Caracterización morfológica y perfil de bandas de reacción en cadena de la polimerasa (pcr) y amplificación aleatoria de adn polimórfico (rapd) de anastrepha distincta greene 1934”

Texto completo

(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. NDICE UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. IN FO. “CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y PERFIL DE BANDAS DE. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) y. DE. AMPLIFICACIÓN ALEATORIA DE ADN POLIMÓRFICO (RAPD) DE. TESIS. PARA OBTENER EL TÍTULO DE BIÓLOGO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. Anastrepha distincta GREENE 1934”. AUTOR: Br. SÁNCHEZ TUESTA LINDA CRISTINA Asesora: Dra. ZULITA ADRIANA PRIETO LARA TRUJILLO – PERU 2014. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. AC IÓ. N. TRUJILLO. UN IC. Dr. ORLANDO VELÁSQUEZ BENITES. A. Y. CO. M. RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. ÁT. IC. Dra. VILMA JULIA MÉNDEZ GIL. RM. VICE-RECTORA ACADÉMICA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. DE. IN FO. TRUJILLO. AS. Dra. FLOR MARLENE LUNA VICTORIA MORI. TRUJILLO. Dr. ALBERTO SANTIAGO UCEDA DUCLÓS. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. VICE-RECTORA ADMINISTRATIVA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. DI. RE. SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. AC IÓ. N. Dr. JOSÉ MOSTACERO LEÓN. Y. CO. M. UN IC. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. IC. A. Dr. WILLIAM ZELADA ESTRAVER. DE. IN FO. RM. ÁT. SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. AS. Dr. FREDDY PELÁEZ PELÁEZ. EM. DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE. Dr. FREDDY MEJÍA COICO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. CIENENCIAS BIOLÓGICAS. JEFE DEL DEPARTAMENTO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CERTIFICADO DEL ASESOR. El que suscribe, Dra Zulita Prieto Lara en calidad de asesor de la tesis “CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y PERFIL DE BANDAS DE REACCIÓN. CO. M. UN IC. ADN POLIMÓRFICO (RAPD) DE Anastrepha distincta GREENE 1934”. AC IÓ. N. EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y AMPLIFICACIÓN ALEATORIA DE. Y. CERTIFICA:. IC. A. Que la investigación ha sido desarrollada de conformidad con los objetivos propuestos. ÁT. en su perfil académico, y que el informe ha sido revisado y acoge las observaciones y. RM. sugerencias alcanzadas.. IN FO. Por ello, autorizo al Br. SÁNCHEZ TUESTA, LINDA CRISTINA para continuar con. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. el trámite de reglamento correspondiente.. Dra. Zulita Adriana Prieto Lara. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. Señores Miembros del Jurado dictaminador:. N. En cumplimiento con las disposiciones reglamentarias vigentes para la obtención de. AC IÓ. grados y títulos de la Escuela Académica Profesional de Ciencias Biológicas de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo; someto a. UN IC. vuestra consideración y criterio el presente informe de tesis titulado tesis titulada:. EN. CADENA. DE. LA. POLIMERASA. (PCR). Y. CO. REACCIÓN. M. “CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y PERFIL DE BANDAS DE. AMPLIFICACIÓN ALEATORIA DE ADN POLIMÓRFICO (RAPD) DE. A. Y. Anastrepha distincta GREENE 1934”. Con lo cual pretendo cumplir con los. Trujillo, Noviembre del 2014. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. requisitos para optar el título de Biólogo.. DI. RE. CC. IO. Br. Sánchez Tuesta Linda Cristina. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Dr. GASPAR AYQUIPA AYCHO. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. PRESIDENTE. UN IC. AC IÓ. N. MIEMBROS DEL JURADO. Dra. FATIMA ZAVALA DE LA CRUZ. Dra. ZULITA PRIETO LARA VOCAL. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. SECRETARIO. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que el presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. siendo aprobado por UNANIMIDAD.. IC. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. PRESIDENTE. A. Y. Dr. GASPAR AYQUIPA AYCHO. SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. Dra. FATIMA ZAVALA DE LA CRUZ. Dra. ZULITA PRIETO LARA VOCAL. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. N. A DIOS, porque todo lo bueno viene de él, por. AC IÓ. haber cuidado de mí, e inundarme con sus bendiciones y su inmenso amor. Porque me basta. UN IC. tu gracia, tu fuerza se manifiesta en mi debilidad, pues si me siento débil entonces es cuando soy. ÁT. IC. A. Y. CO. M. fuerte.. RM. A mis amados PADRES, Yoli y Antonio,. IN FO. quienes con su amor y dedicación me han dado lo mejor. Por su apoyo incondicional, su. DE. amistad y porque siempre han confiado en mí.. dedicado a ustedes. Los amo.. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. Todo logro que alcance en mi vida será. CC. A mi HERMANO Angel por su constante apoyo. DI. RE. y consejos por ser uno de mis ejemplos a seguir, gracias por confiar en mí.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A mis HERMANITOS Antonio y Antonella, porque durante todo este tiempo me han. N. animado y han permanecido a mi lado, ustedes. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. son mi motivo para superarme cada día.. IC. A. A esas PERSONAS importantes en mi vida, que. ÁT. siempre estuvieron listas para brindarme toda. RM. su ayuda, durante estos cinco años de carrera,. IN FO. gracias a Melissa, Evelyn, Emma, Milagritos,. DE. SI ST. EM. AS. DE. Silvia y Bayron.. N. A mis MAESTROS, por sus enseñanzas. IO. especialmente a la Dra Zulita, gracias por la. CC. oportunidad que me ha brindado de crecer. DI. RE. profesionalmente. Dios la bendiga siempre.. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTOS. Agradezco a Dios por guiarme durante todo este camino y que a pesar de todos. AC IÓ. N. los obstáculos él me ha protegido para salir adelante.. UN IC. A mis padres, por enseñarme a valorar las pequeñas cosas de la vida, por su apoyo incondicional y sobre todo por su amor y comprensión, porque nunca me. Y. CO. M. dejaron sola.. IC. A. A mis hermanos por ser mis compañeros y amigos, por brindarme su cariño y. IN FO. RM. ÁT. siempre darme ánimos.. A mi asesora Dra. Zulita Prieto Lara, por su apoyo en la realización de la presente tesis, por sus consejos, por darme la oportunidad de crecer profesionalmente. EM. AS. DE. y en forma personal.. SI ST. A Melissa, por su amistad que es uno de los tesoros más valiosos que poseo, por. DE. su apoyo en la recolección y montaje de las muestras.. IO. N. A Evelyn, Emma, Milagritos, Silvia y Bayron, por su apoyo durante estos cinco. DI. RE. CC. años de vida universitaria, gracias por hacer que estos años sean inolvidables.. A. los miembros del Laboratorio de Genética y Biología Molecular: Dra. Fátima, Carlos, Mónica y David por su apoyo en la realización del presente informe de tesis.. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN. El género Anastrepha (familia Tephritidae) incluye un variado número de especies plagas que requieren investigaciones para lograr una clasificación. AC IÓ. N. taxonómica que se diferencien de manera objetiva en los diferentes estados de su. ciclo biológico. El presente trabajo tuvo como finalidad describir las. UN IC. características morfológicas de la estructura corporal y obtener el perfil de bandas RAPDs del estado adulto de Anastrepha distincta recolectados en huaba (Inga Sp). M. de Laredo, Perú. Los individuos fueron colectados en el estado larvario, se. CO. acondicionó hasta obtener el estado adulto, los que fueron disectados y en los. así mismo se realizaron la. A. individuos hembras se realizaron las mediciones,. Y. montajes obtenidos de las alas, estuche de ovipositor y ovipositor de 10. ÁT. IC. extracciones de ADN genómico y PCR con los iniciadores de la serie C – OPC 05. RM. y OPC 10. Las características morfológicas de los individuos, diseño alar con presencia de la banda Costal unida a la banda S, mancha Hialina costal de R1 4+5. y la banda S separada de la banda V con ambos. IN FO. llegando hasta la vena R. brazos delgados, así como las longitudes promedios de las alas, estuche del. DE. ovipositor y ovipositor fueron 7.245 mm, 3.014 mm, 3.063 mm respectivamente,. AS. fueron concordantes con los resultados de otros investigaciones. En relación a los 14 productos PCR claramente. EM. productos PCR - RAPDS se obtuvieron. SI ST. identificables, con el OPC10 4 loci monomórficos y 10, polimórficos y para el iniciador OPC 05, 3 loci monomórficos y 11 polimórficos. Se determinó la. DE. especie A. distincta en base a las características taxonómicas indicadas y los marcadores moleculares OPC 10 y OPC 05 por el alto grado de polimorfismo se. IO. N. considera informativos para estudios poblacionales y diferenciación de especies. DI. RE. CC. de la familia Tephritidae.. Palabras Clave: Caracterización Morfológica, PCR – RAPD, Anastrepha. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT. The genus Anastrepha (Tephritidae family) includes a diverse number of. N. pest species that require research to develop a taxonomy to differentiate. AC IÓ. objectively at different stages of their life cycle. This study aimed to describe the morphological features of the body structure and obtain the profile of RAPD. UN IC. bands adulthood Anastrepha distincta collected huaba (Inga Sp) of Laredo, Peru. The individuals were collected in the larval state, it conditioned until adulthood,. CO. M. which were dissected and assemblies obtained from the wings case ovipositor and ovipositor of 10 female individuals measurements were performed, also the. A. Y. extraction of genomic DNA and PCR with primers was performed the C series -. IC. OPC 05 and OPC 10. morphological characteristics of individuals, design alar. ÁT. presence of costal band connected to the strip S, stain Hialina R1 reaching costal. RM. vein R 4 + 5 and the separated S band V band with two thin arms, and the. IN FO. average length of the wings, and ovipositor sheath of ovipositor were 7.245 mm, 3.014 mm, 3.063 mm, respectively, were consistent with the results of other. DE. investigations. Relative to the PCR product - 14 RAPD PCR products were obtained clearly identifiable, with monomorphic loci OPC10 4 and 10, and for. AS. the initiator polymorphic OPC 05, 3 and 11 polymorphic loci monomorphic. A.. EM. distincta species based on taxonomic characteristics and molecular markers. SI ST. indicated OPC 10 and OPC 05 by the high degree of polymorphism is considered informative for population studies and differentiation of species of. IO. N. DE. the family Tephritidae was determined.. DI. RE. CC. Keywords: Morphological Characterization, PCR - RAPD, Anastrepha.. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONTENIDO ii. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGIAS. iii. AC IÓ. N. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. iv. UN IC. CERTIFICADO DEL ASESOR PRESENTACIÓN. CO. M. MIEMBROS DEL JURADO. vi vii. A. Y. APROBACION DE TESIS. v. ÁT. IC. DEDICATORIA. IN FO. RM. AGRADECIMIENTOS RESUMEN. AS. 1. SI ST. INTRODUCCIÓN. xi. xiii. EM. CONTENIDO. x. xii. DE. ABSTRACT. viii. 5 11 22. IO. RESULTADOS. CC. N. DE. MATERIALES Y METODOS. DI. RE. DISCUSION CONCLUSIONES. 25. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. 26. ANEXOS. 31. xiii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN. El género Anastrepha (familia Tephritidae) incluye un variado número de. N. especies de importancia económica debido a los daños que provocan sus larvas en. AC IÓ. los distintos frutos de plantas cultivadas. Las especies de este género están. distribuidas en los países de la Región Neotrópica, desde el valle del Río Grande, al. de Chile y Argentina (Korytkowski y Ojeda, 1968 y. UN IC. sur de Estados Unidos de Norte América, Florida, Texas y California, hasta el norte Korytkowski, 2001).. M. Investigadores sobre las moscas de la fruta son obligatorios en los países en los que. CO. la producción de fruta está ligada a la exportación comercial. A nivel mundial, el. Y. cálculo de las pérdidas causadas por las moscas de la fruta sobrepasan la cantidad. IC. A. de dos mil millones dólares/año y la disminución del rendimiento de los frutales. ÁT. puede ser de 10 a 75%, además de las perdidas por sanciones en la exportación y. RM. tratamientos para la erradicación de esta plaga (Gonzales, Loza-Murguía, Hugh,. IN FO. Cuba, Almanza y Ruiz, 2011).. El ciclo biológico de la mosca de la fruta comienza cuando las hembras. DE. fertilizadas insertan su ovipositor y depositan sus huevos por debajo del pericarpio. AS. del futo, generalmente en frutos próximos a madurar entre 60-70% de madurez. EM. (Núñez, Gómez, Guarín y León, 2004).. Las larvas en particular causan los. SI ST. mayores daños directos al barrenar los frutos de diversas plantas cultivadas, disminuyendo así su valor y producción, de manera indirecta al limitar la. DE. comercialización de las frutas, aumento de costos de producción por la implementación de medidas de control. (Vilatuña, Sandoval y Tigrero, 2010;. CC. IO. N. Ramón y Villa, 2012 y Comunidad Andina, 2002). estado de huevo está en función de las condiciones. RE. La duración del. DI. ambientales de temperatura y humedad que varía entre 2 a 7 días en verano y de 20 a 30 días en invierno. El estado larvario tiene tres instar con una duración de 6 a 11 días, la larva en el tercer instar abandona el fruto para empupar, el estado de pupa dura de 9 a 15 días .Una vez alcanzada la madurez fisiológica el adulto emerge del suelo, el cual puede llegar a vivir hasta tres meses bajo condiciones ambientales favorables (Comunidad Andina, 2002).. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La taxonomía de adultos de Anastrepha se basa especialmente en los patrones alares, características generales de su ovipositor como el tamaño, estructura y extremo del ovipositor, también son determinadas algunas especies en base a su tercer instar larvario (Insuasty, Cuadros, Monroy y Bautista, 2007;. N. Korytkowski y Ojeda, 1968). Estudios realizados en el 2002 dieron a conocer la. AC IÓ. presencia de por lo menos 17 grupos de especies entre ellos el grupo Fraterculus, que incluye la mayoría de especies plagas de mayor importancia económica en. UN IC. Perú y que frecuentemente son capturadas en trampas McPhail del Sistema de Detección del Programa Nacional de Moscas de la Fruta (Comunidad Andina,. CO. M. 2002). Una de las especies más frecuentemente encontradas en las trampas alimenticias, especialmente en zonas de la costa y selva peruana, es Anastrefa. Y. distincta, esta especie pertenece al grupo fratercullus, es de tamaño variable, y se. de la plaga permite ajustar los parámetros. RM. La correcta determinación. ÁT. IC. A. alimenta de casi todas las especies de Inga.. IN FO. bioecológicos de cada especie de moscas de la fruta, así como los métodos de control disponibles para erradicar la plaga (Guillén, 2004). A pesar de la. DE. importancia de la mosca de la fruta, las larvas de las especies de tefrítidos incluyendo el género Anastrepha, no se han estudiado lo profundamente para. AS. lograr una clara diferenciación, debido a que la morfología de las larvas son muy. EM. similares entre sí, puesto que las principales diferencias morfológicas se observan. SI ST. en estado adulto (Gómez, Pinto, Valadéz. y Núñez, 2008; López, López,. DE. Hernández, Santiago, Gutiérrez y Hernández, 2010). Por la importancia de la mosca de la fruta en nuestro país y el deficiente. IO. N. control, sumado a la variabilidad genética de las especies, se hace necesario. CC. implementar un adecuado reconocimiento de las distintas especies, para lo cual. RE. están siendo empleados las técnicas y métodos genéticos y moleculares (Suliman,. DI. Gallagher y Hennerty, 2009; Carranza, Motte, Motte, Cevallos, Saucedo y. Canchignia, 2008) en muchos casos sólo una región del ADN es usada, dependiendo de los propósitos de la investigación.. En los últimos años la Genética y Biología Molecular, ha permitido el avance de la taxonomía molecular y la diferenciación de especies, subespecies y 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. poblaciones a través de la tecnología de Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que es ampliamente utilizada para dichos propósitos en una gran mayoría de áfidos, dípteros entre otros insectos, Senthil y Gurusubramanian 2014; Guirao, Beitia y Cenis, 1994 y Acevedo, Navarro, Constantino, Gil y Benavides, 2007),. N. en hongos (Silvana, Aljanabi, Correa, 2003 y Davila, Zambrano y Castillo, 2001),. AC IÓ. peces,( Usman, Agbebi, Bankole, Ogunta y Popoola, 2013) y plantas. Esta técnica es capaz de estudiar y caracterizar a los individuos desde su unidad molecular más. UN IC. básica, el ADN.. debido a. su. CO. M. El ADN es la sustancia central para el control celular,. importancia, es fundamental contar con métodos extracción y purificación. Y. adecuadas ya que la calidad del material genético obtenido va a depender del. IC. A. método de extracción, así como del tipo de tejido que se utilice. De ahí la. ÁT. importancia de la selección del método que se ajuste a los objetivos de la. RM. investigación a realizar (Picó y Pérez, 2012). La integridad del ADN extraído, se. IN FO. confirma y visualiza mediante electroforesis en gel de agarosa, que consiste en la separación de moléculas a través de un gel de naturaleza porosa, separadas de. DE. acuerdo a su tamaño y carga por un campo eléctrico. (Yábar, 2003).. AS. Gómez et al, (2008) logró extraer ADN total de tres larvas de género. EM. Anastrepha en México modificando el método de extracción Sambrook, que. SI ST. consistió en fenolizar dos veces más las muestras y utilizar mayor cantidad de ARNsa. así como material fresco, obteniendo ADN óptimo. La utilidad de las. DE. técnicas moleculares para abordar diversos tipos de problemas biológicos ha. N. quedado más que demostrada, además de permitir la adecuada comprensión del. IO. proceso de flujo de genes y la estructura de la población entre los subgrupos de. DI. RE. CC. poblaciones dependiendo de los propósitos de la investigación.. Una técnica de gran potencial para la taxonomía de insectos es la RAPD-. PCR (polimorfismo de ADN amplificado al azar) se basan en una sencilla estrategia y son utilizados por su fácil implementación,. amplifican. aleatoriamente segmentos de ADN, para lo cual, se emplea primers de secuencia corta y arbitraria, utiliza temperaturas bajas durante la hibridación. Tras la amplificación, los fragmentos se separan por su tamaño mediante electroforesis en 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. gel, los productos amplificados generan un patrón multibanda, característico de cada uno de los individuos analizados así se determina polimorfismo genómico (Picó y Pérez, 2012).. N. Por su aplicación los RAPDS no requiere un conocimiento previo de la. AC IÓ. secuencia del organismo a analizar, utiliza poco ADN, la técnica requiere corto. tiempo en el análisis y permiten comparar y diferenciar individuos, poblaciones o. UN IC. especies simultáneamente y realizar numerosos estudios de diversidad, sobre todo en especies no modelo en las que no se dispone de información previa de. CO. M. secuencia. El polimorfismo de las bandas entre individuos se debe a cambios en la. Y. secuencia de los nucleótidos, en los sitios de acoplamiento del oligonucleótido,. IC. A. En el área de la Entomología Agrícola, la técnica RAPD ha sido utilizada. ÁT. con éxito en la identificación de diversas especies y poblaciones de áfidos,. RM. moscas blancas entre otros. (Black, Duteau, Puterka, Nechols, Pettorini, 1992;. IN FO. Ceñis, Pérez, y Fereres, 1993; Guirao, Beitia y Cenis, 1994 y Jordano, 2000). En especies de Anastrepha la técnica RAPD-PCR ha sido usada por diferentes. DE. investigadores como Basso et al, 2003 quienes analizaron polimorfismos de ADN de varias poblaciones sudamericanas de A. fraterculus, Shi y Lawrence,. AS. (1999) emplearon RAPD-PCR para determinar marcadores de ADN de una línea. EM. de células embrionarias de A suspensa. suceptibles a la infección por un. SI ST. entomopoxivirus.. DE. Utilizando RAPD-PCR Gómez et al, (2008), diferenció tres especies del. N. genero Anastrepha: A. ludens, A. oblicua y A. striata de importancia económica. IO. en México, utilizando 14 iniciadores de secuencias aleatorias de la serie C. DI. RE. CC. obteniendo un mejor resultado con los iniciadores OPC- 5 y OPC 10.. Por la importancia de los insectos plaga y la necesidad de su detección. temprana y forma rápida inclusive en el estado larvario, el objetivo del presente trabajo fue determinar la características morfológicas y perfil de bandas RAPDPCR. de la especie Anastrepha. distincta en individuos adultos, que infesta. generalmente el cultivo de Inga sp. “huaba o pacae”. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y MÉTODOS 1.. Material Biológico Se recolectó frutos de Inga sp”guaba” infestados con larvas de Anastrepha. AC IÓ. N. distincta, procedentes de Alto Laredo ubicado en el distrito de Laredo, provincia de Trujillo, departamento de la Libertad. El material biológico recolectado fue al laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias. UN IC. llevado. Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo. (Anexo 3).. CO. M. Asimismo se recibió Material Biológico, individuos adultos de Anastrepha. Y. distincta donados por Servicio Nacional de Sanidad Agraria del Perú sede Viru,. ÁT. IC. A. 2. Caracterización Morfológica. RM. 2.1.Obtención del Adulto. IN FO. Para los instar larvales encontrados se utilizaron placas petri, una vez que llegaron al estado de pupa, fueron mantenidas en vasos de plásticos con papel humedecido hasta la emergencia del adulto. Los. DE. cuales fueron colocados en jaulas de material plástico transparente. AS. 5Lt. de capacidad, más o menos de forma cúbica, con aberturas. SI ST. EM. circulares en los dos extremos (González et al. 1971) (Anexo 4).. 2.2.Disección y montaje del Adulto. DE. Se procedió a diseccionar 10 individuos hembras en estado adulto, la disección se llevó a cabo utilizando un estereoscopio con 3 a 11.5. DI. RE. CC. IO. N. x, Para la conservación de las muestras se procedió a montar alas y ovipositor de cada individuo en láminas porta objetos. Para ello se extrajo las alas y el estuche del ovipositor, luego fueron colocados en hidróxido de potasio (KOH) al 10 % por 10 minutos. Los montajes se realizaron en medio glicerina usando un estereoscopio a aumento 11.3 X. Los montajes se etiquetaron y sellaron con reactivo sellante. (Korytkowski y Ojeda, 1968).El corrido de clave se realizó según Korytkowski (2001), y comparando con muestras de individuos. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. adultos obtenidos del laboratorio de SENASA del distrito de Virù. (Anexo 5 y 6). 2.3.Toma de Datos los caracteres y se elaboró un registro de. N. Se tomó en cuenta. AC IÓ. caracteres morfológicos que identificaron a Anastrepha distincta:. diseño alar (forma, disposición y coloración de las bandas alares y. UN IC. características de la venación); longitud del estuche del ovipositor, terminalia femenina ovipositor o aculeus (forma y longitud), forma. CO. M. del ápice del ovipositor o aculeus (Caraballo, 2001; Korytkowski y Ojeda, 196; Korytkowski, 2001; López, 2008). Luego se procedió a. Y. tomar mediciones de la longitud alar y del ovipositor (Korytkowski y. ÁT. IC. A. Ojeda, 1968; Korytkowski, 2001).. IN FO. RM. 3. Caracterización Molecular RAPD- PCR. 3.1.Extracción de ADN genómico. del abdomen.. DE. De cada individuo de ADN se disectó la cabeza y tórax con parte. AS. Para la extracción de ADN se utilizó el tórax y parte del abdomen de. EM. cada uno de los ejemplares se siguió el método de extracción de. SI ST. Cheung et al, (1993) modificado. Cada tejido fue colocado en un tubo de microcentrifuga Eppendorf de 1.5 µl, se agregó 300 µl de. DE. buffer de lisis que contiene 200Mm TRIS hydrochloride (tris-HCL). DI. RE. CC. IO. N. pH 8.5, 250 Mm cloruro de sodio (Nacl), 25 mM ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0.5 % dodecilsulfato sódico (SDS) en frío. Se agregó 75 µl de SDS, incubándose por 4 horas a una temperatura de 600C, invirtiéndose cada 10 minutos. Luego se centrifugó 1400 rpm por 15 minutos. Se transfirió el sobrenadante a otro tubo de minicentrifuga y se le adicionó 168,75 µl acetato de amonio. Se agregó al sobrenadante 300 µl de isopropanol frío, invirtiéndose varias veces, posteriormente se incubó a una temperatura de -20°C por dos horas, para precipitar el ADN. 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las muestras fueron centrifugadas a 14000 rpm por 15 minutos a 20°C, se eliminó el sobrenadante dejando el pellet (ADN). Luego se agregó 300 µl de etanol al 70%, se eliminó el etanol para proceder a secar el pellet por 20 minutos aproximadamente a temperatura. N. ambiente hasta que el etanol evapore finalmente se resuspendió el. conservado a. AC IÓ. ADN en 100 µl de buffer TE (Tris 10 mM-EDTA 1mM), para ser. una temperatura de – 20 °C hasta su utilización.. UN IC. (Anexo 7).. El análisis se. determinó. CO. M. 3.2.Concentración y calidad (ratio) de ADN:. mediante un espectrofotómetro Thermo. Y. Scientific modelo Genesys 10 Bio (razón Abs 230/ Abs 260). (Armas et. IC. A. al., 2005).. ÁT. Para determinar la concentración (Concentración = Absorbancia (260nm). RM. x50ng/mLxDilución-1) y calidad del ADN obtenido se procedió a diluir. IN FO. las muestras en buffer TE (Tris 10 mM-EDTA 1mM) por un factor de 50 (2 µl de muestra y 98 µl de buffer TE). Se calibró el equipo utilizando. DE. buffer TE como blanco y posteriormente se llevó a cabo la medición de. AS. las muestras. (Anexo 12).. SI ST. EM. 3.3. Electroforesis. Los productos de la extracción de ADN fueron separados mediante un. DE. corrido en gel de agarosa al 1 %, se utilizó el buffer de resolución TAE. DI. RE. CC. IO. N. 1X (40 mM tris acetato, 1mM EDTA) y azul de bromomofenol 6x como colorante de corrida para la referencia de avance. Con una micropipeta cada muestra se vertió en un pocillo mezclando previamente 1 µl de azul de bromofenol con 5 µl de muestra. La electroforesis se llevó a cabo a 100V por 30 minutos. Se utilizó 4 µl SYBR safe DNA gel Stain, para la visualización de las bandas. La lectura del corrido de los geles fue observada y fotografiada por el documentador de geles Chemidoc y software de marca Biorad.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 3.4. Resuspensión de Primer. Los iniciadores de secuencia aleatoria de la serie C (OPC-5 y OPC-10) liofilizados fueron resuspendidos en buffer TE, conociendo el número de. UN IC. AC IÓ. técnicas. La resuspensión se llevó a cabo mediante la fórmula:. N. nano moles (nM) de cada iniciador que se encuentra descrito en las fichas. primer liofilizado.. CO. Nmol = cantidad de imprimación en escala nmol.. M. V= Volumen (en µL) del Buffe TE 1X que debe ser adicionado al tubo del. A. Y. Cf= Concentración final en µM.. IC. La concentración de los primer fue de 25 nM y se adicionó a cada tubo. ÁT. 250 µl de buffer TE, para obtener una concentración final de 100 µM.. RM. posteriormente se realizó una dilución de cada primer tomando 20 µl. IN FO. del stock y agregando 80 µl de buffer TE, para obtener a una concentración de 20 µM. Se procedió a guardar el Stock y las. AS. 3.5.Amplificación. DE. diluciones a una temperatura de -20°C.. EM. La amplificación se llevó a cabo utilizando la técnica RAPD. SI ST. seleccionando dos iniciadores de secuencia aleatoria Operon serie C. (Gómez et al, 2008; Christudhas y Mathai 2014; khan, Naz, Naz y. DI. RE. CC. IO. N. DE. Naeem, 2013) (Tabla 1).. Tabla.1. Secuencias de iniciadores RAPD-PCR utilizados para la amplificación de ADN de A. distincta,. Iniciador. Secuencia. Rango de. T°. tamaño OPC-05. 5’-GATGACCGCC-‘3. 1000-3300. 33.4. OPC-10. 5’-TGTCTGGGTG-‘3. 900-3000. 35.6. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En dos tubo de microcentrifuga de 1.5 µl se preparó los Master Mix con cada primer, lo cual consistió en mezclar los componentes necesarios para que se puede llevar a cabo la amplificación por PCR, posteriormente se repartió 24 µl de cada Mix a tubos de 0.2 ml, luego. N. se agregó 1 µl de ADN, excepto para los controles negativos (CN) en. AC IÓ. los cuales se añadió 1 µl de agua grado biología molecular,. UN IC. posteriormente se centrifugó por unos segundos (Tabla 2, Anexo 8).. A. Y. CO. polimerasa para ADN de A. distincta. M. Tabla.2. Componentes del Master mix – Reacción en cadena de la. CONCENTRACIÓN POR REACCIÓN. IN FO. RM. 5x Green Gotaq Flexi Buffer MgCl2 Solution, 25 mM dNTP 10 mM. ÁT. IC. COMPONENTE. 2.0mM 0.2 mM de cada dNTP 0.1 µM 1.25U < 0.5 µg/50µl. DE. SI ST. EM. AS. DE. Primer GoTaq DNA Polymerase (5µ/µL) Temple ADN Agua libre de DNAsas y RNAsas para completar 25 µl Volumen Final. 1X. 5 µl 2 µl 0.5 µl 1 µl 0.125 µl 1 µl 13.88µl. 25 µl. 25 µl. en cadena de la Polimerasa se llevó a cabo en un. termociclador veriti de 0.2 ml marca Applies Biosystem, se programó de la siguiente manera (Senthil y Gurusubramanian, 2011; Pardo, Michelangeli , Ramis , Mogollon y Silva, 2008) (Tabla 3, Anexo 9). DI. RE. CC. IO. N. La reacción. VOLUMEN FINAL POR REACCIÓN. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla.3. Condiciones para una Reacción en cadena de la polimerasa para ADN de A. distincta TIEMPO. 1 Ciclo inicial. Desnaturalización inicial. 5’. Desnaturalización. 1’. Hibridación. 1’. UN IC M. 94 °C. 2’. 10’. 72°C. CO. Extensión Fina. RM. ÁT. IC. A. Extensión 1Ciclo. 94 °C. 37 °C (OPC 10) o 40°C (OPC 05) 72°C. Y. 45 Ciclo. TEMPERATURA. N. PASOS. AC IÓ. CICLOS. IN FO. 3.6. Electroforesis. DE. Los productos Amplificados con los primer OPC 05 y OPC 10, fueron separados mediante un corrido en gel de agarosa al 2 %, se utilizó el. AS. buffer de resolución TAE 1X (40 mM tris acetato, 1mM EDTA) y un. SI ST. EM. marcador de peso molecular.. Con una micropipeta cada muestra se vertió en un pocillo mezclando. DE. previamente 1 µl de azul de bromofenol con 5 µl de muestra. Se agregó. 150 V por 40 minutos. Se utilizó 4 µl SYBR safe DNA gel Stain para la visualización de las bandas. La lectura del corrido de los geles fue observada y fotografiada por el documentador de genes Chemidoc y software. (Anexo 10 y 11).. DI. RE. CC. IO. N. 5 µl de marcador de peso molecular. La electroforesis se llevó a cabo a. 4. Toma de datos. En relación al análisis PCR-RPD se determinó el número de loci mono mórficos y polimórficos. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS. N. 1. Caracterización Morfológica:. AC IÓ. Anastrepha distincta se reconoce morfológicamente por la combinación de. UN IC. los caracteres siguientes:. Diseño alar; se observó la banda S bien desarrollada, unida a la banda. CO. M. costal, mancha hialina costal de R1 llega hasta R 4+5, sección apical de la banda S delgada, bandas S y V separadas, banda V con ambos brazos delgados,. A. Y. el brazo distal está separado del proximal en su porción superior; vena R 4+5. IC. casi recta, curva apical de la vena M moderada (Fig. 1).. ÁT. La longitud de las alas se encontró en un rango de 6.956 a 7.245 mm.. RM. Séptimo segmento, o estuche del ovopositor se registró un rango de 2.3 a 3.5. IN FO. mm de longitud (Fig. 2, Tabla 5). Los ovovipositores o aculeus; midieron entre 2.9 a 3.1 mm de longitud, (Fig. 3., Anexo 1). El ápice del aculeus; largo y. AS. DE. delgado con serras diminutas presentando de 13 a 14 dientes por lado. (Fig. 4).. EM. 2. Caracterización Molecular RAPD-PCR. SI ST. Evaluación de calidad de ADN:. DE. La calidad de ADN obtenida según el método Cheung et al, (1993) registró valores en un rango de 1.714 a 2 mediante. N. modificado,. IO. espectrofotometría; la concentración más alta de ADN fue de 14.35 µl/ ml y la. CC. más baja fue de 8.15 µl/ ml, considerándose ADN de buena calidad (Tabla 1).. DI. RE. Mediante la electroforesis en gel de agarosa al 1% se muestra la calidad e. integridad del ADN extraído, obteniendo bandas definidas, visibles, con poco arrastre y con buena resolución. (Fig. 5, Tabla 6).. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla.4. Comparación de los caracteres morfológicos encontrados con lo descrito por Korytkowski Y Ojeda (1968).. Y OJEDA (1968). PRESENTE TRABAJO. Unidas. Unidas. Ala: Banda S y banda C. N. REPORTADO EN EL. AC IÓ. TAXONOMICO. KORYTKOWSKI. UN IC. CARÁCTER. M. Ala: Banda S. CO. Separadas. separada de la. A. Y. banda V. Separadas. Presente y llega hasta. Presente y llega hasta. vena R4+5. vena R4+5. RM. ÁT. Hialina R1. 6.0 a 7.5 mm. IN FO. Longitud Alar. DE. Longitud del. SI ST. EM. ovipositor. 2.3 a 3.5 mm. 2.3 a 3.1 mm. 2.25 a 3.6 mm. 2.9 a 3.1 mm. DI. RE. CC. IO. N. DE. ovipositor. 6.956 a 7.245 mm. AS. estuche del. Longitud del. IC. Ala: Mancha. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Fig.1. Patrón alar de Anastrepha distincta, (A) Individuo donado por SENASA, (B).. DE. Individuo procedente del Distrito Laredo. 1. Banda Costal y S ligeramente. la vena R4+5.. DI. RE. CC. IO. N. unidas, 2. Banda S y banda V separadas, 3. Mancha hialina de R1 llegando hasta. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. SI ST. Fig. 2. Estuche del ovipositor de Anastrepha distincta, (A). Individuo donado por. DI. RE. CC. IO. N. DE. SENASA, (B). Individuo procedente del Distrito de Laredo.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Fig. 3. Ovipositor de Anastrepha distincta, (A) Individuo donado por SENASA, (B).. DI. RE. CC. IO. N. DE. Individuo procedente del Distrito de Laredo, Perú.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. SI ST. Fig.4.Vista ventral del Ápice del Ovipositor de Anastrepha distincta, (A) Individuo. DI. RE. CC. IO. N. DE. proporcionada por SENASA, (B). Individuo procedente del Distrito de Laredo.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) M UN IC AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla. 5. Valores de la media y de variación de la longitud de Alas, estuche de ovipositor y del ovipositor de individuos en estadio adulto de. Y. CO. Anastrepha distincta.. Longitud Alar. 10. 7.112. 0.007475. Longitud del Estuche del Ovipositor. 10. 3.0137. 0.00132. Longitud del Ovopositor. 10. 3.063. Desviación Estándar. Mínimo. Máximo. Rango. 0.08646. 6.956. 7.245. 0.289. 0.03630. 2.981. 3.103. 0.122. 0.07378. 2.943. 3.146. 0.203. A. Varianza. IC. Promedio. RM ÁT. n. AS. DE. IN FO. Carácter Morfológico. DI. RE. CC I. O. N. DE. SI. ST. EM. 0.005444. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 6.. Valores de las medidas de concentración, grado de pureza para el. método de extracción de ADN genómico de Anastrepha distincta.. Concentración. (Promedio ±DE). (ug/ul) (Promedio. AC IÓ. N. Grado de pureza. UN IC. ±DE) 1.7781±0.158. Método de. 11.189± 2.044. CO. M. Extracción. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. DE: Desviación estándar. DI. RE. Fig. 5. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de las muestras de ADN genómico extraído por el método empleado con A. distincta. Las bandas 4,5 y7 corresponden a muestra de cabeza y el resto corresponde a tórax y parte del abdomen.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 3. RAPD-PCR Amplificación con primer OPC 10 y OPC 05:. Se pueden observar los productos de amplificación de muestras de ADN de individuos. AC IÓ. N. de A. distincta con los primer OPC 10 y OPC 05. Los perfiles de bandas son coincidentes entre las muestras de ADN de cabeza y tórax. UN IC. con parte del abdomen que corresponden al mismo individuo, como se observa en la Fig. 6, las bandas del carril 1 y 2 pertenecen al mismo individuo así como de las bandas. CO. M. del carril 3 y 4 y bandas del carril 5 y 6.. Para determinar el número de loci se consideró solo las bandas con mayor nitidez, 14. Y. fragmentos de ADN fueron amplificados por primer dentro del rango de tamaño de 300. IC. A. y 3000 pares de bases para OPC 10 y 200 a 3000 pares de bases para OPC 05. Se. ÁT. reporta 10 loci polimórficos y 4 mono mórficos para el primer OPC 10, para el OPC 05. RM. se reportan 11 loci polimórficos y 3 mono mórficos. Los perfiles genéticos de los. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. individuos son diferentes entre sí.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. muestras de ADN genómico extraído de A. distincta., obtenido con el iniciador OPC 10.Los carril 1,3 y 5 corresponden a ADN de cabeza y el resto es ADN de Tórax con parte del abdomen. Marcador de Peso Molecular DNA Molecular Weight marker XIV 100 bp (Carril 9).. DI. RE. CC. IO. N. Fig. 6. Productos de amplificación por la técnica de RAPDs- PCR de las. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DI. RE. CC. IO. N. Fig. 7. Productos de amplificación por la técnica de RAPDs- PCR de las muestras de ADN genómico extraído de A. distincta., obtenido con el iniciador OPC 05. Los carril 1 y 2 corresponden a ADN de cabeza y el resto es ADN de Tórax con parte del abdomen. Marcador de Peso Molecular DNA Molecular Weight marker XIV 100 bp (Carril 9).. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSIÓN Anastrepha distincta pertenece al grupo Fraterculus y es una de las especies más frecuentemente encontradas en las trampas alimenticias, especialmente en. N. zonas de la costa y selva peruana, es de tamaño variable, y se alimenta de casi. AC IÓ. todas las especies de Inga “guaba”. A. distincta, ha sido usualmente confundida con Anastrepha fraterculus hasta antes de la descripción de Stone (1942), quien. entre ambas especies, ya que en A.. UN IC. ha señalado claramente las diferencias. M. distincta las manchas oscuras del mediotergito no alcanzan el sub scutellum.. Y. CO. Caracterización morfológica. A. En relación con los patrones alares, se observó en todos los individuos la. ÁT. IC. Banda Costal unida con la banda S llegando a la vena R 4+5 lo que coincide con. RM. lo descrito por Kurytkowski y Ojeda (1968), comparado con estudios realizados por Stone (1942); Kurytkowski y Ojeda (1968); Lopez (2010) y Vilatuña et al. IN FO. (2010) quienes indican que en A. fraterculus la amplitud de la unión de la banda Costal con la banda S es mayor que la que presenta A. distincta. Esta especie. DE. también ha sido confundida con A. distans pero esta ultima presenta la banda V. AS. estrechamente ligada a la banda S lo cual nunca sucede en A. distincta. SI ST. EM. (Kurytkowski y Ojeda 1968).. Las medidas registradas en longitud promedio de las alas es de 7.112 ±. DE. 0.086 coincide con lo indicado por Kurytkowski y Ojeda (1968). Stone (1942) indica que la longitud alar es de 6 a 7.5 mm.. Con respecto a la forma y. IO. N. denticulación del ápice del aculeus, presenta entre 12 a 14 dientes de forma que concuerda con los resultados para la misma especie de. CC. redondeada,. RE. investigaciones anteriores. Kurytkowski y Ojeda (1968) y Arias (2010) reportan. DI. que el ápice del aculeus de A. distincta presentan entre 9 a 15 dientes o serras redondeadas, diferentes de A. fraterculus que presenta una forma del ápice del aculeus con dientes romos y redondeados y con una marcada constricción antes de la sierra. Así también las medidas del estuche del ovipositor y del ovipositor fueron concordantes con los resultados de Korytkowski, (1968), Arias, 2004 y Stone (1942). 22. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Caracterización por los marcadores RAPDs- PCR, OPC 10 y OPC 05. La calidad y concentración de ADN obtenida fue la óptima demostrada por los resultados de las mediciones de espectrofotometría y evidenciado en geles de agarosa 1% por la presencia de bandas de ADN definidas y con buena resolución. N. concordantes a lo descrito por otros investigadores como Huescas 2004, De. AC IÓ. Armas, 2005. Extracciones de ADN que permitieron la síntesis de secuencias de. ADN de genomas de los individuos A. distincta con los primers OPC 05 y OPC. UN IC. 10.. CO. M. Los perfiles de bandas RAPDs-PCR con los primers OPC 10 y OPC 05 fueron idénticos en los extractos de ADN de cabeza y tórax del mismo individuo.. Y. Con tejido de tórax se tiene mayor concentración de ADN que en el extracto de. IC. A. ADN de cabeza. Sin embargo, el tejido para la extracción de ADN, el de cabeza. ÁT. se obtuvo con la disección directa, a diferencia del tejido de tórax, que requiere. RM. disección y eliminación de órganos internos. Trabajos de Pecina et al., (2009) en. IN FO. A. ludens, extrajo ADN tomando como muestra el imago completo, en otras especies del género Anastrepha han utilizado larvas del tercer instar (Gómez,. DE. 2008) y en insectos en general Christudhas 2014 recomienda utilizar tórax de. AS. cuando el insectos grandes para la extracción de ADN.. EM. La utilización del tipo de tejido de cabeza o tórax dependerá de los objetivos. SI ST. de la investigación, en el caso de marcadores arbitrarios como RAPDs pueden amplificar no solamente blancos del genoma motivo de investigación sino. DE. también de otros organismos presentes en el tubo digestivo si no se realiza una Si se cuenta con marcadores que identifique. N. adecuada obtención del tejido.. IO. secuencias específicas de la especie motivo de estudio, como marcadores alelo. RE. CC. específicos (SCAR-PCR y otros) bastaría con muestras de cabeza de los insectos.. DI. Analizando los perfiles de bandas de ADN entre individuos de Anastrepha distincta, con dos iniciadores de la serie OPC, se obtuvieron 14 fragmentos de ADN bajo las condiciones de amplificación establecidas, los geles mostraron bandas definidas, algunas de ellas se apreciaron con mayor grosor e intensidad, que puede explicarse que el genotipo del individuo esté en condición homocigota o heterocigota, o que exista más de una secuencia del mismo blanco de amplificación 23. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. o que podría deberse a grupos de amplificaciones con pesos moleculares similares que no se resolvieron en las condiciones electroforéticas utilizadas. El perfil de bandas con el OPC 10 en A. distincta, sin considerar la intensidad de las bandas, se reporta 14 loci, de los cuales 4 son monomórficos y. AC IÓ. N. 10 polimórficos. Comparado con lo reportado por Gómez (2008) para los mismos. primers reportó para A. ludens 15 bandas, para A. oblicua 6 bandas y para A.. UN IC. striata, 15, diferenciándose de manera general en los tamaños de los fragmentos. M. de ADN.. CO. Así también se encontraron diferencias del perfil de bandas de A. distincta. Y. entre individuos con el OPC 05, con presencia de 14 loci, 3 monomórficos y 11. A. polimórficos, y con otras especies de Anastrepha con los mismos primers OPC. ÁT. IC. 05. Gómez (2008) reportó 4 bandas para A. ludens, 9 bandas para A. oblucua y 25. RM. para A. striata. Con tamaños de fragmentos diferentes entre estas especies y. IN FO. comparada con A. distincta de la presente investigación.. Reyes et al, (1996) y Callejas et al, (1998) emplearon esta misma técnica en. DE. otros Tefrítidos; como Bactrocera y Ceratitis capitata respectivamente, incluso. AS. lograron la diferenciación de sus especies de interés utilizando también la. EM. iniciadores aleatorios de la serie C. Es importante incluir nuevas investigaciones. SI ST. dentro de las especies de Anastrepha y otras especies relacionadas dentro de los Tefritidos, para las determinaciones de distancias genéticas con los marcadores. DE. OPC 05, OPC 10 y otros.. IO. N. Los resultados obtenidos por los diferentes trabajos, pueden sugerir que la. CC. caracterización y diferenciación de este tipo de insectos se puede resolver. RE. mediante RAPDs sin mayor problema con los iniciadores de la serie C. Así mismo. DI. los marcadores OPC 05 y 10 pueden ser utilizados para diferenciar genéticamente a poblaciones de A. distincta, como por ejemplo mostrar evidencias del grado de. variabilidad genética entre poblaciones, información importante para evaluar estrategias de control biológico y/o químico.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIONES. -. Se confirma el rango de valores de caracteres taxonómicos descritos para. AC IÓ. N. Anastrepha distincta. En el diseño alar se observó la banda S unida a la banda. Costal llegando a la vena R4+5, la longitud de estuche del ovopositor, en el. UN IC. rango de 2.3 a 3.5 mm, la longitud del ovopositor en un rango de 2.9 a 3.1mm y el número de dientes por lado del ápice del ovopositor de 13 a 14.. Los productos RAPDs-PCR con los OPC 05 y OPC 10 para Anastrepha. M. -. CO. distincta en muestras de ADN de cabeza y tórax presentaron el mismo perfil de. Los individuos de Anastrepha. distincta. analizados son genéticamente. A. -. Y. bandas, siendo más abundante la concentración de ADN en muestras de tórax.. Se obtuvieron 14 fragmentos de ADN para ambos marcadores dominantes OPC. ÁT. -. IC. diferentes entre sí para los marcadores OPC 05 y OPC 10.. distincta,. RM. 10 y OPC 05 para Anastrepha. 4 loci monomórficos y 10. IN FO. polimórficos, dentro del rango de tamaño de 300 y 3000 pares de bases para OPC 10, y 3 loci monomórficos y 11 polimórficos, 200 a 3000 pares de bases. Los marcadores dominantes OPC 10 y OPC 05 para Anastrepha distincta son. AS. -. DE. para OPC 05.. EM. informativos para estudios de diferenciación genética de poblacionales y de. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. especies del grupo de Tefrídidos.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Acevedo, B. F.; Navarro E, L.; Constantino, C. L.; Gil, P. Z.; Pablo Benavides, M. P. 2007. Método Rápido y Económico para la Extracción de ADN Genómico en la Broca del Café y su Uso en PCR. Cenicafé 58(2): 134-. AC IÓ. N. 141.. Arias, L. M.; Jines, A. 2004 Características morfológicas para identificar. UN IC. adultos de moscas de la fruta de importancia económica en el litoral. M. ecuatoriano. Instituto Nacional de Investigación científica.. CO. Armas, Y.; Rodríguez, C.; M.; Bisset, L. J. 2005. Modificación de un método. Y. de extracción de ADN genómico de Aedes aegypti ( Diptera: Culicidae).. IC. A. Revista colombiana de Entomologia 31 (2): 203-206 (2005).. ÁT. Basso, A.; Sonvico, A.; Quesada, A, L. y Manso F.. 2003. Karyotypic and. fraterculus. (Wied). (Diptera:Tephritidae).. Journal. of. IN FO. Anastrepha. RM. molecular identification of laboratory of the South American fruit fly. Economic Entomology 96(4): 1237-1244. DE. Black, W. C; Duteau, N. M.; Puterka, G. J.; Nechols, J. R. y Pettorini, J. M.,. AS. 1992: Use of the RAPD-PCR to detect DNA polymorphisms in aphids.. EM. Bull. Entomol. Res., 82(2): 151-159.. SI ST. Callejas, C., Roda P., Reyes A.. y Ochando M. D.. 1998. Identificación. genética de Dacus –Bactrocera- oleae Gmelin (Diptera: Tephritidae). DE. mediante marcadores RAPD-PCR. Bol. San. Veg. Plagas. 24: 873-882.. DI. RE. CC. IO. N. Caraballo, J. 2001. Diagnosis y clave pictórica para las especies del género Anastrepha Schiner, 1868 (Díptera: tephritidae) de importancia económica en Venezuela. Boletín de Entomología Venezolana Vol. 16(3): 157-164. Carranza, P. M.; Motte, E.; Cedeño, V.; Cevallos, F. O.; Saucedo, A. S. y Canchignia, M. H. 2008. Estudio de la Diversidad Genética de 20. Accesiones de Cacao (Theobroma cacao L.) Mediante AP-PCR de la Colección del Centro del Cacao de Aroma Tenguel en la Finca. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Experimental La Buseta. Publicado como articulo en Ciencia y Tecnología 1: 1-5. 2008. Ceñís, J. L.; Pérez, P. y Fereres, A., 1993: Identification of various aphid (Homoptera: Aphididae) species and clones by random amplified. AC IÓ. N. polymorphic DNA (RAPD-PCR). Ann. Entomol. Soc. Am., 86(5): 545550.. UN IC. Cheung, W.; Hubert, N. y Landry, B. 1993. A simple and rapid DNA extraction. Mathai, M. 2014. Genetic variation of a migratory. Y. Christudhas, A. y. CO. analysis. PCR Methods and Applications 3: 69-70.. M. method for plant, animal, and insects suitable for RAPD and other PCR. A. dragonfly characterized with random DNA markers. Journal of. ÁT. IC. Entomology and Zoology Studies 2014; 2 (2): 182-184. RM. Comunidad andina, 2002 .Perfil para la caracterización de plagas en los. IN FO. países miembros de la comunidad andina. Secretaria general de la comunidad andina, Lima-Perú, 2002 pág. 19.. DE. Davila, M. Zambrano, K. Castillo, M. 2001. Uso de la técnica RAPD para la. AS. identidad de fragmentos de ADN posiblemente relacionados con. EM. virulencia en Hongos entomopatogenos. Bioagro 13(3):93-98.2001.. SI ST. González, M.; Loza-Murguía, M.; Hugh, S.; Cuba, N.; Almanza, J. y Ruiz, M. 2011. Dinámica poblacional de adultos de la mosca boliviana de la fruta. DE. Anastrepha sp. (Díptera: Tephritidae) en el Municipio de Coroico, Paz, Bolivia. J. Selva Andina Res. Soc. v.2 n.2.. N. Departamento de La. DI. RE. CC. IO. González, B.; Vargas, V.; Jara P. 1971 .Estudios sobre la aplicación de la técnica de machos estériles en el control de la mosca sudamericana de la fruta, Anastrepha fraterculus (WIED).1 Rev. Per. Entom. Vol. 14, Nº 1.. Gómez, V., Pinto, V., Valadéz, M., y Núñez, C. 2008. Diferenciación molecular de larvas de tres especies de Anastrepha (díptera: tephritidae) de importancia económica en México. Folia Entomol. Mex., 47(3): 113124.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Guillen, A. 2004. Apéndice técnico para la identificación de moscas de la fruta. Dirección de moscas de la fruta 2: 1- 23. Guirao, P., Beitia F., Cenis, L. 1994. Aplicación de la Tecnica Rapd- PCR a la taxonomía de moscas blancas (Homoptera, Aleyrodidae). Bol Sanidad. AC IÓ. N. Vegetal. Plagas, 20: 757-764,1994.. Huescas Minerva, Comparación de diferentes técnicas de extracción de ADN. UN IC. aplicadas a Quercus eduardii Trel. [Tesis Pregrado] México: Universidad. M. Autónoma Chapingo, 2004.. CO. Insuasty, B., Cuadros, M., Monroy R., Bautista D.2007 Manejo Integrado de. Y. Moscas de la Fruta de la Guayaba (Anastrepha spp.) .CORPOICA.. A. Jordano, B. P. 2000. Utilidad y aplicaciones de técnicas moleculares en. ÁT. IC. ecología y conservación de especies. Utilidad y aplicaciones de técnicas. RM. moleculares en ecología y conservación de especies Pabellón del Perú. Khan, S., Naz, S., Reema y Naeem, R. 2013. Genetic Fingerprinting Of Local. IN FO. Turmeric Genotypes Using Rapds. Department of Biotechnology and Genetic Engineering Kohat University of Science and Technology. DE. (KUST), Pakistan.. Pak. J. Bot., 45(S1): 339-346, January 2013.. AS. Korytkowski, C. y Ojeda, P. 1968. Especies del genero Anastrepha Schiner. EM. 1868 en el noroeste peruano. Rev. Per. De Ent., 11(1): 32-70.. SI ST. Korytkowski, C. 2001. Situación actual del genero Anastrepha Schiner, 1868(Díptera: Tephritidae) en el Perú. Rev. Per. de Ent., 42: 97-158.. DE. López, M., López, B., Hernández, A., Santiago, M., Gutiérrez, R., Hernández,. IO. N. L. 2010. Guía de campo para el reconocimiento de moscas de la fruta del. DI. RE. CC. género Anastrepha. Federal Senasica.. Martínez-Alava. 2007. Nuevos registros en el género Anastrepha (Díptera: Tephritidae) para Colombia. Revista Colombiana de Entomología 33 (1): 36-42. Núñez, L., Gómez, R., Guarín, G. y León, G. 2004. Moscas de las frutas (Díptera: Tephritidae) y parasitoides asociados con Psidium guajava L. y. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Coffea arabica L. en tres municipios de la Provincia de Vélez (Santander, Colombia). Revista CORPOICA. VOL. 5 N° 1. Pág. 5-12. Pardo, A., Michelangeli, C., Ramis, C., Mogollon, N. y Silva C. 2008 Evaluación de. AC IÓ. rosea Hortus ex Beer, Conservados in Vitro. Bioagro 20 ( 2): 97-104.2008. N. la Estabilidad genética mediante marcadores RAPD, en brotes de Billbergia. Pecina, Q. V., López, A. J., Gallardo, J., Rull, J., Rosales, R. E., Cortez M. E.,. UN IC. Hernández, D. S., Mayek, P. N., y Aluja, S. A. 2009. Genetic differences between Anastrepha ludens (Loew) populations stemming from a native. CO. Núm.3 1 de julio-30 de septiembre p. 323-331. M. and an exotic host in new Mexico. Agricultura Técnica en México Vol. 35. A. Y. Picó, S. M., Pérez, C. A. 2012 Marcadores moleculares basados en PCR:. IC. Marcadores RAPD (Random amplified polymorphic DNA). Fragmentos. RM. ÁT. de ADN polimórficos amplificados al azar.. Reyes, A., Callejas C., Roda P. y Ochando M. D. 1996. Caracterización. IN FO. genética en Ceratitis capitata asociada a fruto hospedador. II. Análisis. Ramón, D.. DE. mediante RAPD-PCR. Bol. San. Veg. Plagas, 22: 361-371. y Villa, C. 2012. Monitoreo de las especies de los géneros. AS. Anastrepha y Ceratitis en dos cantones de la provincia. de morona. SI ST. EM. Santiago”. Tesis para obtener el título de Ingeniero Agrónomo. p 55-100. Senthil, K. N. y Gurusubramanian, G. 2011. Randon amplified polymorphic. DE. DNA (RAPD) markers and its applications. Sei Vis 11 (3), 116-124.. N. Mizoram Aizaul, India.. DI. RE. CC. IO. Silvana, T. M., Aljanabi, S., Correa, M. M.. 2003. Genetic variability of. brazilian alternaria spp. Isolates as revealed by RAPD analysis. Brazilian Journal of Microbiology (2003) 34:117-119.. Shi, X. y Lawrence, P. O. 1999. An embryonic cell line from the caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa (Diptera: Tephritidae). In Vitro Cell Dev. Biol-Animal 35:12-14 Stone, A. 19425. The Fruitfleis of the genus Anastrepha. U.s. Dep. Agr. Misc. Pubi.439:1-112. 29. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Suliman, E. K., Gallagher, T., Hennerty, M. 2009. RAPD-based detection of genomic. instability. in. cucumber. plants. derived. from. somatic. embryogenesis. African Journal of Biotechnology Vol. 8 (14), pp. 32193222, 20.. AC IÓ. N. Usman, B. A., Agbebi, O. T., Bankole, M. O., Oguntade, O. R. y Popoola, M. O. 2013. Molecular characterisation of two cichlids populations (Tilapia. UN IC. guineensis and Sarotherodon melanotheron) from different water bodies in Lagos State, Nigeria . Global Science Research Journals Vol. 1 (1). pp.. CO. M. 054-060, December, 2013. A. Dirección de moscas de la fruta 2(3): 2 – 35.. Y. Trujillo, A. 2010. Manual técnico para la identificación de moscas de la fruta.. ÁT. IC. Vilatuña, R. J., Sandoval, L. D., Tigrero, S. J. 2010. Manejo y control de. RM. Moscas de la fruta. Agencia Ecuatoriana De Aseguramiento De La. IN FO. Calidad De Agro.. Yabar, V. C. 2003.Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas. DE. y ADN. Division de Biologia Molecular del Centro Nacional de Salud. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. Publica Instituto Nacional de Salud.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. ANEXOS. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(45) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ANEXO 1 Medidas de Longitud Alar y longitud del ovopositor de individuos en estadio adulto de Anastrepha distincta Medidas Estuche del. Medidas. (mm). Ovipositor. Ovopositor (mm). AC IÓ. N. Medidas ala. 1. individuo 1. 7.067. 3.032. 3.10321. 2. individuo 2. 7.145. 2.981. 3. individuo 3. 7.245. 3.012. UN IC. Muestra. 4. individuo 4. 7.113. 2.985. 5. individuo 5. 7.152. 3.001. 6. individuo 6. 7.141. 3.031. 7. individuo 7. 7.113. 3.014. 8. individuo 8. 6.956. 3.103. 3.12805. 9. individuo 9. 6.996. ÁT. Nª. 2.991. 3.10982. 10. individuo 10. 7.191. 2.987. 3.00386. 3.07009. M. 3.06075. 3.14668 2.94857 2.94396. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. IC. A. Y. CO. 3.11904. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..