Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Citrus limon sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. PARASITOLOGÍA. “Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Citrus. TESIS. PARA OBTENER EL TÍTULO DE BIÓLOGO - MICROBIOLÓGO. BI. BL. IO. TE. CA. DE. limon sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes”. AUTOR: Br. Luis Gabriel Cueva Yesquén ASESOR: Dr. Pedro Estuardo Mercado Martínez. TRUJILLO – PERU 2016. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. G. LO. DR. ORLANDO GONZÁLES NIEVES. IC. AS. TRUJILLO. AS. BI. O. RECTOR. CI EN. CI. DR. RUBÉN VERA VÉLIZ. DE. VICE-RECTORA ACADÉMICO. VICE-RECTOR ADMINISTRATIVA. BI. BL. IO. TE. CA. DR. WEYDER PORTOCARRERO CÁRDENAS. DR. ESTEBAN ILICH ZERPA PROFESOR SECRETARIO GENERAL. ii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS. G. LO. DR. MARCO SALAZAR CASTILLO. IC. AS. BIOLÓGICAS. CI EN. CI. AS. BI. O. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. DR. SANTOS ENRIQUE PADILLA SAGASTEGUI. BIOLÓGICAS. DRA. EVA VILLANUEVA TARAZONA. BI. BL. IO. TE. CA. DE. PROFESOR SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS. DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. iii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CERTIFICACIÓN DEL ASESOR. AS. El que suscribe, Dr. Pedro Mercado Martínez, en calidad de profesor asesor de la tesis:. IC. Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Citrus limon sobre el. O. LO. G. crecimiento de Listeria monocytogenes.. BI. CERTIFICA:. AS. Que la investigación ha sido desarrollada de conformidad con los objetivos propuestos en su perfil académico y que el informe ha sido revisado y acoge las. CI. observaciones y sugerencias alcanzadas.. CI EN. Por ello, autorizo al Br. Luis Gabriel Cueva Yesquén para continuar con los. BI. BL. IO. TE. CA. DE. procedimientos según sus fines.. Dr. Pedro Mercado Martínez ASESOR. iv. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. AS. Señores miembros del jurado dictaminador:. IC. En cumplimiento con las disposiciones reglamentarias vigentes para la. G. obtención de grados y títulos de las Escuela Académica Profesional de Microbiología. LO. y Parasitología, Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de. BI. O. Trujillo, someto a vuestra consideración y criterio el presente informe de tesis titulado: “Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Citrus limon sobre el. AS. crecimiento de Listeria monocytogenes” con la cual pretendo cumplir con los. Trujillo, Julio del 2016. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. requisitos para optar el título de Biólogo-Microbiólogo.. Br. Luis Gabriel Cueva Yesquén.. v. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. O. Dr. Icela Rodríguez Haro. LO. G. IC. AS. MIEMBROS DEL JURADO. CI EN. CI. AS. BI. PRESIDENTE. SECRETARIO. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Ms. C. Eduardo Muñoz Ganoza. Dr. Pedro Mercado Martínez VOCAL. vi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. AS. Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que. IC. el presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales,. AS. BI. O. LO. G. siendo APROBADO por UNANIMIDAD.. CI. Dr. Icela Rodríguez Haro. Ms. C. Eduardo Muñoz Ganoza SECRETARIO. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. PRESIDENTE. Dr. Pedro Mercado Martínez VOCAL vii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. IC. para lograr mis objetivos, y por su infinita bondad y amor.. AS. A Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto, dándome salud. LO. G. A mis familiares, por su apoyo incondicional en cada paso que he dado. O. en la vida y darme esa fuerza que me ayuda a seguir adelante.. BI. A mis amigos, Rosita, Yuli, Lizbeth, Iris, Ivan y Rossy, por el día a día,. AS. por su paciencia, sus ocurrencias, sus consejos, su cariño, por permitirme. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. compartir estos años a su lado, por ser mi familia cercana.. viii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO. AS. Un cordial agradecimiento a mi asesor de tesis Dr. Pedro Mercado. IC. Martínez por su apoyo y guía en la investigación. LO. G. A los miembros del jurado, quienes aportaron con su amplia. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. experiencia en esta investigación.. ix. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN Los aceites esenciales de cítricos no sólo representan una alternativa en la. AS. conservación de alimentos frescos, sino que además son reconocidos como. IC. sustancia seguras (GRAS) por la FDA y se ha encontrado que son inhibidores. G. contra una gama de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. La presente. LO. investigación tiene como objetivo determinar la concentración mínima. O. inhibitoria del aceite esencial de Citrus limón sobre el crecimiento de Listeria. BI. monocytogenes. Para ello se obtuvo el aceite esencial a partir de la cáscara del. AS. fruto de Citrus limon, mediante la técnica de Hidrodestilación tipo Clevenger. Luego se determinó el tiempo de generación (Tg) de un cultivo de Listeria. CI. monocytogenes proporcionado por el Laboratorio de Fisiología y Genética. CI EN. Microbiana de la Universidad Nacional de Trujillo. Para determinar la Concentración Mínima inhibitoria (CMI) se utilizó la técnica de dilución en. DE. Caldo dónde se incubó únicamente por el tiempo de generación de la bacteria. Se evaluaron cuatro clones del cultivo de Listeria monocytogenes. La CMI fue. CA. 40 g/mL para los cuatro clones. Por lo tanto el aceite esencial de cáscara de. TE. Citrus limón “limón dulce” tiene la capacidad de inhibir el crecimiento de. BL. IO. Listeria monocytogenes.. BI. Palabras clave: aceite esencial, concentración mínima inhibitoria, Listeria monocytogenes.. x. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONTENIDO .ii. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. iii. AS. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. iv. IC. CERTIFICACIÓN DEL ASESOR. G. PRESENTACIÓN. LO. MIEMBROS DEL JURADO. x. BI. RESUMEN. AS. CONTENIDO. CI. INTRODUCCIÓN. MATERIAL Y MÉTODOS. DISCUSIÓN. .. xi 1 6 7 11 13 17. CA. CONCLUSIÓN. DE. RESULTADOS. CI EN. OBJETIVOS. vi vii. O. APROBACIÓN. v. 18. TE. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 23. BI. BL. IO. ANEXOS. xi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN. AS. A pesar de las mejoras en las técnicas de higiene y producción de alimentos, la seguridad alimentaria es cada vez más un problema de salud pública1. Se ha. IC. estimado que hasta un 30% de las personas en los países industrializados sufren. LO. G. de una enfermedad transmitida por alimentos cada año y en el año 2000 por lo menos dos millones de personas murieron a causa de enfermedades diarreicas. BI. O. en todo el mundo1. Hay por lo tanto todavía una necesidad de desarrollar nuevos métodos para reducir o eliminar los patógenos transmitidos por. AS. alimentos. Al mismo tiempo, la sociedad occidental parece estar. CI. experimentando una tendencia por el consumismo "green", con el deseo de. CI EN. utilizar menos aditivos alimentarios sintéticos y productos con menor impacto al medio ambiente2. Una alternativa es el uso de aceites esenciales como. DE. aditivos antibacterianos.. CA. Los aceites esenciales (AE) son líquidos aceitosos aromáticos obtenidos a. TE. partir de material vegetal (flores, brotes, semillas, hojas, ramas, cortezas,. IO. hierbas, madera, frutos y raíces)2. Se pueden obtener por fermentación o. BL. extracción, pero el método de hidrodestilación por vapor es el más utilizado. BI. para la producción comercial de AEs. Se estima que 3.000 AEs son conocidos, de los cuales unos 300 están comercialmente destinados principalmente para el mercado de sabores y fragancias3. Se demostró que los AEs presentan propiedades antibacterianas4,5, antiviral5,6, antimicótico7,8, antitoxigénica5,9, antiparasitario10, e insecticida 11. 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Los AE lo constituyen una diversa familia de compuestos orgánicos de bajo. AS. peso molecular con grandes diferencias en la actividad antimicrobiana. Los. G. química: terpenos, terpenoides, fenilpropenos, y "otros". 2. IC. compuestos activos pueden dividirse en cuatro grupos según su estructura. LO. Los terpenos son hidrocarburos producidos a partir de la combinación de varias. O. unidades de isopreno (C5H8). Los terpenos se sintetizan en el citoplasma de las. BI. células de plantas, y la síntesis procede de la vía del ácido mevalónico a partir. AS. de acetil-CoA. Los terpenos tienen un hidrocarburo como columna vertebral,. CI. que puede ser reorganizado en estructuras cíclicas por ciclasas, formando así. CI EN. las estructuras monocíclicos o bicíclicos.12. Los terpenoides son terpenos que se someten a modificaciones bioquímicas por enzimas que añaden moléculas de oxígeno y se mueven o eliminan grupos. DE. metilo12. Los terpenoides se pueden subdividir en alcoholes, ésteres, aldehídos,. CA. cetonas, éteres, fenoles, y epóxidos. La actividad antimicrobiana de la mayoría de los terpenoides está vinculado a sus grupos funcionales, y se ha demostrado. TE. que el grupo hidroxilo de los terpenoides fenólicos y la presencia de electrones. IO. deslocalizados son importantes para la actividad antimicrobiana.. BL. Los fenilpropenos constituyen una subfamilia entre los diversos grupos de. BI. compuestos orgánicos llamados fenilpropanoides que se sintetizan a partir de la fenilalanina precursor de aminoácidos en las plantas. Los fenilpropanoides tienen su nombre del grupo aromático fenol y del propeno de la cola de tres carbonos de ácido cinámico, producido en la primera etapa de la biosíntesis de 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. los fenilpropanoides. La actividad antimicrobiana de fenilpropenos depende de la clase y el número de sustituyentes en el anillo aromático, cepas microbianas seleccionadas, y los parámetros de ensayo experimentales, tales como la. IC. AS. elección de medio de crecimiento, temperatura, etc.13. G. Los AEs de los cítricos contienen un 85-99% de componentes volátiles y del. LO. 1-15%, no volátiles. Los componentes volátiles son una mezcla de. O. monoterpenos (limoneno) y sesquiterpenos hidrocarburos y sus derivados. BI. oxigenados incluyendo: aldehídos (citral), cetonas, ácidos, alcoholes (linalol). CI. AS. y ésteres.14. CI EN. Teniendo en cuenta el gran número de diferentes grupos de compuestos químicos presentes en los AEs, lo más probable es que su actividad antibacteriana no sea atribuible a un mecanismo específico, sino que existan. DE. varios blancos en la célula 15 como la degradación de la pared celular16, daño a 17. , daño a las proteínas de membrana9,. CA. la membrana citoplasmática9,. 18. ,. filtración de los contenidos celulares19, 20, la coagulación del citoplasma y el. TE. agotamiento de la fuerza motriz protónica9,. 21. . Se ha demostrado que los. IO. mecanismos de inactivación por el citral y el carvacrol se relaciona con la. BL. producción de ROS (radicales libres del oxígeno)22. Dónde después de un. BI. tratamiento por 3 horas, con 300 µl/ L de Citral redujo el número inicial de células en 3 ciclos logarítmicos y el tratamiento con 100 µl/ L de Carvacrol inactivaron 2.5 ciclos logarítmicos de la población bacteriana inicial23.. 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Listeria. monocytogenes es un bacilo Gram-positivo, no esporulante,. facultativamente anaeróbico que crece entre -0,4 y 50 ° C (210, 425). Es catalasa positivo y oxidasa negativo y expresa una β-hemolisina que produce. AS. zonas de inhibición en agar sangre. El organismo posee flagelos peritricos, que. IC. le dan la característica de motilidad, que ocurre sólo en un estrecho intervalo. G. de temperatura. Cuando el organismo se cultiva entre 20 y 25 °C, la flagelina. 24. . Las colonias demuestran un. O. producción flagelina se reduce notablemente. LO. es a la vez producida y ensamblada en la superficie celular, pero a 37 °C la. BI. brillo azul verdoso característico por la luz transmitida de forma oblicua. L.. AS. monocytogenes está ampliamente presente en plantas, el suelo y las muestras. CI. de agua superficial.25. CI EN. Son muchos los factores que afectan a la patogenicidad de L. monocytogenes: su capacidad de crecimiento intracelular, compuestos de hierro, catalasa y superóxido dismutasa, componentes de la superficie y las β-hemolisinas. DE. indican que su virulencia es multifactorial. 26. CA. Se conoce además que la virulencia del organismo puede ser afectado por su. TE. temperatura de crecimiento. El crecimiento de L. monocytogenes a 4°C aumentó su virulencia en ratones inoculados por vía intravenosa, aunque no. BL. IO. parece afectar a los ratones que habían sido infectados por vía oral27. Este. BI. fenómeno puede aumentar la virulencia del organismo en los alimentos refrigerados. Los patógenos intracelulares facultativos como L. monocytogenes deben poseer. los medios necesarios para superar la respuestas inmune no específica mediada por fagocitos. El organismo sobrevive dentro de las células no sensibilizadas 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. del sistema mononuclear de fagocitos28. La formación de un radical libre tóxico, superóxido (01-), es una parte importante de la secuencia en la muerte de fagocitosis por las bacterias. La presencia de superóxido dismutasa en la. AS. bacteria ofrece una defensa contra esta molécula tóxica y por lo tanto, es un. IC. posible factor de virulencia del organismo.. LO. G. Además debido a que este microorganismo es psicotrópico, puede ser considerado como un agente patógeno peligroso en los alimentos almacenados. BI. O. a temperatura de refrigeración29. Además de forma natural en el medio ambiente, esta bacteria también se ha encontrado en una variedad de alimentos,. AS. como carnes crudas, verduras y alimentos procesados como los quesos. CI. blandos30. La aparición de esta bacteria en productos alimenticios hace que sea. CI EN. un patógeno potencialmente peligroso debido a la gran cantidad brotes de listeriosis31. La listeriosis es una infección grave. causada por el consumo de. DE. alimentos contaminados con este patógeno y ha sido reconocida como un importante problema de salud pública que afecta principalmente a las mujeres. CA. embarazadas, los recién nacidos y adultos con sistemas inmunológicos. IO. TE. debilitados 32.. BL. JUSTIFICACIÓN. BI. Demostrar que el aceite esencial de Citrus limon tiene un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de Listeria moncytogenes puede justificar su aplicación. Porque además de ser seguro para el consumo reduciría la carga microbiana inicial durante la producción de alimentos y así extender su vida útil. 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Objetivo general: Determinar la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Citrus. IC. AS. limón sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes.. LO. G. Objetivos específicos:. 1. Determinar la fase logarítmica media y el tiempo de generación de Listeria. BI. O. monocytogenes.. 2. Medir el efecto inhibitorio del aceite esencial de Citrus limon sobre el. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. crecimiento de Listeria monocytogenes.. 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y MÉTODO 1. MATERIAL BIOLÓGICO. AS. En el presente estudio se utilizó un cultivo de L. monocytogenes que fue. IC. proporcionado por el Laboratorio de Fisiología y Genética Microbiana. G. del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad. O. LO. Nacional de Trujillo.. AS. BI. 2. PROCEDIMIENTO. CI. 2.1. Obtención del aceite esencial (A.E.) de C. limón “limón dulce”. CI EN. Se colectó 10 Kg de fruto de C. limon de áreas de cultivo del distrito de Cascas, La Libertad. La planta se identificó en el Herbario de la. DE. Universidad Privada Antenor Orrego. Se eliminó completamente la pulpa y se dejó secar la cáscara a T° ambiente (25°-28°C) aproximadamente. CA. por 96 horas.. TE. El aceite esencial se obtuvo a partir de la cáscara por el método de. BI. BL. IO. Hidrodestilación Directa tipo Clevenger. y luego se purificó. (deshidratación) con MgSO4. La obtención del aceite se realizó en el Laboratorio de Instrumentales del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad Nacional de Trujillo. 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.2. Preparación de solución Stock del aceite esencial Se determinó la densidad del aceite esencial de C. limon para preparar una solución de 40 mg de A.E./ml sulfóxido de dimetilo (DMSO). El. AS. DMSO se utilizó para disolver el aceite. Después, se tomó una alícuota y se diluyó en 9 ml de Caldo de. IC. de 1 mL de esta solución. G. Enriquecimiento Selectivo de Fraser (Merck Millipore®) para obtener. LO. una solución Stock de 4 mg (4000µg) E.O. /mL. La solución Stock se. BI. O. almacenó a -20 ° C.. AS. 2.3. Obtención de la curva de crecimiento de L. monocytogenes. CI. El crecimiento se obtuvo sembrando 1 ml de suspensión de L.. CI EN. monocytogenes (equivalente al Tubo 0.5 de Mac Farland 1,5x108 UFC/mL) en 99 ml de Caldo de Enriquecimiento Selectivo de Fraser (Merck Millipore®) a 100 RPM, 37° C durante 24 horas, y se determinó. DE. la concentración de la población microbiana cada 2 horas por el método. CA. de recuento en placa. Con estos recuentos se obtuvo la curva de. TE. crecimiento y por consiguiente el tiempo de generación.. BI. BL. IO. 2.4. Preparación de inóculo de L. monocytogenes para determinar CMI Se aislaron colonias en el medio Agar Oxford (Merck Millipore®) que representaron cada una, una repetición. En el presente trabajo se realizaron cuatro repeticiones Se sembró L. monocytogenes en Caldo de Enriquecimiento Selectivo de Fraser (Merck Millipore®) e incubó a 37°C y 100 RPM para obtener un 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. cultivo en fase logarítmica media (7 horas). Se lavó el cultivo con NaCl (0.85%) tres veces y se resuspendió en 10 ml de la misma solución hasta obtener una turbidez equivalente al tubo N°0.5 del Nefelómetro de. AS. MacFarland (1.5x108 UFC/ml). Se diluyó al centésimo la suspensión. IC. bacterina en NaCl (0.85%) para obtener una concentración de 1.5x106. LO. G. cel/ml.. O. 2.5. Determinación de la concentración mínima inhibitoria.. BI. Se realizó por la técnica de dilución en caldo33. en pocillos de. AS. microcultivo de 2 ml de volumen. Se sirvió 800 µl de Caldo de. CI. Enriquecimiento Selectivo de Fraser (Merck Millipore®) en 12 pocillos. CI EN. y para el primer pocillo se adicionó 800 µL (3200 µg E.O) de solución Stock del aceite esencial de C. limon para obtener una concentración de 1600 µg/ml. Del primer pocillo se tomó 800 µl y se realizaron diluciones. DE. hasta el onceavo pocillo para obtener las concentraciones 800; 400; 200,. CA. 100; 50; 25; 12.5; 6.25; 3.125; 1.5625 µg/ml. Luego se completó el mililitro para cada pocillo con 200 µL de inóculo (3x105 células) de. BI. BL. IO. TE. manera que las concentraciones finales de aceite esencial fueron: 1280; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 µg/ml. El doceavo pocillo se completó con 200 µl de inóculo (3x105 células),. que sirvió de control. Se incubaron los 12 sistemas a 37° C por el tiempo de generación (obtenido en la curva de crecimiento). Luego, se tomó una alícuota (0.1 mL) de cada sistema y se realizó tres diluciones al décimo. Las dos 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. últimas diluciones se sembraron por superficie en Agar Oxford a 37° por 24 horas, para determinar las UFC/ml. Los sistemas completaron su incubación por 24 horas y se verificó el. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. crecimiento con la aparición de turbidez.. 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS. AS. En el presente trabajo se obtuvieron los siguientes resultados:. IC. 1. En la Figura 01 se observa que la fase logarítmica media fue a las 7. LO. G. horas de incubación y el tiempo de generación es de 55 minutos para el cultivo de Listeria monocytogenes proporcionado por Laboratorio de Fisiología y. BI. O. Genética Microbiana.. AS. Figura 01. Curva corregida de la fase logarítmica de crecimiento de Listeria. CI. monocytogenes.. CI EN. Fase Logarítmica. 1.00E+13 1.00E+12. DE. 1.00E+10. y = 8E+06e0.7066x. 1.00E+09. CA. UFC/mL. 1.00E+11. TE. 1.00E+08. 1.00E+07. 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. 14. 16. 18. Horas. BL. IO. 1.00E+06. BI. Tiempo de generación: 55 minutos. 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2. La concentración mínima de aceite esencial de cáscara de Citrus limon que se necesitó para inhibir el crecimiento de los cuatro clones de. IC. AS. Listeria monocytogenes evaluados, fue de 40 µg/mL. (Fig. 02). G. Figura 02. Población microbiana resultante de la exposición a diferentes. BI. O. LO. concentraciones del aceite esencial de cáscara de Citrus limon. AS. [UFC/mL] 1.00E+08. CI. 1.00E+07. CI EN. 1.00E+06 1.00E+05. 1.00E+03. TE. 1.00E+00. 3° repetición. 4° repetición. CA. 1.00E+02 1.00E+01. 2° repetición. DE. 1.00E+04. 1° repetición. 2.5. 5. 10. 20. [40 … 1280]. [E.O. µg/mL]. BI. BL. IO. 1.25. 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSIÓN La concentración mínima inhibitoria (CMI), es un indicador clave del potencial de un. AS. agente antimicrobiano, se define como la concentración en la que se evita el. IC. crecimiento visible de bacterias bajo las condiciones de crecimiento definidas. La. G. dilución en agar y dilución en caldo son las técnicas más comúnmente utilizadas para. LO. determinar la concentración inhibitoria mínima de agentes antimicrobianos,. O. incluyendo antibióticos y otros sustancias que “matan” (actividad bactericida) o. BI. inhiben el crecimiento (actividad bacteriostática) de bacterias. La técnica de dilución. AS. en caldo utiliza un medio líquido medio contiene concentraciones crecientes geométricamente (típicamente una serie de diluciones dobles) del agente. CI EN. CI. antimicrobiano, que es inoculado con un número definido de células bacterianas.34 Para determinar la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial obtenido de cáscara de Citrus limon “limón dulce” se utilizó la técnica de macrodilución en caldo. DE. debido a la polaridad del compuesto natural el cual podría desempeñar un papel. CA. negativo en la difusión en el agar35. Otra razón por la que no se utilizó la técnica de dilución en agar o difusión en disco es que se puede reducir la eficiencia de estos. IO. TE. métodos por la precipitación del aceite esencial en los pocillos o en los discos.. BL. A pesar de ello Gomes et al, 201436 utilizó la tecníca de dilución en agar dónde. BI. encontró que la concentración mínima inhibitoria de Citrus limon para Listeria. monocytogenes fue de 3.91 ug/mL a diferencia que en este estudio se necesitó de una mayor concentración para inhibir el crecimiento de cuatro clones de Listeria monocytogenes.. 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Los aceites esenciales son fuentes potenciales de nuevos compuestos antimicrobianos sobre todo contra patógenos bacterianos. Estudios in vitro han mostrado que los aceites esenciales inhiben el crecimiento bacteriano pero varían en su eficacia2 debido a que. AS. los componentes químicos que actúan como agentes antimicrobianos varían en tipo y. IC. concentración.. LO. G. Los aceites esenciales poseen en su mayoría tres tipos de compuestos, según su naturaleza química: terpenos, terpenoides y fenilpropenos. De los tres tipos, el que. BI. O. posee mayor actividad antimicrobiana son los terpenoides debido a que poseen radicales hidroxilo y electrones desapareados, seguidos de los terpenos y. AS. fenilpropenos2. En los aceites esenciales de la mayoría de cítricos, los monoterpenos. CI EN. entre un 1.8% a 2.2% del aceite37. CI. representan el 97% acompañado de alcoholes, aldehídos y ésteres que constituyen. Según Lota et al, 200238, que analizó la composición química de aceites esenciales. DE. obtenidos de la cáscara de 21 variedades de Citrus limon, determinó que el limonene. CA. (monoterpeno) fue siempre el principal constituyente de todos los aceites, en un rango entre 38,1 a 95.8%, β-pinene entre un 0.1% a 15.8%, γ-terpinene hasta un 18% y. TE. linalool hasta un 23.3%.. IO. Por otro lado Fisher et al, 200814 determinó que en la composición química del aceite. BL. esencial, obtenido de la cáscara de una variedad de Citrus limon, había 78.84% de. BI. limonene, 3.85% de ocimene, 3.34% de valencene, 1.47% de butilacetato y 1.3% de α-terpineol y según Gomes et al, 201436 detectó 52.62% de limonene, 7.84% de geranial, 7.51% de sabinene y 5.47% de neral, entre otros.. 14. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Los compuestos químicos de los aceites esenciales de los cítricos son altamente volátiles, inclusive a temperatura ambiente39, por lo que una vez obtenido el aceite se debe conservar en congelación (-20°C) y durante su evaluación el tiempo de. AS. exposición al patógeno no debe ser muy prolongado.. IC. En el presente estudio el tiempo al que se expuso los clones de Listeria monocytogenes. LO. G. a las diferentes concentraciones de aceite esencial de Citrus limon fue de 55 minutos, el que además representa el tiempo que necesita la bacteria para duplicar su población. BI. O. (Tg, tiempo de generación). Otros factores que pueden afectar en la volatilización del. AS. aceite esencial son la humedad, la concentración de los compuestos y la presión.39. CI. El hecho de exponer al patógeno, a una determinada concentración de aceite esencial,. CI EN. únicamente por su tiempo de generación indica que sus compuestos activos (los de mayor concentración) necesitarían solo de este tiempo para eliminar a toda la. DE. población microbiana. Por lo que, el limoneno debería ser quién cumple esta función. El limoneno pertenece a la familia de hidrocarburos monoterpenos cíclicos, que se. CA. acumula en la membrana plasmática bacteriana debido a su característica de. TE. hidrofóbico provocando una pérdida de la integridad de la membrana y la disipación de la fuerza motriz protónica40. Además produce especies reactivas tóxicas como los. IO. ROS(especies reactivas del oxígeno)41 que causan daño oxidativo en una variedad de. BL. macromoléculas celulares como DNA, proteínas y lípidos. Se ha encontrado que la. BI. toxicidad del limonene es significativamente mayor que la de otros monoterpenos o disolventes con hidrofobicidad similar.42 Entonces el limonene presente en el aceite esencial de Citrus limon actuará durante el tiempo de generación cuando Listeria. 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. monocytogenes se divida y duplica su población micriabana exponiendo la membrana. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. la membrana celular y biomoléculas vitales para la bacteria.. 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIÓN La concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de cáscara de Citrus limón. AS. “limón dulce” determinada para Listeria monocytogenes inhibe el crecimiento a través. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. de la muerte bacteriana.. 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. WHO. 2002. World health report: Reducing risks, promoting healthy life. Geneva,. World Health Organization, 2002. ISBN 92 4 1562072 ISSN 1020-3311, p. 248. Hyldgaard M, Mygind T, Meyer RL. Essential oils in food preservation: mode of. AS. 2.. IC. action, synergies, and interactions with food matrix components. Front Microbiol.. G. 2012;3:12. doi: 10.3389/fmicb.2012.00012.. LO. 3. Berka-Zougali B, Ferhat MA, Hassani A, Chemat F, Allaf KS. Comparative study. O. of essential oils extracted from Algerian Myrtus communis L. leaves using. BI. microwaves and hydrodistillation.Int J Mol Sci. 2012;13(4):4673-95.. AS. 4. Prabuseenivasan S, Jayakumar M, Ignacimuthu S. In vitro antibacterial activity of. CI. some plant essential oils. BMC Complement Altern Med. 2006;6:39. with. antibacterial,. CI EN. 5. Reichling J, Schnitzler P, Suschke U, Saller R. Essential oils of aromatic plants. antifungal,. antiviral,. and. cytotoxic. properties--an. DE. overview.Forsch Komplementmed. 2009;16(2):79-90. 6. Duschatzky CB, Possetto ML, Talarico LB, García CC, Michis F, Almeida NV,et. CA. al. Evaluation of chemical and antiviral properties of essential oils from South. TE. American plants.Antivir Chem Chemother. 2005;16(4):247-51. 7. Cannas S, Molicotti P, Ruggeri M, Cubeddu M, Sanguinetti M, Marongiu B, et al.. IO. Antimycotic activity of Myrtus communis L. towards Candida spp. from isolates.J. BL. Infect Dev Ctries. 2013;7(3):295-8.. BI. 8. Gbadamosi IT, Egunyomi A. In-vitro propagation and antimycotic potential of. extracts and essential oil of roots of Aristolochia bracteolata Linn. (Aristolochiaceae). Afr J Tradit Complement Altern Med. 2011;9(1):50-5.. 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 9. Ultee A, Smid EJ. Influence of carvacrol on growth and toxin production by. Bacillus cereus. Int J Food Microbiol. 2001;64(3):373-8. 10. Metuge JA, Nyongbela KD, Mbah JA, Samje M, Fotso G, Babiaka SB,et al. Anti-. AS. Onchocerca activity and phytochemical analysis of an essential oil from Cyperus. IC. articulatus L. BMC Complement Altern Med. 2014;14:223.. G. 11. Mdoe FP, Cheng SS, Msangi S, Nkwengulila G, Chang ST, Kweka EJ.Activity of. LO. Cinnamomum osmophloeum leaf essential oil against Anopheles gambiae s.s.. O. Parasit Vectors. 2014;7:209.. AS. Nutrition. Amsterdam: Academic Press. 2003.. BI. 12. Caballero B, Trugo LC, Finglas PM. Encyclopedia of Food Sciences and. CI. 13. Pauli A, Kubeczka KH. Antimicrobial properties of volatile phenylpropanes. Nat. CI EN. Prod Commun. 2010;5(9):1387-94.. 14. Fisher K, Phillips C. Potential antimicrobial uses of essential oils in food: is citrus. the answer? Trends Food Sci Technol. 2008;19(3):156-164.. DE. 15. Carson CF, Mee BJ, Riley TV. Mechanism of action of Melaleuca alternifolia (tea. CA. tree) oil on Staphylococcus aureus determined by time-kill, lysis, leakage, and salt tolerance assays and electron microscopy. Antimicrob Agents Chemother.. TE. 2002;46(6):1914-20.. IO. 16. Helander IM, Alakomi H, Mattila-Sandholm T, Pol I, Smid EJ , et al.. BL. Characterization of the action of selected essential oil components on Gram-. BI. Negative Bacteria. J Agric Food Chem. 1998; 46(9):3590–5. 17. Di Pasqua R, Betts G, Hoskins N, Edwards M, Ercolini D, Mauriello G.. Membrane toxicity of antimicrobial compounds from essential oils. J Agric Food Chem. 2007;55(12):4863-70. 19. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 18. Juven BJ, Kanner J, Schved F, Weisslowicz H. Factors that interact with the. antibacterial action of thyme essential oil and its active constituents. J Appl Bacteriol. 1994;76(6):626-31.. AS. 19. Cox SD, Mann CM, Markham JL, Bell HC, Gustafson JE, Warmington JR, et al.. IC. The mode of antimicrobial action of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea. G. tree oil). J Appl Microbiol. 2000;88(1):170-5.. LO. 20. Lambert RJ, Skandamis PN, Coote PJ, Nychas GJ. A study of the minimum. BI. carvacrol. J Appl Microbiol. 2001;91(3):453-62.. O. inhibitory concentration and mode of action of oregano essential oil, thymol and. AS. 21. Gustafson JE, Liew YC, Chew S, Markham J, Bell HC, Wyllie SG, et al. Effects. CI. of tea tree oil on Escherichia coli. Lett Appl Microbiol. 1998;26(3):194-8.. CI EN. 22. Dugo P, Mondello L, Dugo L, Stancanelli R, Dugo G. LC-MS for the. identification of oxygen heterocyclic compounds in citrus essential oils. J Pharm Biomed Anal. 2000;24(1):147-54.. DE. 23. Chueca B, Pagán R, García-Gonzalo D. Oxygenated monoterpenes citral and. CA. carvacrol cause oxidative damage in Escherichia coli without the involvement of tricarboxylic acid cycle and Fenton reaction. Int J Food Microbiol. 2014;189:126-. TE. 31.. IO. 24. Peel M, Donachie W, Shaw A. Temperature-dependent expression of flagella of. BL. Listeria monocytogenes studied by electron microscopy, SDS-PAGE and western. BI. blotting. J Gen Microbiol. 1988;134(8):2171-8. 25. Weis J, Seeliger HPR. Incidence of Listeria monocytogenes in Nature. Applied. Microbiology. 1975;30(1):29-32. 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 26. Chakraborty T, Goebel W. Recent developments in the study of virulence in. Listeria monocytogenes. Curr Top Microbiol Immunol.1988;138:41–48 27. Czuprynski CJ, Brown JF, Roll JT. Growth at reduced temperatures increases the. AS. virulence of Listeria monocytogenes for intravenously but not intragastrically. IC. inoculated mice. Microb Pathog. 1989;7(3):213-23. G. 28. Kaufmann, SHE. Listeriosis: New findings-current concern. Microb Pathog.. LO. 1988; 5:225-231. O. 29. Farber JM, Peterkin PI. Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen.. BI. Microbiol Rev. 1991;55(3):476-511.. AS. 30. Choi KH, Lee H, Lee S, Kim S, Yoon Y. Cheese Microbial Risk Assessments - A. CI. Review.Asian-Australas J Anim Sci. 2016;29(3):307-14.. 2000;2(13):1651-60.. CI EN. 31. Feldhusen F. The role of seafood in bacterial foodborne diseases. Microbes Infect.. 32. Gandhi M, Chikindas ML. Listeria: A foodborne pathogen that knows how to. DE. survive. Int J Food Microbiol. 2007;113(1):1-15.. CA. 33. Friedman M, Henika PR, Mandrell RE.. Bactericidal activities of plant essential. oils and some of their isolated constituents against Campylobacter jejuni,. TE. Escherichia coli, Listeria monocytogenes, and Salmonella enterica. J Food Prot.. IO. 2002;65(10):1545-60.. BL. 34. Wiegand I, Hilpert K, Hancock RE. Agar and broth dilution methods to determine. BI. the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 2008;3(2):163-75.. 35. Sánchez JGB, Kouznetsov VV. Antimycobacterial susceptibility testing methods. for natural products research. Braz J Microbiol. 2010; 41(2):270-7 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 36. Gomes M, Cardoso M, Soares M, Batista L, Machado S, Andrade S, et al .Use of. Essential Oils of the Genus Citrus as Biocidal Agents. American Journal of Plant Sciences. 2014;5(3):299-305. AS. 37. Moufida S, Marzouk B. Biochemical characterization of blood orange, sweet. IC. orange, lemon, bergamot and bitter orange. Phytochemistry. 2003;62(8):1283-9.. G. 38. Lota ML, de Rocca Serra D, Tomi F, Jacquemond C, Casanova J. Volatile. LO. components of peel and leaf oils of lemon and lime species. J Agric Food Chem.. O. 2002;50(4):796-805.. BI. 39. Aumo J, Wärna J, Salmi T, Murzin D. Interaction of kinetics and internal diffusion. AS. in complex catalytic three-phase reactions: Activity and selectivity in citral. CI. hydrogenation. Chem Eng Sci. 2006; 61(2):814-22.. CI EN. 40. Sikkema J, de Bont JA, Poolman B. Interactions of cyclic hydrocarbons with. biological membranes. J Biol Chem. 1994; 269(11):8022-8. 41. Chueca B, Pagán R, García-Gonzalo D. Differential Mechanism of Escherichia. DE. coli Inactivation by (+)-Limonene as a Function of Cell Physiological State and. CA. Drug’s Concentration. Pavelka M, ed. PLoS ONE. 2014;9(4):e94072. doi:10.1371/journal.pone.0094072.. TE. 42. Brennan TC, Turner CD, Krömer JO, Nielsen LK. Alleviating monoterpene. IO. toxicity using a two-phase extractive fermentation for the bioproduction of jet fuel. BL. mixtures in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Bioeng. 2012;109(10):2513-. BI. 22.. 22. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. ANEXOS. 23. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 01. Figura 01. Curva corregida de la fase logarítmica de crecimiento de Listeria. AS. monocytogenes.. IC. Fase Logarítmica. G. 1.00E+13. LO. 1.00E+12. O. 1.00E+10. y = 8E+06e0.7066x. BI. UFC/mL. 1.00E+11. 1.00E+09. AS. 1.00E+08. 1.00E+06 0. 2. 4. 6. CI. 1.00E+07. 8. 10. 12. 14. 16. 18. CI EN. Horas. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Tiempo de generación: 55 minutos. 24. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 02. G. IC. concentraciones del aceite esencial de cáscara de Citrus limon. AS. Figura 02. Población microbiana resultante de la exposición a diferentes. LO. [UFC/mL]. O. 1.00E+08. BI. 1.00E+07 1.00E+06. 1° repetición. AS. 1.00E+05. 2° repetición 3° repetición. CI. 1.00E+04. 4° repetición. CI EN. 1.00E+03 1.00E+02. 1.00E+00. 2.5. 5. 10. 20. [40 … 1280]. [E.O. µg/mL]. BI. BL. IO. TE. CA. 1.25. DE. 1.00E+01. 25. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 03. Figura 03. Exposición de un clon de Listeria monocytogenes a las diferentes. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. concentraciones de aceite esencial de cáscara de Citrus limon “limon dulce”. 26. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Anexo 04:. 27. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. Anexo 05. BI. BL I. O. TE CA. DE. CI. EN. CI AS. BI. O. LO. G. DIAGRAMA DE FLUJO. 28. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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