Biodegradation of the Purgeable Fraction of Diesel Fuel under Nitrate Reducing Conditions and the Effect of Surfactant Gaele in Batch and Continuous Upflow Biofilm Reactors-Edición Única

México a

de 20.

INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE

MONTERREY

PRESENTE.-Por medio de la presente hago constar que soy autor y titular de la obra

denominada".

, en los sucesivo LA OBRA, en virtud de lo cual autorizo a el Instituto

Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey (EL INSTITUTO) para que

efectúe la divulgación, publicación, comunicación pública, distribución,

distribución pública y reproducción, así como la digitalización de la misma, con

fines académicos o propios al objeto de EL INSTITUTO, dentro del círculo de la

comunidad del Tecnológico de Monterrey.

El Instituto se compromete a respetar en todo momento mi autoría y a

otorgarme el crédito correspondiente en todas las actividades mencionadas

anteriormente de la obra.

De la misma manera, manifiesto que el contenido académico, literario, la

edición y en general cualquier parte de LA OBRA son de mi entera

responsabilidad, por lo que deslindo a EL INSTITUTO por cualquier violación a

los derechos de autor y/o propiedad intelectual y/o cualquier responsabilidad

relacionada con la OBRA que cometa el suscrito frente a terceros.

Biodegradation of the Purgeable Fraction of Diesel Fuel under

Nitrate Reducing Conditions and the Effect of Surfactant Gaele

in Batch and Continuous Upflow Biofilm Reactors-Edición

Única

Title

Biodegradation of the Purgeable Fraction of Diesel Fuel

under Nitrate Reducing Conditions and the Effect of

Surfactant Gaele in Batch and Continuous Upflow Biofilm

Reactors-Edición Única

Authors

Mixtli Campos Pineda

Affiliation

Tecnológico de Monterrey, Campus Monterrey

Issue Date

2010-12-01

Item type

Tesis

Rights

Open Access

Downloaded

18-Jan-2017 15:42:39

INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS

SUPERIORES DE MONTERREY

CAMPUS MONTERREY

DIVISIÓN DE INGENIERÍA

Y

ARQUITECTURA

PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERIA

BIODEGRADATION OF THE PURGEABLE FRACTION OF DIESEL F U a UNDER NITRATE REDUCING CONDITIONS A N D THE EFFECT OF SURFACTANT GAELE IN BATCH

AND CONTINUOUS UPFLOW BIOFILM REACTORS

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

PRESENTADO

COMO

REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TÍTULO DE

MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN

SISTEMAS AMBIENTALES

POR:

INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY

CAMPUS MONTERREY

DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA

PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA

BIODEGRADATION OF THE PURGEABLE FRACTION OF DIESEL FUEL

UNDER NITRATE REDUCING CONDITIONS AND THE EFFECT OF

SURFACTANT GAELE IN BATCH AND CONTINUOUS UPFLOW BIOFILM

REACTORS

PROYECTO DE I N V E S T I G A C I Ó N PRESENTADO C O M O REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TÍTULO DE MAESTRO EN CIENCIAS C O N ESPECIALIDAD EN SISTEMAS

AMBIENTALES

POR

MIXTLI CAMPOS PINEDA

INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY

CAMPUS MONTERREY

DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA

P R O G R A M A DE G R A D U A D O S EN INGENIERÍA

Los miembros del c o m i t é de tesis recomendamos que la presente tesis

presentada por MIXTLI CAMPOS PINEDA sea a c e p t a d a como requisito parcial

para obtener el grado a c a d é m i c o de Maestro en Ciencias con especialidad en

Sistemas Ambientales

Comité de tesis:

DR. ALBERTO MENDOZA DOMÍNGUEZ

Director del Programa de Maestría en Sistemas Ambientales

M O N T E R R E Y , N.L

I!

DEDICATORY

Πάτερ ημ ών, ό έν τοις  ούρανοΐς ­

άγιασθήτω τό δνομ ά σου, 

έλθέτω ή βασιλεία σου, 

γενηθήτω τό θέλημ α σου, ώς  έν ουρανώ και έπ'ι γης · 

Τον αρτον ημ ών τόν έπιούσιον δός  ήμ ΐν σήμ ερον­

Και αφες  ήμ ΐν τά όφειλήμ ατα ημ ών, 

ώς  και ήμ εΐς  άφήκαμ εν τοις  όφειλέταις  ημ ών· 

Και μ ή ε'ισενέγκης  ήμ ας  εις  πειρασμ όν, 

άλλα ρΟσαι ήμ ας  άπό τοΰ πονηρού· 

Ό τ ι σοΰ έστιν ή βασιλεία και ή δύναμ ις  και ή δόξα εις  τούς  αιώνας  τών αιώνων­

ACKNOWLEDGEMENTS

This research was supported under the auspices of SEP­CONACYT ­82761, CONACYT­ SNI­LIC­

101753, CONACYT­ SNI­91360 research projects, and under the fund of the Cátedra de

Nanomateriales y Materiales Avanzados from ITESM Campus Monterrey CAT 120.

I highly appreciate Dr. Karim Acuna­Askar's advice throughout the course of my research and for

letting me work at the Environmental Bioremediation Research Laboratory. Thank you for your

continuous support and teaching, I had the opportunity to learn about a wide range of subjects,

and to realize the importance of discipline in research.

Dr. Luz Maria Martínez Calderón, for keeping my mind focused on my goals and giving me

perspective in order to continue giving my best. Thanks for everything.

Dr. Marcelo Videa Vargas, for his advice during the project and for letting me work at the

Nanomaterials Laboratory at ITESM. Dr. Roberto Parra Saldivar, for your help and advice during

the project.

Thanks are given to Prof. Dr. Rolando Tijerina Menchaca, M.D., Chairman of the UANL School of

Medicine Department of Microbiology for giving me the opportunity to work at the Regional

Center for the Control of Infectious Diseases and use equipment and facilities to make this work

ABSTRACT

Diesel is a product of the medium fraction of the refining process of petroleum, which 

encompasses a mixture of linear and cyclic paraffins, aromatic compounds and hydrocarbons 

with chain lengths that range from 10 to 28 carbons. Followed by gasoline, diesel fuel (PEMEX 

diesel) is the most sold petroleum fuel with sales of nearly 300,000 tons monthly and a 

production of nearly 246,000 barrels per day (SENER; 2010). Contamination of soil and water 

bodies with diesel fuel can occur due to spills and leaks from underground tanks, representing a 

significant problem since several diesel components are considered carcinogenic and toxic for 

the environment (Health Protection Agency UK; 2007). Therefore, it becomes a necessity to 

implement methods to promote intrinsic remediation of the impacted sites or to apply 

technologies to accelerate cleanup processes through the use of exogenous mechanisms 

involving equipment and instrumentation. Biological reactors are widely known for enhancing 

the removal of contaminants up to a certain degree, where microbial populations are capable of 

cleaving chemical bonds, and therefore modifying chemical structures. Although there are 

previous diesel degradation studies with biological reactors (Boopathy; 2000), this work studied 

diesel biodegradation with a biofilm reactor under nitrate­reducing conditions, using volcanic 

and alluvial stones as packing medium, thus providing a more cost­effective alternative for 

bioremediation of impacted sites. In the present project batch and continuous upflow packed 

bed reactor (CPR) studies were conducted to evaluate the biodegradation of the purgeable 

fraction of diesel fuel under nitrate­reducing conditions by using both biphasic pseudo­first 

order (BPF) and Arvin's kinetic models. The evaluation of the BPF at a diesel concentration of 30 

mg/L recorded the highest first phase rate of 0.20 h­1

 and 82% removal for the whole range of 

diesel (WRD) hydrocarbons with GAELE, and was up to 5­fold higher than without GAELE in 

batch assays. A 6­month CPR study recorded BPF rates 0.175­0.412 h­1

retention times (HRTs) of 1.5­3.0 hour at diesel concentrations between 50 and 70 mg/L and 

showed up to 95.8% WRD removal at the shorter HRT with GAELE. Without GAELE, effluent ORP 

ranged below zero and increased above zero with GAELE. The 12­month steady­state CPR study 

was run at an HRT of 0.5 hour and involved a 3­level diesel concentration range: low, medium, 

and high, with and without GAELE. At the 3­level diesel concentration ranges, with and without 

GAELE, the BPF model did not record significant differences on the WRD rate constants. In 

addition, for the C10­C18 and C20­C22 hydrocarbon ranges, the BPF model recorded slight 

differences only at the medium­range diesel concentration when GAELE was added and failed to 

record the effect of GAELE at the low­ and high­range diesel concentrations. In contrast, Arvin's 

model recorded an increase on the WRD overall rates of 2.2­, 2.3­ and 1.5­fold higher at the low­

, medium­ and high­range diesel concentrations when GAELE was added. Furthermore, Arvin's 

model recorded an increase on the rates of the C10­C18 range of 1.2­, 3.3­ and 2.5­fold for the 

low­, medium­ and high­range diesel concentrations with the addition of GAELE. Interestingly, 

the increase on Arvin's model rates of the C20­C22 range recorded 9.6­, 1.8­ and 1.2­fold higher 

when GAELE was added to the low­, medium­ and high­range diesel concentrations, 

respectively. As for the C10­C18, Arvin's maximum utilization rates recorded an increase of 1.8­, 

1.9­ and 2.3­fold at the low­, medium­ and high­range diesel concentrations when GAELE was 

added to the assays. Noteworthy, the addition of GAELE increased Arvin's maximum utilization 

rates of C20­C22 by 36.1­, 1.4­ and 1.8­fold for the low­, medium­ and high­range diesel 

concentrations, respectively. Among the bacteria identified were the following: Pseudomonas

aeruginosa, Pseudomonas stutzeri, Burkholderia cepacia, Achromobacter xylosoxidans,

Citrobacter freundii and Ralstonia picketti. In batch studies ORP and DO ranged from 126 mV 

and 6.9 mg/L at the start of the assays to ­130 mV and 0.0 mg/L at the end. In CPR studies ORP 

effluent. BOD5 removals ranged 96.1­73.1% from the lowest to the highest diesel concentrations 

without GAELE, and increased from 98.1 to 90.8% with GAELE. On the other hand, COD removals 

ranged 92.9­41.6% from the lowest to the highest diesel concentrations in the absence of 

GAELE, and increased from 94.7 to 80.7% in the presence of GAELE. GAELE also contributed to 

TABLE OF CONTENTS

DEDICATORY Ill

ACKNOWLEDGEMENTS IV

ABSTRACT V

TABLE OF CONTENTS VIII

INDEX OF FIGURES XI

INDEX OF TABLES XI

CHAPTER I. INTRODUCTION 1

1.1 DIESEL: COMPOSITION AND ENVIRONMENTAL IMPACT 1 

1.1.1 Toxicity of diesel components 3

1.1.2 Normativity on Maximum Contaminant Levels (MCLs) of Total Petroleum

Hydrocarbons (TPHs) and on those pertaining to diesel 4

1.2 PROJECT OBJECTIVES 6 

1.3 SCIENTIFIC CONTRIBUTION 7 

CHAPTER II. THEORETICAL BACKGROUND 9

2.1 BIODEGRADATION 9 

2.1.1 Biological reactors 9

2.1.2 Batch reactors 11

2.1.3 Continuous-flow biodegradation 11

2.3 SAMPLE INJECTION METHODS  1 9 

2.4 METHOD OF DIESEL QUANTIFICATION  2 0 

CHAPTER III. EXPERIMENTAL PROCEDURE 21

3.1 CHEMICALS AND CULTURE CONDITIONS  2 1 

3.2 BACTERIAL SEED PREPARATION  2 1 

3.3 DESIGN OF BATCH BIOASSAYS  2 2 

3.4 STERILIZATION OF SOIL, HETEROTROPHIC PLATE COUNT AND SONICATION  2 3 

3.5 DETERMINATION OF ENVIRONMENTAL PARAMETERS AND ANALYSIS OF DIESEL  2 4 

3.6 VAPOR­LIQUID PHASE PARTITION COEFFICIENT CURVE OF DIESEL  2 5 

3.7 CONTINUOUS­FLOW BIOFILM REACTOR OPERATION  2 6 

3.8 ANALYTICAL DETERMINATION DESIGN FOR CONTINUOUS­FLOW  2 9 

3.9 NITRATE REDUCTION TEST  2 9 

3 . 1 0 CRITICAL MICELLE CONCENTRATION  ( C M C )  3 0 

3 . 1 1 EVALUATION OF BIPHASIC PSEUDO­FIRST ORDER MODEL  3 1 

3 . 1 2 EVALUATION OF ARVIN'S MODEL  3 1 

3 . 1 3 ISOLATION AND IDENTIFICATION OF DIESEL­DEGRADING BACTERIA  3 3 

3 . 1 4 PREDOMINANCE ASSAYS  3 5 

CHAPTER IV. RESULTS AND DISCUSSION 36

4.1 VALIDATION OF THE ANALYTIC METHOD  3 6 

4.2 BATCH KINETICS  3 6 

4.3 CONTINUOUS­FLOW KINETICS AFTER 6 MONTHS OF BIOFILM GROWTH  4 0 

4.4 CONTINUOUS­FLOW KINETICS AFTER  1 2 MONTHS OF BIOFILM GROWTH  4 5 

4.6 BACTERIAL IDENTIFICATION IN CONTINUOUS FLOW ASSAYS 53 

4.7 BIOREACTOR INFLUENT AND EFFLUENT  B O D / C O D RATIOS 55 

4.8 STATISTICAL ANALYSIS FOR ARVIN'S MODEL 57 

4.9 STATISTICAL ANALYSIS FOR THE BIPHASIC PSEUDO­FIRST ORDER MODEL 59 

CHAPTER V. CONCLUSIONS 62

REFERENCES 67

APPENDIX A 76

APPENDIX B 79

APPENDIX C 80

APPENDIX D 81

APPENDIX E 81

INDEX OF FIGURES

Figure 2. Typical chromatogram of diesel fuel 19 

Figure 3. Continuous up flow biofilm reactor installed for kinetic assays 28 

Figure 6. Biodegradation kinetics of the purgeable fraction of diesel 41 

Figure 7. Maximum utilization rates 51 

Figure 8. Partial vapor pressures of the purgeable fraction of diesel resulting from substrate 

concentrations at biofilm reactor sampling points 53 

Figure 10. Example of chromatogram of diesel fuel obtained by purge and trap injection 76 

Figure 11. Direct injection of Diesel Range Organics (DRO) 76 

Figure 12. Chromatogram of DRO analyzed with purge and trap injection 77 

Figure 13. Chromatogram of the direct injection of diesel fuel 77 

Figure 14. Calibration curve for the method detection limit of diesel in aqueous samples 78 

Figure 15. Calibration curve for the detection limit of diesel in the vapor phase 78 

INDEX OF TABLES

Table 1. Diesel composition in mass percentage 2 

Table 2. Effects of several diesel components on human health 4 

Table 3. Maximum contaminant levels established in the U.S. and Mexico for some chemicals.. 5 

Table 4. Mexican norms involving regulatory levels for different types of hydrocarbons, including 

diesel 5 

Table 5. Maximum Contaminant Levels for hydrocarbon fractions of petroleum 6 

Table 6. Different types of biological reactors that have been used for biodegradation 10 

Table 8. Types of microbial supports used for biofilm growth. Taken from different sources 13 

Table 9. Microaerophilic degradation of the purgeable fraction of diesel in batch assays 38 

Table 10. Diesel removal conditions in the biofilm reactor at 6­month period of biofilm growth 

for various HRTs 43 

Table 11. Diesel removal conditions in the biofilm reactor at 12­month steady­state maturation 

period at a fixed HRT of 0.5 h 49 

Table 12. Identification of bacteria and microbial population predominance 55 

Table 13. BOD and COD removal percentages at various diesel concentrations 56 

Table 14. Two­way ANOVA results for Arvin's overall biodegradation constants 83 

Table 15. Two­way ANOVA results for Arvin's biodegradation constants of hydrocarbon chain 

length range C10­C18 83 

Table 16. Two­way ANOVA results for Arvin's biodegradation constants of hydrocarbon chain 

length range C20­C22 83 

Table 17. Two­way ANOVA results for the bipashic pseudo­first order overall biodegradation 

constants 84 

Table 18. Two­way ANOVA results for the biphasic pseudo­first order constants of hydrocarbon 

chain length range C10­C18 84 

Table 19. Two­way ANOVA results for the biphasic pseudo­first order constants of hydrocarbon 

chain length range C20­C22 84 

Table 20. Two­way ANOVA results for Arvin's overall maximum utilization rate 85 

Table 21. Two­way ANOVA results for Arvin's maximum utilization rate of hydrocarbon chain 

length range C10­C18 85 

Table 22. Two­way ANOVA results for Arvin's maximum utilization rate of hydrocarbon chain 

CHAPTER I. INTRODUCTION

One of the main causes of water and soil contamination is the release of petroleum­derived 

hydrocarbons into the environment; particularly, automotive diesel that has higher toxicity than 

petroleum in almost every environment. Remediation technologies developed to clean 

impacted sites with contaminants coming from fuel diesel include physical and chemical 

methods such as filtration and combustion, which has a high demand for energy, and biological 

methods, like bioremediation which represents the most cost­effective solution. Therefore, 

understanding the capabilities of biodegradation under specific conditions becomes necessary 

for the design of efficient remediation technologies. Examples of these key conditions that 

maximize the efficiency of bioremediation are the type of biological reactor, identification and 

selection of contaminant degrading bacteria consortium, the kinetic parameters of pollutant 

removal, the oxidative nature of the media and the effect of additives that favor the substrate 

availability. The present project focuses on the study of the above mentioned conditions to 

biodegrade diesel using a specific biological reactor under nitrate reducing conditions. 

The study of biodegradation of diesel requires the knowledge of diesel composition and 

the recognition of its toxicity since it plays a fundamental role in understanding the 

environmental impact of this source of contamination. All of these concepts and the normativity 

established by the environmental protection agencies regardless the permit limits of diesel as 

well as the general and specific objectives of the present work will be mentioned in this chapter. 

1.1 Diesel: composition and environmental impact

Petroleum derivatives are classified according to petroleum's distillation fraction during the 

refining process: the heavy fraction, the middle fraction and is composed by a mixture of 

C10­C28. The composition of a diesel fuel has been reported by Álvarez­Cuenca et al. (2006), as 

shown on Table 1. This composition makes diesel fuel comparable to gasoline; nevertheless, 

diesel fuel has a higher proportion of linear and cyclic paraffins, and a much lower presence of 

aromatic hydrocarbons. Diesel fuel is composed of hydrocarbons with a number of carbons in 

the 10 ­28 range, resulting in a high heterogeneity. As previously noted, demand of diesel has 

increased due to the increment in the number of vehicles that require this fuel. After gasoline, 

diesel (PEMEX diesel) is the highest sold fossil fuel, with sales close to the 300,000 metric tons 

per month and a production of 246,000 barrels per day in the first quarter of 2010 (SENER). 

Table 1. Diesel composition in mass percentage. Edited from Álvarez­Cuenca et al. (2006). 

Diesel contamination of sites such as soil or underground water represents a serious problem 

due to the toxicity of several components of diesel. Even though diesel has, similarly to gasoline, 

a small fraction of a group of hydrocarbons known as BTEX (benzene, toluene, ethylbenzene and 

xylene), this fraction has been shown to hace damaging effects to human health (Kao, et al.; 

2001). In addition, paraffins and olefins represent most of diesel hydrocarbon composition, 

Diesel component  Mass % 

Paraffins  39.7 

Cyclic paraffins  50.8 

Alkyl­benzenes  3.2 

Indanes and tetralines  0.8 

Indenes  0.1 

Alkyl­naphtalenes  1.6 

Acenaphtenes and biphenyls  2.2 

which cause a decrease on water quality and renders it inadequate for any use (Álvarez­Cuenca 

et al.; 2006). 

Leaks in underground fuel storage tanks are the main source of the diesel that is present 

in underground water (Eriksson & Hallbeck; 2006). Leaks and spills originating from these tanks 

represent a great contribution to the availability of petroleum hydrocarbons in the environment. 

Furthermore, diesel components are readily transported from soil into underground water 

reservours by leaching. Thus, water bodies have a risk of being contaminated by diesel 

hydrocarbons, posing a potential risk to human heatlh. The US Environmental Protection Agency 

reported in 1990 that around 100,000 leaks from underground petroleum fuel storage tanks 

were detected (Britto et al.; 1996). This renders diesel fuel as an environmental contaminant, 

which has the potential to pollute great amounts of underground water. Considering that 30% 

of the population of the United States uses underground water as source of drinking water 

(Hartley et al.; 1999) and that, in the case of Mexico, this number reaches 70% (Morales et al.; 

IMP), the problem of diesel contamination of water bodies due leaks and filtrations becomes an 

important issue that must be addressed. 

1.1.1 Toxicity of diesel components

Diesel components, such as policyclcic aromatic hydrocarbons (PAH), representing 10% of total 

diesel components, have been classified as carcinogenic by the Agency of Toxic Substances and 

Disease Registry (1995). Furthermore, the USEPA (2009) has identified that several diesel 

components have a toxic effect on the central nervous system. Thus, ingestion of disel 

contaminated water has the potential to casue from headaches and allucinations, to inhability 

The BTEX group corresponds only to nearly less than 5% of diesel components, have high 

solubility in water (up to 1,700 mg/L), thus increaseng their potential of being present in water 

bodies. Further, these components are widely know for their toxicity and are strictly regulated in 

several countries. Benzene has been the component of most interest due to its great 

carcinogenic potential, while the other substances present different levels of toxicity. Different 

effects on human health caused by some components of diesel are shown in Table 2, according 

to the USEPA. In addition, Coulon et al. (2005) have observed that diesel presents a higher 

toxicity than crude petroleum in almost every environment, suggesting further studies on the 

toxicity of diesel should be conducted, since fewer studies have been published as compared to 

those pertaining to the toxicity of gasoline components. 

Table 2. Effects of several diesel components on human health. Edited from USEPA (2009). 

1.1.2 Normativity on Maximum Contaminant Levels (MCLs) of Total Petroleum

Hydrocarbons (TPHs) and on those pertaining to diesel.

As shown in TABLE 3, there are several MCLs for some of diesel components in water in the US 

and Mexico. The US EPA has published the MCL's to regulate BTEX contamination. The 

Association for Environmental Health and Safety (2009) has also published recommendations to 

regulate contamination by hydrocarbons within the chain lengths C1 0­C2 0. In the case of Mexico, 

Substance  Potencial effect on human health  Benzene  Anemia, cancer in the form of leukemia  Toluene  Damage to nervous sistem, kidneys and lungs 

federal regulations for hydrocarbons with carbon numbers in the range of 10­20 do not exist, 

and regulatory levels have been established only for soil. 

Table 3. Maximum contaminant levels established in the U.S. and Mexico for some chemicals  present in diesel.  Edited from USEPA (1997, 2009) and Hartley et al. (1999) 

Substance  Permissible level in the USA  Permissible level in Mexico 

(mg/L)  (mg/L) 

Benzene  0.005  0.01 

Toluene  1  0.3 

Xylene  10  0.5 

Ethylbenzene  0.7  0.7 

Cio —

 C20 HCs  0.42  Not avaible 

Table 4 presents Mexican regulations involved in establishing the composition and  characteristics of water for different beneficial uses, as well as the MCL's for hydrocarbons in  different soils and specifications for their characterization and remediation. A brief description  of each norm is presented as well. Table 5 shows the MCL's different petroleum distillation  fractions (diesel corresponds to the medium fraction as mentioned above) for each type of soil  use. 

Table 4. Mexican norms involving regulatory levels for different types of hydrocarbons, including diesel. 

Table 5. Maximum Contaminant Levels for hydrocarbon fractions of petroleum according  to soil use in Mexico. Edited from DOF Diario Oficial de la Federacion (2003). 

It becomes evident that remediating contaminated soil or water bodies is necessary not only to 

comply with enforceable environmental regulations and meet maximum contaminant limit 

goals, but also to prevent further contamination of water bodies, either groundwater or 

downstream the contaminant plumes. In doing so, the quality of water bodies and human 

health can be preserved as well. Several remediation techniques exist that can be applied to 

remove diesel, among them biodegradation methods offer the most cost­effective. 

1.2 Project objectives

The main objective of this research is to evaluate the biodegradation kinetic constants of diesel 

in batch and continuous upflow biofilm reactors under nitrate­reducing conditions at different 

hydraulic retention times and determine the effect of anionic surfactant GAELE on diesel 

removal and biodegradation kinetic rates. 

In order to achieve the necessary conditions for the kinetic assays, and to succesfully apply the 

kinetic models, it was necessary to accomplish the followig specific objectives: 

Hydrocarbon fraction Soil use

(mg/kg dry weight)

Agriculture Residential Industrial

Light  200  200  500 

Medium  1,200  1,200  5,000 

1. Implement an analytic procedure for the quantification of diesel­range organic (DRO) 

hydrocarbons in aqueous samples using gas chromatography. 

2. Install and operate a continuous upflow reactor using a mixture of volcanic and alluvial 

stones, as microbial support, in order to grow a biofilm adapted to diesel degradation 

and confirm nitrate­reducing capabilities of batch and continuous­flow reactors. 

3. Isolate and identify Gram­negative bacterial populations adapted to diesel degradation 

in batch and continuous­flow biofilm reactors, using a bacterial identification 

biochemical system with confirmation by DNA extraction. 

4. Determine the cell mass concentration in batch and continuous­flow reactors in terms 

of volatile suspended solids (VSS). 

5. Evaluate diesel biodegradation kinetic rate constants under nitrate­reducing conditions 

in batch and continuous­flow reactor inoculated with 6­ and 12­month adaptation 

period biofilm. 

6. Determine the vapor pressure of the purgeable diesel components according to their 

respective concentration in the liquid phase for each bioreactor sampling point in the 

presence and absence of sufactant GAELE. 

7. Determine the effect of surfactant GAELE on diesel biodegradation. 

8. Determine the efficiencey of the reactor on diesel hydrocarbon removal by measuring 

COD and BOD5 at three different concentrations with and without GAELE. 

1.3 Scientific contribution

The present study evaluated a biphasic kinetic model not previously published for diesel 

biodegradation using a batch reactor. This model indicates the capabilities of a batch design to 

degrade diesel under nitrate­reducing conditions. In addition, a continuous­flow biofilm reactor 

surface area which stimulated an effective biofilm growth and biofilm attachment. Then, the 

continuos­flow biofilm design allowed the use of short hydraulic retention times, useful for non­

recalcitrant substrates. 

Two kinetic models, biphasic and Arvin's model, not previously published for diesel degradation 

in a continuous­flow biofilm reactor were evaluated. A comparison between the kinetic 

constants obtained from two different models and their applicability in biofilm performance 

analysis. An analysis of the bacterial consortium for each biofilm reactor segment comprising 

Gram­negative bacterial identification, biofilm growth determination and biomass calculation, in 

terms of VSS, is also presented. 

It is noteworthy to add that this study implemented a complete methodology for the evaluation 

of the treatability of diesel fuel in aqueous matrix. Factors that become relevant when working 

with a multisubstrate mixture such as centroid molar volume, diffusion in the bulk liquid and 

into the biofilm, volatilization and secondary­substrate uptake were taken into consideration. 

Therefore, the methodology developed has a high potential for scaling and application in 

CHAPTER II. THEORETICAL BACKGROUND

Automotive diesel is a complex mixture of volatile and semivolatile chemical compounds that 

include linear and branched hydrocarbons often reported as recalcitrant contaminants of soil 

and water bodies. To understand and propose bioremediation actions the fundamental 

concepts such as biodegradation, continuous upflow biofilm reactors and gas chromatography 

as a technique to quantify diesel are introduced in this chapter. 

2.1 Biodegradation

Biodegradation is a process that focuses on the removal of chemical compounds, through its 

decomposition or transformation, by using organisms. This process can occur thanks to the 

enzymatic capabilities of organisms, allowing metabolization of chemicals and convert them into 

biomass, and some other inocuous products such as water and carbon dioxide. This process is 

termed bioremediation, and requieres the use of biological reactors. 

2.1.1 Biological reactors

Remediation requires an in­depth assessment of the physical­chemical properties of 

contaminants as well as the characterization of the surrounding environment site to be treated. 

This would include either an evaluation on the potential of indigenous biological constituents to 

promote intrinsic remediation on the impacted site or applying technologies to accelerate 

cleanup processes through exogenous mechanisms involving equipment and instrumentation. 

Biological reactors are widely known to enhancing the removal of contaminants up to a certain 

degree in batch cultures, where microbial populations are capable of cleaving chemical bonds, 

and therefore modifying chemical structures, while growing prior to reach the stationary phase. 

Table 6 shows different types of biological reactor that have been used to degrade 

hydrocarbons. This work will focus on batch and continuous up flow biofilm reactors for 

biodegradation studies. 

Figure 1. General diagram of a biological reactor. A biological reactor has three important characteristics:  type of reactor, microbial support (if used) and type of surfactant (if used). 

Table 6. Different types of biological reactors used for biodegradation. Edited from multiple sources 

Reactor type  Reference 

Batch  Marquez­Rocha et al. Water, Air and Soil Pollution., (2001) 

Aerobic Submerged Filter (ASF)  Morgan­Sagastume et al. Bioresource Technology., (2008) 

Sequential Soil Column System  Nay et al. Biodegradation, (1999) 

Upflow Anaerobic Sludge Blanket  Fang et al. J. Environ. Eng. Sci., (1997)  Reactor (UASBR) 

Pseudo­Continuous Flow  Britto et al. Water, Air and Soil Pollution., (1996)  Bioreactor 

Microcosmos  Mohn et al. So/7 Biology & Biochemistry., (2000) 

Fluidized Bed Reactor (FBR)  Arrar et al. Biochemical Engineering Journal., (2007) 

Continuous Stirred Tank Reactor  Geerdink et al. Biodegradation, (1996) 

2.1.2 Batch reactors

Batch bioassays are a useful means to depict the response of substrates to a certain microbial 

culture. Studies reported have shown that in many instances, however, low degradation rate 

constants are obtained regardless the microbial source, either a consortium as in this work, or a 

pure culture as in the degradation of diesel by Pseudomonas fluorescens, where a first­order 

kinetic constant of 0.0306 d"1

 was reported (Sepic et al., 1996). Therefore, it is necessary to 

develop experimental designs to attain high­performance cost­effective degradation rates as 

posed by continuous­flow biofilm assays. 

2.1.3 Continuous-flow biodegradation

For continuous­flow reactors designed to grow biofilms, substrate concentrations in the bulk 

above the minimum concentration to allow growth would maintain a steady­state monolayer 

formation which is critical for the operation of biofilm reactors allowing significant thickness of 

the microbial film and thus, a suitable substrate flux under steady­state kinetic conditions 

(Rittman and McCarty, 1978; 1980a). Due to the lifespan of the biofilm, the thickness can 

decline rapidly as the concentration of a single energy­supplying substrate decreases in the bulk 

liquid (Rittman and McCarty, 1980b), therefore it is important to assess the sustainability, in 

particular the maintenance energy rates of a multilayer biofilm that is supplied by complex 

mixtures of substrates as well as the possibility to evaluate the maximum utilization rate of 

multisubstrate consumption by kinetic configurations deserves to be explored. In addition, 

studies on biofilm kinetics have shown that mass transport and molecular diffusivity should be 

included in the mathematical models (Hartmann, 1967; Williamson and McCarty, 1976a). It is 

predicting the flux of a single rate­limiting substrate (Rittman and McCarty, 1981), further 

challenges arise in modeling the kinetics of a complex mixture, where several substrates come 

forth not only into the bulk liquid at different concentrations and structural bioavailability, but 

also have low volatility which would cause to partition into the vapor­liquid phases. Modeling of 

secondary utilization holds some constraints, especially for cases where biofilm growth is 

established by the utilization of the primary substrate. However, the biofilm mass produced by 

the primary substrate can be coupled with the individual concentrations of secondary substrates 

to determine their maximum specific substrate utilization rates and their half­velocity rates in 

continuous­flow column studies at short­ and long­term reactor operation (Bouwer and 

McCarty, 1985; Williamson and McCarty, 1976b). This work presents a comprehensive study on 

up flow biofilm degradation kinetics of long and short chain hydrocarbons at varying diesel 

concentrations with and without the presence of a surfactant. 

2.2.3.1 Surfactants 

Diesel fuel has low solubility in water; therefore, studies to assess the effect of different 

surfactants on diesel biodegradation have been man. For example, Franzetti et al. have studied 

the effect of Tween and Brij surfactants under different conditions, obtaining and increase in 

biodegradation in closed Erlenmeyer flask and in an aerobic stirred batch slurry reactor, but 

without using a kinetic model or determining kinetic constants (Franzetti et al. 2008). Several 

surfactants used for diesel degradation are shown in Table 7. This work was carried by modeling 

the effect of the anionic surfactant GAELE on the biodegradation kinetic rates of diesel, it was 

considered to use relatively high initial mass per liter ratios as to reach 24 mg/L and a range of 

2.2.3.2 Microbial supports 

For the case of biofilms, the use of microbial supports allows for the growth of a microbial 

biofilm, required for an effective biodegradation. Supports with high surface area are 

recommended, as they can support a greater amount of biomass. Table 8 shows different 

supports used for biodegradation of hydrocarbons. High surface area supports, however, have 

the risk of wash­out at short hydraulic retention times (HRT). Therefore, this work uses volcanic 

stone (tezontle) and alluvial stone in order to create a packed bed as microbial support, which 

allows the use of short HRTs. 

Table 8. Types of microbial supports used for biofilm growth. Taken from different sources. 

Table 7. Types of surfactants used for diesel biodegradation. Edited from several works. 

Surfactant  Reference 

Rhamnolipids  Owsianiak et al. Bioresource Technology., (2009) 

Surfactin  Whang et al. Journal of Hazardous Materials, (2008) 

Tween (sorbitan derivatives)  Franzetti et al. Journal of Hazardous Materials., (2008) 

Brij (poli­alkyl ethoxylates)  Franzetti et al. Journal of Hazardous Materials., (2008) 

Microbial supports  Reference 

Activated carbon  Alvarez­Cuenca et al. Bioprocess Biosyst. Eng., (2006) 

Soil (sand)  Nay et al. Biodegradation, (1999) 

Volcanic stone  Morgan­Sagastume et al. Bioresource Technology., (2008) 

No support  Marquez­Rocha et al. Water, Air and Soil Pollution., (2001) 

2.2.3.3 Extraction of volatile and semivolatile hydrocarbons 

Automotive diesel is a complex mixture of volatile and semivolatile hydrocarbons. Semivolatile 

hydrocarbons are not readily extracted by the purge and trap sample concentrator system, not 

injection into the gas chromatograph (GC). Therefore, a sound approach would presume the 

extraction of the semivolatile fraction of diesel in aqueous samples by using a liquid­liquid 

extraction procedure with an organic solvent followed by sample concentration. However, a 

liquid­liquid extraction procedure would involve injecting samples directly into the GC injector. 

In our case this imposes a burden on two sides. On the one side, the analysis of diesel as a 

substrate by direct injection would increase the method detection limit (MDL) and therefore the 

minimum detectable mass in the liquid samples would rise. We found the MDL of diesel in liquid 

samples to be at 8.4 mg/L when using hexane as the organic solvent. On the other side, 

concentrations near the MDL supplied into our laboratory­scale bioreactor would impose an 

extremely high metabolic stress to the biofilm microbial communities as a result of exceeding 

reactor design capabilities. In addition, the partition of volatile components of diesel into the 

vapor phase has to be taken into consideration, in order to assess the potential of these 

components for increasing vapor pressure and thus affecting biological reactor design. 

2.2.3.4 Vapor­liquid phase thermodynamics 

An introductory approach to the complexity of the vapor­liquid phase equilibrium involved with 

a solution of small amounts of diesel in water would need to consider the system as an ideal­

dilute solution, where the vapor pressures of diesel and water play an important role. For the 

water as the solvent, its contribution to the total vapor pressure would follow Raoult's law with 

a linear relation where the slope is given by the vapor pressure of water in its pure form. 

Although diesel is a complex mixture of hydrophobic components, it would be desirable to 

picture the whole mixture as a single component for the purpose of calculating the mass of 

diesel that would escape from the liquid into the vapor phase and which may not be available 

total vapor pressure of the solution would follow Henry's law with a linear relation where the 

slope is given by the Henry's law constant (H) as a function of ydfd (Sedlbauer et. al., 2002), 

where yd is the activity coefficient. For hydrocarbons that are sparingly soluble in water yd can 

be replaced by its value at saturation solubility in water (yd*), which is also given by the 

reciprocal of the solute molar fraction at the saturation point (l/xd*), therefore H=/d/xd*. Based 

on the reported solubility of diesel in water, ranging 0.2 ­ 5 mg/L (UNEP, 1996), the molar 

fraction of diesel (MW = 233.3 g/mole) at the saturation point would range from 1.54 x 10"8

 to 

3.86 x 10"7

. In this paper, the initial mass per liter ratio used for the batch kinetics was nearly 6 

times whereas for the continuous­flow experiments ranged 10 ­ 224 times the solubility. These 

initial diesel concentrations would give rise to molar fractions of 1.85 x 10"6

 for the batch kinetics 

and 2.46 x  1 0s

 ­ 1.96 x 10"4

 for the continuous­flow assays. Although these molar fractions were 

higher than the saturation solubility, a vigorous mixing as well as micellization may have 

enhanced homogeneity to assume dilute solution conditions. With this consideration, a mass 

balance evaluation of substrate throughout of the bioiflm reactor can be constructed, in order 

to assess the phenomena occurring during biodegradation. 

2.2.3.5 Mass balance throughout the continuous­flow biofilm reactor 

It can be assumed that, at the influent point of the biofilm reactor, the constituents of diesel 

would partition into both vapor and liquid phases and that, throughout the biofilm, the mass of 

those constituents that make up diesel a whole substrate may split into the removed and non­

removed fractions of the substrate between biofilm sampling points. The removed diesel 

fraction of the substrate as a whole may contain mass substrate from both the vapor and liquid 

phases. In addition, for the particular case of hydrocarbons that are sparingly soluble in water 

lower segments of the reactor biofilm would partition into the vapor phase that would flow 

upwards through upper segments of the reactor. In contrast, the remaining fractions of the 

substrate in the liquid phase may be uptaken by the biota between upper and lower biofilm 

segments of the reactor. The fractions of the substrate in the vapor phase flowing upwards 

through the reactor can either be degraded or continue flowing free by convective movement 

through upper biofilm segments in the reactor. It can also be assumed that the total vapor 

phase of the substrate found at the headspace, and which would ultimately be released at the 

effluent sampling point, could be originated from: a) the non­degraded vapor mass of the 

substrate at the influent and b) the vapor mass coming off from the non­removed mass fraction 

of the substrate in the liquid phase between lower and upper reactor biofilm segments. For the 

equations, two assumptions can be undertaken. A mass balance simulation might consider the 

upflow of the substrate constituents following a semi­compartmentalized model of removal 

segments between the column sampling points. Other assumption would bring forward the 

inference that at the effluent headspace, under steady­state conditions, at any hydraulic 

retention time, keeping the pressure constant, the change of substrate removal in the vapor 

phase versus time equals zero. Thus, at headspace: (dSr/dt)P =0. At the reactor entrance point, 

the total influent substrate concentration would partition into the liquid and vapor phases as 

follows: 

The difference of substrate concentrations between upper and lower sampling points would 

$n - (S„!.u Sn-\Lu ) +

(SnLr Sn~U.r ) + nViu ~ ^n-Wiu )

 + _nV

lr ~ ^n-Wir ) + i^nVu ~ S„-\Vu ) +

(S

- S

_

. )

At the effluent vapor chamber headspace sampling point, the total concentration of substrate in 

the vapor phase would be given by the following expression: 

Where: 

S= Substrate concentration 

n = number of sampling point 

S t h v u = Substrate concentration in the unremoved fraction of vapor phase at headspace 

Sgviu = Substrate concentration of the fraction of vapor phase released from the influent 

point that freely reached the headspace. 

S8 V u = Substrate concentration of the unremoved vapor phase residuals released by the 

last biofilm segment. 

T, = total substrate concentration at the influent 

Vi r = removed fraction of vapor phase released from the influent point 

Vi u = unremoved fraction of vapor phase released from the influent point flowing free 

throughout the reactor 

Lr = removed fraction of liquid phase between sampling points 

Vr = removed fraction of the vapor phase released by the liquid phase flowing upwards 

through the reactor. 

Lu = unremoved fraction of liquid phase between sampling points 

2.2 Use of gas chromatography to quantify diesel

Different methods of diesel hydrocarbon quantification exist. Nevertheless, as diesel 

components have different properties, chromatography methos present a simple and precise 

alternative to quantify diesel hydrocarbons with high leves of precission and efficiency. Due to 

the nature of chromatographic analysis, diesel components can be identified individually in such 

a way that an indiviual analysis of components or hydrogarbon chain length ranges or an 

analysis of diesel as a whole can be performed (Pavlova & Iranova; 2003). As for the case of gas 

chromatography, there exist different mechanisms to detect diesel components once separated. 

Among the different types of detectors, the ones used for detection of diesel hydrocarbons are 

mass spectrometry (GC­MS) and flame ionization detection (GC­FID) (Pavlova & Iranova; 2003). 

Even though mass spectrometry detection offers a high detection level, flame ionizaiton 

detection provides a less expensive alternative, while providing an efficient quatitative analysis 

in a wide range of concentrations. Figure 2 shows a characteristic chromatogram for diesel 

(Sepic et al.; 1996). Peaks corresponding to paraffins are more notorious, as they comprehend a 

higher mass percentage, their retention time varyng according to their size. Depending on the 

chromatographic parameters used a bump may show, indicating an unresolved hydrocarbon 

Figure 2. Typical chromatogram of diesel fuel. The numbered peaks represent several linear  hydrocarbons, while the bump corresponds to an unresolved hydrocarbon mixture. Edited from Sepic et  al. (1996). 

2.3 Sample injection methods

There are two methods for sample injection, direct injection and purge and trap injection. Direct 

injection methods consist on taking a diesel sample, being it in the liquid or vapor phase, and 

injecting it directly into the gas cromatograph. In contrast, the purge and trap method consists 

on injecting an aqueous diesel sample in a container that is purged with an inert gas for a set 

time, purging the gaseous phase with the volatile components from the sample. This phase is 

then adsorbed on a trap, desorbing later at a wide range of temperatures in order to 

concentrate the sample and transfer the analytes to the chromatograph capillary column 

(Grindstaff, Guia Tecnica Restek).

The use of a purge and trap system enhances the detection of purgeable diesel components 

(Grindstaff, Guia Tecnica Restek), but hinders the detection of non purgeable diesel components 

due to the fact that nonvolatile components will no be purged and thus, will not be shown on 

the chromatogram. Due to the fact that it is expected the decline of some chromatogram peaks 

and the appearance of some other peaks (which could represente the production of 

intermediate metabolites), a method that increases precision and enhances the detection limit 

of diesel components is preferred, in order to concentrate samples and inject them effciently. 

2.4 Method of diesel quantification

While analysis and quantification of single substrates with chromatography methods require 

peak identificaction, diesel fuel comprises a wide range of components which have different 

retention times and cannot be fully resolved. Therefore, USEPA recommends quantifying diesel 

fuel as a sum of areas in a retention time range defined for diesel­range organics. The end of the 

area integration range is defined as the retention time when the surrogate o­terphenyl appears. 

As diesel fuel is the complex sustrate evaluatd in this work, a calibration curve will be 

constructed applying EPA's Method 8015B using a gas chromatograph with detection by flame 

ionization (GC­FID) to perform the quatitative analysis of diesel hydrocarbons in order to obtain 

their biodegradation profiles. A purge and trap concentrator will be used for sampling injection 

CHAPTER III. EXPERIMENTAL PROCEDURE

3.1 Chemicals and culture conditions

Chemicals, including glycolic acid ethoxylate lauryl ether (GAELE, an anionic surfactant), diesel 

range organics (DRO) calibration standard, equilibrated phenol, Triton X­100, EDTA, 

Tris(hydroxymethyl) aminoethane (Tris), sodium dodecyl sulfate (SDS), absolute ethanol, 

chloroform­isoamyl alcohol (24:1) and pancreatic ribonuclease (RNase A) were purchased from 

Sigma­Aldrich (Mexico) and were above 98% purity. Diesel was purchased from a local diesel 

station. Deionized water from a Milli­Q purification system (Millipore, USA) was used in 

preparing samples. The TSNT lysis buffer was prepared by diluting the following mixture to 1 L: 

a) 500 mL of water with 20 mL of Triton X­100, b) 100 mL of 10% (w/v) SDS, c) 20 mL of 5 M 

NaCI, d) 5 mL of 2 M Tris­HCI at pH 8 and e) 2 mL of 0.5 M EDTA at pH 8. Mineral medium I 

(MMI) prepared according to Acuna­Askar et al., (2006) was used to maintain the growth of a 

bacterial consortium fed with diesel. Mineral medium II (MMII) was prepared to resuspend the 

bacterial cells after centrifugation and had the following composition (in g/L): KH2P04, 2; 

NH4NO3, 0.5; MgCI2, 0.5; NaC2H302, 1.5; NaN03, 1; glycerol, 0.5; K2HP04, 3.5; trace nutrient stock 

solution (in mL/L), 1 (Criddle et al., 1990). The initial pH of MMII was 7.0­7.5. MMII was used for 

batch and continuous­flow biofilm experimental assays. Nitrate reducing conditions were tested 

by using the Nitrate Reduction Test Kit provided by Fluka (Sigma­Aldrich Chemie GmbH). 

3.2 Bacterial seed preparation

The bacterial consortium used as seed inoculums for both the batch and continuous­flow 

experimental bioassays was originally obtained from a petrochemical refinery wastewater 

flowrate of 30 mL/s ± 5mL/s, and has been fed with 200 mg/L of diesel three times a week for 

five years, followed by weekly renewals of the culture medium and biomass detention time of 

30 days. Acclimatization conditions include temperature 18­26°C, dissolved oxygen (DO) 0.5­1.2 

mg/L, oxidation­reduction potential (ORP) ­320 to ­250 mv and pH 6.9­7.8. Culture conditions 

allowed the bacterial consortium to reach 1,360 mg/L as volatile suspended solids (VSS). VSS 

determination followed the Standard Method 2540 E (Standard Methods, 1998). For the batch 

assay kinetics design, a total volume of 540 mL of mixed liquor was taken from the bacterial 

acclimatization reactor using 12 centrifuge tubes filled up to 45 mL each. The acclimatized 

consortium was precipitated in a centrifuge (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA), model 

Allegra X­22R at 3,041 x g at 259

C for 7 minutes. The bacterial cells were resuspended in two 50­

mL centrifuge tubes with 35 mL of MMII to reach a VSS of 3,370 mg/L in each concentrate. 

3.3 Design of batch bioassays

The substrate mineral medium (SMM) of the batch experimental bioassays was made up of 50 

mL of MMII and the addition of 10 u± of diesel into 122­mL amber­glass crimp­sealed bottles 

(Wheaton Science Products, Millville, NJ). A 2­mL inoculum from the concentrated bacterial cells 

was added to  S M M to reach 130 mg/L VSS. Because of the density of the diesel used in this 

study, 0.84 g/mL, an amount of 8.4 mg of diesel would be expected to partition into both the 

liquid and vapor phases. However, samples were mixed for 3 minutes to obtain uniform diesel 

concentration causing volatile losses at the start of the kinetics. Further chromatographic 

analysis and the use of the vapor­liquid phase partition coefficient curve ­as described below­, 

for the mass balance, revealed that an amount of nearly 30 mg/L in the liquid phase was the 

initial diesel concentration in the batch kinetic studies. Controls with only SMM and three sets of 

contained SMM, 130 mg/L VSS of inoculum and 5.5% sterilized soil (SS). Set 3 contained SMM, 

130 mg/L VSS of inoculum and 25 mg/L GAELE. Based on the advantages attained by increasing 

effective solubility (Volkering et al., 1995), and stimulating suitable intermolecular forces at the 

interface to facilitate substrate dissolution rate (Grimberg et al., 1996), the amount of GAELE 

added to experimental bioassays was slightly below the critical micelle concentration (CMC). 

Samples and controls were shaken at 7 x g at 28­305C, using a Lab­line oscillating incubator 

shaker (Barnstead International, Dubuque, IA). The diesel mass was monitored in the liquid 

phase for 288 hours at different times from 0, 24, 48, 72, 144 and 288 hours. The diesel in the 

vapor phase was obtained by extrapolation from the vapor­liquid phase coefficient partition 

curve. At the end of the kinetics, to obtain the overall degradation percentage, the diesel left in 

both liquid and vapor phases was summed up and the total was subtracted from the initial mass 

added at the start of the experiment. The mass balance revealed that the decrease of diesel in 

the vapor phase showed a constant relation with the consumption of diesel in the liquid phase, 

suggesting that phase equilibrium kept constant throughout the kinetics. For quality control 

purposes and to achieve repeatability on data, the experimental bioassays were run by triplicate 

at different dates to evaluate the reproducibility of diesel biodegradation kinetics. 

3.4 Sterilization of soil, heterotrophic plate count and sonication

A set of three­gram samples of soil sieved through mesh 3 mm were wrapped in aluminum foil 

and sterilized following three sterilization cycles in an autoclave (Pelton & Crane CO., Charlotte, 

NC.) model MC. The number of bacteria was counted by using a Quebec colony counter 

(American Optical, Buffalo, NY), model 3325, and reported as colony­forming units per millilitre 

of original solution (CFU/mL). Soil samples were considered sterile at a maximum of 5 CFU/mL in 

sample preparation and for estimating the number of heterotrophic bacteria. A Branson Sonifier 

250 (Branson Ultrasonics, Co., Danbury, CT) sonicator was used and programmed for each 

amber serum bottle at two cycles of two minutes each at 80% duty cycle. USEPA method 3550 

was used to extract potential diesel trapped in cell materials. 

3.5 Determination of environmental parameters and analysis of diesel

The pH and the ORP were measured with a pH probe HI 1618D and an ORP probe HI 3620D 

connected to a Hanna HI 98150 microprocessor logging pH/ORP meter. A Hanna HI 9143 

microprocessor meter was used to measure DO. The pH, ORP and DO probes were calibrated 

on a daily basis. Diesel was analyzed by a Varian 3400 GC/FID chromatograph following standard 

procedures with some modifications according to USEPA, (1996). A Petrocol™ (Supelco, 

Bellefonte, PA) 100m x 0.25mm ID x 0.5u.m film DH fused silica GC capillary column was used. 

The oven temperature started at 709

C and held for 1 min, ramped to 120°C at 2°C/min, held for 

5 min, then ramped to 140°C at 3°C/min and held for 3 min, then ramped to 180°C at 2°C/min 

and held for 3 min; finally, ramped to 210°C at 50°C/min and held for 5.74 min. The oven 

temperature program allowed for both separation of the peaks of diesel components and 

avoidance of chromatogram bump formation. The injector was set up at a split ratio of 1:50, 

with a split flow of 100 mL/min, at a column flow of 2 mL/min, and its temperature was set up 

isothermal at 220°C. Detector conditions included both attenuation and range at 8 and 12, 

respectively. Detector temperature was set isothermal at 300°C. A volume of 5 mL of liquid and 

vapor (headspace) samples were placed in the purge vessel of a Tekmar* (Cincinati, OH) model 

LSC 2000 purge and trap concentrator by using a SGE 10­mL gas­tight syringe (Australia). Liquid 

and vapor samples were purged with nitrogen at 80°C for 10 min and desorbed at 225°C for 4 

protocol, which included accuracy, precision, specificity, selectivity, method detection limit 

(MDL), linearity and robustness testing for the purgeable fraction of diesel was followed 

(Bliesner, 2006). Substrate calibration curve of known standard concentrations was based on 

fresh commercial diesel. The DRO standard kit was used to assess the degradation of 

hydrocarbon chain length segments. Both linear regression and correlation analysis techniques 

were employed to draw the standardized calibration curves and effect sample analysis 

calculations as well (Daniel, 2006). 

3.6 Vapor-liquid phase partition coefficient curve of diesel

To obtain the diesel mass balance that would partition into the vapor and liquid phases in the 

batch assays, an experimental vapor­liquid phase partition coefficient was obtained. Two sets of 

samples were prepared at 25°C by pouring 61 mL of milliQ water with a calibrated burette into 

122­mL amber­glass crimp­sealed bottles (Wheaton Science Products, Millville, NJ) and adding 

known volumes of diesel with either a 10­ui SGE microsyringe or a 100­p.L Hamilton 

microsyringe (Reno, NV). The total diesel mass added to the bottles was calculated by using the 

density of diesel (0.84 g/mL). The two sets contained eleven different quantities of known 

amounts of total diesel mass ranging from 0.84 to 20 mg. The total mass of diesel supplied at 

the start of the batch assays and monitored throughout the kinetics fell within the range of 

diesel mass added. One set of samples was used to analyze diesel in the liquid phase and the 

other set to analyze it in the vapor phase. Three charts were plotted with the data from the GC 

areas obtained from the liquid and vapor samples. The first chart was plotted with the total 

diesel mass added to the bottles vs. the GC areas of the liquid phase samples. The second chart 

was plotted with the total diesel mass added to the bottles vs. the GC areas of the vapor phase 

slope value obtained from the third chart was used to calculate the experimental vapor­liquid 

phase partition coefficient of diesel in batch assays. Based on a closed system model used on 

the batch bioassays, a practical method detection limit of diesel in the vapor phase (MDLfsel

)

was calculated according to [AVn '{AVn + A,n)] (Mn /Vril), where AVn is the GC area of the 5­mL 

vapor phase standards, Aln is the GC area of the 5­mL liquid phase standards, n is each sample 

of two sets of eleven standards analyzed for either the vapor or liquid phases, Mn is the total 

mass of diesel added to each standard and VVn is the headspace volume, which was fixed at 61 

mL for the eleven vapor­phase standards. A chart with the GC area of each vapor phase 

standard on the x axis and the standard concentration in the vapor phase on the y axis was 

plotted. The extrapolation of the y­intercept was taken as the practical {MDLd

ySel

) of the vapor­

phase standard curve. The practical (MDL?yesel

) of the diesel purgeable fraction in the vapor 

phase was calculated as 4.5 mg/L. 

3.7 Continuous-flow biofilm reactor operation

An upflow glass­column reactor of 5 cm of inner diameter and 53.34 cm high was used in this 

study. Eight sampling points, including influent and effluent, separately distributed every 7.62 

cm from each other rendered seven continuous biofilm segment units from the bottom to the 

top of the reactor. At the upper end a vapor chamber was connected to keep substrate vapors 

confined and in contact with Orbo™ (Supelco, Bellefonte, PA) activated carbon tubes to monitor 

volatilization losses in the off­gas. Peristaltic pumps at flowrates of nearly 3.2, 6.5 and 20 

mL/min were used to feed the influent into the reactor for the HRTs of 3, 1.5 and 0.5 h,