Estudio fitoquímico y capacidad antioxidante in vitro del fruto fresco de jaltomata ventricosa

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. RM. Estudio fitoquímico y capacidad antioxidante in vitro del fruto fresco. TESIS I. IO. AUTORES:. TE. CA. DE. FA. de Jaltomata ventricosa. Gaspar Trebejo, Kelly Jamelí. . Jiménez Rodríguez, Yhen Aracely. BI BL. . ASESORA: Mg. Q.F. Marilú Roxana Soto Vásquez. TRUJILLO – PERU 2015 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. A Dios… Por estar conmigo en cada paso que doy, por fortalecer mi corazón e iluminar mi mente y por haber puesto en mi camino a aquellas personas. UI M Q. A mis padres…. IC A. que han sido y son mi soporte en mis estudios.. BI. O. Por darme el apoyo necesario en el transcurso. IA. Y. de mi carrera y por ser ejemplos de trabajo y. RM. AC. perseverancia.. FA. A mi hijo Steve…. CA. DE. Por ser mi mayor incentivo y. IO BI BL. vida.. TE. motivación para los triunfos de mi. A mis amigos Yhen, Amanda, Jimmy y hermana Sarita… Por darme el apoyo, por estar pendientes de mi carrera, por estar conmigo cuando más lo necesitaba. Gaspar Trebejo Kelly 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A Dios… Por su infinito amor y misericordia, por siempre escucharme, por siempre estar conmigo en los buenos y malos momentos, porque siento que me lleva de su mano día. O. Q. A mis padres…. UI M. IC A. tras día.. Y. BI. Por todo su amor y apoyo incondicional desde. AC. IA. siempre, por ser ellos mi mayor motivación. RM. para seguir luchando cada día para salir. CA. DE. FA. adelante.. IO. TE. A mi abuelita, a mi tía Imelda…. BI BL. Por todo su cariño y apoyo a lo largo de mi carrera universitaria, por toda su buena vibra, por toda la confianza puesta en mí.. Jiménez Rodríguez Yhen. 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTOS A nuestra asesora: Mg. MARILÚ ROXANA SOTO VÁSQUEZ Por su apoyo desinteresado, paciencia y valiosas orientaciones. Gracias por su tiempo, su dedicación y por brindarnos sus conocimientos y experiencias para. IC A. poder culminar este estudio.. UI M. A la Escuela de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo por. BI. O. Q. formarnos como profesionales competitivas con ética, valores y amor a la carrera.. IA. Y. A quienes estuvieron vinculados de alguna manera a este trabajo de investigación;. AC. asistentes del laboratorio, amigos y demás. A todos nuestro mayor reconocimiento. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. y gratitud.. 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. JURADO DICTAMINADOR. _________________________________. IC A. Dr. Roberto Osmundo Ibañez Julca. IA. Y. BI. O. Q. UI M. PRESIDENTE. AC. _________________________________. RM. Q. F. Carmen Rosa Silva Correa. IO. TE. CA. DE. FA. MIEMBRO. BI BL. _________________________________ Mg. Marilú Roxana Soto Vásquez MIEMBRO. 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR: De conformidad con las disposiciones legales y vigentes de reglamentos de Grados y Títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo – La Libertad, sometemos a vuestro elevado criterio el presente trabajo de investigación titulado:. UI M. Q. de Jaltomata ventricosa. IC A. Estudio fitoquímico y capacidad antioxidante in vitro del fruto fresco. BI. O. Sea propicia esta oportunidad para manifestar el más profundo agradecimiento a nuestra. IA. Y. Alma Mater y a toda su plana docente, por su meritoria labor de educadores y por la. AC. formación profesional que nos han brindado a través de sus enseñanzas.. RM. De manera muy especial agradecemos la valiosa colaboración de los señores miembros. FA. del jurado.. DE. Dejamos a vuestra consideración Señores Miembros del Jurado, la respectiva. TE. CA. calificación del presente informe.. BI BL. IO. Trujillo,……………. de 2015. ___________________________. ___________________________. Gaspar Trebejo Kelly Jamelí. Jiménez Rodríguez Yhen Aracely. Autora. Autora. 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. Página -----------------------------------------------------------------------------. i. Abstract. ----------------------------------------------------------------------------. ii. UI M. IC A. Resumen. INTRODUCCIÓN. ------------------------------------------------- 1. II.. MATERIAL Y MÉTODO. III.. RESULTADOS. IV.. DISCUSIÓN. V.. CONCLUSIONES. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. Q. I.. BI. O. ----------------------------------------- 8. IA. Y. ------------------------------------------------- 22. AC. ---------------------------------------------------------- 26. FA. RM. ------------------------------------------------- 32 ----------------------- 33. BI BL. IO. TE. CA. DE. ANEXOS ------------------------------------------------------------------- 41. 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN El. objetivo. del. presente. trabajo. de. investigación. fue. determinar. los. fitoconstituyentes del fruto fresco de Jaltomata ventricosa (Sogorome) y evaluar su capacidad antioxidante, así como determinar la concentración de polifenoles totales y ácido ascórbico en dicho fruto. Para el estudio fitoquímico se siguió el método de Martínez y Cuellar, según el cual la muestra fue sometida a la acción extractiva de. IC A. solventes de polaridad creciente: diclorometano, etanol y agua. La concentración de. UI M. polifenoles totales fue determinada por el método de Folin-Ciocalteu y la de ácido. O. Q. ascórbico por el método de Robinson Stock usando 2,6-diclorofenol-indofenol. La. BI. capacidad antioxidante se determinó por el método de decoloración del radical 2,2-. IA. Y. difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH*). Los resultados mostraron lípidos, triterpenos y. AC. esteroides, catequinas, compuestos fenólicos, flavonoides, antocianinas, taninos,. FA. RM. azúcares reductores, aminoácidos, mucílagos y alcaloides como fitoconstituyentes. DE. del fruto en estudio. El fruto fresco de Jaltomata ventricosa (Sogorome) presenta. CA. 319.26 mg equivalentes de ácido gálico por g de muestra y 9.23 mg de ácido. TE. ascórbico por 100 g de muestra. Asimismo dicho fruto presenta capacidad. llegando a 95.79 % a una concentración de 200 ug/mL, con un. BI BL. (p<0.05),. IO. antioxidante frente al 2, 2-difenil-1-picrilhidrazil, a la dosis de 50, 100 y 200 ug/mL. Coeficiente de Inhibición al 50% de 42.51 ug/mL. En conclusión el fruto de Jaltomata ventricosa (Sogorome) es rico en fitoconstituyentes, encontrándose elevado en compuestos fenólicos y presenta un moderado potencial antioxidante, lo que lo haría recomendable para su consumo.. Palabras clave: Jaltomata ventricosa, fitoconstituyentes, polifenoles, ácido ascórbico, capacidad antioxidante. 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT The objective of this research was to determine the fresh fruit phytoconstituents Jaltomata ventricosa (Sogorome) and evaluate its antioxidant capacity and determine the concentration of total phenolics and ascorbic acid in this fruit. For the phytochemical study method Martínez and Cuellar, whereby the sample was subjected to the extractive action of solvents of increasing polarity followed dichloromethane,. IC A. ethanol and water. The concentration of total polyphenols was determined by the Folin-. UI M. Ciocalteu and ascorbic acid by the method of Robinson Stock using 2,6-. O. Q. dichlorophenolindophenol. The antioxidant capacity was determined by the method of. BI. bleaching radical 2,2-diphenyl-1-picrilhidrazilo (DPPH*). The results showed lipids,. reducing. sugars,. amino. acids,. alkaloids. AC. tannins,. IA. Y. triterpenes and steroids, catechins, phenolic compounds, flavonoids, anthocyanins, and. mucilages. as. fruit. FA. RM. phytoconstituents study. Fresh fruit of Jaltomata ventricosa (Sogorome) presents. DE. 319.26 mg gallic acid equivalents per gram of sample and 9.23 mg of ascorbic acid per. CA. 100 g of sample. Also this fruit has antioxidant capacity compared with 2, 2-diphenyl-1-. TE. picrylhydrazyl, at the dose of 50, 100 and 200 ug / mL (p <0.05), reaching 95.79% at a. IO. concentration of 200 ug / mL, with Coefficient of 50% inhibition of 42.51 ug / mL. In. BI BL. conclusion, the fruit is rich in Jaltomata ventricosa (Sogorome) phytoconstituents, I was found high in phenolic compounds and has a moderate antioxidant potential, which would be recommended for consumption. Keywords: Jaltomata ventricosa, phytoconstituents, polyphenols, ascorbic acid, antioxidant capacity.. 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCIÓN Los cambios en el estilo de vida de la población han contribuido a que las enfermedades crónico-degenerativas como el cáncer, la diabetes y las enfermedades cardiovasculares sean actualmente una de las principales preocupaciones para las autoridades de salud, constituyendo cerca del 60% de las muertes en el mundo que podrían evitarse con ejercicio y una dieta saludable1, 2.. IC A. En los últimos 30 años viene desarrollándose cada día un interés mayor por. UI M. los problemas relacionados con el estrés oxidativo, los radicales libres, las especies. IA. Y. BI. poseen en la bioquímica, la biología y la medicina3.. O. Q. reactivas del oxígeno y los antioxidantes, todo esto dado por la importancia que. AC. Tal es así que se ha descubierto que los radicales libres están asociados a. RM. muchas patologías en el ser humano, tales como, carcinogénesis, cataratas, diabetes y. FA. ateroesclerosis. A su vez, esta última provoca hipertensión, angina, isquemia,. CA. DE. accidentes cerebrovasculares y otros problemas4, 5 ,6.. TE. También se han visto relacionados con diversas afecciones del sistema. IO. nervioso, como la enfermedad de Parkinson, Alzheimer, la enfermedad de la neurona. BI BL. motora y en otros desórdenes del sistema nervioso central (SNC)7, 8.. Desde el punto de vista químico los radicales libres son todas aquellas especies químicas, cargadas o no, que en su estructura atómica presentan un electrón desapareado o impar en el orbital externo, dándole una configuración espacial que genera gran inestabilidad. Debido a que estas especies reactivas no poseen receptores específicos, tienen una capacidad de agresión indiscriminada sobre células y tejidos vivientes9-12. 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los radicales libres son generados por reacciones bioquímicas redox que ocurren como consecuencia del metabolismo celular normal, por los fagocitos en reacciones inflamatorias controladas, como respuesta a la exposición a diferentes factores como la contaminación ambiental, la exposición a radiaciones ionizantes, el tabaco, algunos medicamentos, los aditivos químicos en alimentos procesados y algunos xenobióticos como pesticidas, herbicidas y fungicidas13.. IC A. En condiciones fisiológicas, el organismo neutraliza los radicales libres a. UI M. través de varios mecanismos que involucran la producción de enzimas antioxidantes. O. Q. para prevenir el daño oxidante. Sin embargo, si esta capacidad de control es. Y. BI. superada, cambia el balance a favor de la oxidación y se establece el estrés oxidativo,. AC. IA. que puede provocar grandes daños a células y biomoléculas14.. RM. El daño o estrés oxidativo se ha definido como la exposición de la materia. FA. viva a diversas fuentes que producen una ruptura del equilibrio que debe existir entre. DE. las sustancias o factores prooxidantes y los mecanismos antioxidantes encargados de. CA. eliminar dichas especies químicas, ya sea por un déficit de estas defensas o por un. IO. TE. incremento exagerado de la producción de especies reactivas del oxígeno. Todo esto. BI BL. trae como consecuencia alteraciones de la relación estructura-función en cualquier órgano, sistema o grupo celular especializado; por lo tanto se reconoce como mecanismo general de daño celular, asociado con la fisiopatología primaria o la evolución de un número creciente de entidades y síndromes de interés médico-social, involucrado en la génesis y en las consecuencias de dichos eventos15.. Frente a esto, el organismo debe responder con una defensa antioxidante extra, la cual la encontramos en ciertos alimentos que contienen metabolitos 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. secundarios como el ácido ascórbico, el alfa tocoferol, los betacarotenos, los polifenoles 16.. Las sustancias antioxidantes hallándose presentes a bajas concentraciones, con respecto a las de un sustrato oxidable (biomolécula), retardan o previenen la oxidación de dicho sustrato. El antioxidante al reaccionar con el radical libre (RL) le cede un electrón oxidándose a su vez y transformándose en un RL débil, con escasos. IC A. o nulos efectos tóxicos y que en algunos casos, pueden regenerarse a su forma. UI M. primitiva por la acción de otros antioxidantes. Tienen diferentes mecanismos de. O. Q. acción; unos impiden la formación de los RL y/o especies reactivas (sistema de. Y. BI. prevención), otros inhiben la acción de los RL (sistema barredor) y otros favorecen la. IA. reparación y la reconstitución de las estructuras biológicas dañadas (sistema de. RM. AC. reparación) 17, 18.. FA. La recomendación de aumentar la ingesta de alimentos ricos en antioxidantes. DE. naturales es, en la actualidad, considerada una de las formas más efectivas de reducir. CA. el riesgo de desarrollo de aquellas enfermedades crónicas no transmisibles que más. BI BL. IO. TE. limitan la calidad y expectativas de vida de la población mundial 16.. Diversos estudios señalan a la familia de las solanáceas como un grupo de alimentos con un elevado porcentaje de sustancias antioxidantes. Estas son una familia botánica formada por 90 géneros y 2.600 especies, algunas de ellas se cultivan como alimento, otras en jardinería y otras con diferentes fines19.. Las plantas de la familia de las Solanáceas tienen flores con cinco sépalos, cinco pétalos, cinco estambres y un único pistilo y, en casi todos los casos, producen una baya cuando maduran. Dentro de esta familia existen diversas especies de 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Jaltomata como la Jaltomata ventricosa, una especie endémica que los pobladores de la sierra liberteña la conocen como Sogorome y la usan como alimento de animales y de la cual hay poca información respecto a sus propiedades curativas dado que es una especie no conocida y su cultivo no requiere mayor costo19.. Sin embargo en algunas investigaciones se señalan la importancia medicinal de la familia de esta planta y refiere que se debe a la capacidad antioxidante que. IC A. poseen, tal es así que en una de las investigaciones que realizó la Universidad. UI M. Nacional de Colombia denominado “Capacidad antioxidante y contenido fenólico. O. Q. total de tres frutas cultivadas en la región andina” señalan que el lulo, la uchuva y el. Y. BI. tomate de árbol, tienen gran capacidad antioxidante y presentan alto contenido. AC. IA. fenólico que les confiere propiedades terapéuticas20.. RM. Otro estudio sobre esta familia lo realizó la Universidad Nacional de Entre. FA. Ríos de Argentina, titulado "Evaluación de la actividad antioxidante del tomate. DE. (Lycopersicon Solanaceae) durante el crecimiento, almacenamiento, maduración y. CA. comercialización", cuyo objetivo fue investigar la concentración de los componentes. IO. TE. antioxidantes presentes en el tomate y la actividad antioxidante total durante dichas. BI BL. etapas. La actividad antioxidante se midió utilizando los métodos: "Ferric reducing/antioxidant power" (FRAP). y decoloración. del. β-caroteno.. Los. antioxidantes ácido L-ascórbico, licopeno y β-caroteno fueron 2,6 veces mayor en la comercialización respecto de los valores iniciales, mientras que la actividad antioxidante en la última etapa fue 2,1 y 3,5 veces más alta que en el crecimiento para los métodos FRAP y decoloración de β-caroteno, respectivamente. En consecuencia, el consumidor dispone de un fruto rico en antioxidantes, lo que le. 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. atribuye la capacidad de captación de los radicales libres presentes en nuestro cuerpo21.. Además, se han reportado estudios de otras especies de la familia de esta planta, entre los que encontramos uno realizado por la Universidad Nacional Mayor de San Marcos titulado “Capacidad antioxidante de tres variedades de papa (Solanum tuberosum) con y sin cáscara” procedentes de Junín. Se utilizó el método de. IC A. reducción del radical libre estable 2,2 difenil - 1 – picrilhidrazil (DPPH*) a la. UI M. hidracina correspondiente y señalan que estas tres variedades de papa poseen una. O. Q. buena capacidad antioxidante, teniendo una mayor acción frente al sistema generador. IA. Y. BI. de radicales libres la papa blanca con cáscara y la papa amarilla sin cáscara22.. AC. Y tal es el interés de corroborar el efecto antioxidante de diferentes plantas,. RM. que se han ido desarrollando estudios in vivo como lo señala el trabajo que realizó la. FA. Universidad Nacional Mayor de San Marcos titulado “Efecto antioxidante y. DE. citoprotector de Solanum tuberosum (papa) en la mucosa gástrica de animales de. CA. experimentación”, se trabajó con el zumo de Solanum tuberosum, variedad tomasa. IO. TE. administrado vía oral post ayuno a ratas albinas machos. Se midió en la mucosa. BI BL. gástrica el estrés oxidativo por lipoperoxidación, la formación de moco por alcian blue y la protección midiendo la extensión del área lacerada en imagen digitalizada. A partir del fraccionamiento del zumo crudo, la fracción sobrenadante posee actividad de defensa antioxidante en dosis de 5mL/kg de peso y la fracción del precipitado brinda citoprotección a la mucosa gástrica de manera dosis dependiente23.. 14. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Una investigación de Leiva y col. incluye a la especie Jaltomata ventricosa (Sogorome) dentro de algunos frutales silvestres de solanáceas endémicas del Perú. El centro de diversidad para el género Jaltomata es el norte del Perú. Todas las especies aquí reportadas poseen frutos comestibles por su sabor dulce y agradable24.. Si bien hay trabajos sobre plantas que tienen capacidad antioxidante; cada día el ser humano con el estrés, la contaminación y otros factores, se encuentra. IC A. susceptible de padecer alguna enfermedad crónico-degenerativa, lo que conlleva a. UI M. los investigadores a realizar estudios para descubrir nuevas plantas que tengan dicha. O. Q. capacidad, ya que existen evidencias probadas de que es posible evitar las. Y. BI. defunciones prematuras por dichas enfermedades gracias a algunas plantas. IA. medicinales y se dispone de intervenciones eficaces en función de los costos para. RM. AC. evitarlas25.. FA. Teniendo en cuenta el uso tradicional, bajo costo y fácil adquisición de. DE. Jaltomata ventricosa (Sogorome) y al no existir trabajos científicos en nuestro medio. CA. sobre sus fitoconstituyentes, ya que es una especie endémica, surge el interés de. IO. TE. realizar su correspondiente estudio fitoquímico. Además, a la vista de los importantes. BI BL. antecedentes de la familia Solanaceae, se pretendió confirmar la posible capacidad antioxidante de esta especie vegetal frente al reactivo DPPH*.. Con ello se busca orientar la posibilidad de su utilización en la prevención de enfermedades crónico-degenerativas producidas por radicales libres, teniendo en cuenta su capacidad antioxidante.. 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.. PROBLEMA 1.1. ¿Cuáles son los fitoconstituyentes del fruto fresco de Jaltomata ventricosa? 1.2. ¿Presenta capacidad antioxidante in vitro el fruto fresco de Jaltomata ventricosa frente al 2, 2-difenil-1-picrilhidrazil?. 2.. HIPÓTESIS:. IC A. El fruto fresco de Jaltomata ventricosa contiene fitoconstituyentes con. OBJETIVOS:. Q. 3.. UI M. capacidad antioxidante in vitro frente al 2, 2-difenil-1-picrilhidrazil.. BI. O. 3.1. Objetivo General:. Y. Determinar los fitoconstituyentes del fruto fresco de Jaltomata. AC. IA. ventricosa y evaluar su capacidad antioxidante in vitro frente al 2, 2-. FA. 3.2. Objetivos Específicos:. RM. difenil-1-picrilhidrazil.. CA. ventricosa.. DE. 1. Realizar el estudio fitoquímico del fruto fresco de Jaltomata. IO. TE. 2. Determinar la concentración de polifenoles totales del fruto fresco de. BI BL. Jaltomata ventricosa. 3. Determinar la concentración de ácido ascórbico del fruto fresco de Jaltomata ventricosa. 4. Determinar la capacidad. antioxidante in vitro del fruto fresco de. Jaltomata ventricosa. 5. Comparar la capacidad antioxidante in vitro del fruto fresco de Jaltomata ventricosa con la del estándar de ácido ascórbico.. 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II.. MATERIAL Y MÉTODO: 1. MATERIAL 1.1.Material Botánico -. Se recolectaron 500 g del fruto maduro de la especie Jaltomata ventricosa (Sogorome), del distrito de Usquil, provincia de Otuzco,. IC A. Región La Libertad.. UI M. 1.2.Material de Laboratorio. Q.  Material de Vidrio y Otros. BI Y.  Equipos de Laboratorio. Balanza Analítica OHAUS GA 200. -. Espectrofotómetro “JENWAY” 6105 UV/Vis. -. Licuadora “COLDEX”. -. Bomba de vacío GAST MODEL Nº 0211-V45M- G218C. . Refrigeradora. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. . 1.3.Reactivos. Colorante Sudán III. BI BL. . O. El de uso común en el laboratorio. . Ácido clorhídrico concentrado. . Reactivo de Dragendorff. . Reactivo de Mayer. . Reactivo de Wagner. . Reactivo de Baljet. . Hidróxido de sodio. . Anhídrido acético 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Ácido sulfúrico concentrado. . Carbonato de sodio. . Rectivo de Fehling. . Tricloruro férrico al 5%. . Ninhidrina al 2%. . Cinta de magnesio metálico. . Alcohol amílico. . Rectivo de Kedde. . 2,2 - difenil - 1 – picrylhidrazil [DPPH*] (Aldrich). . Solución patrón de ácido gálico (Sigma Aldrich). . Reactivo de Folin - Ciocalteau (Sigma Aldrich). . Bicarbonato de sodio (Sigma Aldrich). . Ácido ascórbico (Sigma Aldrich). . Ácido metafosfórico (Sigma Aldrich). . 2,6-diclorofenol indofenol (Sigma Aldrich). UI M. Q O. BI. Y. IA. AC. RM. FA. DE. CA. IO. Agua destilada (Dropaksa). Etanol 96º G.L. (Merck). BI BL. . TE. 1.4.Solventes: . IC A. . . Diclorometano. 2. MÉTODO 2.1. RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA Los frutos de Jaltomata ventricosa (Sogorome) fueron recolectados en el distrito de Usquil, provincia de Otuzco, región La Libertad, ubicado a 3018 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. msnm y coordenadas geográficas 07° 48' 54'' Lat. S y 78° 24' 59'' Long O, durante el mes de marzo. 2.2. IDENTIFICACIÓN Y DETERMINACIÓN TAXONÓMICA DE LA ESPECIE Un ejemplar de la especie fue llevada al Herbarium Truxillense de la Universidad Nacional de Trujillo para su identificación y verificación. IC A. taxonómica, siendo depositada con el código N° 54379 (Anexo 1). UI M. 2.3. SELECCIÓN DE LA MUESTRA. Q. Se seleccionaron los frutos al azar teniendo en cuenta su estado de. BI. O. maduración y, excluyendo aquellos con brotes, cáscara verde con daños. IA. Y. superficiales (golpes, cortes o exceso de humedad) y que hayan estado. RM. 2.4. LAVADO DE LA DROGA. AC. deshidratados o arrugados.. FA. Se procedió a lavar los frutos con agua potable a chorro y luego con agua. DE. destilada para finalmente secar la superficie con papel toalla.. TE. CA. 2.5. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA. IO. Se pesó 10 g de los frutos frescos de Jaltomata ventricosa (Sogorome), se. BI BL. trituró con ayuda de un mortero y se añadió 10 mL de diclorometano, se llevó a baño María por 10 minutos, se filtró y el residuo se llevó a sequedad a temperatura ambiente. Posteriormente se agregó 20 mL de etanol 96° GL y se llevó a baño María por 10 minutos, se filtró nuevamente y el residuo se llevó a estufa a 40° C hasta sequedad. En seguida se añadió 10 mL de agua, se llevó a baño María por 10 minutos y se filtró. Los extractos se utilizaron para realizar el estudio fitoquímico.. 19. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.6. ESTUDIO FITOQUÍMICO DEL FRUTO FRESCO DE Jaltomata ventricosa (SOGOROME) Fundamento De acuerdo con este método para el estudio fitoquímico de Martínez y Cuellar, la muestra fue sometida a la acción extractiva de solventes de polaridad creciente: diclorometano, etanol y agua, modificando el pH del. IC A. medio con el fin de obtener los fitoconstituyentes de acuerdo a su. UI M. solubilidad, luego estos fueron identificados haciendo uso de reactivos de. O. Q. coloración y precipitación26.. BI. Procedimiento. IA. Y. Se realizó la identificación de los fitoconstituyentes de acuerdo a los. AC. esquemas I, II y III. (Anexos 2, 3 y 4).. RM. En cada caso, para realizar los ensayos se procedió de la siguiente forma:. DE. FA.  Ensayo de Sudán: Permitió reconocer en el extracto la presencia de. CA. compuestos grasos, para ello, a la alícuota de la fracción en el solvente de. TE. extracción, se le añadió 1mL de una solución diluida en agua del colorante. IO. Sudan III. Se calentó en baño de agua hasta evaporación del solvente26.. BI BL. La presencia de compuestos grasos se consideró positiva si aparecían gotas o una película coloreada de rojo en el seno del líquido o en las paredes del tubo de ensayo respectivamente26..  Ensayo de Baljet: Permitió reconocer en los extractos la presencia de compuestos con agrupamiento lactónico, en particular cumarinas, aunque otros compuestos lactónicos pueden dar positivo al ensayo.. 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Para ello, en el caso del extracto diclorometánico se evaporó el solvente en baño de agua y se redisolvió en la menor cantidad de alcohol (1mL). En estas condiciones se adicionó 1mL del reactivo, considerándose un ensayo positivo la aparición de coloración o precipitado rojo (++ y +++) respectivamente26.  Ensayo de Borntrager: Permitió reconocer en el extracto etanólico la. IC A. presencia de quinonas. Para ello se evaporó el solvente de una alícuota del. UI M. extracto en baño de agua y el residuo se redisolvió en 1 mL de cloroformo.. Q. Se agregó 1mL de hidróxido de sodio, se agitó mezclando las fases y se dejó. BI. O. en reposo hasta su ulterior separación. Si la fase acuosa alcalina (superior). Y. se coloreaba de rosado o rojo, el ensayo se consideraba positivo. Coloración. AC. IA. rosada (++), coloración roja (+++) 26.. RM.  Ensayo de Liebermann-Burchard: Permitió reconocer en los extractos la. FA. presencia de triterpenos y/o esteroides, por ambos tipos de productos poseer. CA. posición 5-626.. DE. un núcleo del androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la. IO. TE. Para ello, se evaporó el solvente de una alícuota de cada extracto en baño de. BI BL. agua y el residuo se redisolvió en 1mL de cloroformo. Se adicionó 1mL de anhídrido acético y se mezcló bien. Por la pared del tubo de ensayo se dejó resbalar II a III gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar. Un ensayo positivo fue reconocido por un cambio rápido de coloración: 1. Rosado-azul muy rápido. 2. Verde intenso-visible aunque rápido. 3. Verde oscuro-negro-final de la reacción.. 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Muy pocas veces puede observarse el primer cambio. El tercer cambio generalmente ocurre cuando el material evaluado tiene cantidades importantes de estos compuestos. Importante: Para realizar este ensayo no puede haber agua en el medio de reacción, pues ésta con el ácido sulfúrico reacciona de forma violenta y puede ocurrir un accidente26.. IC A. La reacción de Liebermann-Burchard se emplea también para diferenciar las. UI M. estructuras esteroidales de los triterpenoides, las primeras producen. Q. coloraciones azul o azul verdoso, mientras que para las segundas se observa. BI. O. rojo, rosado o púrpura. Estas coloraciones pueden variar por interferencias. Y. producidas por carotenos, xantofilas y esteroides saturados que puedan estar. AC. Ensayo de catequinas: Para ello se tomó I gota de la solución etanólica, con. RM. . IA. presentes26.. FA. la ayuda de un capilar y se aplicó sobre papel filtro. Sobre la mancha se. DE. aplicó solución de carbonato de sodio. La aparición de una mancha verde. TE. Ensayo de resinas: Para detectar este tipo de compuesto, se añadió a 2 mL. IO. . CA. carmelita a la luz UV, indicó un ensayo positivo26.. BI BL. de la solución etanólica, 10 mL de agua destilada. La aparición de un precipitado reveló un ensayo positivo26. . Ensayo de Fehling: Permitió reconocer en los extractos, la presencia de azúcares reductores. Para ello, la alícuota del extracto debe encontrarse en agua. Se adicionaron 2 mL del reactivo y se calentó en baño de agua 5 a 10 minutos. El ensayo se consideró positivo si la solución se coloreaba de rojo o aparece precipitado rojo26.. 22. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. . Ensayo de la espuma: Permitió reconocer en un extracto la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como triterpénica. De modo que la alícuota del extracto etanólico, se diluyó con cinco veces su volumen en agua y se agitó, dicha mezcla, fuertemente durante 5 a 10 minutos. El ensayo se consideró positivo si aparecía espuma en la superficie del líquido de más de 2 mm de altura y persistente por más de 2 minutos26. Ensayo del cloruro férrico: Permitió reconocer la presencia de compuestos. IC A. . UI M. fenólicos y/o taninos en los extractos. En el caso del extracto etanólico, se. Q. determina la presencia tanto de fenoles como de taninos. A una alícuota del. BI. O. extracto etanólico se le añadió III gotas de una solución de tricloruro férrico. Y. al 5% en solución salina fisiológica. Para el extracto acuoso, el ensayo. AC. IA. determina fundamentalmente taninos. A una alícuota del extracto se añadió. RM. acetato de sodio para neutralizar y III gotas de una solución de tricloruro. FA. férrico al 5% en solución salina fisiológica, un ensayo positivo puede dar la. DE. siguiente información general:. CA.  Desarrollo de una coloración rojo-vino: compuestos fenólicos en general.. IO. TE.  Desarrollo de una coloración verde intensa: taninos del tipo. BI BL. pirocatecólicos.  Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo pirogalotánicos. . Ensayo de la ninhidrina: Permitió reconocer en el extracto la presencia de aminoácidos libres o de aminas en general. Se tomó una alícuota del extracto en alcohol, se mezcló con 2 mL de solución al 2% de ninhidrina en agua. La mezcla se calentó 5 a 10 minutos en baño de agua. Este ensayo se consideró positivo si se desarrollaba un color azul violáceo26.. 23. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. . Ensayo de Shinoda: Permitió reconocer la presencia de flavonoides en los extractos. Una alícuota del extracto etanólico, se diluyó con 1 mL de ácido clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico. Después de la reacción se esperó 5 minutos, se añadió 1mL de alcohol amílico, se mezclaron las fases y se dejó reposar hasta que se separen26. Para el extracto acuoso, se procedió de igual forma, a partir de la adición del. IC A. ácido clorhídrico concentrado.. UI M. El ensayo se consideró positivo si el alcohol amílico se coloreaba de. O. Ensayo de Kedde: Permitió reconocer en el extracto la presencia de. BI. . Q. amarillo, naranja, carmelita o rojo; intenso en todos los casos26.. IA. Y. glucósidos cardiotónicos. Una alícuota del extracto en etanol se mezcló con. AC. 1 mL del reactivo y se dejó reposar durante 5 a 10 minutos. En un ensayo. RM. positivo se desarrolla una coloración violácea, persistente durante 1 a 2. Ensayo de antocianidinas: Permitió reconocer en el extracto la presencia de. DE. . FA. horas26.. CA. estructuras de secuencia C6-C3-C6 del grupo de los flavonoides. Se calentó. IO. TE. 2 mL del extracto etanólico 10 minutos con 1mL de HClcc, se dejó enfriar y. BI BL. se añadió 1 mL de agua y 2 mL de alcohol amílico. Se agitó y se dejó separar las dos fases. La aparición de color rojo a marrón en la fase amílica fue indicativa de un ensayo positivo26. . Ensayo de mucílagos: Permitió reconocer en el extracto la presencia de una estructura tipo polisacárido, el cual formará un coloide hidrófilo de alto índice de masa que aumenta la densidad del agua donde se extrae. Para ello una alícuota del extracto se enfrió en agua de 0 a 5 ºC y si la solución tomaba una consistencia gelatinosa el ensayo se consideraba positivo26. 24. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. . Ensayo de Dragendorff: Permitió reconocer en los extractos la presencia de alcaloides, para ello, en el caso de los extractos diclorometánico y etanólico, se evaporó el solvente de una alícuota de los mismos en baño de agua y el residuo se redisolvió en 1mL de ácido clorhídrico al 1%. Para el extracto acuoso, a la alícuota se le añadió I gota de ácido clorhídrico concentrado, (se calentó suavemente y se dejó enfriar). Con la solución acuosa ácida se. IC A. realizó el ensayo, se añadió III gotas del reactivo de Dragendorff, si hubo. Ensayo de Mayer: Se realizó según la forma descrita anteriormente, hasta. Q. . UI M. opalescencia se consideró (+), turbidez definida (++), precipitado (+++) 26.. BI. O. obtener una solución ácida. Se añadió luego, una pizca de cloruro de sodio. Y. en polvo, se agitó y filtró. Se añadió II ó III gotas de la solución reactiva de. AC. IA. Mayer, y si hubo opalescencia (+), turbidez definida (++), precipitado. RM. copioso (+++) 26.. FA. Observación: En el caso de alcaloides cuaternarios y los aminoácidos. DE. libres, éstos solo se encuentran en el extracto acuoso y para considerar su. CA. presencia la reacción debía ser (++) o (+++), ya que un resultado (+) puede. IO. TE. provenir de una extracción incompleta de bases primarias, secundarias o. . BI BL. terciarias26.. Ensayo de Wagner: Se partió al igual que en los casos anteriores de la solución ácida, se añadió II ó III gotas del reactivo, clasificando los resultados de la misma forma26.. 2.7. DETERMINACIÓN. DEL. CONTENIDO. DE. POLIFENOLES. TOTALES EN EL FRUTO FRESCO DE Jaltomata ventricosa (SOGOROME) Curva patrón de ácido gálico 25. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. - Se preparó un sistema de 4 tubos de ensayo numerados. - Se añadió a cada tubo la cantidad correspondiente de agua destilada (675, 650, 625 y 600 uL) y posteriormente la de ácido gálico 2.5 mM (25, 50, 75 y 100 uL respectivamente). - Se agregó a cada tubo 600 μl de solución de carbonato sódico al 7,5 % y se agitó (aproximadamente un segundo).. IC A. - Se añadió a cada tubo 200 μl de reactivo de Folin-Ciocalteau y se agitó.. UI M. - Se colocó la gradilla con los tubos en un baño de agua precalentado a. Q. 50º C y se incubó 10 minutos.. BI. O. - A continuación se midió la absorbancia de las disoluciones a 760 nm. IA. Y. en el espectrofotómetro.. AC. Blanco. RM. En un tubo de ensayo se añadió 700 uL de agua destilada, 600 μl de. FA. solución de carbonato sódico al 7,5 %, se agitó y se agregó 200 μl de. DE. reactivo de Folin-Ciocalteau agitando nuevamente, luego se siguió el. TE. IO. Muestra. CA. procedimiento realizado para los tubos patrón.. BI BL. Se pesaron 30 g de los frutos frescos de Jaltomata ventricosa (Sogorome). Luego se cortaron en pequeños trozos y se licuaron con 100 mL de etanol. 96º G.L. Posteriormente se filtró y se guardó en frasco de color ámbar, manteniéndose en refrigeración. Medida del contenido en polifenoles totales del fruto fresco de Jaltomata ventricosa (Sogorome)27. En un tubo de ensayo se añadió 600 uL de agua destilada, 100 uL de muestra, 600 μl de solución de carbonato sódico al 7,5 %, se agitó y se 26. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. agregó 200 μl de reactivo de Folin-Ciocalteau agitando nuevamente, luego se siguió el procedimiento realizado para los tubos patrón.. 2.8. DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN EL FRUTO FRESCO DE Jaltomata ventricosa (SOGOROME). MÉTODO DE ROBINSON STOCK, CITADO POR RANGANA, 1986.. IC A. El método de determinación directo está basado en la cuantificación del. UI M. exceso de 2,6-diclorofenol-indofenol, el cual disminuye la intensidad de su. Q. color debido al ácido ascórbico presente en la muestra y en la solución de. BI. O. los estándares28.. Y. Reactivos:. AC. IA. - Solución de ácido metafosfórico al 2%.. RM. - Solución indicadora: Se disolvieron 100 mg de 2,6-diclorofenol. FA. indofenol y 4 mg de bicarbonato de sodio en agua destilada caliente. DE. (85-95°C), se enfrió y se aforó a 100 mL. Se filtró y diluyó 25 mL a. CA. 500 mL con agua destilada.. IO. TE. - Soluciones estándares de ácido ascórbico: Se pesaron exactamente 100. BI BL. mg de ácido ascórbico y se aforaron hasta 100 mL con HPO3 al 2%. Se diluyeron 4 mL de esta solución hasta 100 mL con HPO3 al 2% (1 mL = 40 µg de ácido ascórbico). Procedimiento: - Curva estándar: En tubos de vidrio se colocó los siguientes volúmenes de la solución estándar de ácido ascórbico 1, 2, 3, 4 y 5 mL y se llevó a 5 mL totales con HPO3 al 2%. Se adicionó 10 mL de la solución indicadora y se tomó la lectura dentro de los 15 a 20 segundos de 27. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. reacción. Se llevó el equipo al 100% de transmitancia con un blanco de 5 mL de HPO3 al 2% y 10 mL de agua. Se tomó la medición a la longitud de onda de 518 nm, obteniendo la curva tipo absorbancia contra concentración. - Muestra: Se pesó 10 g de muestra y se aforó hasta 100 mL con HPO3 al 2 %. Se tomó 5 mL de este extracto y se adicionó 10 mL de la. IC A. solución indicadora y se procedió a leer su absorbancia a 518 nm con. UI M. un blanco de 5 mL del extracto y 10 mL de HPO3 al 2%.. Q. Cálculos:. BI. O. La concentración de ácido ascórbico de la curva estándar y de la muestra. Y. se realizó a través de la siguiente ecuación:. RM. AC. IA. 𝐴 ∗ 𝐵 ∗ 100 𝑚𝑔 𝑑𝑒 á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑎𝑠𝑐ó𝑟𝑏𝑖𝑐𝑜 = 100 𝑔 𝑜 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐶 ∗ 1000 ∗ 𝐷. FA. Donde:. DE. A = Contenido de ácido ascórbico estimado en la curva tipo. CA. B = Volumen de aforo (1000 mL).. TE. C = mL de solución tomados para la estimación (5 mL).. BI BL. IO. D = Peso de la muestra. 2.9. DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE in vitro DEL FRUTO FRESCO DE Jaltomata ventricosa (SOGOROME) POR EL MÉTODO DPPH* El Fundamento del método desarrollado por Brand-Willams et al DPPH*, consiste en que este radical tiene un electrón desapareado y es de color azulvioleta, decolorándose hacia amarillo pálido por reacción con una sustancia antioxidante; la absorbancia es medida espectrofotométricamente a 517 nm. 28. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La diferencia de absorbancias, permite obtener el porcentaje de captación de radicales libres29. Procedimiento 1. Se preparó 100 ml de una solución de DPPH* (2,2-difenil-1picrilhidrazilo) en etanol de 20 mg/L. 2. Luego se preparó una solución etanólica del fruto fresco a una. IC A. concentración de 300 ug/ml (Solución A) y de 600 ug/mL (Solución D). UI M. 3. El Blanco se preparó con etanol agua 2:1 para ajustar el. Q. espectrofotómetro a cero.. BI. O. 4. El Blanco de muestra se preparó con 0.75 mL de muestra (solución A). Y. y 1.5 mL de etanol.. AC. IA. 5. Se preparó el patrón de referencia con 1.5 mL de DPPH* y 0.75 mL de. RM. agua.. FA. 6. Luego se procedió a preparar la muestra con 0.75 mL de solución A y. DE. 1.5 mL de DPPH*, obteniéndose una concentración final de 100 ug/mL,. CA. dejándose por 5 minutos y se leyó a 517 nm en el espectrofotómetro.. IO. TE. 7. Se midió la absorbancia del patrón de referencia y del blanco de la. BI BL. muestra. 8. Luego se diluyó la solución A con etanol en una proporción 1:2 (solución B) para obtener una concentración final de 50 ug/mL, y en una proporción de 1:10 (solución C) para obtener una concentración final de 10 ug/mL. 9. Con las soluciones B, C y D se procedió igual a los puntos 6 y 7. Los extractos fueron evaluados a diferentes concentraciones de 10, 50, 100 y 200 ug/mL, utilizando como control, un estándar de ácido ascórbico. 29. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Posteriormente, con los valores de las absorbancias obtenidas se determinó el % de captación de radicales libres (DPPH*) mediante la siguiente fórmula:. Donde:. IC A. A1= Absorbancia del patrón de referencia. UI M. A2= Absorbancia de la muestra. Y. BI. O. Q. A3= Absorbancia del blanco de muestra. IA. Cálculo del coeficiente de inhibición al 50%. 2,2 - difenil -1-. muestra que. captura. RM. AC. picrylhidrazil (DPPH*). El IC50, es la cantidad de. del. FA. radicales DPPH* en un 50%. Así un menor valor de IC50 indica una mayor. DE. capacidad antioxidante, porque requiere menos cantidad de muestra para. CA. capturar un 50% de radicales DPPH*. El IC50 se reemplazará en la ecuación. TE. que se obtendrá de la curva de concentración versus % de captación de. BI BL. IO. radicales libres.. 3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los valores de la capacidad antioxidante fueron sometidos a un análisis de correlación de variables (coeficiente de correlación de Pearson), y a los valores correspondientes al Coeficiente de Inhibición al 50% se aplicó T de Student, utilizando un nivel de significancia del 95% (p0.05).. 30. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III.. RESULTADOS. TABLA 01: Fitoconstituyentes presentes en el fruto fresco de Jaltomata ventricosa (Sogorome) Resultados Fitoconstituyentes. Ensayo. Extracto diclorometánico. Extracto etanólico. Extracto acuoso. Sudán. +. -/-. -/-. Compuestos lactónicos. Ensayo de Baljet. -. -. -/-. Quinonas. Borntranger. Triterpenos y esteroides. Azúcares reductores. Lieberman Burchard Ensayo de catequinas Ensayo de resinas Licor de Fehling. Saponina. Espuma. Compuestos fenólicos/Taninos. Cloruro Férrico. Aminoácidos. -. -/-. +. UI M. -/-. +. -/-. -. -/-. IA. IC A. Lípidos. +. +. -/-. -. -. -/-. +. +. Ninhidrina. -/-. +. -/-. Flavonoides. Shinoda. -/-. +. -. Glicósidos cardiotónicos. Reacción de Kedde Ensayo de Antocianidinas Ensayo de mucílagos. -/-. -. -/-. -/-. +. -/-. Mucílagos. Alcaloides. Q O BI. Y. -/-. RM. AC. -/-. CA. TE IO. BI BL. Antocianidinas. -/-. DE. Resinas. +. FA. Catequinas. -/-. -/-. +. Dragendorff. -. -. +. Mayer. -. -. +. Wagner. -. -. +. Leyenda: (+): Positivo (-): Negativo (-/-): No se realizó el ensayo 31. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA 02: Concentración de polifenoles totales y ácido ascórbico del fruto fresco de Jaltomata ventricosa (Sogorome) Fenoles totales (mg/Eq.. Ácido ascórbico (mg/100. ácido gálico/g de fruto. g de fruto). 318.64. 9.2023. M2. 319.48. 9.2137. M3. 320.31. 9.2253. Promedio. 319.48. 9.2138. D. E.. 0.83501. 0.01150. C. V.. 0.261367. 0.12482. Q. UI M. IC A. M1. BI. O. TABLA 03: Capacidad antioxidante del estándar de ácido ascórbico y del fruto. IA. Y. fresco de Jaltomata ventricosa (Sogorome). AC. Estándar de ácido ascórbico (µg/mL) 10. 50. M1 (%). 40.59. 55.12. M2 (%). 40.68. 55.31. DE. M3 (%). 40.78. Promedio. IO. RM. Concentración. 100. 200. 10. 50. 100. 200. 71.70. 97.32. 37.65. 51.89. 70.28. 95.03. 71.95. 97.69. 38.34. 52.36. 70.90. 96.02. 55.45. 72.20. 97.94. 39.00. 52.73. 71.21. 96.31. 55.29. 71.95. 97.65. 38.33. 52.33. 70.79. 95.79. 0.09125. 0.16453. 0.24848. 0.31277. 0.67667. 0.42376. 0.47365. 0.67171. 0.22428. 0.29755. 0.34534. 0.32029. 1.76543. 0.80985. 0.66905. 0.70127. C. V.. TE. CA. FA. Muestras. 40.68. BI BL. D. E.. Soluciones etanólicas de Jaltomata ventricosa (µg/mL). 32. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) % Captación de radicales libres. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 120.00 97.65. p = 0.004. 100.00 71.95. 80.00. y = 0.2968x + 39.686 R² = 0.9927. 55.29. 60.00. 40.68. 40.00. 20.00 0.00 0. 50. 100. 150. 200. 250. IC A. Concentración ug/mL. Y. BI. O. Q. UI M. GRÁFICO 01: Porcentaje de captación de radicales libres del estándar de ácido ascórbico. IA. 120.00. AC. p = 0.005. 70.79. RM. 80.00 52.33. y = 0.3012x + 37.197 R² = 0.9901. FA. 60.00 38.33 40.00. DE. % Captación. 100.00. 95.79. CA. 20.00. 50. 100. 150. 200. 250. Concentración ug/mL. BI BL. IO. 0. TE. 0.00. GRÁFICO 02: Porcentaje de captación de radicales libres del fruto fresco de Jaltomata ventricosa (Sogorome). 33. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. p = 0.91. 42.51. 45 40. 34.75. IC 50 (ug/mL). 35 30 25 20 15 10 5. 0 Jaltomata ventricosa. IC A. Ácido ascórbico. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. GRÁFICO 03: Coeficiente de Inhibición al 50% (IC50) del estándar de ácido áscórbico y del fruto fresco de Jaltomata ventricosa (Sogorome). 34. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV.. DISCUSIÓN. Mediante el estudio fitoquímico se identificaron los fitoconstituyentes presentes en los extractos diclorometánico, etanólico y acuoso del fruto fresco de Jaltomata ventricosa (Sogorome), encontrándose lípidos, triterpernos y esteroides en el primero; catequinas, compuestos fenólicos, triterpenos y esteroides, flavonoides, antocianinas, azúcares reductores y aminoácidos en el segundo; taninos, azúcares reductores, mucílagos y. IC A. alcaloides cuaternarios en el último, tal como se detalla en la tabla 01.. UI M. Las extracciones llevadas a cabo siguieron orden de polaridad ascendente utilizando tres. O. Q. solventes: diclorometano, etanol y agua; de menor a mayor polaridad, respectivamente.. AC. IA. secundarios de acuerdo a su solubilidad30-32.. Y. BI. Estos solventes modifican el pH del medio con el fin de obtener los metabolitos. RM. La extracción de los fitoconstituyentes sigue un orden de polaridad ascendente; debido a. FA. que las células de donde se los ha de extraer, constituyen sistemas hidrofílicos internos,. DE. donde se encuentran los primeros, inmersos dentro de una vesícula, que consta de una. CA. membrana lipofílica. Cuando se tritura la droga, se rompen las paredes y membranas. IO. BI BL. mencionados.. TE. celulares, dejando libres las vesículas que almacenan a los fitoconstituyentes. El diclorometano, al ponerse en contacto con la droga, va a difundir fácilmente por la membrana vesicular, disolviéndola a su paso y extrayendo los principios activos de polaridad semejante (lipofílicos); este solvente, no extrae aquellos metabolitos secundarios unidos no covalentemente a sistemas hidrofílicos (proteínas, péptidos) en el citoplasma expuesto; sino que se repele con estos últimos.. 35. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El etanol, como solvente de polaridad intermedia, extrae los fitoconstituyentes afines; su labor se ve facilitada por la secuencia del procedimiento: el diclorometano ya disolvió las membranas vesiculares, tal es así que solo se remite a romper las interacciones que mantienen atraídos (no unidos) a los principios activos, hacia los sistemas hidrofílicos33, 34. .. Finalmente, el agua extrae los principios activos más hidrosolubles, debido a su elevada. IC A. polaridad; esta es capaz de extraerlos en sus formas ionizadas, situación que escapa a las. UI M. particularidades de los solventes anteriores.. BI. O. Q. En la tabla 02 se muestra los resultados de la cuantificación de polifenoles totales y. Y. ácido ascórbico, encontrándose en promedio 319.48 mg equivalentes de ácido gálico. AC. IA. por g de muestra fresca y 9.21 mg de ácido ascórbico por 100 g de fruto fresco.. RM. Al no existir trabajos de investigación que informen del contenido de polifenoles y. FA. ácido ascórbico, así como de la capacidad antioxidante de esta especie ni del género. DE. Jaltomata, comparamos nuestros resultados con estudios realizados en especies de la. TE IO. L. (pimiento).. CA. familia Solanaceae tales como Physalis peruviana L. (aguaymanto) y Capsicum annuum. BI BL. El resultado obtenido en la cuantificación de polifenoles totales es mayor en comparación a los reportados por Aparcana y Villareal (2014) para el extracto etanólico de aguaymanto, quienes registran 149.3, 144.4, 127.9 y 106 mg equivalentes de ácido gálico por 100 g de fruto fresco de aguaymanto provenientes de Huánuco, Junín, Ancash y Cajamarca respectivamente35. Muchos reportes han mostrado una cercana relación entre el contenido de fenoles y la capacidad antioxidante de las plantas. Kuskoski et al (2004), como Muñoz et al (2007), 36. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. mencionan que la capacidad antioxidante obtenida por el método DPPH* y ABTS (Ácido 2,2´-azino-bis-(3-ethilbenzotiazolin-6-sulfonico)) se correlaciona con el contenido de compuestos fenólicos totales, por su parte Tovar del Río (2013) obtuvo coeficientes de correlación destacados al determinar la actividad antioxidante de varias plantas, sin embargo, la mayor o menor actividad, no siempre va aparejada con la concentración de polifenoles, así Okawa reporta que cuando se evalúa la capacidad de. IC A. secuestro de radicales libres no siempre es importante el contenido de polifenoles sino. UI M. más bien la posición del grupo hidroxilo, además en su composición química existen. Q. otros metabolitos secundarios que debido a su estructura pueden contribuir a su eficacia. BI. O. antioxidante. Por otro lado Singh y col. mencionan que el coeficiente de inhibición varía. Y. dependiendo de la granulometría de las muestras, el lugar de origen, las condiciones. AC. IA. climáticas y el tratamiento de los alimentos36-41.. FA. RM. El resultado obtenido en la cuantificación de ácido ascórbico es menor al reportado por. DE. diferentes autores para Physalis peruviana (aguaymanto). Encina y col (2007) informan. CA. 28,55 mg/100 g de fruto, Gutiérrez y col (2007) 33.2 mg/100 g de muestra comestible,. TE. Cortés y col (2015) 20,75 mg/100g de muestra42-44.. BI BL. IO. Se debe tener en cuenta que él ácido ascórbico se degrada fácilmente al estar en contacto con el aire, la luz y el calor, por lo que una parte podría haberse perdido durante la preparación de la muestra o durante el almacenamiento y transporte, como sucede con Capsicum annuum (pimiento) que sufre una pérdida significativa de contenido de ácido ascórbico cuando los frutos maduros se almacenan a temperatura ambiente o refrigerado (4° C) 45. A pH fisiológico el ácido ascórbico se encuentra en forma de anión, pudiendo ceder dos electrones, mediante una reacción reversible, para dar el ácido dehidroascórbico a través 37. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. del radical ascorbilo. El ácido ascórbico es un excelente neutralizador de radicales libres, como hidroxilo o peroxilo, en medios acuosos. Además, el ascorbato también puede actuar como antioxidante quelatando metales, atrapando oxígeno singlete y mediante la reducción de los hidroperóxidos a alcoholes que son más estables y no continúan las reacciones radicalarias46. La capacidad antioxidante de un fruto se debe al efecto sinérgico entre los compuestos. UI M. IC A. bioactivos como los flavonoides, polifenoles y ácido ascórbico presentes en él47. Los resultados obtenidos en la determinación de la capacidad antioxidante por el. BI. O. Q. método DPPH* muestran que hay relación positiva significativa (p = 0.005) entre la. Y. concentración del extracto y el porcentaje de captación de radicales libres, es decir, a. AC. IA. mayor concentración del extracto, hay mayor captación de radicales libres, la capacidad. RM. antioxidante es dependiente de la concentración del extracto, obteniéndose un 95.79 %. FA. de captación de radicales libres a una concentración de 200 ug/mL del extracto. DE. etanólico de Jaltomata ventricosa (Sogorome), porcentaje muy cercano al encontrado. CA. con el estándar de ácido ascórbico a la misma concentración, el cual fue de 97.65 %,. IO. TE. como se muestra en la tabla 03.. BI BL. Aparcana y Villareal (2014) reportan un porcentaje de captación de radicales libres de 82.51 %, 86.86 %, 93.26 % y 100 % para los extractos etanólicos del fruto de aguaymanto provenientes de Cajamarca, Ancash, Junín y Huánuco respectivamente a una concentración de 4 mg/mL determinado por el mismo método. Por otro lado Medina y col (2011) registran 83,44 % de captación de radicales libres para un cultivar de pimiento, determinado por el mismo método, es decir, los resultados obtenidos son cercanos a los obtenidos por otros investigadores para especies de la familia Solanaceae35 ,48. 38. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Kuskoski y col. realizaron la medición de la absorbancia del radical DPPH* a los 30 minutos; sin embargo, considerando que los radicales libres tienen vida media corta, en el presente estudio se midió la absorbancia a los 5 minutos, en concordancia con los trabajos de Lebeau et al, 2000, quienes trabajaron a partir de los 5 minutos y Schwarz et al 2001, a los 10 minutos. Asimismo, Neyra al evaluar la capacidad antioxidante de la manzana, consideró un tiempo de incubación de 8 minutos dado que en la evaluación. IC A. antioxidante de un compuesto, no sólo reviste importancia la estructura química y la. UI M. concentración, sino también el tipo de productos de reacción formados49-51.. O. Q. Si bien es cierto que existen diferentes métodos para evaluar la capacidad antioxidante,. BI. ya sea in vitro o in vivo, los métodos in vitro nos permiten tener una idea aproximada de. IA. Y. lo que ocurre en situaciones complejas in vivo. El método del DPPH* presenta una. AC. excelente estabilidad en ciertas condiciones por presentar un radical libre que puede. FA. RM. obtenerse directamente sin una preparación previa, mientras que otros como el ABTS. DE. tienen que ser generados tras una reacción que puede ser química, enzimática o. CA. electroquímica49.. TE. Se determinó también la cantidad de muestra requerida para reducir en un 50% la. BI BL. IO. concentración de DPPH*, IC50, siendo ésta mayor para el fruto de Jaltomata ventricosa (Sogorome) en comparación con el estándar de ácido ascórbico (Gráfico 03), resultados concordantes con los obtenidos para el porcentaje de captación de radicales libres, que es un tanto más bajo para Jaltomata ventricosa (Sogorome). Esta diferencia puede explicarse considerando que la capacidad antioxidante de una muestra vegetal no viene dado solo por la suma de las capacidades antioxidantes de cada componente, sino que también depende del constituyente que contiene, pudiendo interactuar entre sí, produciéndose efectos sinérgicos o inhibitorios52. 39. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En otros trabajos se reportaron criterios de selección para extractos vegetales con base en el IC50; considerando de alto potencial antioxidante aquellos con valores menores a 30 μg/mL, con moderado potencial ubicados en un rango entre 30 μg/mL y 100 μg/mL y de bajo potencial antioxidante aquellos con un IC50 por encima de 100 μg/mL (Ramos et al., 2003). De acuerdo con estos criterios el extracto del fruto de Jaltomata ventricosa (Sogorome) se consideraría con moderado potencial antioxidante, pues tiene. IC A. un IC50 de 42.51 μg/mL, no encontrándose diferencia estadísticamente significativa en. UI M. comparación con el estándar de ácido ascórbico que tiene un IC50 de 34.75μg/mL (p =. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. 0.91) 53.. 40. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V.. CONCLUSIONES 1.. El fruto fresco de Jaltomata ventricosa (Sogorome) presenta los siguientes fitoconstituyentes: lípidos, triterpenos y esteroides, catequinas, azúcares reductores, compuestos fenólicos, taninos, aminoácidos, flavonoides y antocianidinas, mucílagos y alcaloides cuaternarios.. 2.. El fruto fresco de Jaltomata ventricosa (Sogorome) presenta 319.26 mg. El fruto fresco de Jaltomata ventricosa (Sogorome) presenta 9.23 mg de ácido. UI M. 3.. IC A. equivalentes de ácido gálico por g de muestra.. ascórbico por 100 g de muestra.. Q. El fruto fresco de Jaltomata ventricosa (Sogorome) presenta capacidad. BI. O. 4.. Y. antioxidante frente al 2, 2-difenil-1-picrilhidrazil, a la dosis de 50, 100 y 200. El fruto fresco de Jaltomata ventricosa (Sogorome) presenta capacidad. RM. 5.. AC. IA. ug/mL (p<0,05), llegando a 95.79 % a una concentración de 200 ug/mL.. BI BL. IO. TE. CA. DE. ug/mL respectivamente.. FA. antioxidante similar al estándar de ácido ascórbico con IC50 de 42.51 y 34.75. 41. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Sociedad mexicana de salud pública, A.C. Guía para la estrategia de prevención en temas prioritarios de salud pública: enfermedades crónico-degenerativas. [Internet]. México: Sociedad mexicana de salud pública, A.C. [citado el 5 de marzo de 2014]. Disponible en: http://www.discapacidadonline.com/wpcontent/uploads/2012/06/enfermedades-degenerativas-guia-prevencion-salud-. IC A. publica.pdf. UI M. 2. Ortiz A. Universitam.com [Internet]. [Actualizado el 19 de junio 2010; citado el. O. Q. 5 de marzo de 2014]. Disponible en: http://universitam.com/?p=260. Y. BI. 3. Romero D, Bueno J. Radicales libres del oxígeno y antioxidantes en medicina. AC. IA. (Editorial). Rev Clin Española 1998;184(7):345-6. RM. 4. Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M, Telser J. Free radicals. FA. and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J. DE. Biochem Cell Biol [Internet]. 2007 [citado el 5 de marzo de 2014]; 39(1): 44-84.. TE. CA. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16978905. IO. 5. Moskovitz J, Yim B, Chock B. Free radicals and disease. Arch Biochem. BI BL. Biophys 2002; 397: 354-359. 6. Enfermedades producidas por radicales libres. Scielo Rev. Panam. Salud Pública [Revista on-line] 1997 [citado el 5 de marzo de 2014]; 1 (5). Disponible en: http://www.scielosp.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S102049891997000500010 7. Ray W, Ashall F, Goate A. Molecular pathogenesis of sporadic and familial forms of Alzheimer's disease. Mol Med Today [Internet]. 1998 [citado el 5 de 42. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.