Efecto de diferentes tipos de sustrato de almidón sobre la cinética de crecimiento de Bacillus licheniformis
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(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. UN IC. AC IÓ. N. TRUJILLO. M. Dr. Orlando Gonzáles Nieves. ÁT. IC. A. Y. CO. RECTOR. RM. Dr. Rubén Vera Véliz. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. VICERECTOR ACADÉMICO. VICERECTOR DE INVESTIGACIÓN. DI. RE. CC. IO. N. DE. Dr.Weyder Portocarrero Cárdenas. Dr. Steban Ilich Zerpa. SECRETARIO GENERAL ii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS. A. Y. CO. M. UN IC. BIOLÓGICAS. ÁT. IC. Dr. José Mostacero León. AS. DE. IN FO. RM. DECANO. SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. Dr. William Zelada Estraver. Dra. Bertha Soriano Bernilla. DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. iii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. PRESENTACIÓN. M. UN IC. Señores Miembros del Jurado:. CO. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y. Y. Títulos de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología de la. IC. A. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a. RM. ÁT. vuestra consideración y criterio el presente trabajo de tesis titulado:. IN FO. “Efecto de diferentes tipos de sustrato de almidón sobre la cinética de crecimiento de Bacillus licheniformis” con el cual pretendo obtener el Título. EM. AS. DE. Profesional de Biólogo Microbiólogo.. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. Trujillo, Diciembre de 2015. DI. Br. Gabi Zocorro Zegarra Zuñiga. iv. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. MIEMBROS DEL JURADO. UN IC. Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido ejecutada. M. en concordancia con las normas de la Escuela Académico Profesional de. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.. IN FO. _________________________________ Ms. C. Pedro Alvarado Salinas. SI ST. EM. AS. DE. PRESIDENTE. Dr. Luis Llenque Díaz SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. _________________________________. _________________________________ Ms. C. Jaime Agreda Gaitán VOCAL v. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. N. Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran que el. AC IÓ. presente Informe de Tesis titulado “Efecto de diferentes tipos de sustrato de. los. requisitos. formales. y. fundamentales,. siendo. APROBADO. por. M. con. UN IC. almidón sobre la cinética de crecimiento de Bacillus licheniformis”: ha cumplido. IC. A. Y. CO. UNANIMIDAD.. RM. ÁT. _________________________________. IN FO. Ms. C. Pedro Alvarado Salinas. EM. AS. DE. PRESIDENTE. Dr. Luis Llenque Díaz SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. _________________________________. _________________________________ Ms. C. Jaime Agreda Gaitán VOCAL vi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UN IC. AC IÓ. N. CERTIFICACION DEL ASESOR. CO. M. El que suscribe, profesor asesor de la tesis titulada:. Y. “Efecto de diferentes tipos de sustrato de almidón sobre la cinética de. RM. ÁT. IC. A. crecimiento de Bacillus licheniformis”. IN FO. Que ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad. DE. con su correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado acogiendo las. EM. AS. observaciones y sugerencias alcanzadas.. SI ST. Por lo tanto, autorizo a Gabi Zocorro Zegarra Zuñiga continuar con el trámite. N. DE. del reglamento correspondiente.. RE. CC. IO. Trujillo, Diciembre de 2015. DI. _________________________________ Dr. Luis Alberto Llenque Díaz ASESOR. vii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIAS. AC IÓ. N. Mi tesis la dedico con todo mi amor y cariño:. UN IC. A Dios. Todo poderoso por iluminar mi vida con su presencia, guiarme en todo instante y prodigiarme de entendimiento, sabiduría y fortaleza en los momentos. CO. M. que sentí desfallecer y permitir culminar esta parte de mi proyecto de vida. A mis. Y. padres Felicita y Alcides quienes con su gran amor, esfuerzo, humildad y apoyo. IC. A. incondicional han contribuido en la realización de mis sueños, respaldándome. ÁT. con sus oraciones y por esperar de mí siempre lo mejor. A mi amado esposo covi. RM. que ha sido mi impulso durante toda mi carrera y el pilar principal para la. IN FO. culminación de la misma, que con su apoyo constante y amor incondicional ha. DE. sido amigo y compañero inseparable. A mi hija, mi inspiración, mi futuro, mi. AS. legado. Por el amor incondicional, por ser lo mejor de mi vida. Por enseñarme. EM. como algo tan pequeño puede serlo todo. A mis hermanos Corina, Pedro, Rita,. SI ST. Yuli, Eduar y demás familiares quienes en todo momento me brindaron su confianza, comprensión y los mejores consejos de superación personal y. DE. profesional. A los amigos Laura, Mili que están y estuvieron presentes. DI. RE. CC. IO. N. brindándome la fuerza, confianza y apoyo por hacer este sueño realidad.. viii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. AGRADECIMIENTO. UN IC. A mi asesor, Dr. Luis Alberto Llenque Díaz, por brindarme su tiempo, apoyo y. M. dedicación, así como las sugerencias constructivas durante el desarrollo de la. CO. presente investigación, además por brindarme su amistad y conocimientos. ÁT. IC. A. Y. académicos durante mi formación profesional.. RM. A mis amigos, por estar conmigo todo este tiempo y compartir experiencias,. IN FO. conocimientos, momentos alegres y tristes. Gracias por ser mis amigos y recuerden. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. que siempre los llevare en mi corazón.. ix. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INDICE. N. Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo………………………….….….….ii. AC IÓ. Autoridades de la Facultad de Ciencias Biológicas……………………….……….….. iii. UN IC. Presentación…………………………………………………….………….…….…......iv. CO. M. Miembros del jurado………………………………………………………..…….…..…v. A. Y. Aprobación………………………………………………...……………….………..…vi. ÁT. IC. Certificación del Asesor…………………………………...…….………….…...…….vii. IN FO. RM. Dedicatoria………………………………………………………...……….…….…..viii Agradecimiento………………..………………………….….…………….………….ix. AS. DE. Índice…..…………………………………………………….…………………….…...x. EM. Resumen………………………………………………………………………............ xii. SI ST. INTRODUCCIÓN…………………….………………………………….………….....1. DE. Objetivos………………………………………………………………….………....….10. IO. N. 1. MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………...11. CC. 1. Material biológico………………………………………………….……….......11. DI. RE. 2. Procedimiento…………………………………….……………….…………….11 1.1. Reactivacion del cultivo de Bacillus licheniformis FGM-A15…………....11 2.1.1 Determinación de la pureza de las colonias………………………..11. x. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.1.2 Verificación de la capacidad degradativa de almidón por. N. Bacillus licheniformis FGM-A15…………………………...11. AC IÓ. 2.2. Construcción de biorreactores……………..……………………….......12. UN IC. 2.3. Preparación del inóculo…………..….…………………..……...….…..12 2.4. Obtencion y estandarización del almidón de papa……………………..12. CO. M. 2.5. Obtencion y estandarización del almidón de yuca……...........…….…..13. Y. 2.6. Determinacion de la curva de crecimiento de Bacillus licheniformis. ÁT. IC. A. FGM- A15………………………………………………………..……...…13. RM. 2.7 Procesamiento de datos…………………....……………..………….....14. IN FO. 2.8 Analisis estadísticos……………….……………..………….……….....14. DE. RESULTADOS……………………………………………………………………...15. AS. DISCUSIÓN…………………………………………………………………..…....19. EM. CONCLUSIONES…………………………………………………….………...…..25. SI ST. RECOMENDACIONES…………………………………………………………....26. DE. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………….....……..27. DI. RE. CC. IO. N. ANEXOS……………………………………………………………………...…….35. xi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN El presente trabajo estuvo orientado a determinar el efecto de diferentes tipos. AC IÓ. N. de almidón sobre la cinética de crecimiento de Bacillus licheniformis FGM-A15 proporcionado por el laboratorio de Fisiología y Genética Microbiana, de la Facultad. UN IC. de Ciencias Biológicas en un biorreactor agitado.. CO. M. El cultivo bacteriano fue reactivado mediante siembra en placas conteniendo agar. Y. almidón 0.2% y se incubó a 35°C por 48h, luego se procedió a verificar la capacidad. IC. A. hidrolítica del almidón mediante la prueba de lugol e identificación microscópica,. ÁT. mediante coloración Gram. Se sembró en agar almidón 0.1% e incubadas a 37°C por partir del cultivo joven se preparó una suspensión con solución salina. RM. 24h; a. IN FO. fisiológica estéril, equivalente al tubo N° 1 del nefelómetro de Mc Farland (3.0 x 108. DE. UFC/mL). En cada biorreactor se colocó 90 mL de una solución de caldo almidón. AS. (yuca y papa) 1% -buffer fosfato a pH 6.0, suplementado con sales (NH4)2SO4,. EM. CaCl2, NaCl. Luego se agregó 10 mL de inóculo estandarizado (3.0x108 UFC/mL) a. SI ST. cada biorreactor, seguidamente, se puso en funcionamiento y se incubó a temperatura. DE. ambiente (25ºC). El recuento bacteriano (UFC/mL) se realizó por la técnica de. N. recuento en placa a las 0,2,4,6,8,10,12,14,y 16 h, extrayendo 5 mL de muestra del. CC. IO. biorreactor haciendo diluciones adecuadas en solución salina fisiológica estéril, para. RE. luego sembrar 0.1 mL de dilución en placas de agar almidón y se incubó a 37ºC por. DI. 24 horas. Se encontró que la máxima velocidad de crecimiento de Bacillus licheniformis se obtuvo con almidón de yuca.. xii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN Las plantas producen una gran cantidad de polisacáridos, los cuales sirven. AC IÓ. N. como sustratos a bacterias del suelo1. La yuca es una de las principales plantas. tropicales difundidas en todos los continentes, originaria de la zona tropical de. UN IC. América, florece en suelos pobres en nutrientes, con periodos vegetativos que van. M. desde 8 hasta 12 meses. Las variedades de yuca son: yuca dulce o comestible y yuca. CO. amarga o brava, esta clasificación se basa en la cantidad de glucósidos tóxicos. A. Y. producidos, los cuales se forman por la acción de las enzimas linamarasa, al romper. ÁT. IC. los tejidos sobre dos glucósidos cianogenicos llamados linamarina y lotaustralina2.. RM. Las variedades amargas reciben su nombre por su contenido de ácido cianhídrico. IN FO. libre y de cianoglucosido; tiene una mayor cantidad de glucósidos tóxicos en la. DE. pulpa de la raíz, mientras que la dulce contiene trazas en la cascara, las cuales. AS. desaparecen durante la cocción. Las amargas se cultivan para la producción de. SI ST. las variedades dulces.. EM. almidón de yuca comercial, debido a q su contenido de almidón es más alto que en. DE. La yuca a nivel mundial es producida principalmente como un cultivo de. N. subsistencia por pequeños agricultores3 es relativamente resistente a enfermedades lo. CC. IO. que favorece un buen rendimiento4. El cultivo de yuca ha venido creciendo. RE. rápidamente y su productividad ha aumentado a medida que se implementan nuevas. DI. tecnologías de producción. La yuca en Santander junto con otra variedad de productos agrícolas es fuente alternativa de almidón tanto para la producción de etanol como para la obtención de jarabes glucosados y de otros oligosacáridos llamados dextrinas2 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La variedad amarga es más eficiente en cuanto a la producción de almidón, la hace especialmente apta para ciertos procesos industriales, con rendimientos de hasta 80. AC IÓ. N. T/ha por año bajo condiciones experimentales, siendo su potencial similar al de caña de azúcar, maíz, arroz. Su potencial de rendimiento sobresale al compararse con. UN IC. otros cultivos por tener la habilidad de crecer donde otros cultivos no lo hacen3.. M. La papa como cultivo se inició hace más de 7000 años, a orillas del lago. CO. Titicaca en la frontera entre lo que hoy día son Perú y Bolivia, y fueron los indígenas. A. Y. del altiplano andino quienes se dieron la tarea de seleccionar y cultivar muchas de las. ÁT. IC. variedades y especies que hoy día conocemos. Con posterioridad a la conquista de. RM. América, la papa fue llevada a Europa por los españoles donde se le cultivaba como. IN FO. curiosidad en los jardines de los nobles y muchos años después comenzó a ser. DE. utilizada como alimento; gracias a sus múltiples usos y a su capacidad de adaptación. AS. a diferentes zonas agroclimatológicas su mejoramiento genético se aceleró en. EM. Europa, llegando a convertirse en uno de los principales alimentos no solo del viejo. SI ST. continente sino también del resto de la población mundial. Solanum tuberosum . es uno de los cultivos alimenticios más importantes, por ser superior a todos los demás. DE. cultivos en la producción de carbohidrato por unidad de tiempo y superficie, y en la. IO. N. producción de energía5. Ocupando el cuarto lugar en producción mundial de. CC. alimento después del trigo, el arroz y el maíz 6. Y en cuanto al consumo humano. RE. ocupa el quinto lugar7. Es principal fuente de carbono para los organismos vivos y. DI. constituye la clase más abundante de moléculas biológicas, las cuales por oxidación, proveen a la célula de esqueletos de carbono y energía necesaria para llevar a cabo los procesos metabólicos8, También es uno de los principales componentes de la 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. biomasa es el almidón, se utilizan ampliamente en las industrias de procesamiento de alimentos y generan una gran cantidad de residuos9.. AC IÓ. N. El almidón es un polisacárido de reserva en plantas superiores, distribuido tanto en las raíces, tallos y hojas, encontrándose más abundantemente en las semillas de. UN IC. los cereales y en los tubérculos como las patatas, camote, yuca, etc. en forma de. M. gránulos intracelulares compactos. Dicha estructura puede ser explicado en términos. CO. de la fuerza de atracción entre las largas moléculas de carbohidratos, y dentro de los. A. Y. gránulos se dispone radialmente en capas concéntricas, una mezcla de moléculas. ÁT. IC. lineales y ramificadas y cuando hay asociaciones paralelas entre estas, se juntan por. RM. puente de hidrogeno lo que resultan en regiones cristalinas o micelas, lo cual causa. IN FO. que el granulo sea birrefringente y evita su disolución en agua fría por la formación de una malla molecular que mantiene juntos los gránulos. Estas fuerzas asociadas. AS. DE. entre las moléculas pueden ser vencidas si se aplica una energía suficiente10.. EM. Estructuralmente el almidón presenta un grupo aldehído en el extremo de la. SI ST. cadena polimérica conocido como grupo reductor y está constituido por dos tipos de. DE. polímeros: la amilasa y la amilopectina; la primera, es un polímero lineal de. N. aproximadamente 6000 unidades de glucosa con enlace α-1,4 glucósido; mientras. IO. que la amilopectina posee cadenas lineales cortas α-1,4 de 10 - 60 unidades de. RE. CC. glucosa y de cadenas laterales α-1,6 con 15 - 45 unidades de glucosa. El número. DI. promedio de puntos de ramificación es del 5%. La molécula completa de amilopectina contiene aproximadamente 2 000 000 unidades de glucosa, por lo que es considerada una de las moléculas más grandes de la naturaleza11. 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Una de las propiedades características de las enzimas es su capacidad de catalizar ciertas reacciones químicas bien definidas y su presencia se detecta, en. AC IÓ. N. general, por la reacción que cataliza; y la cantidad de la misma se estima a partir de la velocidad de la reacción; en este sentido, las amilasas son enzimas que degradan el. UN IC. almidón dando como productos dextrinas y polímeros compuestos progresivamente. M. por unidades de glucosa12, que tienen numerosas aplicaciones biotecnológicas, un. CO. ejemplo de ello es la producción de jarabes, que contienen oligosacáridos como. Y. maltosa y glucosa. Las otras propiedades y los mecanismos de acción de las amilasas. IC. A. dependen del origen de las mismas, generalmente las α- amilasas son estables entre. RM. ÁT. pH 5.5 y 8.010 ,en presencia de un componente de calcio con un pH óptimo entre 4.8. Bacillus. IN FO. y 6.513.. licheniformis se utiliza industrialmente para la producción de. DE. enzimas, tales como proteasas y α-amilasas14. Las amilasas están incluidas en una. EM. AS. familia de enzimas hidrolíticas compuesta por: α-amilasa, β-amilasa, glucoamilasa e. SI ST. isoamilasa, que se encuentran ampliamente distribuidas en tejidos vegetales, donde juegan un rol muy importante en la degradación del almidón en la germinación de las. DE. semillas; en tejidos animales, cumpliendo una misión digestiva; y en diversas. IO. N. especies de microorganismos como hongos y bacterias15. Las α-amilasa provenientes. CC. de hongos y bacterias son las más utilizadas en el sector industrial por sus múltiples. RE. ventajas: fácil disponibilidad, volumen de producción, estabilidad de operación,. DI. modificación y optimización del proceso16. La termoestabilidad de esta enzima, industrialmente, ha hecho que las amilasas tengan gran aplicabilidad en diversos procesos12. 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. El principal producto final de la acción de la glucoamilasa sobre el almidón es glucosa, lo que la diferencia claramente de la α y β amilasas. La enzima también. AC IÓ. N. produce pequeñas cantidades de oligosacáridos. La sacarificación del almidón puede alcanzar hasta 96% de dextrosa. La acción de la enzima causa inversión de la. UN IC. configuración, produciendo β-glucosa. Las glucoamilasas son inactivas sobre. M. almidón nativo y su actividad es máxima entre pH 4.0 y 5.5, y temperatura alrededor. CO. de 55-65 °C. La tasa de reacción cae rápidamente a medida que disminuye el tamaño. Y. de la molécula de sustrato, siendo máxima sobre almidones previamente sometidos a. ÁT. IC. A. licuefacción17.. RM. La α -amilasa o α -1,4-glucohidrolasa catalizan la etapa de hidrólisis de los. IN FO. enlaces α-1-4 del almidón y los oligosacáridos, liberando moléculas de glucosa a. DE. partir del extremo no reductor de la cadena. Los enlaces ramificados α-1-4 también. AS. se hidrolizan, pero mucho más lentamente, formándose un jarabe de glucosa cuyo. EM. contenido de glucosa es 95 a 97 % en peso y de un 30 a 50% de oligosacáridos. SI ST. grandes. La glucosa formada se utiliza como jarabe o se cristaliza para obtener glucosa pura sólida. Se usa a gran escala en la industria de procesado del almidón en. DE. tanques discontinuos a 55-60 °C y pH de 4.5 y con períodos de incubación de 48-92. IO. N. horas. El calcio la estabiliza frente a la desnaturalización por el calor o los álcalis, y. CC. la hidrólisis puede llevarse a cabo fácilmente añadiendo el enzima soluble al almidón. RE. una vez que la α-amilasa ha realizado del 15 al 30 % de la hidrólisis posible. La α-. DI. amilasa bacteriana hidroliza el enlace glucosídico interno dando lugar a productos de bajo peso molecular, solubles y menos viscosos, cuya ruptura está limitada por la presencia de los enlaces glucosídicos a-1-6 en los puntos de ramificación de la 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. molécula del almidón nativo (amilopectina). Los productos de hidrólisis tienen configuración a en la glucosa del extremo reductor. Se piensa que la enzima actúa. AC IÓ. N. por la acción combinada de los grupos carboxilo e histidina del centro activo18. El principal género bacteriano productor de amilasas es la familia Bacillaceae. UN IC. que se caracterizan por ser bacilos aerobios y anaerobios facultativos, Gram. M. positivos, producen endosporas con morfología oval o cilíndrica que le permite. CO. resistir condiciones desfavorables en el ambiente, son móviles por la presencia de. A. Y. flagelos laterales, son catalasa positiva, presentando hemólisis variable y un. ÁT. IC. crecimiento activo en un rango de pH entre 5.5 - 8.518. La propagación activa del. RM. microorganismo se produce en medios que presentan superficie húmeda, y por lo. IN FO. general crece bien en agar sangre, produciendo colonias blanquecinas, grandes,. DE. extendidas e irregulares19. Dentro de las especies registradas tenemos a Bacillus. AS. licheniformis, B. stearothermophilus, B. subtilis y B. amyloliquefacien, quienes son. EM. aplicados en procesos industriales para alimentos, textiles, fermentación, papelería. SI ST. entre otros20 por sus amplios rangos de operación de temperatura (25-90°C), resistencia a pH extremos (1.0-11.5) y altos niveles de expresión16. Por su parte, la. DE. amilasa de B. licheniformis tiene un pH óptimo de 5.0 a 8.0, temperatura optima de. IO. N. 76°C y un peso molecular de 2.25 x 104 Kd1, producen complejos amilolíticos para. CC. hidrólizar almidón con el fin de mejorar el desarrollo de este proceso industriales21.. RE. La inducción de amilasa tipo α requiere un sustrato que contenga enlaces α-1,4. DI. glucosídicos, además de maltosa, dextrina y almidón, y la glucosa, producto final de la hidrólisis tiene la posibilidad de reprimir la síntesis de enzima como un. 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. mecanismo conocido como represión catabólica22 e inactivada a un pH en el rango de 4.8 - 5.0 y estable entre 6.0 y 7.0 23.. AC IÓ. N. Las bacterias del género Bacillus son aislados del suelo, que participa conjuntamente con otras bacterias en las primeras etapas de descomposición de la. UN IC. biomasa vegetal y que mediante el uso de carbohidrolasas extracelulares degrada. M. varios polisacáridos presentes en estos materiales, produciendo oligo, di o mono. CO. sacáridos que son transportados, fosforilados y subsecuentemente catabolizados vía. A. Y. glicólisis o pentosas fosfatos24 .Las moléculas enzimáticas (hidrolasas) se encuentran. ÁT. IC. aisladas, no agregativos, que usualmente se excretan al medio de cultivo, el cual es. RM. indispensable para la eficiente hidrólisis de los sustratos. Por otro lado, la expresión. IN FO. de las hidrolasas puede ser regulada a nivel transcripcional, donde la glucosa reprime. DE. dicho proceso25. Aunque se ha podido determinar que la actividad catalítica de las. EM. por glucosa y celobiosa26. AS. enzimas son inhibidas por los sustratos, existen algunas cepas que no son inhibidas. SI ST. En los procesos de fermentación los microorganismos desarrollan su. DE. actividad vital en medios de elevada complejidad, donde el agente responsable de la. N. transformación es una célula viva que asimila diversos materiales, se reproduce y. CC. IO. produce otras sustancias, algunas de interés económico. Uno de los aspectos más. RE. importantes del estudio de la cinética de estos procesos es la selección de los. DI. métodos analíticos seguros para evaluar confiablemente las sustancias consumidas y producidas por el microorganismo, y la variación de su concentración con el tiempo;. la concentración de células en el medio constituye una medida adecuada de la concentración del sistema enzimático responsable de la transformación. Por esta 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. razón las velocidades de. crecimiento, consumo de sustrato y de formación de. producto, generalmente se expresan como velocidades específicas referidas a la. AC IÓ. N. concentración de células activas 27. Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los. UN IC. mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el. M. medio de cultivo para reproducir nuevos microorganismos. Este proceso continúa. CO. hasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el. A. Y. crecimiento se detiene. También puede detenerse el crecimiento por acumulación de. ÁT. IC. alguna substancia inhibidora formada por los mismos microorganismos. Luego hay. RM. dos aspectos claramente diferenciables que hacen al crecimiento microbiano: uno. IN FO. estequiométrico, por el cual la concentración final de microorganismos obtenidos dependerá de la concentración y composición del medio de cultivo, y el otro cinético,. AS. DE. el que dirá con qué velocidad se lleva a cabo el proceso26.. EM. Debido a la naturaleza autocatalítica del crecimiento microbiano, es lógico. SI ST. suponer que la concentración de microorganismos, X, influye en la velocidad con. DE. que aumenta la población, representado por rX = µX, donde µ es la velocidad. N. específica de crecimiento, la cual para un tipo de microorganismo dado depende. CC. IO. principalmente de la composición y concentración del medio de cultivo, presencia de. RE. inhibidores, temperatura y pH. Existen diversas expresiones para µ siendo la más. DI. difundida la ecuación de Monod, que relaciona el valor de pendiente (m) con la concentración de un componente del medio de cultivo que está en defecto respecto de. los. requerimientos. del. microorganismo:. el. sustrato. limitante,. que. matemáticamente se representa como µ = µmax (S/Ks +S), donde S es la 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. concentración de sustrato limitante, um es la velocidad de crecimiento específica máxima, y Ks se conoce como constante de saturación. El valor de Ks está. AC IÓ. N. inversamente relacionado con la afinidad del microorganismo por el sustrato28. Bacillus licheniformis es reconocido industrialmente atractivo por sus altas su desarrollo bajo condiciones ambientales extremas;. UN IC. tasas de crecimiento, y. M. además, por su capacidad para secretar grandes cantidades de enzimas extracelulares. CO. directamente al medio de cultivo en condiciones aeróbicas29. Se sabe que. A. Y. naturalmente metaboliza una amplia variedad de azúcares incluyendo xilosa,. ÁT. IC. arabinosa, almidón, celulosa, sacarosa, celobiosa y glucosa; sin embargo, a pesar del. RM. extenso conocimiento genético y bioquímico del género30. Existe poca información. 31. ; esto plantea la necesidad de generar conocimiento. DE. en condiciones aeróbicas. IN FO. de aspectos bioenergéticas, metabólicos, de crecimiento y de formación de productos. AS. básico del metabolismo y consumo de glucosa, a partir del almidón de diferentes. EM. sustratos en condiciones aeróbicas que se encuentran en la naturaleza como residuos. SI ST. contaminantes del medio ambiente.. DE. Existe una población bacteriana que tiene capacidad de utilizar el almidón. N. como fuente carbonada para su crecimiento, desarrollo y reproducción; en forma. CC. IO. paralela se sabe que las bacterias excretan amilasas con el afán de hidrolizarlos, y. RE. que constituyen comercialmente los extractos enzimáticos que pueden ser utilizados. DI. en la industria a gran escala26. En este sentido la determinación de las curvas de crecimiento en los diferentes sustratos de almidón permitirá la determinación de los parámetros cinéticos, velocidad específica de crecimiento y tiempo de generación, de Bacillus licheniformis como criterios para identificar las condiciones fisiológicas 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. previas al trabajo a gran escala y/o para aplicar técnicas de mejoramiento genético en. UN IC. AC IÓ. N. condiciones de laboratorio.. CO. M. OBJETIVO (S):. Y. A. GENERAL. IC. A. 1. Determinar el efecto del almidón de papa, y yuca sobre la cinética de. RM. ÁT. crecimiento de Bacillus licheniformis FGM-A15 en un sistema agitado bajo. IN FO. condiciones de laboratorio.. DE. B. ESPECÍFICOS. AS. 1. Describir las curvas de crecimiento de Bacillus licheniformis FGM-A15. EM. utilizando almidón de papa, y de yuca en sistemas agitados bajo condiciones. SI ST. de laboratorio.. DE. 2. Determinar la velocidad específica de crecimiento y tiempo de generación de. N. Bacillus licheniformis FGM-A15 utilizando almidón de papa, y de yuca en. CC. IO. sistemas agitados bajo condiciones de laboratorio.. DI. RE. 3.. Establecer si existe o no diferencia significativa entre los valores de los. parámetros cinéticos de Bacillus licheniformis FGM-A15 en cada uno de los sistemas ensayados.. 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y MÉTODOS. MATERIAL BIOLÓGICO. N. 1.. AC IÓ. Cultivo de Bacillus licheniformis FGM-A15 (ANEXO 1), proporcionado por el. UN IC. Laboratorio de Fisiología y Genética Microbiana, con capacidad amilolítica. M. aislado de residuos de efluente de curtiembre32.. CO. Tubérculo de papa y yuca, obtenidos del mercado La Hermelinda, Trujillo-. IC. PROCEDIMIENTO. ÁT. 2.. A. Y. Perú.. RM. 2.1. REACTIVACIÓN DEL CULTIVO DE Bacillus licheniformis FGM-A15. IN FO. El cultivo puro fue reactivado mediante siembra por estría en placas. AS. DE. conteniendo Agar Almidón 0.2% previa incubación a 35 ºC por 48 h 33.. EM. 2.1.1. DETERMINACIÓN DE LA PUREZA DE LAS COLONIAS. SI ST. A partir del cultivo reactivado se realizó una coloración Gram, y. DE. posterior observación microscópica (ANEXO 2).. DI. RE. CC. IO. N. 2.1.2. VERIFICACIÓN DE LA CAPACIDAD DEGRADATIVA DE ALMIDÓN. Luego de haber reactivado el cultivo, se verificó la capacidad degradativa del almidón por Bacillus licheniformis FGM-A15, sembrando por puntura en placa conteniendo Agar Almidón 0.2% y se incubó a 35 ºC por 48h. Posteriormente se agregó la solución de 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Lugol, y se observó el halo neto de hidrolisis del almidón alrededor. AC IÓ. N. de la colonia (ANEXO 3).. 2.2. CONSTRUCCIÓN DE BIORREACTORES. UN IC. Se construyeron cuatro biorreactores con frascos de vidrio de 250 mL de. M. capacidad; al cual se le acondicionaron 04 “bafles” de vidrio, un motor de 6V. CO. y un agitador tipo Roushton, a cada uno (ANEXO 4). Los frascos y agitadores. Y. fueron esterilizados con lejía al 2.5 % por 30 minutos y luego irradiados con. IC. A. luz ultravioleta de una lámpara de 300 Watt, a una distancia de 40 cm, por 60. IN FO. RM. ÁT. minutos34.. DE. 2.3. PREPARACIÓN DEL INÓCULO. A partir del cultivo reactivado y utilizando solución salina fisiológica estéril se. EM. AS. ©preparó una suspensión bacteriana equivalente al tubo Nº 1 (3.0 x 108. DE. SI ST. UFC/mL) del nefelómetro de Mac Farland 29, constituyendo el inóculo.. DI. RE. CC. IO. N. 2.4. OBTENCIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DEL ALMIDÓN DE PAPA Se pesó 300 g. de papa, se cortó en trozos pequeños, y colocados en un matraz con 500 mL de agua destilada y se calentó en autoclave a 121 ºC por 15 min. Y una atmósfera de presión (ANEXO 5). Se separó el sobrenadante, y se estandarizó la concentración de almidón en la disolución, colocando, en un tubo de ensayo, 0.1 mL de sobrenadante, 0.9 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. mL de agua destilada, 0.1 mL de HCl 0.10 N y 0.5 mL de solución yodada (ANEXO 6). Se dejó en reposo por 5 min. Y se hizo lectura de la. AC IÓ. N. absorbancia en el espectrofotómetro a 580 nm. (ANEXO 7).. UN IC. 2.5. OBTENCIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DEL ALMIDÓN DE YUCA. M. Se pesó 300 g. de yuca y se cortó en trozos pequeños (ANEXO 8), luego. CO. fueron colocados en un balón con 500 mL de agua destilada y se autoclavó a. Y. 121ºC por 15 min, y una atmósfera de presión (ANEXO 9).. IC. A. Se separó el sobrenadante, y se estandarizó la concentración de almidón en. RM. ÁT. la disolución (ANEXO 10), colocando, en un tubo de ensayo, 0.1 mL de. IN FO. sobrenadante, 0.9 mL de agua destilada, 0.1 mL de HCl 0.10 N y 0.5 mL de solución yodada. Se dejó reposar por 5 min, y. se hizo lectura de la. AS. DE. absorbancia en el espectrofotómetro a 580 nm.. EM. 2.6. DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE Bacillus. SI ST. licheniformis FGM-A15. DE. Se colocó 90 mL de Caldo Almidón 1% -buffer fosfato, pH 6.0 en el. N. Biorreactor I (Almidón de papa), luego se agregó 10 mL de inóculo. DI. RE. CC. IO. bacteriano estandarizado (3.0 x 108 UFC/mL) se hizo funcionar el agitador a 150 rpm aproximadamente (ANEXO 11) e incubó a temperatura. ambiental (23-25 ºC). Cada 2 horas hasta las 16 h se extrajo una alícuota de 5 mL de muestra del biorreactor y se hizo diluciones (ANEXO 12) en solución salina fisiológica estéril. Luego se sembró, por superficie (ANEXO 13), 0.1 mL de dilución en placas de Agar Almidón y se incubó a 35 ºC por 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 24 h. Finalmente, se realizó el recuento bacteriano (UFC/mL). 29. (ANEXO. 14). Este mismo procedimiento se repitió con el Biorreactor II (Almidón. UN IC. AC IÓ. N. de yuca). Cada ensayo se realizó por tres veces (ANEXO 15 - 17).. M. 2.7. PROCESAMIENTO DE DATOS. CO. Con los datos obtenidos (UFC/mL) en relación al tiempo de incubación se. A. Y. graficó cada una de las curvas de crecimiento bacteriano (Sistemas I y II).. ÁT. IC. Luego se realizaron los cálculos necesarios para determinar los valores. RM. promedios de la velocidad específica de crecimiento y tiempo de generación. IN FO. (ANEXO 18).De Bacillus licheniformis FGM-A15 en las condiciones de. AS. DE. ensayo.. SI ST. EM. 2.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los promedios fueron analizados por el software Statistical Análisis System. DE. (Version 8.1). Mediante Análisis de Varianza por el procedimiento de. significativas entre los sistemas de ensayo para cada variable de estudio.. DI. RE. CC. IO. N. Modelos Lineales Generales para establecer si existe o no diferencias. 14. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. RESULTADOS. AC IÓ. La Figura 1, describe las curvas de crecimiento de Bacillus licheniformis FGM-. UN IC. A15 en el Biorreactor I (Almidon de papa) y Biorreactor II (Almidón de yuca) a temperatura ambiente (23-25 °C) y pH 6.0, observandose que la bacteria. CO. M. tuvo un mayor crecimiento en el Biorreactor II, con una fase de latencia hasta. Y. las 2 h, una fase logarítmica hasta las 10 h y posterior fase de muerte hasta las. ÁT. IC. A. 16 h.. RM. En la Figura 2, se observa las fases logaritmicas de crecimiento de Bacillus. IN FO. licheniformis FGM-A15 experimental y corregida en el Biorreactor I (Almidon de papa) y Biorreactor II (Almidón de yuca) a temperatura. DE. ambiental (23-25 °C) y pH 6.0. En el Biorreactor I empieza a las 0 h y termina. AS. a las 8 h; mientras que, en el Biorreactor II empieza a las 2h y termina a las. SI ST. EM. 10 h.. En la Figura 3, se representa las velocidades específicas de crecimiento (u, h-1). DE. y tiempos de generación (tg, min) de Bacillus licheniformis FGM-A15 en el. IO. N. Biorreactor I (Almidon de papa) y II (Almidón de yuca) determinada a. DI. RE. CC. temperatura ambiental (23-25 °C) y pH 6.0. Se observa que la bacteria tiene una mayor velocidad específica de crecimiento en el Biorreactor I (3.6017. generaciones /h-1), y menor en el Biorreactor II (2.7312 generaciones /h-1); mientras que, tiene un tiempo de generación de 11.54 min en el Biorreactor I, y 15.22 min en el Biorreactor II. 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(28) DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. Figura 1. Curvas de crecimiento de Bacillus licheniformis FGM-A15. SI ST. EM. experimental en el Biorreactor I (Almidon de papa) y. DI. RE. CC. IO. N. DE. Biorreactor II (Almidón de yuca).. 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(29) ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RM. Figura 2. Fase logaritmica de crecimiento de Bacillus licheniformis FGM-A15. IN FO. en el Biorreactor I (Almidón de papa) y Biorreactor II (Almidón. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. de yuca).. 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(30) M. b. ÁT. b. AS. DE. IN FO. RM. a. IC. A. Y. CO. a. UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. EM. Figura 3. Velocidad específica de crecimiento (u, h-1) y tiempo de generación. SI ST. (tg, min) de Bacillus licheniformis FGM-A15 en el Biorreactor I. DE. (Almidón de papa) y Biorreactor II (Almidón de yuca).. IO. N. a: p < 0.05. DI. RE. CC. b: p < 0.05. 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. DISCUSIÓN. 23. . Entonces, al observar la evolución del crecimiento de. UN IC. celular o de productos. AC IÓ. Las diferentes fuentes de nutrientes pueden afectar la velocidad de síntesis. Bacillus licheniformis FGM-A15 en los dos sistemas de ensayos relacionados con la. CO. M. fuente de almidón, de papa y de yuca, durante las 16 horas, se verifica que existe. Y. diferente comportamiento en el crecimiento para cada uno de las fuentes de almidón. IC. A. (Fig. 1), lo cual se debería a que la estimulación o inhibición del crecimiento y el. ÁT. metabolismo de los microorganismos dependen de la disponibilidad y concentración. 36. . El crecimiento bacteriano, entre las 0 y 2 horas, fue. IN FO. condiciones ambientales. RM. de nutrientes, como fuente de carbono y nitrógeno principalmente, y de las. DE. menor con el almidón de papa, en comparación al almidón de yuca, quizás se deba a. AS. que con dicha fuente de almidón, el biopolímero estuvo menos disponible, que se. EM. evidencia un menor crecimiento de la bacteria; en tanto que, el almidón de yuca. DE. SI ST. permitió un crecimiento rápido en este lapso de tiempo.. IO. N. La mayoría de los sustratos son capaces de presentar una acción inhibitoria 26. , es conocido. CC. reversible sobre el crecimiento de las poblaciones microbianas. RE. también que las fuentes de sustrato limitante más frecuentes son la fuente de. DI. carbono, la de nitrógeno o el aceptor final de electrones, como el oxígeno molecular o el nitrato. En este experimento, el sustrato limitante para el crecimiento fue el almidón. Estos resultados concuerdan con los análisis derivados de la teoría de Monod para un sistema cerrado como el cultivo batch, tal como se realizó en el 19. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. presente trabajo, la fase exponencial no puede desarrollarse indefinidamente, porque. AC IÓ. N. en estos sistemas hay influencia marcada del sustrato limitante en el crecimiento37.. En la Fig. 1, también se observa que hubo un crecimiento exponencial de B.. UN IC. licheniformis desde las 2 hasta las 10 horas en almidón de yuca, esto se puede deber. M. a que en dicha fuente de almidón, la proporción carbono: nitrógeno (C: N) haya sido. CO. la más adecuada, puesto que este es un factor decisivo en la tasa de aprovechamiento. Y. del sustrato, siendo según un medio de crecimiento óptimo aquel que tenga una. IC. A. proporción C: N aproximadamente 20: 138. En tanto que, el crecimiento bacteriano. RM. ÁT. con la fuente de almidón de papa, tuvo solamente una fase de crecimiento. IN FO. exponencial hasta las 8 horas, quizás por la reducción de la concentración del almidón en el sistema de ensayo. Generalmente entre los sustratos componentes del. DE. medio de cultivo hay uno que se consume a una mayor velocidad que los restantes39,. AS. o rige el crecimiento porque es necesario para el crecimiento y buen desarrollo. EM. celular, el cual se nombra sustrato limitante, en este caso no sólo habría que tener en. SI ST. cuenta la cinética de crecimiento y de consumo de nutrientes, sino los mecanismos. IO. N. DE. de entrada de estos a la célula y los modelos existentes 40. CC. En el biorreactor II, que contiene almidón de yuca, se observa que después de. RE. las 10 horas hasta las 16 horas se observa un reducción del crecimiento de B.. DI. licheniformis FGM-A15; en tanto que, en el biorreactor I, con almidón de papa, la bacteria decrece desde las 8 horas hasta las 16 horas. Una causa por la que un microorganismo deja de crecer en un medio de cultivo es la inhibición que se 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. presenta como consecuencia de la acumulación de productos ácidos del metabolismo que cambian el pH del medio de cultivo; se sabe que los iones H+ en numerosas. AC IÓ. N. reacciones enzimáticas pueden actuar como inhibidores no competitivos41, pero en el presente trabajo no se tuvo en cuenta la influencia del pH, por lo que se recomienda. CO. M. UN IC. monitorear el valor de pH durante el crecimiento de esta bacteria.. Y. Desde el punto de vista cinético, la tendencia del crecimiento bacteriano se. IC. A. observa en la Fig. 2, donde la B. licheniformis FGM-A15 en el biorreactor II. ÁT. (almidón de yuca) es mayor en relación al biorreactor I (almidón de papa).. RM. Considerando que durante el sistema de ensayo se controlan determinados factores. IN FO. como el pH, la temperatura y se asume que no se forman productos inhibidores del. 12. . Entonces, se observa que debe existir una relación. AS. la concentración de sustrato. DE. crecimiento, la velocidad específica de crecimiento (μ) se hace sólo dependiente de. EM. entre velocidad específica de crecimiento y la concentración de almidón (sustrato). SI ST. sigue una cinética de saturación, y la µ también está en función de otras condiciones. DE. de crecimiento, como agitación, aeración, temperatura, condiciones redox del medio,. N. productos intermediarios, cambio de las propiedades reológicas del medio, sistemas. DI. RE. CC. IO. de entrada de nutrientes a la célula, etc.26. En relación a la velocidad específica de crecimiento promedio de B.. licheniformis FGM-A15 se encontró que fue mayor (3,6017 generaciones/hora) en almidón de yuca (Fig.3), esto concuerda con lo descrito en la evaluación de la curva 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. de crecimiento en las condiciones de ensayo (Fig.2). Debido a la naturaleza autocatalítica del crecimiento microbiano, es lógico suponer que la concentración de. AC IÓ. N. B. licheniformis, X, influye en la velocidad con que aumenta la población, representado por rX = µX, la cual para un tipo de microorganismo dado depende. UN IC. principalmente de la composición y concentración del medio de cultivo, presencia de. M. inhibidores, temperatura y pH43. Existen diversas expresiones para µ siendo la más. CO. difundida la ecuación de Monod, que relaciona el valor de pendiente (m) con la. Y. concentración de un componente del medio de cultivo que está en defecto respecto requerimientos. del. microorganismo:. el. sustrato. A. los. limitante,. que. IC. de. RM. ÁT. matemáticamente se representa como µ = µmax (S/Ks +S), donde S es la. IN FO. concentración de sustrato limitante, µmax es la velocidad de crecimiento específica. DE. máxima, y Ks se conoce como constante de saturación 28.. EM. AS. Así mismo, la mayor velocidad de crecimiento de B. licheniformis FGM-A15. SI ST. en almidón de yuca (Fig. 3), se puede atribuir a la rapidez con que son transportados los nutrientes, lo cual se debe a la afinidad por el sistema transportador. 45. .Esta. DE. rapidez en el transporte de nutrientes contribuiría con la movilización de los. IO. N. nutrientes al interior de la bacteria, pudiendo lograr un incremento en su crecimiento.. CC. Además es conocido que todo aquello que afecte el crecimiento de un. RE. microorganismo se ve reflejado en sus parámetros cinéticos, tales como la velocidad. DI. de crecimiento y tiempo de generación 36. La significancia de los sistemas es 0.001 (Anexo 19) menor al valor de alfa de 0.05, por lo tanto se dice que existen. 22. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. diferencias significativas entre los sistemas, lo que indica que al menos uno de los. AC IÓ. N. sistemas tienen promedios diferentes.. Paralelo al crecimiento bacteriano, existe inducción, síntesis y excreción de. 43. . La alfa-amilasa (Alfa 1,4-D- Glucan Glucano-. M. amilasas degradan de almidón. UN IC. enzimas tipo hidrolasas para degradar los biopolímeros como el almidón. Las. CO. hidrolasa) hidroliza los enlaces glucosídicos alfa-1,4 de los polisacáridos que poseen. A. Y. 3 o más unidades de D-glucosa en unión alfa-1,4; pero el ataque se hace en forma no. ÁT. IC. selectiva (tipo endoenzima) sobre varios puntos de la cadena simultáneamente,. RM. aunque los primeros productos de la hidrólisis son siempre oligosacáridos de 5-7. IN FO. unidades de glucosa, o un número múltiplo. La amiloglucosidasa (Alfa-1,4- D-. DE. Glucan glucohidrolasa) es una exohidrolasa también conocida como glucoamilasa,. AS. que hidroliza los enlaces glucosídicos alfa-1,4 y alfa-1,6 de la amilosa y la. EM. amilopectina separando unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la. SI ST. cadena 43.. DE. Los almidones nativos tienen características muy específicas y se comportan. IO. N. de diferentes maneras en cuanto a sus propiedades funcionales, lo que depende de su. CC. fuente natural; por tal motivo, el estudio de fuentes convencionales y no. RE. convencionales de almidones es una alternativa a las diferentes industrias (alimentos,. DI. cosméticos, papel, textil y otras.) en su utilización; siendo los cereales, raíces, tubérculos y leguminosas, las principales fuentes de obtención de almidones en nuestro país, así como del maíz, papa, yuca y arroz; y por consiguiente, los 23. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. almidones son utilizados como materia prima en diversas industrias y representan un insumo vital para la industria de alimentos como estabilizadores, ayudantes en la. N. emulsificación, mejoradores de textura y otros, en donde sus propiedades funcionales. UN IC. AC IÓ. son determinantes en la calidad del producto final44. CO. M. El cultivo de las bacterias en sistemas agitados utilizando sustratos contenidos. Y. en residuos agroindustriales constituye una alternativa para la obtención de jarabes. IC. A. glucosados. En este sentido, las amilasas que se secretan en los medios de cultivo. ÁT. podrían ser utilizados en la hidrolisis del almidón a nivel de laboratorio, escala piloto. RM. o industrial, por ello se propone utilizar las amilasas provenientes de. B.. IN FO. lichenformis45, las cuales se caracterizan por ser estables a altas temperaturas e. DE. hidrolizar enlaces 1,4- α-glicosídicos aún en el centro de la cadena, por lo que se la. 46. . A nivel regional, la industria del bioetanol es una alternativa para la. EM. unidades. AS. conoce como endoamilasa, produciendo glucosa, maltosa y oligómeros de 3 a 7. SI ST. aplicación y uso de las bacterias degradadoras de almidón, que es elaborado a través. DE. de la fermentación de productos con alto contenido de carbohidratos como la papa,. N. hemicelulosa como la madera blanda, inclusive celulosa o residuos de papel, melazas. IO. azucareras, maíz, almidón de trigo, almidón de papa, almidón de yuca y por. DI. RE. CC. hidrólisis y fermentación de residuos celulósicos47.. 24. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. CONCLUSIONES. AC IÓ. 1. Bacillus licheniformis FGM-A15 alcanzó una mayor velocidad específica de. UN IC. crecimiento, y un menor tiempo de generación en un sistema agitado con. CO. M. almidón de yuca a temperatura ambiental y pH 6.0.. A. Y. 2. La fase logarítmica media de Bacillus licheniformis FGM-A15 en el sistema. RM. ÁT. IC. con almidón de yuca se alcanzó a las 6 horas, en las condiciones de ensayo.. IN FO. 3. Los valores de velocidad específica de crecimiento, y tiempo de generación determinados para Bacillus licheniformis FGM-A15 en los sistemas de. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. ensayo son significativamente diferentes.. 25. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. RECOMENDACIONES. AC IÓ. 1. Evaluar la proporción de C: N en el medio de cultivo, durante el crecimiento de. UN IC. Bacillus licheniformis en un biorreactor agitado. M. 2. Al momento de preparar la solución de caldo almidón, los reactivos deben ser. CO. preparados y esterilizados por separado, ya que algunas sales reaccionan al ser. IC. A. Y. mezcladas precipitando posteriormente.. ÁT. 3. Se debe monitorear y controlar el pH de la solución de caldo almidón durante. IN FO. RM. todo el funcionamiento de los biorreactores.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. 4. Evaluar la variación de pH durante el crecimiento de Bacillus licheniformis.. 26. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
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