado que inhibe el crecimiento de . (Sundqvist G. 1992).
Algunas combinaciones de bacterias resultan más potentes que otras, por
ejemplo, la unión entre ! ! y
utilizando únicamente , indujo una modesta destrucción periapical en comparación con la combinación entre !
y , que demostró ser mas agresiva. (Liébana, 1997).
! /( ) 3 3 +C 6D( / /(' +
Hoy en día se asume que la microbiota endodóntica está representada, principalmente, por microorganismos Gram negativos, los cuales viven, se multiplican y eventualmente mueren en el conducto radicular infectado, liberando en este proceso endotoxinas. La actividad endotóxica está fuertemente relacionada con la presencia y el número de bacterias Gram negativas en el canal radicular (Pajari 1993) éstas en un determinado momento, pueden superar el foramen apical e iniciar una lesión a ese nivel. (Dalby, 2000).
Las endotoxinas contenidas en la pared celular de las bacterias Gram negativas son las sustancias responsables de los mecanismos inflamatorios que se desencadenan a nivel pulpar. Son liberadas al medio después de la desintegración de la bacteria, lo que produce diversos efectos biológicos, como fiebre o estimulación de la actividad linfocítica. (Dalby, 2000).
Algunos microorganismos anaerobios producen enzimas extracelulares como colagenasas y proteasas que al parecer estimulan la invasión bacteriana de los tejidos. (Dalby, 2000).
2 2 2E
7 7
Son bacterias pleomorfas que aparecen con formas muy variables: en huso, globulosas, redondeadas, finas, etc. Son moderadamente sacarolíticas, aunque sintetizan material de reserva intracelular a expensas de polímeros de glucosa. Sus fuentes nutricionales y energéticas mas importantes provienen del catabolismo de péptidos y aminoácidos, elaborando como producto metabólico final especialmente acido butírico. A diferencia de otros bacilos Gram negativos anaerobios estrictos son resistentes al verde brillante. Puede aislarse como hábitat primario en la cavidad oral y además aislarse del intestino, vías respiratorias aunque se encuentra por lo general en el surco gingival. (ANEXO 1) (Liébana 2002).
,
Comprende bacterias asacarolíticas, es decir que no metabolizan los hidratos de carbono ni por la vía de Embden=Meyerhof=Parnas (glucólisis) ni por la ruta pentosa de fosfatos, debido a que carecen de enzimas como la glucosa= 6=fosfato deshidrogenasa y gluconato=6=fosfato=deshidrogenasa. Emplean compuestos nitrogenados como fuentes energéticas, no se desarrollan en presencia de bilis al 20%. Este microorganismo se encuentra en el surco gingival, de forma especial cuando hay lesiones periodontales avanzadas; mas raramente puede detectarse, quizás a modo de reservorio, en el dorso de la lengua, amígdalas y saliva. No se le considera como parte integrante de la microbiota oral normal sino como un patógeno exógeno ausente en individuos sanos. Se le relaciona con multitud de procesos patológicos: gingivitis, pulpitis, abscesos periodontales y periapicales. Para su aislamiento, los medios de cultivo deben incluir vitamina K y de forma especial, por su dependencia del hierro, hemina o sangre, habitualmente a de carnero lacada, esto es, congelada y descongelada para que, al romperse la membrana de los hematíes, se liberen mejor los nutrientes. Para hacer los medios selectivos se añaden antibióticos no activos sobre ) es el caso de kanamicina, tobramicina, acido nalidíxico, colistina o bacitracina (medio preconizado por Hunt). Las colonias, claramente diferenciadas, aparecen tras una incubación de al menos 48 horas a 36 +/= 1 °C; muestran la típica pigmentación marrón oscura o negra y no fluorescente bajo una luz ultravioleta. Las características para su identificación, son aparte de las del género, la producción de indol a partir del triptófano y el hecho de poseer una enzima proteolítica semejante a la tripsina que hidroliza un sustrato incoloro, la Benzoil.D=L= arginina=B –naftilamida (BANA) dando origen a un compuesto coloreado (B=naftilamida). (Liébana, 2002).
Capsula: es de naturaleza polisacárida que aparte de permitir la subdivisión de la especie en seis serotipos, tiene una acción antifagocitaria por su efecto antiopsónico.
Membrana externa: tiene gran interés fisiopatológico por poseer proteínas que se comportan como adhesinas que participan en fenómenos de adhesión y coagregacion bacteriana y, por tanto, en la colonización de células epiteliales y fibroblastos y en la formación y mantenimiento de la placa subgingival. Con respecto a esto ultimo cabe destacar los procesos
coagregativos de con #
(Liébana, 2002).
La endotoxina asociada al lipopolisacárido (LPS) cuya actividad endotóxica, con respecto a otras bacterias Gram negativas, no parece muy importante. Formar vesículas superficiales que se liberan con facilidad del resto del soma celular; dichas vesículas atraviesan barreras impermeables a la célula completa y transportan, de esta forma, factores de virulencia que serian trasladados a distancia. (Liébana, 2002).
Fimbrias: como las proteínas de la membrana externa y con sus mismas consecuencias, se comportan como adhesinas e intervienen en fenómenos de coagregacion y adhesión a superficies epiteliales y dentales, en este caso con la mediación de la saliva. (Liébana, 2002).
impedinas, desempeñan un papel importante en el surco gingival para producir periodontitis. (Liébana, 2002).
Otros compuestos proteicos: es el caso de la superóxido dismutasa, que permite a resistir la acción oxidante de los radicales superoxido generados en el interior de los leucocitos polimorfonucleares. Otras exoenzimas que también contribuyen al daño tisular como hialuronidasa, fosfatasa alcalina; y una exotoxina del tipo epiteliotoxina de gran importancia en el proceso penetrante de los tejidos. (Liébana, 2002).
Metabolitos tóxicos tisulares: son ácidos grasos de cadena corta, amoniaco, compuestos azufrados volátiles, metilmercaptano, que aumenta la permeabilidad de la mucosa oral. (Liébana, 2002).
Moléculas antibacterianas: muchos de los metabolitos citados ejercen un efecto competitivo con otras bacterias; a ellos hay que añadir la producción de bacteriocinas por parte de algunas cepas de . Todas estas moléculas están implicadas en las amplias interrelaciones que las bacterias establecen en la cavidad oral. (ANEXO 2) (Liébana, 2002).
Comprende bacterias moderadamente sacarolíticas por la vía Embdem Meyerhof Parnas pero no metabolizan los glúcidos por la vía de las pentosas fosfato ya que carecen de las enzimas glucosa=6 –fosfato deshidrogenasa y gluconato=6 –fosfato= deshidrogenasa. No se desarrolla en presencia de bilis al 20%. Son resistentes a la vancomicina.
Especies pigmentadas:
! ! ! ! !
relaciona con mayor o menor grado con multitud de procesos, como infecciones pulpares, absceso periapical, alveolitis, etc. En la mayoría de los casos su patogenicidad no es muy bien conocida, de forma que participarían en estos procesos unidas a otras bacterias de carácter sinérgico. Con respecto a las enfermedades periodontales la mas implicada son
cuyas colonias al contrario de , emiten fluorescencia; la primera especie esta presente en el surco gingival en una de cada dos personas con buena salud periodontal y su prevalencia pasa a tres de cada cuatro sujetos con problemas de gingivitis o periodontitis; por ello resulta difícil atribuirle un papel claro como periodontopatogena; con respecto a se aísla aun con mayor frecuencia en individuos
sanos. ! ! se han descrito fimbrias
como adhesinas y residuos proteicos y glucoproteicos superficiales, pueden actuar como receptores de otras adhesinas. También se ha comprobado la capacidad para degradar inmunoglobulinas, su acción toxica sobre los fibroblastos y su actividad fibronolítica. La boca es un reservorio habitual para estas bacterias. Especies no pigmentadas (Koneman. 1999).
Son ! ! ! !
+ ! La mayoría de ellas tienen como
hábitat primario el surco gingival, algunas especies son más abundantes en las enfermedades periodontales aunque su grado patógeno real se desconoce. (ANEXO 3) (Liébana, 2002).
cerebro y los senos, pleuropulmonares, peritoneales, etc. También se detectan con el mismo carácter con lesiones de caries de dentina, formas avanzadas de periodontitis, abscesos de origen dental, conductos radiculares infectados, etc. Ante una identificación preliminar de cocos Gram positivos anaerobios, la sensibilidad mediante la técnica de disco=placa a polianetol sulfonato sódico (SPS) indica la identificación de
, la fácil diferenciación de este último por su morfología microscópica (tamaño) y porque se identifica muy bien con los micrométodos que detectan enzimas preformados, un cromatograma abigarrado, incluyendo hasta ácido isocaproico en los productos finales del metabolismo. Únicamente en el caso de la cromatografía separa un género y una especie concreta, en el resto, y según los últimos cambios taxonómicos, los productos finales del metabolismo son los mismos para los distintos géneros. Aquí se da la paradoja de que con los caracteres fenotípicos usualmente estudiados, hay que llegar al diagnóstico de especie para poder llegar al género adecuado. Cuando esto no sea posible, quizás sea bueno conocer en que grupo se está. (ANEXO 4) (Alcalá , 2004).
Sus colonias en agar sangre son α y γ hemolíticas y excepcionalmente β= hemolíticas. En su estructura antigénica hay que destacar que poseen los polisacáridos parietales c, e y f, y, proteínas asociadas a la mureina conocidas como antígenos I y II estas proteínas u otras similares participan en procesos adhesivos: a) como adhesinas interactuando con receptores de la película adquirida, tales como proteínas ricas en prolina. b) como glucosiltransferasas y receptoras de glucano en fenómenos agregativos y coagregativos entre bacterias que colonizan los dientes. (Liébana, 2002).
Los factores de virulencia a destacar son: a) Síntesis de polisacáridos intracelulares.
b) Síntesis de polisacáridos extracelulares de tipo glucano insolubles y solubles y fructanos
c) Movilización de polisacáridos intracelulares por glucógeno fosforilasa y extracelulares solubles por dextranasas y fructanasas.
d) Poder acidogeno, acidofilo y acidurico, inicio de crecimiento a pH 5 y corto efecto post=pH.
e) Importante capacidad adhesiva por las proteínas parietales, que facilitan su adhesión en superficies duras en ausencia de glucanos, agregativa y coagregativa, a través de glucanos y proteínas receptoras de glucanos.
Pertenecen a este genero numerosas especies, la mas frecuente en patología humana es , seguida de
. Se asocian en parejas y cadenas cortas; en cultivo son muy parecidas a los estreptococos. Pertenecen al serogrupo D pero fueron separadas de los estreptococos por carácter quimiogénico. Sus factores de virulencia no son muy bien conocidos. Su hábitat es el intestino. Producen una gran variedad de procesos infecciones extraorales que plantean un problema particular de tratamiento antibiótico. Por su metabolismo anaerobio son intrínsecamente resistentes a los aminoglucósidos que, sin embargo pueden penetrar si se unen a otros compuestos que inhiben la síntesis del peptidoglucano al ingresar en el interior de las bacterias, pero aun así no serán útiles si las cepas muestran altos niveles de resistencia por la producción de enzimas inactivantes; por otra parte, las cefalosporinas no son eficaces por la baja afinidad de sus PBP a las misma. (Koneman, 1999).
origen pulpar. se puede encontrar asociado a
! % y otras bacterias facultativas así como bacterias anaerobias lo que puede crear una flora mixta aun más virulenta. (Liebana 2002).
Las especies crecen como células de levaduras típicas de 4=6 [m redondas u ovaladas con gemación en la mayoría de las condiciones y en casi todas las temperaturas, crecen en condiciones de anaerobiosis en medios de cultivo a pH con rango entre 2,5 y 7,5 y la temperatura oscila entre 20o y 38o, el crecimiento de colonias se puede detectar entre 48 y 72 horas después de la siembra. (Liébana, 2002).
Los microorganismos del genero son oportunistas se encuentran como comensal en la cavidad bucal, intestino, vagina, secreción bronquial y piel del hombre. Las colonias de esta especie se observan macroscópicamente: color crema cerosa, húmedas, redondas. Y microscópicamente son blastosporas redondas u ovales. (Liébana, 2002).
colonizar el hospedero y ocasionar daños de forma directa al activar, resistir o desviar los mecanismos de defensa del mismo. Estos atributos que contribuyen a la patogénesis de incluye la morfogénesis (transición entre las células levaduras unicelulares y las formas de crecimiento filamentosas), las enzimas secretadas aspartil proteasas (SAP) y fosfolipasas y las biomoléculas de reconocimiento del hospedero (adhesinas), que le permiten iniciar el proceso de formación de biopeliculas. Así mismo, el cambio de fenotipo se acompaña por alteraciones en la expresión de antígenos, morfología colonial afinidades de a los tejidos. (Castrillon et al 2005)
es un microorganismo muy versátil, por su capacidad para sobrevivir como comensal en varios sitios anatómicamente distintos como la piel, intestino, cavidad vaginal y oral. En el esputo expectorado y en la vejiga urinaria de los pacientes con catéteres a permanencia; ya que en promedio del 25 al 30% de los individuos son portadores de C. albicans en estas cavidades. Además de el reservorio endógeno (cavidades naturales del hombre), también se puede adquirir de fuentes exógenas y se aíslan de superficies ambientales. (ANEXO 7) (Bonardello 1999).
,
7 +/ . '- B+' *- A -.'/ '- 3' 2 / * *(
Tabla 1. Principales géneros y especies de microbiota oral C&.+ 55 D
2 2 7
7 7
de la colonización de la pulpa dental a partir de la invasión del torrente sanguíneo en ausencia de inflamación (anacoresis) Bajo este reporte se pudo sustentar con resultados que por primera vez la colonización por
en la pulpa dental por vía sanguínea es un hecho. Su trabajo fue desarrollado en inicio con la inoculación intraperitoneal en conejillos de indias y posteriormente con la técnica de amplificación PCR y secuenciación directa, fue recuperada hasta en un 50 % de los animales.
. es un bacilo no fermentativo, anaeróbico, Gram negativo, que crece en agar sangre formando colonias pequeñas, circulares, transparentes, lisas, y brillantes. Se ha recuperado de la profundidad de la cavidad periodontal y se ha relacionado la enfermedad periodontal con el microorganismo, Doan, (2000), hace referencia a la identificación por la técnica de PCR a partir de la muestra periodontal. Cabe destacar que previamente al realizar pruebas bioquímicas no hay consistencia para la identificación de . además que no es frecuente encontrar tal microorganismo en la placa subgingival ya que es muy poco lo reportado. Por esto Doan y colaboradores dieron a conocer una identificación definitiva de . como un organismo que se encuentra en muestras de placa subgingival, así como desarrollar un método de detección PCR para . y comparar la eficacia entre los métodos de detección entre medios de cultivo y PCR.
Otro tipo de microorganismo rara vez encontrado en lesiones pulpares es
que murieron por la “plaga dental” de la época. El uso de PCR para la extracción de ADN antiguo e incorporación de primers específicos para el gen humano beta=globina demostró la ausencia de inhibidores. La incorporación de primers específicos para / & (el gen codificante de la subunidad=beta para la ARN polimerasa) y asociado a la virulencia (gen codificante para la activación del plasminógeno) con esto se logro obtener una indistinguible secuencia de nucleótidos para su identificación de la bacteria. También dedujeron los autores que a partir de la pulpa dental promete ser un blanco atractivo para determinar la etiología de enfermedades septicémicas ancestrales. (Drancourt .1998).
Otros microorganismos son: & ! % !
0 ! % ! #
! 0 ! % !
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2'3 *- 3' / ( )*
Son preparados que intentan reproducir artificialmente las condiciones del hábitat natural de los agentes bacterianos. Sus componentes deben cubrir todas las necesidades nutricionales de las bacterias que se van a estudiar y deben incorporarse en una mezcla justa y equilibrada. (Liébana, 2002)
Clasificación de los medios de cultivo se hace en función de su contenido, de su estado y de su utilidad, según Liébana (2002)
1. Según su contenido.
a.) Definidos o sintéticos: Se conoce perfectamente la composición química, ya que se elaboran añadiendo productos puros e individualizados.
b.) No sintéticos o empíricos: No se conoce la composición exacta; se prepara con extractos de carne, de levadura, peptonas etc. su empleo se basa en la experiencia y son los medios más utilizados (ej., agar cerebro corazón o agar Mueller Hilton)
2. Según su estado.
b.) Semisólidos: Contienen agar en escasa proporción (menos del 1%) se utilizan como medios para analizar alguna característica especial de las bacteria, como por ejemplo la movilidad o la capacidad oxidativa fermentativa. También se emplean como medios de transporte de muestras clínicas (ej., medio Stuart)
c.) Sólidos: Se obtienen agregando agar al medio liquido en una cantidad suficiente para que solidifiquen, según su utilización, se distribuyen en tubos o platos de petri, se utilizan principalmente para pruebas de identificación bioquímica (ej., bilis esculina agar)
3. Según su utilización:
a.) Básicos o comunes: Son aptos para las bacterias no exigentes y contienen los nutrientes mínimos para el desarrollo.
b.) Enriquecidos: Son medios básicos que se suplementan con sustancias muy nutritivas para bacterias exigentes, como la sangre, el suero, etc.
c.) Selectivos: Estos medios permiten el crecimiento de algunas bacterias e inhiben el de otras se utilizan en casos que interese recuperar ciertos tipos de microorganismos y se desee impedir el crecimiento de otros.
Cada microorganismo requiere una variedad de condiciones especiales para su crecimiento. Para conseguir su desarrollo, es fundamental otorgarle tanto condiciones físico=químicas óptimas como un medio de cultivo que contenga los nutrientes necesarios para su multiplicación. (ANEXO 9) (Liébana 2002).
+D - - 2 / * * 5 /*
Reconociendo la evidencia de la participación de los microorganismos en el establecimiento y manutención de los procesos en el conducto radicular y en la región periapical, el análisis microbiológico como recurso de la determinación del efecto terapéutico no se constituye en técnica de rutina en las clínicas de endodoncia y en instituciones académicas (Siqueira, 1997). Los procedimientos microbiológicos, relativos a la recolección, transporte, siembra e incubación, con el objeto de preservar y propagar los microorganismos anaerobios presenta poca practicidad, son costosos y consumidores de tiempo; las técnicas genéticas presentan restricciones a nivel de la practica y evaluaciones clínicas; el resultado negativo puede expresar falta de sensibilidad de la técnica; el uso de eficientes sustancias antimicrobianas durante el tratamiento químico=mecánico y en la medicación intracanal optimizan el control microbiano. Aun con aquellas limitaciones, actualmente el análisis microbiológico con base en el cultivo de microorganismos oriundos del conducto radicular parece constituirse en recursos de laboratorio valioso en el contexto de la técnica endodóntica. (Estrela 2005).
Finalmente el análisis microbiológico de los conductos radiculares es útil en la evaluación y acompañamiento de los casos recidivantes, porque permite, por ejemplo, el aislamiento de microorganismos de los géneros
! # y (originalmente # )
(Molander . 1998), facilitando su identificación y posteriormente permitiendo la determinación de su perfil de sensibilidad a antibióticos y/o quimioterápicos (Molander . 1998).
El protocolo para el ensayo microbiológico de naturaleza cultivable, concluido el tratamiento químico=mecánico, consisten lo siguiente:
a. Adición de la solución de muestreo, haciendo movimientos de introducción y retirada con la ayuda de una lima.
b. Repetición del procedimiento
c. Retirada del material adherido a las paredes del conducto con lima endodóntica y, en la secuencia, su corte en el segmento activo, con subsiguiente inmersión del mismo en medio de transporte
d. Homogenización de la mezcla y transferencia del segmento de la lima para el medio de cultivo correspondiente y/o repique de la suspensión microbiana
e. Incubación
f. Lectura e interpretación de los resultados.
Los medios de transporte tienen por finalidad la preservación de los microorganismos, eventualmente generados en el material clínico, desde su recolección hasta el adecuado procesamiento en laboratorio. Por su composición y características esos medios tienen acción 6 ! impidiendo, de ese modo, que ocurran alteraciones en la proporción original de los microorganismos, así como condiciones capaces de proteger la microbiota endodóntica de los efectos tóxicos del oxigeno molecular; el uso de esos medios actualmente constituyen un recurso universal a medida que los microorganismos conservan su viabilidad en los mismos. Entre los medios de transporte comúnmente recomendados, se encuentran: Medio de Transporte Reducido (RTF), Medio III Microbiostatico de Viabilidad y Mantenimiento (VMGA III) y el Caldo Tioglicolato (THM). (Siqueira, 1997).
La etapa correspondiente al cultivo exige la utilización de medios de cultivos líquidos, semisólidos y/o sólidos, dependiendo del propósito del estudio. Esos medios deben ser ricos en sustancias nutritivas, de modo que soporten el crecimiento y multiplicación de la gama variada de microorganismos endodónticos, abarcando aquellos con gran capacidad de síntesis y también aquellos exigentes de sustancias nutritivas más complejas. Las sustancias enriquecedoras son hemina y vitamina K, complementariamente, en medio sólido, debe ser adicionada sangre desfibrinada de carnero. (Siqueira, 1997).
aislamiento de los principales microorganismos de las lesiones pulpares. (Estrela, 2005).
La incubación del material debe priorizar los microorganismos anaerobios, considerando que la presencia de microorganismos aerobios estrictos es fugaz o inexistente. La incubación debe ser realizada en anaerobiosis, alcanzada por medio físico (vacuo e insuflación con una mezcla con el 80% de N2 el 10% H2 y el 10% de CO2) o medio químico (sistema Gazpak o
Anaerobac). El tiempo de incubación varía entre 3, 6 y 14 días. (Molander , 1998).
En el medio líquido o semisólido, la lectura tiene como referencia la presencia o ausencia de turbidez del mismo, indicativa, o no, del crecimiento y multiplicación de microorganismos. El medio sólido va a permitir el aislamiento de microorganismos, la determinación de su capacidad hemolítica, la obtención de cultivo puro y subsecuentemente, su caracterización morfológica, fisiológica y/o genética y, cuando es necesario, el análisis de sensibilidad a antimicrobianos. (Siqueira, 1997).
! F 2
Recientemente, la metodología molecular de identificación microbiana (reacción de la cadena de polimerasa (PCR), sondas genómicas de ADN y técnicas de hibridación molecular ADN=ADN) han permitido, por un lado, obtener muestras positivas casi en un 100 % de los casos de identificación de especies bacterianas que, hasta el momento, no habían sido relacionadas con la patología periapical. (Canalda=Brau, 2006)
Aunque para demostrar el potencial y el futuro que aun mantiene una técnica molecular se puede señalar a Fouad (2000), quienes a partir de un estudio de PCR en los canales radiculares de una pulpa necrótica, revelaron la presencia de un microorganismo relacionado al genero 4 el cual no ha sido previamente descrito dentro de las infecciones endodónticas. (Fouad
. 2002).
Rolph (2001), utilizaron la técnica de reacción de hibridación fundamentada en el apareamiento de dos cadenas sencillas de ácidos nucleicos que sean complementarias entre si para formar un hibrido, para realizar un estudio de identificación de microorganismos situados en canales radiculares y demostrar que las técnicas moleculares pueden detectar la presencia de bacterias vinculadas a las infecciones endodónticas cuando las técnicas de cultivo dan un resultado negativo, y además puede ser usado en la identificación de un amplio rango de bacterias relacionadas a la infección endodóntica así estas no sean cultivables.
A partir de estos métodos de laboratorio, se han detectado, en orden de frecuencia las bacterias mas prevalentes en la periodontitis apicales tales
como " (68%) (61%)
" (58%). (Canalda=Brau, 2006)
Las técnicas de biología molecular han revolucionado el campo del diagnostico microbiológico, ya que constituyen la alternativa de mayor utilidad para la caracterización de ciertos microorganismos que presentan dificultades para su detección mediante los métodos convencionales. Gracias a su relativa sencillez y gran sensibilidad, son de especial ayuda en múltiples situaciones que requieran su identificación.
8( // 5+ 3' D/ 3*- + / ' /*-: Existen diversos métodos de extracción y el procedimiento elegido depende del tipo de muestra, la cantidad de microorganismos presente y la naturaleza del ácido nucleico. Por ejemplo, si se trata de una colonia microbiana puede ser suficiente una extracción con calor o con detergentes; la proteasa K es útil en diversas muestras que contengan células o detritos celulares: la extracción mediante fenol= cloroformo es la técnica de referencia, pero requiere muchos pasos y entraña el riesgo de contaminación de la muestra. Actualmente, existen equipos comerciales de extracción que combinan la acción de agentes químicos (p.ej., tiocianato de guanidina), enzimáticos (p.ej., proteasa K) solventes orgánicos (p.ej., alcohol o acetona) y medios físicos (p. ej., partículas de sílice o filtración por membranas); estos métodos están al alcance de la mayoría de los laboratorios y tienen las ventajas de su gran sensibilidad y relativa sencillez. Una vez extraída la diana, se puede proceder a la detección de los ácidos nucleicos propiamente dicha. (Liébana, 2002)
! ' // 5+ 3' ? 3 / 5+
sistema que posteriormente ponga de manifiesto su presencia: enzimas, antígenos, moléculas fluorescentes o radioisótopos. (Liébana, 2002).
! 7 <
Los más utilizados son: hibridación en microplaca (formato de enzimoinmunoanálisis) o en solución (el acido nucleico y la sonda se encuentra en solución, lo que acelera el proceso de hibridación). (Liébana, 2002).
+C 6* +6 +* +D - -, se basa en la capacidad en que tienen Ag y Ac de adherirse a una superficie inerte como el poliestireno sin perder sus propiedades y en la posibilidad de marcar una inmunoglobulina con una enzima. (Liébana, 2002).
*( *(: consiste en desnaturalizar el acido nucleico diana y luego fijarlo por calor o luz UV en una membrana de nylon; posteriormente se añade la sonda, lo que permite la detección cualitativa de un agente infeccioso en una muestra. (Liébana, 2002).
* (?' + A * (?' + *(: el primero permite determinar el tamaño del fragmento de ADN que hibrida con la sonda; el ADN se digiere previamente con enzimas de restricción y se separan por tamaño los fragmentos resultantes mediante electroforesis; estos se transfieren por la acción de un tampón de gran fuerza iónica a una membrana de soporte como nylon o nitrocelulosa y posteriormente se sigue como en el Dot blot. La técnica es compleja y larga y requiere gran cantidad de muestra, lo cual limita su aplicación. El Northern blot es una variación de Southern blot utilizando ARN en lugar de ADN. (Liébana, 2002).
caso, que el microorganismo está implicado en el proceso infeccioso. (Liébana, 2002).
! 6. 1 / / 5+ 3' D/ 3*- + / '
/*-Las técnicas de hibridación pueden carecer de la suficiente sensibilidad cuando el microorganismo buscado se encuentra en escasa cantidad en la muestra. Para esto se recurre a métodos químicos o enzimáticos para aumentar específicamente la cantidad de una secuencia de ácido nucleico del microorganismo. (Liébana, 2002).
Se puede describir dos grandes grupos de técnicas en función de lo que se amplifica:
Amplifica la diana: el primero que comprende la mayoría de los métodos existentes, entre estos están la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que es la más extendida y la Amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) aunque además existen otras como la reacción en cadena de ligasa (LCR)
! ' // 5+ '+ / 3'+ 3' .* 6' - G7 H
Componentes:
3 + : es el ADN que se desea amplificar; también se llama ADN molde. Su cantidad y calidad son factores determinantes de la eficacia de la reacción.
'-*8 + / '5( 3*- ( 1*-1 (*- G3 7H, aportan las bases que componen el ADN (dATP, dTTP, dGTP) y debe encontrarse en cantidades iguales.
' 3* '-, también se conocen como primers o iniciadores; son oligonucleótidos (secuencia de ADN de 15=20 bases de longitud complementarias de los extremos 3´ de cada una de las cadenas de ADN diana). (Liébana, 2002).
4 .* 6' - : ADN polimerasa obtenida de la bacteria termófila "
7 !que tiene una temperatura máxima de actuación de 72=90°C y es estable a las temperaturas de la reacción. Su función consiste en alargar la cadena de ADN hibridada con el cebador mediante la incorporación de los dNTP. (Liébana, 2002).
* * 3' 6 +'- *: Influye en la hibridación de los cebadores con el ADN diana y en la actividad de la Taq polimerasa. (Liébana, 2002).
.5+ 3' ? 3 / 5+: asegura la fuerza iónica y el pH óptimos de la reacción enzimática.
' // 5+,
= Desnaturalización del ADN: Temperatura de 90=95°C, se separan las dos hebras de ADN, quedando disponibles para hibridar con los cebadores. = Hibridación del ADN con los cebadores: se produce a una temperatura que oscila entre 35=65°C, dependiendo de la composición de los cebadores. (Liébana, 2002).
= Extensión o polimerización de la cadena de ADN: La Taq actúa alargando el nuevo hibrido formado a una temperatura de 72°C a partir del extremo 3´ del cebador, incorporando los dNTP complementarios del molde de ADN diana. El producto de este primer ciclo sirve como diana para el siguiente ya que se somete a unA nueva desnaturalización y a las etapas sucesivas. (ANEXO 10) (Liébana, 2002).
! '('// 5+ 3' . *3 /(* 6. 1 / 3*:
! 2*3 1 / / *+'- 3' 7
= RT PCR: si el acido nucleico diana es ARN, tras la extracción este se debe convertir en ADN complementario (ADNc) ya que la Taq polimerasa es especifica de ADN. Se utiliza la enzima retrotranscriptasa, para transcribir el ARN a ADN monocatenario y luego la Taq polimerasa lo convierte en ADN bicatenario. (Liébana, 2002).
= Nested=PCR: se trata de dos reacciones de PCR consecutivas y se utiliza para aumentar la sensibilidad de la amplificación; en una primera reacción se emplean cebadores externos y en la segunda cebadores internos que amplifican un fragmento interno al amplificado en la primera PCR. Así se logra aumentar la sensibilidad de la reacción. (Liébana, 2002).
= Múltiple PCR: Permite la identificación de múltiples fragmentos pertenecientes a un mismo gen o a distintos genes. Para ello, se utilizan tantas parejas de cebadores como productos se desee amplificar. (Liébana, 2002).
= PCR * el tejido se pone en contacto con la mezcla de reacción en termocicladores adaptados, los cebadores están marcados con algún sistema indicador y luego se revela directamente el producto amplificado. (Liébana, 2002).
!
Para conseguir la amplificación del ARN se utiliza una estrategia enzimática y no es necesaria la desnaturalización, ya que la diana se encuentra en forma de cadena sencilla. Se utiliza una cascada de reacciones a través de tres enzimas, una retrotranscriptasa (que es una ADN polimerasa que puede utilizar como molde una molécula de ARN, aunque también es capaz de copiar a partir de ADN. Una ARNasa H (degradadora de ARN, pero solo cuando éste está hibridado con ADN). Y una T7 ARN polimerasa (que sintetiza entre 10 y 100 copias de ARN a partir de una doble cadena de ADN). (Liébana, 2002).
! 6 1 / 3*
Esta técnica amplifica la señal y no la diana. La señal que se amplifica es la obtenida tras la hibridación de tres tipos de sondas: de captura, de anclaje, de marcaje.
moléculas marcadoras que es, en esencia, de lo que depende la intensidad de la señal producida. (Liébana, 2002).
! 2 7 2
2
! I ,
Corresponde al número de bases de guanina + citosina en relación con el número total: adenina (A) timina (T). guanina (G) y citosina (C). El porcentaje de G+C es constante dentro de una especie y dentro de un mismo género las variaciones de dicho contenido son generalmente menores del 10%. Sin embargo aunque dos microorganismos tengan un contenido G+C similar no se puede suponer que las secuencias sean iguales; por ello, esta característica debe ser analizada con otros datos complementarios. (Liébana, 2002).
! < J ,
