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Selección in vitro de cultivos rizobianos que promueven la germinación de semillas de Lactuca sativa “lechuga”

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Academic year: 2020

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. N. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. PARASITOLOGÍA. RM. Selección in vitro de cultivos rizobianos que promueven la. AS. DE. IN FO. germinación de semillas de Lactuca sativa “lechuga”. EM. TESIS. SI ST. PARA OBTENER EL TÍTULO DE:. AUTOR: Br. HILDA CRISTHINE CASTRO GIL. ASESOR: Dra. BERTHA SORIANO BERNILLA. DI. RE. CC. IO. N. DE. BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO. Trujillo – Perú 2013. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO. AC IÓ. N. Dr. Orlando Velásquez Benítez. UN IC. RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. IC. A. Y. CO. VICERRECTORA ACADÉMICA. M. Dra. Vilma Julia Méndez Gil. ÁT. Dr. Regné Cortéz Lara. IN FO. RM. SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. DE. Dr. Hermes Escalante Añorga. EM. AS. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. SI ST. Dr. César Augusto Jara Campos. DI. RE. CC. IO. N. DE. SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. Dr. Pedro Alvarado Salinas. DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CERTIFICACIÓN DEL ASESOR. AC IÓ. N. La que suscribe, profesora asesora de la presente tesis, declara que ésta ha. UN IC. sido ejecutada de conformidad con su correspondiente proyecto y con las debidas orientaciones brindadas a la tesista. Con respecto al informe, éste ha sido. CO. M. revisado y acoge las observaciones y sugerencias alcanzadas. Por lo que autorizo. Y. a la Bachiller Hilda Cristhine Castro Gil, continuar con el trámite de. ___________________________________ Dra. Bertha Soriano Bernilla Asesora. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. reglamento correspondiente.. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. AC IÓ. N. Señores Miembros del Jurado Dictaminador:. UN IC. Acorde con las disposiciones establecidas por el Reglamento de Grados y. M. Títulos de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología de. CO. la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo,. A. Y. presento a vuestra consideración y claro discernimiento la presente tesis:. ÁT. IC. Selección in vitro de cultivos rizobianos que promueven la germinación de. RM. semillas de Lactuca sativa “lechuga” con el objetivo de obtener el Título. DE. IN FO. Profesional de Biólogo-Microbiólogo.. EM. AS. Espero que la presente investigación sea de vuestra aprobación.. _______________________________________ Br. Castro Gil, Hilda Cristhine. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. Trujillo, Abril del 2013.. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CO. M. Dr. Juan Guevara Gonzales. UN IC. ______________________________. AC IÓ. N. MIEMBROS DEL JURADO. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. Presidente. ______________________________. Secretario. _____________________________ Dra. Bertha Soriano Bernilla Vocal. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. Ms. C. Aníbal Quintana. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. N. Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran. AC IÓ. que el presente Informe de Tesis ha cumplido con los requisitos formales y. CO. M. UN IC. fundamentos teóricos, siendo aprobado por UNANIMIDAD.. A. Y. ______________________________. DE. IN FO. RM. Presidente. ÁT. IC. Dr. Juan Guevara Gonzales. EM. AS. ______________________________. Secretario. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. Ms. C. Aníbal Quintana. _____________________________ Dra. Bertha Soriano Bernilla Vocal. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA A Dios,. AC IÓ. N. Por iluminar siempre mi camino.. UN IC. A mis padres,. M. Aristides e Hilda, por todo su amor, por estar ahí en. CO. todo momento de mi vida, por enseñarme lo. A. Y. maravilloso que es tener una familia unida, fuerte y. ÁT. IC. feliz, por sus enseñanzas valiosas y por confiar en. DE. IN FO. RM. mí.. AS. A mis hermanos,. EM. Yvan, Flor, Gerhard y Tony por los momentos. SI ST. que pasamos juntos, gracias por enseñarme con. DE. sus risas, ocurrencias y enojos a ver la vida de. A Raúl por su comprensión, cariño y compañía y especialmente por nuestro hijo. DI. RE. CC. IO. N. una manera diferente.. Valentino, quien es el motor de mi vida.. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO. Agradezco de manera especial a mi asesora Dra. Bertha Soriano Bernilla, por. AC IÓ. N. permitirme realizar este trabajo de investigación en el Laboratorio de Microbiología. UN IC. Ambiental, además por su apoyo, asesoría y paciencia en el desarrollo de esta tesis.. M. A los profesores de la escuela de Microbiología y Parasitología por su amistad,. CO. dedicación, y por brindarme sus conocimientos académicos durante mi formación como. A. Y. futuro profesional. Quiero extender un sincero agradecimiento a los profesores Jaime. RM. ÁT. IC. Agreda y Miguel Muñoz su apoyo incondicional a lo largo de la carrera.. IN FO. A Zully, por su preocupación y por el apoyo tanto en lo personal como en lo. DE. profesional y por incentivarme a seguir adelante de manera firme y constante.. EM. AS. A mis amigas y colegas Fiorella, Maritza que me acompañaron y ayudaron. SI ST. durante la carrera, por su entusiasmo y empeño para lograr nuestro objetivo.. DE. A todas las personas que me apoyaron de alguna manera a culminar la tesis, pues. CC. IO. N. cada granito de arena cuenta.. DI. RE. Gracias.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN El presente estudio se realizó con el fin de seleccionar cultivos rizobianos que. N. promueven la germinación de semillas de Lactuca sativa ¨lechuga¨. Primero, se evaluó. AC IÓ. la capacidad promotora de crecimiento vegetal de cada uno de los cultivos rizobianos,. UN IC. aislados de Pisum sativum´¨arveja¨, mediante pruebas de producción de sideróforos, solubilización de fosfato y producción de ácido indolacético, teniendo como resultados. CO. M. que siete cultivos resultaron ser positivos a la producción de sideróforos (Ra-138-01,. Y. Ra-014-03, Ra-074-01, Ra-201-03, Ra-289-01, Ra-212-01, Ra-113-01), cuatro cultivos. IC. A. a la solubilización de fosfatos (Ra-014-03, Ra-074-01, Ra-289-01, Ra-113-01) y. RM. ÁT. ninguno positivo a la producción de ácido indolacético. Luego se evaluó la promoción. IN FO. de la germinación de semillas de L. sativa ¨lechuga¨; los tratamientos (inoculaciones de cultivos individuales y cultivos mixtos) estuvieron constituidos por los cultivos. DE. rizobianos pre-seleccionados, aquellos que resultaron ser positivos al menos a una. EM. AS. prueba de capacidad promotora de crecimiento vegetal.. SI ST. Se determinó el porcentaje de germinación y se realizó mediciones de radícula e hipocotilo al cuarto día de iniciado el ensayo de germinación, aplicando el análisis de. DE. varianza y prueba de Tukey a los datos recopilados; obteniendo que los cultivos que. IO. N. tuvieron un efecto significativo positivo en la germinación de semillas de L. sativa por. CC. lo cual se recomiendan emplearlos como potenciales bacterias promotoras de la. RE. germinación: los cultivos individuales Ra-138-01, Ra-014-03, Ra-212-01; además de. DI. siete cultivos mixtos, constituyendo un alternativa para reducir el uso de agroquímicos.. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONTENIDO. AC IÓ. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO……………..i. N. Página. UN IC. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS...……………..ii. CO. M. CERTIFICACIÓN DEL ASESOR……………………………………………………..iii. Y. PRESENTACIÓN.………………………………………………………………………iv. ÁT. IC. A. MIEMBROS DEL JURADO............................................................................................v. IN FO. RM. APROBACIÓN………………………………………………………………………….vi. DEDICATORIA…………………………………………………………………………vii. AS. DE. AGRADECIMIENTO…………………………………………………………………..viii. SI ST. EM. RESUMEN………………………………………………………………………………ix. CONTENIDO……………………………………………………………………………x INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….…….01. II.. MATERIAL Y MÉTODO……………………………………………………….....17. IO. N. DE. I.. CC. III. RESULTADOS .……………………………………………………………………24. RE. IV. DISCUSIÓN…………………………………………………………………..........34. DI. V. ENUNCIADO RESUMEN ..……………………………………………………….45 VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………...46. ANEXOS. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN. N. I.. AC IÓ. Se considera que el suelo es uno de los ambientes más complejos en. UN IC. cuanto a vida microbiana, se refiere que puede contener cerca de 109 células bacterianas/gramo de suelo y un estimado de 103 especies microbianas diferentes. CO. M. por gramo de suelo.1 Estos microorganismos aportan fuertemente al desarrollo de. Y. la flora que crece en el suelo, entre más rico en microorganismos sea el suelo. IC. A. mayor será el desarrollo de las plantas en el suelo. Además, la diversidad de. RM. ÁT. microorganismos presentes en el suelo va a depender de las condiciones naturales. IN FO. y ambientales del mismo, es decir, que factores como la acidez, humedad, salinidad, temperatura, etc. afectan directamente la población microbiana existente. AS. DE. en el suelo.2, 3. EM. En los últimos años, la sostenibilidad agrícola ha cobrado especial interés. SI ST. al conocer su incidencia directa en los beneficios para el hombre y para el balance. DE. ecológico y agroecológico. De tal manera que para fortalecer los sistemas. N. agrícolas sostenibles, es necesario conocer los componentes que lo integran y que. CC. IO. puedan determinar la funcionalidad de los mismos. De ahí la importancia de. RE. reconocer que la productividad de los cultivos viene dada por la fertilidad del. DI. suelo, que puede ser evaluada por sus. características físicas, químicas y. biológicas. El éxito de un cultivo depende del rápido establecimiento de las plántulas en el suelo. Para que esto ocurra, además de otros factores, es importante la alta disponibilidad de nutrientes.4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En la mayoría de los sistemas agrícolas, el nitrógeno es el más limitante para la producción, seguido por el fósforo; además la existencia plagas que. AC IÓ. N. perjudican los cultivos, por lo tanto, surge como una efectiva solución el uso de. UN IC. fertilizantes químicos y pesticidas. A pesar del uso indiscriminado de estos agroquímicos para mejorar los rendimientos en algunas regiones del mundo, su. CO. M. elevado costo de producción y la creciente contaminación ambiental, hacen que se. Y. manifieste la urgente necesidad de desarrollar alternativas que minimicen el. IC. A. impacto negativo sobre el ambiente. Por otra parte, los acuerdos del tratado de. ÁT. libre comercio y las normas de control de calidad crean la necesidad de ajustar los. RM. sistemas de producción buscando nuevas alternativas. Una alternativa la cual. IN FO. permitiría disminuir la cantidad de agroquímicos utilizados es el uso. DE. microorganismos, esta alternativa además de contribuir a bajar costos, permitirá la. SI ST. EM. los recursos naturales.4. AS. producción sin un grave deterioro del agrosistema, manteniendo adecuadamente. En este sentido, se reconoce que los microorganismos, participan en. DE. diferentes reacciones de los elementos químicos, que reflejan su dinámica en la. IO. N. naturaleza.. Dentro. CC. inmovilización,. de. las. solubilización,. reacciones. están;. mineralización,. la. reducción,. fijación.. Estas. oxidación, reacciones. DI. RE. finalmente se reflejan en el suelo como degradación de los compuestos orgánicos, formación de humus, liberación de nutrimentos que incrementan la nutrición de las plantas, producción de compuestos antibióticos, transporte de nutrimentos, producción de compuestos promotores del crecimiento, etc.5. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En respuesta a la necesidad de generar cultivos limpios, con trazas mínimas o nulas de agroquímicos que afecten la salud humana, se ha venido. AC IÓ. N. implementado el uso de los microorganismos benéficos del suelo, constituyendo. UN IC. una herramienta tecnológica al alcance de la ciencia, está representada por las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (Plant Growth Promoting. CO. M. Rhizobacteria, PGPR).6 Se definen como aquellas bacterias rizosféricas capaces de impactar positivamente sobre el crecimiento de cualquier especie vegetal. Estos. IC. A. Y. microorganismos pueden encontrarse en asociaciones simbióticas o de vida libre.7. ÁT. Un amplio número de géneros bacterianos están considerados dentro de esta. Kliebsiella,. Serratia,. Xanthomonas,. IN FO. Hafnia,. RM. clasificación: Agrobacterium, Alcaligenes, Arthobacter, Erwinia, Flavobacterium, Azospirillum,. Clostridium,. DE. Pseudomonas, Acetobacter, Burkholderia, Bacillus, Burkholderia, Bacillus,. EM. AS. Herbaspirillum, Enterobacter y Azotobacter, entre otros.8. SI ST. Según Kloepper et al. las PGPR pueden ser: Bioprotectores (supresión de enfermedades de plantas), Biofertilizantes (aumentar la capacidad de adquisición. DE. de nutrientes) y Bioestimulantes (producción de fitohormonas).9 Posteriormente,. IO. N. Bashan y Holguin propusieron una nueva clasificación para las PGPR, que. CC. incluye a todas las bacterias benéficas teniendo en cuenta su papel particular, de. DI. RE. tal forma, que el término se divide en PGPB (Plant growth promoting bacteriabacterias promotoras del crecimiento de las plantas) y biocontrol-PGPB (Biocontrol-plant growth promoting bacteria-bacterias promotoras del crecimiento de las plantas con actividad de biocontrol).10, 11. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A inicios del siglo XX, Hiltner introdujo el término rizósfera para describir la zona del suelo afectada por el desarrollo de las raíces, las cuales inducen la. AC IÓ. N. proliferación de los microorganismos. Las actividades metabólicas de tales. UN IC. poblaciones estimuladas, tanto desde el punto de vista cualitativo como cuantitativo, son de vital importancia para el desarrollo de las plantas, tal. M. incremento de la actividad microbiana en la rizósfera recibe el nombre de efecto. Y. CO. rizosférico12, el cual es ejercido por el suministro de compuestos orgánicos. IC. A. (solubles e insolubles) que aportan los exudados radicales, formados por azúcares,. ÁT. mucigel, ácidos orgánicos y aminoácidos, pueden conformar hasta un 40 % de los. RM. fotosintatos de la planta, lo cual cambia la composición del suelo en la vecindad. IN FO. de la raíz creando un medio selectivo para la existencia de grandes poblaciones. DE. microbianas heterótrofas, que establecen diferentes interacciones con la planta,. EM. AS. tanto positivas, negativas como neutrales. 13, 14, 15. SI ST. A finales de la década de los 70, Kloepper y colaboradores fueron los pioneros en introducir el término PGPR para referirse a las rizobacterias capaces. DE. de provocar un efecto benéfico en las plantas. Recientemente, la denominación se. IO. N. ha extendido a microorganismos PGP para incluir hongos y cualquier organismo. CC. afín.16 Las rizobacterias beneficiosas conocidas con el acrónimo de PGPR han. DI. RE. demostrado ser altamente eficientes para aumentar el crecimiento de las plantas e incrementar su tolerancia a otros microorganismos causantes de enfermedades. Existen algunas características que definen a este grupo: 17. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. . Elevada densidad poblacional en la rizósfera después de su inoculación en las plantas, ya que una población que declina rápidamente tiene una baja capacidad competitiva con la microflora nativa de suelo. Capacidad de colonización efectiva en la superficie de la raíz.. . Control, de manera natural y eficiente, de otros microrganismos del suelo. AC IÓ. UN IC. capaces de enfermar a las plantas.. M. No producen daño al hombre.. Y. CO. . N. . IC. A. Las PGPR están asociadas a muchos tipos de planta y se encuentran. RM. ÁT. comúnmente presentes en diversos ambientes. Algunas rizobacterias colonizan la. IN FO. superficie de la raíz y la interfase del suelo subsiguiente; algunas otras pueden tener características endofitas.6 Kloepper et al y más recientemente Gray y Smith,. DE. describieron que las bacterias promotoras del crecimiento vegetal pueden también. AS. penetrar al interior de las raíces y establecerse como poblaciones endófitas,. EM. muchas de ellas tienen la capacidad de trascender las barreras de la endodermis,. SI ST. atravesar la corteza de la raíz hasta el sistema vascular y, sin causar perjuicio a la. DE. planta. Se ha considerado que las bacterias endófitas podrían tener algunas. N. ventajas competitivas sobre las rizosféricas, ya que la disponibilidad de nutrientes. CC. IO. es mayor en el interior de las plantas y el número de microorganismos endófitos. RE. es menor que el de los rizosféricos. Además, las bacterias endófitas se encuentran. DI. mejor protegidas que las rizosféricas de las condiciones adversas que se presentan en el medio ambiente.18, 19. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En el proceso de colonización de la raíz o rizósfera la bacteria es atraída por quimiotaxis, basada en compuestos presentes en exudados radicales, para posteriormente unirse en la superficie radical. En general la competencia por. AC IÓ. N. nutrimentos genera en la rizosfera interacciones microbianas acordes al. UN IC. metabolismo de la planta debido a la liberación de sustancias difusantes, secreciones, lisados, gases y mucilagos. Asimismo, el establecimiento de las. CO. M. poblaciones competitivas de microorganismos promotores del crecimiento en. Y. plantas depende principalmente de aspectos puntuales como la colonización. IC. A. rizosférica de la planta, dada por la liberación sus exudados radicales, y la. ÁT. capacidad de respuesta genética y quimioatrayente del microorganismo hacia la. IN FO. RM. rizósfera.20. DE. Dentro de los mecanismos para la promoción del crecimiento vegetal. AS. encontramos dos tipos, mecanismos directos e indirectos.21 Los mecanismos. EM. directos son aquellos en donde los microorganismos actúan sobre la planta, dentro. SI ST. de estos encontramos la producción de promotores de crecimiento vegetal; la producción de estos metabolitos generan una mejor regulación de estomas, lo que. DE. evita su deterioro, por estar asociado a depresión del crecimiento y síntomas de. IO. N. marchitamiento en la planta. Ocasionan también un desarrollo radical más. CC. ramificado jugando un papel fundamental en la absorción del agua y en el. DI. RE. mejoramiento de la nutrición al aumentar su acceso a los nutrientes en el suelo. Adicionalmente, las PGPR pueden promover el crecimiento vegetal mejorando la disponibilidad de nutrientes en el suelo mediante solubilización de fósforo, fijación de nitrógeno y producción de sideróforos.20, 22, 23, 24. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Los mecanismos indirectos son aquellos en donde el microorganismo es capaz de inhibir diferentes patógenos que interfieren con el desarrollo de la planta, como hongos y bacterias los cuales son neutralizados por diversos mecanismos:. AC IÓ. N. competencia por espacio o nutrientes, producción de metabolitos antibióticos,. UN IC. secreción de diversas enzimas hidrolíticas que degradan la pared celular de los patógenos. También se ha evidenciado la producción de sideróforos. Otro. M. mecanismo indirecto es el incremento de la capacidad de respuesta sistémica de la. Y. CO. planta frente a los patógenos.25, 26 La conjunción de ambos mecanismos de acción evidente del. IC. A. (directos e indirectos) han dado como resultado la promoción. ÁT. crecimiento en plantas; observándose un incremento en la emergencia, el vigor y. RM. el peso, un mayor desarrollo en sistemas radiculares y un incremento hasta el 30%. IN FO. en la producción de cultivos de interés comercial, tales como papa, rábano, trigo y. AS. DE. soja.27. EM. Los sideróforos (palabra griega que significa portador de hierro) son. SI ST. pigmentos extracelulares, fluorescentes o no, de bajo peso molecular (500-. DE. 1000Da) y solubles en soluciones acuosas a pH neutros; muestran una coloración. N. característica de acuerdo a la estructura química que posean y una gran afinidad. CC. IO. por el Fe+3.28, 29 Tales compuestos desempeñan un papel rector en el control de. RE. hongos fitopatógenos que provocan enfermedades en diferentes cultivos de. DI. importancia económica. En condiciones de escasez de hierro, las bacterias producen y excretan los sideróforos al medio. Una vez secuestrado el hierro por los sideróforos, el complejo es reconocido por los receptores de membrana específicos, atravesando la misma por un sistema de transportadores activos.19. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En el interior celular, el metal es depositado en un sitio específico por un proceso que involucra un intercambio de ligandos que puede estar precedido o no por la reducción del hierro o por la hidrólisis del sideróforo. El modo en que la. AC IÓ. N. producción de sideróforos contribuye al control de fitopatógenos ha sido muy. investigado, plantea que cuando el sideróforo se acopla con el hierro, este último. UN IC. se hace inaccesible para los microorganismos patógenos que no posean los. CO. M. receptores proteicos específicos para reconocer el complejo y que además no tengan mecanismos propios tan efectivos de adquisición de hierro. Las plantas. A. Y. colonizadas por rizobacterias no son afectadas por la formación de estos. ÁT. IC. complejos, de hecho se ha planteado que las mismas pueden incorporar a su. sideróforos. son. DE. Los. IN FO. RM. nutrición el hierro solubilizado por los sideróforos.30. compuestos. producidos. por. diferentes. AS. microorganismos en el suelo que basan su actividad en fenómenos de quelación,. SI ST. EM. un fenómeno rutinario en los sistemas biológicos. La gran mayoría de los microorganismos fijadores de nitrógeno producen sideróforos para obtener hierro,. DE. elemento necesario para llevar a cabo la fijación de nitrógeno, ya que la enzima. IO. N. nitrogenasa, que está compuesta de varias unidades proteicas, requiere 36 átomos. CC. de hierro para su correcto funcionamiento.31 Algunas bacterias ambientales. DI. RE. capaces de producir sideróforos son: Pseudomonas, Azospirillum, Azotobacter, Serratia, Klebsiella, Streptomices y Nocardia. A su vez, diversos estudios han. demostrado que entre las diferentes clases des sideróforos existentes, los primeros identificados son los del tipo catecol e hidroxamato, a su vez, existen otros como los α-cetoácidos con características y actividad similar a la de los sideróforos.32 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. El fósforo, después del nitrógeno es el nutriente inorgánico más requerido por las plantas y microorganismos; en el suelo, es el factor limitante del desarrollo vegetal a pesar de ser tan abundante tanto en formas orgánicas como inorgánicas,. AC IÓ. N. debido a que no es posible capturarlo biológicamente del aire como ocurre con el. UN IC. nitrógeno, las concentraciones de fósforo asimilables son muy bajas, normalmente varían entre 5 y 30 mg/kg. Esto se debe a que el fósforo soluble reacciona con. CO. M. iones como el calcio, el hierro o el aluminio, que provocan su precipitación o. Y. fijación, disminuyendo su disponibilidad para las plantas. Los fosfatos. IC. A. inorgánicos aplicados como fertilizantes químicos también son inmovilizados en. ÁT. el suelo y como consecuencia no pueden ser aprovechados totalmente por los. IN FO. RM. cultivos.15. DE. La disponibilidad de fósforo inorgánico depende de diferentes factores. AS. como: los fluidos y minerales presentes en el suelo, el pH, la actividad. EM. microbiológica, la presencia de enzimas y ácidos orgánicos y la intensidad de. SI ST. demanda del nutriente. Los agentes de origen biológico son posibles de manejar y prácticamente tienden a mantener el fosforo en sus estados de mayor. DE. disponibilidad, incrementando y manteniendo altas tasas de mineralización e. IO. N. inmovilización. Por lo tanto los microorganismos son fundamentales para. CC. asegurar un mayor y mejor uso del fósforo en el suelo. El mantenimiento de altas. DI. RE. tasas de nutrientes limitantes es un desafío grande para los agricultores quienes se ven obligados a implementar técnicas, que en algunas ocasiones no resultan muy benéficas para el mismo suelo.33. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Por otro lado, el fósforo es importante por su participación en el proceso de reproducción y en la constitución genética de las plantas por ser un componente de los ácidos nucleicos. Interviene además en muchas reacciones. AC IÓ. N. bioquímicas relacionadas con el metabolismo de los carbohidratos, grasas y. UN IC. proteínas en las que obra como intermediario, donando o aceptando energía en reacciones específicas. Giaconi y Escaff afirman que la presencia de este elemento. CO. M. es indispensable para la buena fecundación de las flores, estimula el desarrollo del. Y. sistema radical y aumenta la resistencia del vegetal a las enfermedades. Además,. A. es uno de los nutrientes que regula los efectos derivados de la presencia de un. RM. ÁT. IC. exceso de nitrógeno.34. IN FO. La inoculación de semillas o suelos con bacterias capaces de solubilizar. DE. fosfato mejora la absorción del fosfato del suelo, así como el aplicado de manera. AS. artificial, dando como resultado el aumento del rendimiento de los cultivos. Así. EM. mismo, muchos autores atribuyen la solubilización de fosfato inorgánico insoluble. SI ST. por los microorganismos, a la producción de ácidos orgánicos y ácidos quelantes de azúcares, la producción de estos ácidos orgánicos resulta en la acidificación de. DE. la célula microbiana y el medio que la rodea. El ácido glucónico y el ácido 2-. IO. N. cetoglucónico son los agentes más producidos por bacterias con habilidad para. CC. solubilizar fosfato.16 Se conocen géneros bacterianos tales como: Pseudomonas,. DI. RE. Bacillus, Rhizobium, Agrobacterium, Burkholderia, Achromobacter, Azotobacter, Microccocus, Aerobacter, Flavobacterium y Erwinia conocidos por su habilidad para solubilizar fosfato.35. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En 1991 Sackett et al. reportaron, por primera vez, aislamientos bacterianos que presentaban solubilización de roca fosfórica visible36. En 1992, Illmer y Shinner, reportaron al ácido glucónico como el agente más frecuente de. AC IÓ. N. solubilización de fosfato, el cual es producido por Pseudomonas sp37. Chabot et. UN IC. al. trabajaron con diferentes cepas; Rhizobium leguminosarum bv. Phaseoli cepa P31 y R1, Serratia sp. cepa 22b, Pseudomonas sp. cepa 24 y Rhizobium sp. cepa. CO. M. 68, fueron examinadas por su potencial de promover el crecimiento en lechuga y. Y. maíz, todos estos microorganismos solubilizadores de fosfato fueron aislados de. IC. A. suelos de Quebec, los experimentos fueron realizados en condiciones de campo en. ÁT. tres sitios diferentes teniendo una baja cantidad de fósforo disponible, los. RM. resultados mostraron claramente que Rhizobium es seleccionado específicamente. IN FO. por su función de solubilizar fosfato como PGPR con no leguminosas como. AS. DE. lechuga y maíz.38. EM. Las hormonas tienen un rol muy importante como reguladoras del. SI ST. crecimiento y desarrollo de las plantas. De acuerdo a la clasificación convencional, existen cinco grupos de fitohormonas: auxinas, giberelinas,. DE. citoquinas, etileno y ácido absícico. Las fitohormonas contribuyen al. IO. N. funcionamiento de diversos procesos biológicos en las plantas, incluyendo la. CC. regulación de la quiescencia y germinación de semillas, la formación de raíces,. DI. RE. florescencia y la maduración del fruto. A su vez, incrementan la resistencia de las plantas a factores ambientales y pueden inducir o suprimir la expresión de genes y la síntesis de enzimas, pigmentos y metabolitos.39. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Un aspecto importante de la interacción planta-bacteria y que está siendo cada vez más estudiada es la producción bacteriana de auxinas, las cuales son responsables de la división, extensión y diferenciación de las células y tejidos de. AC IÓ. N. la planta. Este grupo de fitohornomas estimulan la germinación de las semillas y. UN IC. el tubérculo así como la formación de raíces, controlan el proceso de crecimiento vegetativo, el tropismo y a su vez influyen en la fotosíntesis, formación de. CO. M. pigmentos y biosíntesis de metabolitos. La auxina típica es el ácido indolacético. Y. (AIA) hormona de la cual aún se conoce poco sobre los mecanismos de su. IC. A. expresión, metabolismo, transporte y distribución final. Su efecto en las células es. ÁT. controlar los tropismos, que se manifiestan como inclinaciones giros o curvaturas. RM. del tallo y desarrollo del sistema radical, Se conoce que esta hormona vegetal. IN FO. otorga beneficios a la planta puesto que su división celular incrementa lo cual se. AS. DE. representa en un aumento de tamaño en los frutos y número de hojas.40. EM. La promoción del desarrollo del sistema radical característico de este tipo. SI ST. de reguladores de crecimiento vegetal, es uno de los parámetros utilizados para determinar la efectividad de determinadas bacterias rizosféricas. El rápido. DE. establecimiento de raíces, ya sea por elongación de la raíz primaria o por. IO. N. surgimiento de raíces laterales secundarias, permite a las semillas jóvenes tener un. DI. RE. CC. pronto acceso a nutrientes y agua proveniente de su medio ambiente.. El AIA es similar en estructura al aminoácido triptófano y probablemente es éste el precursor del AIA formado en la planta viva, sin embargo, se conocen cuatro vías de formación de dicha auxina cada una de ellas con un intermediario. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. distinto. Diferentes grupos de plantas emplean diversas rutas para producir AIA a partir del triptófano. En bacterias la producción de AIA ocurre a partir del triptófano por medio de la indol-acetamida que se encuentra implicada en la. AC IÓ. N. formación de tumores en la planta; existe una ruta alternativa tomada por otras. UN IC. bacterias que involucra la utilización del ácido-3-indol pirúvico como intermediario. La habilidad para sintetizar AIA ha sido detectada en diversos. CO. M. géneros bacterianos rizosféricos y epifíticos tales como: Azospirillum, Agrobacterium, Azotobacter, Alcaligenes, Enterobacter, Erwinia, Acetobacter,. IC. A. Y. Pseudomonas, Bacillus y Xanthomonas.41 La inoculación con AIA producido por. ÁT. bacterias promotoras de crecimiento vegetal han sido usadas para estimular la. RM. germinación de semillas, acelerar el crecimiento de raíces, modificar la estructura. DE. IN FO. del sistema de raíces e incrementar su biomasa.42. AS. Este amplio grupo de bacterias llamadas rizobacterias promotoras del. EM. crecimiento en plantas (PGPR) incluye el género Rhizobium, constituido por. SI ST. bacilos Gram Negativos que establecen simbiosis con las leguminosas, son. DE. bacterias quimiorganotróficas que crecen mejor sobre medios complejos. N. (formulación de medio de cultivo que habitualmente lleva un factor de. CC. IO. crecimiento) de 25 a 30 ºC, todas las especies descritas hasta el momento son. RE. capaces de utilizar glucosa, galactosa, fructosa, tiamina y pentatenato de calcio. El. DI. Hierro (Fe) es necesario para la síntesis de hemoproteína, este elemento es un constituyente de la leghemoglobina, se encuentra presente en la Fe-proteína y en la Mo-Fe proteína, componentes de la nitrogenasa (enzima que participa en la fijación de nitrógeno).43, 44. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La capacidad de PGPR DE Rhizobium ha sido estudiada por varias décadas, sin embargo en los últimos anos este estudio se ha intensificado porque la agricultura sustentable demanda mejorar la eficiencia de la fijación de nitrógeno. AC IÓ. N. a través del uso de bacterias competitivas capaces de extender la ventaja de la. UN IC. simbiosis a otros cultivos no leguminosa. Recientemente, el hábitat natural de los rizobios se ha extendido a un tercer nicho, las raíces de las gramíneas. Rhizobium. CO. M. leguminosarum Bv. Trifolii ha demostrado estar presente en forma natural en las. Y. raíces de arroz (Oryza brevigulata) en cultivo rotatorio de trébol sin la presencia. IC. A. de nódulos. Ademas de especies como Acetobacter diazotrophicus y. ÁT. Herbaspirillum seropedicae en caña de azúcar (Sacharum officinarum), o géneros. IN FO. RM. como Azoarcus spp. y Azospirillum spp. en maíz (Zea mays) y arroz (Oryza sp.).45. DE. Actualmente los cultivos hortícolas tienen un fuerte impacto en la. AS. nutrición humana porque provee cantidades elevadas de fitonutrientes que. EM. permitirían evitar riesgos de contraer ciertos tipos de patologías.46 Conscientes de. SI ST. esta problemática, los consumidores están imponiendo una creciente demanda de hortalizas de elevada calidad nutricional, donde las tendencias alimenticias. DE. actuales posicionan a los vegetales de hoja como una parte importante de la dieta.. IO. N. En este aspecto, la lechuga (L. sativa) es considerada una de las hortalizas de hoja. CC. más importante por presentar un ciclo rápido de producción, por ser rica en. DI. RE. vitaminas A y C y en minerales Ca, P y Fe. En nuestra región La Libertad es un cultivo cuya producción ha aumentado 25,5 % según reporte del INEI.47. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. L. sativa, la lechuga, es una planta anual propia de las regiones semitempladas, es una planta herbácea, anual y bianual. Se reporta que las raíces principales de absorción se encuentran a una profundidad de 5 a 30 cm. La raíz. AC IÓ. N. principal llega a medir hasta 1.80 por lo cual se explica su resistencia a la sequía.. UN IC. Llega a tener hasta 80 cm. de altura. Las hojas de la lechuga son lisas, sin peciolo (sésiles), arrosetadas, ovales, gruesas, enteras y las hojas caulinares son. CO. M. semiamplexiculaules, alternas, auriculado, abrazadoras; el extremo puede ser. Y. redondo o rizado su color va del verde amarillo hasta el morado claro,. IC. A. dependiendo del tipo y del cultivar. El talo es pequeño y no se ramifica; sin. ÁT. embargo cuando existen altas temperaturas (mayor de 26) y días largos el tallo se. RM. alarga hasta 1,2 m de longitud, ramificándose el extremo y presentando cada. DE. IN FO. punta de las ramillas terminales una inflorecencia.48. AS. Algunas especies vegetales muestran indeseables condiciones de. EM. germinación, como una gran variación en el tiempo entre el momento de siembra 49. SI ST. y la emergencia, y pueden presentar bajos porcentajes finales de germinación.. En la lechuga se puede observar una cierta disparidad en la energía germinativa. DE. debido a la impermeabilidad que la semillas recien cosechadas muestran en. IO. N. presencia del oxígeno por lo que se han utilizado temperaturas ligeramente. CC. elevadas (20 -30 oC) para inducir la germinación. Díaz et al. evaluó el efecto de. DI. RE. 30 cepas bacterianas en la germinación y el crecimiento de lechuga (Lactuca sativa L. var. Longifolia) encontrando diferencias altamente significativas entre los efectos de los tratamientos, obteniendo un incremento en la germinación del 36.5% con respecto al control sin inocular, a su vez se pudo comprobar que estas. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. mismas plantas al ser inoculadas con las cepas probadas en la germinación. N. promovían el crecimiento de estas a nivel de campo.50. AC IÓ. En tal sentido, ante el aumento poblacional y la creciente demanda de. UN IC. alimentos por ende el uso de productos agroquímicos se ha incrementado en los últimos años para asegurar la productividad y rendimientos de los cultivos, lo que. CO. M. ha provocado un deterioro ecológico progresivo, generando preocupación por la. Y. contaminación de nuestro ecosistema. Comprender esta situación, nos lleva a. IC. A. buscar y desarrollar tecnologías limpias y menos costosas que permitan mejorar la. ÁT. calidad de los cultivos. Los rizobios ofrecen de esta manera una gran oportunidad. Seleccionar in vitro cultivos rizobianos que promueven la. AS. . DE. Objetivo general:. IN FO. presente investigación pretende:. RM. a los investigadores y científicos para revelar su potencial como PGPR, por ello la. EM. germinación de semillas de L. sativa.. SI ST. Objetivos específicos:. N. DE. . crecimiento vegetal mediante las pruebas de producción de. IO. sideróforos, solubilización de fosfatos, producción de ácido. CC RE DI. Pre-seleccionar cultivos rizobianos con capacidad promotora de. indolacético). . Evaluar el porcentaje de germinación, longitud de radícula e hipocotilo de las plántulas de L.sativa.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. II.. MATERIAL Y MÉTODO. Diez cultivos de rizobios nativos autenticados procedentes de nódulos. de. Pisum. sativum. “arveja”,. UN IC. . AC IÓ. N. 2.1. Material biológico. colectados. en. los. CO. M. Departamentos de La Libertad, Lambayeque, Cajamarca y Lima –. A. Tres cepas patrón de Rhizobium (CIAT 71, CIAT 632 y CIAT 899),. IC. . Y. Perú (Anexo 1).. ÁT. proporcionados por el Laboratorio de Microbiología Ambiental de. IN FO. RM. la escuela de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.. Semillas de L. sativa var. White Boston, procedente de HORTUS. DE. . DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. SA, ubicado en Av. César Vallejo 248- Urb. Palermo.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.2.. Procedimiento. Reactivación de los cultivos rizobianos. AC IÓ. N. 2.2.1.. Se reactivó cada uno de los diez cultivos en caldo. UN IC. ELMA (Extracto de levadura-Manitol) (Anexo 2) y se sembró. M. por estría en agar ELMAR (Extracto de levadura-Manitol-Rojo. CO. de congo), se incubó a 28 oC durante 2 a 5 días dependiendo. A. Y. del crecimiento específico de cada cultivo (Anexo 3), con el. ÁT. IC. fin de observar la morfología (macroscópica y microscópica). a partir de las cuales se subcultivó en ELMAC. IN FO. cultivo,. RM. (Anexo 4) y obtener colonias aisladas correspondientes a cada. DE. (Extracto de levadura-Manitol-carbonato de calcio), para. AS. conservación en refrigeración y trabajar con estos cultivos. SI ST. EM. durante la experimentación.. Pruebas in vitro para determinar capacidad promotora de. crecimiento vegetal. A. Prueba de producción de sideróforos. DI. RE. CC. IO. N. DE. 2.2.2.. Se preparó el medio Tryptic Soy Broth (TSB) (Anexo 5), el cual fue diluido al décimo (1/10),. se. adicionó. 8-hidroxiquinolina (50 mg/L) y agar-agar (15g/L). para. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. obtener un medio sólido. Se sirvió el medio en placas Petri, cada placa fue dividida en cuatro cuadrantes, se sembró por estría cada cultivo rizobiano puro, se incubó a 28ºC por 3 a. AC IÓ. N. 5 días. Se consideró como productores de sideróforos a los. UN IC. organismos que crecieron en el medio.51. Y. CO. M. B. Solubilización de fosfato. fosfato será la empleada por Nautiyal.. ÁT. solubilizadoras de. IC. A. La metodología a utilizar para determinar las bacterias. RM. Se sembró por estría de cada cultivo rizobiano puro en. IN FO. placas con medio de cultivo National Botanical Research. AS. DE. Institute’s Phosphate (NBRIP).52, 53 (Anexo 6). EM. Se incubó por 5 a 7 días a 28º C. La evaluación se realizó. SI ST. mediante la observación de la formación de un halo. C. Producción de ácido indolacético. DI. RE. CC. IO. N. DE. transparente alrededor de las colonias.41. Se propagó cada cultivo reactivado en Agar ELMA inclinado incubándose a 28 °C durante 2 o 4 días. La cosecha de la biomasa se realizó utilizando el asa bacteriológica y solución salina fisiológica estéril (SSFe).. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Cada inóculo rizobiano fue estandarizado con el tubo N° 1 del Nefelómetro de Mac Farland, a la concentración aproximada de. 3 x 108 UFC/ml. El conteo total de la. AC IÓ. N. población a inocular se verificará mediante el plaqueo de. UN IC. diluciones al décimo, se sembró las diluciones 10-7, 10-6, 10-5 sobre medio ELMARC de tres cultivos rizobianos elegidos. Y. CO. M. al azar.. A. La metodología de detección de AIA se tomó en base al. ÁT. IC. protocolo utilizado por Naik y Sakthivel modificado.54 Se. RM. tomó 100 µL de cada suspensión rizobiana para ser. IN FO. sembrado en TSB (Tryptic Soy Broth) suplementado con. DE. triptona (3g/L). Se comprobará la presencia del ácido. AS. indolacético utilizando un método colorimétrico basado en. EM. la reacción del reactivo de Salkowsky55 (Anexo 7); se tomó. SI ST. una alícuota de 1 ml de cada cultivo rizobiano y se agregó 2. DI. RE. CC. IO. N. DE. ml del reactivo de Salkowsky, se homogenizó e incubó en oscuridad por 15 minutos. Pasado el tiempo, se observó el viraje de color de cada pocillo de amarillo a diversas tonalidades, desde rosado hasta fucsia encendido. Como control negativo se inoculó agua destilada estéril. Se consideró como productores de ácido indolacético a aquellos cultivos en los cuales se reportó un viraje a tonos rojizos.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.2.3. Germinación in vitro de semillas de L. sativa:. Se sometieron a esta prueba aquellos cultivos rizobianos pre-. AC IÓ. N. seleccionados, es decir aquellos que cumplieron al menos a una. M. UN IC. de las pruebas de capacidad promotora de crecimiento.. de. L.. IC. semillas. sativa. que. presentaron. ÁT. Las. A. Y. CO.  Desinfección de las semillas. RM. características similares como el color, tamaño y porcentaje. IN FO. de germinación no menor del 85%. La desinfección, se realizó por traspaso sucesivo en etanol al 70 % por 1. DE. minuto e hipoclorito de sodio al 5 % por 3 minutos, se. SI ST. EM. AS. enjuago de 5 a 6 veces con agua destilada estéril (ADE).56. DI. RE. CC. IO. N. DE.  Preparación de inóculos rizobianos:. Cada cultivo reactivado fue sembrado en Agar ELMA inclinado incubándose a 28 °C durante 2 o 4 días. La cosecha de la biomasa rizobiana se realizó utilizando el asa bacteriológica y SSFe. Cada inóculo rizobiano fue estandarizado con el tubo N° 1 del Nefelómetro de Mac Farland, a la concentración aproximada de 3 x 108 UFC/ml.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. El conteo total de la población a inocular se verificará mediante el plaqueo de diluciones al décimo, se sembró las diluciones 10-7, 10-6, 10-5 sobre medio ELMARC de tres. AC IÓ. N. cultivos rizobianos elegidos al azar.. CO. M. UN IC.  Evaluación de la germinación de semillas de L. sativa:. Para determinar la promoción de la germinación de. A. Y. semillas de L. sativa por las bacterias en estudio se realizó. RM. ÁT. IC. lo siguiente:. IN FO. Los tratamientos fueron constituidos por cada. DE. cultivo rizobiano positivo por lo menos a una de las pruebas. AS. descritas anteriormente, dichos tratamientos estuvieron. EM. constituidos por cultivos individuales y cultivos mixtos. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. (Anexo 8). Se empleó una placa de Petri por tratamiento, en cada. una se colocó una capa con papel de filtro estéril y agregó 5 ml de ADE. En cada placa se colocó 10 semillas de L. sativa, se inoculó 100 µL de suspensión rizobiana por semilla, las placas fueron tapadas y se incubó. a. temperatura ambiente. Simultáneamente se instaló un testigo al cual solo se le agregó ADE. Se realizó observaciones diarias al cuarto día, teniendo en cuenta:. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. o. Número. de. semillas. germinadas. (porcentaje. de. germinación). o Criterio de germinación la aparición visible de la radícula. AC IÓ. N. (2 mm de longitud).57. UN IC. o Se tomó medida tanto del hipocotilo como de radícula.. CO. M. Se seleccionaron como promotores de la germinación. Y. de semillas de L. sativa aquellos cultivos que presentaron. RM. ÁT. IC. A. diferencia significativa respecto al control.. DE. IN FO. 2.2.4. Análisis estadístico de los resultados. AS. Los resultados correspondientes a las pruebas de. EM. promoción de crecimiento vegetal (producción de AIA,. SI ST. solubilización de fosfatos, producción de sideróforos) se. de germinación de semillas se realizó ANOVA y la prueba de Tukey al nivel de significación α= 0.05 de los tratamientos respecto al control para seleccionar los cultivos promotores de la germinación de semillas de L. sativa.. DI. RE. CC. IO. N. DE. ordenaron y presentaron en tablas y/o figuras. Para la prueba. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. III.. RESULTADOS. AC IÓ. N. Los cultivos rizobianos fueron evaluados de forma cualitativa mediante tres pruebas de crecimiento vegetal, tal como se muestra en la Tabla 1,. UN IC. en la primera de ellas, la producción de sideróforos, siete cultivos resultaron. M. positivos además de la cepa CIAT 899 (Anexo 9). En la segunda prueba, las diez. CO. cepas fueron evaluadas para determinar su capacidad de solubilizar una fuente. A. Y. insoluble de fósforo (Ca3PO4), los resultados mostraron que cuatro cultivos. ÁT. IC. resultaron ser positivos, evidenciado por la presencia de halo de solubilización.. IN FO. RM. (Anexo 10).. La última prueba fue la producción de AIA por los cultivos rizobianos, fue. DE. evaluada en TSB suplementado con triptona, inductor de la producción de AIA. AS. debido a su alto contenido de triptófano, precursor del mencionado metabolito,. SI ST. EM. cuya presencia fue determinada por medio de reacción colorimétrica con reactivo de Salkowski, un resultado positivo tiene una tonalidad rosa. Los resultados. DE. presentes en la Tabla 1 nos muestran que la totalidad de cepas rizobianas. DI. RE. CC. IO. N. evaluadas fueron negativas a esta prueba. (Anexo 11). La promoción de germinación por parte de las cepas rizobianas fue. evaluada mediante montaje de semillas de L.. sativa ¨lechuga¨ (Anexo 12),. inoculadas con los cultivos pre-seleccionados, aquellos que resultaron ser positivos por lo menos a una de las pruebas in vitro de capacidad promotora de crecimiento, tales tratamientos estuvieron constituidos de cultivos puros y mixtos, 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. registrando el número de semillas germinadas al cuarto día para determinar el porcentaje de germinación, además las longitudes de radícula e hipocotilo de las semillas al cuarto día (Anexo 13-14). Los resultados obtenidos se analizaron. UN IC. AC IÓ. N. utilizando Análisis de varianza (ANOVA) y prueba de Tukey (Anexo 15-28).. Uno de los criterios para evaluar la geminación de semillas es la. CO. M. determinación del porcentaje de germinación, en el cual no obtuvimos. Y. significativas en ninguno de los tratamientos respecto al control, tal como se. RM. ÁT. IC. A. representa en las figuras 1 y 2.. ¨lechuga¨,. IN FO. En cuanto a la promoción de la germinación de semillas de L. sativa los cultivos rizobianos inoculados puros que presentan diferencia. DE. significativa respecto al control en ambas variables evaluadas son: Ra 014-03, Ra. AS. 212-01. (Fig. 3 y 4). Con respecto a la inoculación con cultivos mixtos, los. EM. tratamientos que presentan diferencia significativa respecto al control son: T1, T3,. SI ST. T4, T7, T8, T11, T11, T16. Siendo el tratamiento con la mayor longitud radicular y de. La selección de cultivos rizobianos se realizó mediante el análisis. CC. IO. N. DE. hipocotilo el T11. (Fig. 5 y 6). RE. estadístico, fueron seleccionados aquellos cultivos que presentaron diferencia. DI. significativa tanto en la longitud de radícula y de hipocotilo con respecto al control, tal como se muestra en la Tabla 2,. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 1. Pruebas in vitro de capacidad promotora de crecimiento vegetal para pre-. AC IÓ. N. selección de cultivos rizobianos.. M CO Y A. IC. -. -: Negativo. AS. +: Positivo. + + + + + + +. ÁT RM. DE. + + + + + + + +. IN FO. Ra-138-01* Ra-014-03* Ra-074-01* Ra-013-04 Ra-201-03* Ra-289-01* Ra-254-03 Ra-212-01* Ra-113-01* Ra-214-03 CIAT 632 CIAT 71 CIAT 899. UN IC. PRODUCCIÓN SOLUBILIZACIÓN PRODUCCIÓN CULTIVOS DE DE FOSFATOS DE AIA (CÓDIGOS) SIDEROFOROS. *. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. Cultivos pre-seleccionados. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 120. 60. b. 40. b. b. b. b. b. b. b. b. b. b. b. M. 20. b. AC IÓ. N. 80. UN IC. % GERMINACION. 100. b: p > 0.05, no existe diferencia significativa. RM. a: p < 0.05, existe diferencia significativa. ÁT. IC. CULTIVOS INDIVIDUALES. A. Y. CO. 0. inoculadas. con. cultivos. individuales. rizobianos. pre-. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. seleccionados. IN FO. Fig. 1.- Porcentaje de germinación de semillas de L. sativa ¨lechuga¨. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 105. N AC IÓ. 95 b b. b b. b b b b b b. 85. b. b b b b b b b. b b b. b. UN IC. b. 90. b b. M. % GERMINACION. 100. CO. b. b: p > 0.05, no existe diferencia significativa. IN FO. a: p < 0.05, existe diferencia significativa. RM. ÁT. CULTIVOS MIXTOS. IC. A. Y. 80. DE. Fig. 2.- Porcentaje de germinación de semillas de L. sativa ¨lechuga¨. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. inoculadas con cultivos rizobianos mixtos (T). 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 20,00 15,00. b. a. b. b. a. a. b. b. AC IÓ. a. N. a. 10,00 5,00. UN IC. LONGITUD DE RADICULA (mm). 25,00. CO. M. 0,00. IC. b: p > 0.05, no existe diferencia significativa. RM. ÁT. a: p < 0.05, existe diferencia significativa. A. Y. CULTIVOS INDIVIDUALES. IN FO. Fig. 3.- Longitud promedio radicular de semillas de L. sativa ¨lechuga¨ al cuarto día de. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. inoculadas con cultivos rizobianos individuales.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 20,00. a. b. b a. a. a. b. a. b. b. AC IÓ. a. 10,00. N. 15,00. 5,00. UN IC. LONGITUD DE HIPOCOTILO (mm). 25,00. ÁT. b: p > 0.05, no existe diferencia significativa. RM. a: p < 0.05, existe diferencia significativa. IC. A. CULTIVOS INDIVIDUALES. Y. CO. M. 0,00. IN FO. Fig. 4.- Longitud promedio de hipocotilo de semillas de L. sativa ¨lechuga¨ al cuarto día. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. inoculadas con cultivos rizobianos individuales.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 30,00. N. 20,00. AC IÓ. 15,00 10,00 5,00. b. a. a b. b. a. a. b b. a. b. b b. b a. b b. M. a. UN IC. LONGITUD RADICULAR(mm). 25,00. RM. b: p > 0.05, no existe diferencia significativa. IN FO. a: p < 0.05, existe diferencia significativa. ÁT. IC. CULTIVOS MIXTOS. A. Y. CO. 0,00. Fig. 5.- Longitud promedio radicular de semillas de L. sativa ¨lechuga¨ al cuarto día. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. inoculadas con cultivos rizobianos mixtos (T).. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 25,00. 15,00. a. 5,00. b n. a. a. b b. a. a. a a. b a. a. b. b a. b. b. UN IC. 10,00. AC IÓ. N. 20,00. M. LONGITUD DEL HIPOCOTILO(mm). 30,00. A. Y. CO. 0,00. RM. b: p > 0.05, no existe diferencia significativa. IN FO. a: p < 0.05, existe diferencia significativa. ÁT. IC. CULTIVOS MIXTOS. Fig. 6.- Longitud promedio de hipocotilo de semillas de L. sativa ¨lechuga¨ al cuarto día. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. inoculadas con cultivos rizobianos mixtos. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 2.- Cultivos rizobianos individuales y mixtos (T) seleccionados por promover la germinación de semillas de L. sativa en base a la longitud de. + + + + +. T2. -. T3*. +. +. +. +. -. .. -. -. +. +. +. +. -. +. T10. -. +. T11*. +. +. T12. -. -. T13. -. +. T14. -. -. T15. -. -. T16*. +. +. T17. -. -. T18. -. -. DE. T5. EM. T8*. AS. T6 T7*. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. T9. DI. Y A IC ÁT. RM. IN FO. T4*. + + + + +. CO. Ra-138-01* Ra-014-03* Ra-074-01 Ra-201-03 Ra-289-01 Ra-212-01* Ra-113-01 T1*. UN IC. LONGITUD DE LONGITUD DE RADÍCULA HIPOCOTILO. M. CULTIVOS (Códigos). AC IÓ. N. radícula e hipocotilo. -. + : Presenta diferencia significativa, p < 0.05 - : No presenta diferencia significativa p >0.05 * : Cultivos seleccionados. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSION. AC IÓ. N. IV.. UN IC. Hay evidencia que L. sativa puede ser colonizado por bacterias del género. M. Rhizobium , dado que, Peña et al. detectaron la colonización rizosférica de por lo. CO. menos siete cepas de Rhizobium, provenientes de suelo rizosférico de lechuga. A. Y. identificadas mediante una prueba de nodulación con Phaseolus vulgaris y de. ÁT. IC. crecimiento en los medios GPA, ELMABAT, y NaCl 2, 3 y 5%.)58. En la primera parte. RM. de la presente investigación, la capacidad promotora del crecimiento vegetal (PGPR). IN FO. fue evaluada in vitro mediante diversas pruebas fundamentales para determinar microorganismos del suelo con estas propiedades como lo realizan Husen et al. en sus. DE. investigaciones.59 Asimismo, Vargas et al. confirmó el potencial de R. leguminosarum. AS. biovar trifolii como PGPR, quien obtuvo a partir de 252 aislamientos, 59 productores. SI ST. EM. de AIA, 20 productores de sideróforos y 107 solubilizadores de fosfato.60. DE. La primera de las pruebas realizadas fue la síntesis microbiana de sideróforos,. IO. N. está asociada con el aumento en la captación de hierro, lo cual puede asociarse a una. CC. mejor atracción de ese mismo elemento por las plantas y a la protección de estas del. RE. ataque de algunos patógenos. En la mayor parte de suelos este elemento es restrictivo. DI. debido a su baja biodisponibilidad por precipitación o quelación. Para la evaluación de la capacidad de los cultivos rizobianos en estudio para sintetizar sideróforos, los cuales son moléculas orgánicas con una alta afinidad para la quelación de cationes polivalentes, se empleó el compuesto 8- hidroxiquinolina el cual tiene la capacidad de. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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