UNIVERSIDAD A U T O N ~ M A

Cau abltria al tlmpo

UNIVERSIDAD A U T O N ~ M A

METROPOLITANA

DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOL~GICAS Y DE LA SALUD SECRETARiA ACADEMICA

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que el: del Departamento de

de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud,-el siguiente Servicio Social:

TiTULO

ALUMNA LONA DíAZ VERÓNICA

MATRíCüLA 8934371 5

LICENCIATURA BlOLOGíA EXPERIMENTAL PERIODO

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, Distrito Federal a veinticuatro de enero del dos mil uno.

M. V. 2. CARLOS MANUEL ROMERO RAMíREZ BIOLOGíA DE LA REPRODUCCIÓN

"ASOCIACIÓN ENTRE LA RETENCIÓN DE PLACENTA y LA COMPOSICIÓN DEL CALOSTRO EN VACAS LECHERAS"

SEPTIEMBRE 21, 1998 A NOVIEMBRE 13, 2000

A T E N T A M E N T E , "CASA ABIERTA AL TIEMPO"

SECRETARIO ACADÉMICO'

U IIDAD IZTAPALAPA

JASOCIACIÓN

ENTRE

LA

REIENCIÓN DE PLACENTA

Y

LA

COMPOSICIÓN

DEL,

C-0

EN

VACAS

LECHERAS.

Informe de Servicio Social que presenta:

1Verónica Lona

Díaz

4 e

la

enciatura de Biología

Ex,

ximental

/

División de Ciencias Biológicas

y

de la

Salud

Universidad

Autónoma

Metropolitana

-

Iztapalapa

/Asesor:

Carlos

M

Romero Ramírez

Depto de Biología de

la

Reproducción

d'México,

D.F

a

10

de

noviembre

de 2 9

INDICE

I N T R O D U C C I ~ N

Antecedentes

OBJETIVOS

Objetivos específicos

MATERIAL

Y

MÉTODOS

Muestras

Separación de

grasa

Separación de proteínas totales, Separacibn de caseína

Separación de inmunoglobulinas Obtención de estándares

Comprobación de estándares Medición de proteínas totales

Medición de caseína e

inmunoglobulinas

RESULTADOS

D I S C U S I ~ N

BIBLIOGRAFÍ

_A

INTRODUCCION

En la vaca como en los otros nimiantes, la inmunidad materna es transmitida

r f

I

C"

exclusivamente a través del calostro, y previene la presentación de enfermedades infecciosas en las primeras semanas de vida. El calostro es rico en inmunoglobulinas pero su concentración puede cambiar por varios factores como raza, edad y número de gestación, sin embargo existen otros factores que no !re han contemplado. Observaciones de campo de los productores muestran que los becerros nacidos de partos en los que las vacas retuvieron la placenta, presentan enfermedades infecciosas respiratonas y digestivas en las primeras semanas de vida. Este trabajo analizó la relación entre la retención de placenta y la concentración de inmunoglobulinas en vacas lecheras.

ANTECEDENTES

La capacidad de responder ante algún agente infeccioso depende de nuestro sistema inmune, el cuál generará todos los mecanismos necesarios para poder contrarrestar a dicho agente. El sistema inmune está formado por una compleja red estructural de células y moléculas especializadas con diferentes funciones biológicas, distribuidas por todo el organismo. La caractenstica distintiva de este sistema es la capacidad de reconocimiento específico de fragmentos moleculares, que generan el establecimiento de interacciones entre sus componentes con los distintos sistemas del organismo y con los posibles elementos extraños que puedan penetrar en él. Esta capacidad de reconocimiento, con la subsiguiente activación celular y desarrollo de los mecanismos efectores, le concede al sistema inmune una función relevante entre los mecanismos de defensa del organismo frente

a

las infecciones (Tresguerres, 1990).

La

respuesta inmune de los mamíferos esta compuesta por dos grandes sistemas, la inmunidad mediada por células y la inmunidad humoral (Damell et al., 1986; Tresguerres, 1990). Cada uno de los sistemas tiene diferente capacidad y grado de respuesta, con mecanismos propios protectores cuando son estimulados por antígenos como bacterias, virus, toxinas, y tumores entre otros, Ambos sistemas son derivados de los

linfobiastos producidos en la médula ibsea, pero poseen diferentes caminos para su

diferenciación, lo que resulta en dos tipos de linfocitos: T y B, que actuarán tanto en la

inmunidad humoral como en la celular (Larson, 1992).

El componente celular del sistema inmune está constituido por los linfocitos y por las células denominadas citotóxicas espontáneas, así como de linfocitos facilitadores o ayudadores, y asesinos naturales. Entre las células accesorias, que están implicadas en la

activación de los iinfocitos, se incluyen los macrófagos, células dendnticas, de Langerhans, y de Kupffer, entre las más importantes. Los llnfocitos

T,

que maduran en el timo en la etapa fetal y postnatal temprana, presentan en su membrana diferentes proteínas con capacidad de reconocimiento específico del antígeno, activación y adherencia celular, entre otras muchas funciones (Rojas, 1988).

La base molecular del sistema inmune humoral, está formada por el sistema del complemento, las inmunoglobulinas (Igs), citocinas (iinfocinas y monocinas) y las proteínas del sistema principai de histocompatibilidad (Tresguerres, 1990).

Los linfocitos B, maduran en los mamíferos en la médula Ósea; poseen características morfológicas similares a las de

los

linfocitos T, pero presentan en sus membranas inmunoglobulinas de superficie. Tras su activación y maduración, inducida por el antígeno, éstos se diferencian hacia células plasmáticas, con capacidad de secretar inmunoglobulinas. Estas células se encuentran distribuidas a lo largo de todo el cuerpo, incluyendo a la glándula mamaria, por

lo

que es fácil encontrar Igs en sangre y en otros tejidos como mucosas y secreciones taler como saliva y lagrimas entre _otros.

Las hnunoglobulinas son una enorme familia de glucoproteínas, de alto peso

molecular, que comparten características fisicoquímicas, en donde entre 82 al 96% esta representado por polipéptidos y el 4 al 18% restante, por carbohidratos (Goodman, 1994) ademis poseen la capacidad de unión específica a un antígeno (Butler, 1969; Tresguerres, 1990; Goodman, 1994). Casi todas las propiedades de hs inmunoglobulinas derivan de los componentes polipeptídicos estructurales.

Estos

anticuerpos,

son

moléculas bifuncionales capaces de unirse específicamente al antígeno, generando Vanos fenómenos secundaaios.

Existen diversos tipos de inmunoglobulinas, pero su estructura básica comprende 4 cadenas polipeptídic$s: 2 cadenas ligeras

(L-)

y 2 cadenas pesadas (H-), idénticas entre si. En cada una de estas cadenas se identifica

una

porción variable y una porción constante, común para cada uno de los tipos de inmunoglobulinas. Las cadenas se encuentran unidas entre sí por puentes disulfuro, produciendo una configuración espacial en

forma

de

Y,

que resulta como la estructura básica o unidad, que conforma a los diferentes tipos de inmunoglobulinas.

Se conocen en el humano y en otras especies 5 clases y varias subclases de

inmunoglobulinas que presentan diferencias en las cadenas pesadas y similitudes en las cadenas ligeras (Butler, 1974). Las diferencias en las cadenas pesadas generan cambios en la actividad biológica, inmunogenicidad y _{estructura. Las} 5 clases también están presentes en los bovinos y se nombran de la misma manera que en los humanos: IgG, IgA, IgM, IgD e

IgE. Cada una posee una función específica dada por su estructura y se encuentran en concentraciones y momentos específicos para cada U M de ellas. Asi, por ejemplo, la IgG es

la inmunoglobulina más abundante en suero hasta en un 85% en casi todas las especies (Rojas, _{1988), y} también la mas abundante en el calostro bovino (Butler, _{1974). Su}

estructura es la unidad básica de las inniunoglobulinas, es decir, un monómero.

Por

su tamaño relativamente pequeño, es la única inmunoglobulina capaz de atravesar la placenta en humanos (Goodman, 1994), y de esta manera se confiere inmunidad al feto que es incapaz de sintetizarla (Rojas, 1988). En el humano se presentan 4 subclases de esta inmunoglobulina, IgG1, IgG2, IgG3

e

IgG4 y en bovinos _solo se presentan dos subclases:

IgGi

e

IgG2. En ambos casos, ésta inmunoglobuliia es la responsable de la protección del

recién nacido durante las primeras semanas de vida.

La I@ es una de las principales globulinas en leche y calostro en el humano, así como en d e s que trasmiten inmunidad vía placenta, ayudando a que el recién nacido tenga una memoria inmune activa (Butler, 1974). Además es la más abundante

en

saliva, laghas, mucosa intestinal, secreciones bronquiales y otras (Goodman, 1994). Tanto en

humanos como en bovinos encontramos tres subclases: IgAI, IgAz e IgA secretona (SI&,

siendo su estructura I'a de un monómero, dimero o tnmero. Se ha encontrado que la SIgA se

secreta localmente (Butler, 1974)

La IgM constituye aproximadamente el 10% de las inmunoglobuhnas en suero, su estructura es la de un pentámero cuando se encuentra en suero (Rojas, 1988).

No

es capaz de atravesar la placenta, en el calostro y la leche se encuentra en el mismo porcentaje que el presente en suero (Butler, 1974)

I@ e IgE se encuentran en muy bajas concentraciones en el suero, ambas estan presentes en el calostro humano y solamente la I@ en secreciones mamarias bovinas, ésta además es sintetizada localmente (Butler, 1974), en la submucosa del tracto respiratono y

digestivo (Rojas, 1988).

La

resistencia generada por el sistema humoral, en los mamíferos, puede adquirirse

de manera pasiva y natural por dos vías, in útero o vía calosfro (Brambell, 1970; Butler,

1974). Ambas vias u t i l i inmunoglobulinas presentes en el suero materno, encontrándose diferencias en la composición y monto de éstas entre las especies. En general, la mayoría de los mamíferos transfieren inmunidad pasiva al feto desde el útero, antes del parto,

a

través de la placenta vía sanguínea, lo que producir& defensas ai recién nacido, y siendo la proporción y el tipo de anticuerpos transportados dependiente por un lado del sistema inmune humoral de la madre y por otro, de la capacidad de transporte que presente la placenta existente

En

el

caso de la transferencia vía

calostro,

ésta se realiza después del nacimiento por medio de las secreciones lácteas de la madre, tanto calostro como leche y es de vital

importancia su ingestión para la sobrevivencia del recién nacido en las especies que presentan placentación poco invasiva, ya que constituye la Única fuente de inmunidad

temprana.

En general, las crías de los rumiantes como la vaca, la cabra y la borrega, obtienen toda su inmunidad a través de la ingesta de calostro, ya que

nacen

marcadamente

hipogamaglobulinémicas (Husband et al., 1972) o incluso agamaglobulinémicas (Clover and

Zarkower, 1980; Maunsell et al., 1998). En el

caso

particular de la vaca, la placenta

es

de tipo sindesmocorial, es decir, consta de 5 capas de tejido de las 6 capas iniciales con las

cuales se realiza el proceso de placentación y el epitelio uterino se mantiene a través de toda

la gestación, consecuentemente el paso de anticuerpos o de otras proteínas de la madre al feto no se realiza en esta etapa, por lo que la transferencia de inmunidad

se

lleva

a

cabo

extrauterinamente, mediante la ingesta de calcistro o leche.

La leche es secretada por los mamíferos con una primera función de proveer todos los requerimientos nutricionales del recién nacido. Sin embargo por accidente, pero más probablemente por diseño, la leche tiene otras funciones además de la estrictamente nutricional. Muchas de las funciones no nutricionales de la leche son proporcionadas por

proteínas y péptidos los cuales incluyen inmunoglobulinas, emimas e inhibidores de enzimas, transportadores de proteínas, factores de crecimiento y agentes antibacteriales (Larson, 1992).

Ya

que los requerimientos nutricionales y fisiológicos del recién nacido de cada especie son específicos, podemos decir que la leche de cada especie es más o menos

única.

El calostro es el primer aliento del neonato y esta constituido por UM mezcla de

secreciones lácteas y constituyentes de la sangre, en específico inmunoglobuiinas y otras proteínas séricas, que

se

acumulan en la glándula mamaria durante el período de preparto y en el periodo inmediato al nacimiento (Foley and Otterby, 1978). Además, el calostro contiene aminoácidos esenciales y no esenciales, ácidos grasos, lactosa, vitaminas y minerales, así como substancias no nutritivas tales como péptidos, hormonas peptidicas, factores de crecimiento, citocinas, hormonas esteroides, tiroxinas, poiiaminas, nucleótidos y enzimas. El calostro además de ser un importante suplemento alimenticio,

es

capaz de generar inmunidad pasiva y ayudar en la midiiración de órganos, así como producir cambios metabólicos y endocrinos (Blum and Hammon, 1999).

é'

E"

c'

c'

c

c

1-

Cuadro 1. Composición del Calostro

Extracto seco 23.9

Yo

Grasa 6.7 % Proteína 14al19%

Lactosa 2.7

Yo

Ceniza 1.11 %

I

Densidad 1.056

I

Schmidt, G.H. 1971.

El calostro comienza a formarse aproximadamente 3 semanas antes del parto en bovinos y su formación

se

encuentra regulada

a

través de un control hormonal, local y

humoral sobre la glándula mamaria. Durante la caiostrogénesis, los estrógenos séricos

se

incrementan 4 semanas antes del parto, las concentraciones de glucocorticoides, hormona

del crecimiento y prolactina se incrementa una semana antes del parto (Tucker, 1981). Los requerimientos hormonales mínimos necesarios para mantener la lactogénesis y la lactación son los giucocorticoides, prolactina e insulin% (Denamur, 1971). Además, en protocolos de vacas no lactantes, se ha logrado la producción de calostro con estrógenos y progesterona exógena (Smith et al., 1971).

Algunos

de los trabajos que demostraron que los componentes protéicos del calostro provenían del suero, surgen desde 1946, con los trabajos de E. 1,. Smith, donde se muestra por medio de aislamiento y análisis electroforético que la y-globulina, proteína predominante de la leche bovina, también llamada pseudo-globulina era química y antigénicamente idéntica a la y-globuiina de suero, llamada T-globulina, proteínas con una función inmunológica.

Posteriormente Dixon et al. (1961), niostraron que la ghdula mamaria de la vaca es capaz de incorporar continuamente proteínas séncas a sus secreciones al encontrar en éstas

y-globulinas marcadas selectivamente, con I. Después del parto, detectaron UM caida

9

sustancial en los niveles séricos de y-globulinas como una consecuencia del transporte selectivo hacia la formación de calostro, ya que el epitelio acinar de la ubre actúa como transportador de proteínas séricas. Observaron también, que el monto de y-globulinas

presentes en el calostro es igual al monto faltante de éstas proteínas en el suero. Además se

estableció en borregas, que este mecanismo de transporte selectivo es mucho más activo durante la formación de calostro que a lo 1ar;go de la lactación (Mackenzie and Lascelles,

1968).

El paso de estas proteína

a

traves de la barrera mamaría

a

tratado de explicarse de varias maneras; sugiriendo la transudación o filtración de los componentes sanguíneos (Linzell and Peaker, 1974) por situaciones anormales en la lactación tales como infecciones o mastitis, por un lado, y por otro, de un sistema altamente específico de transporte a través

de células secretonas, por medio de receptores de membrana específicos para IgG, de alta afinidad, atrapando a las proteínas y transportandolas a traves del interior de la célula, y

pasandolas

a

la luz por medio de pinocitosis (Larson, 1980).

El suero materno contiene mas de una. clase de inmunoglobulina, pero solo la IgG atraviesa del torrente sanguíneo hasta el lumen de la glándula mamaria.

La

IgGI es la que se acumule en mayor cantidad, es decir, de manera selectiva y en menor cantidad la IgGz con respecto a las otras clases de inmunoglobulinas presentes en el calostro, tales como la IgA e

IgM, ya que estas se derivan de una síntesis local de la glándula mamaria por estimulación

externa, en la mayoría de los casos (Larson, 1979; Norcross, 1982)

Se conoce que varios factores influyen en la transferencia pasiva de inmunoglobulinas calostrales. Estos incluyen la masa ingerida de Ig (Kruse, 1970), el tiempo posparto de la ingesta (Kruse, 1970; Matte et al., 1982; Olson et ai., 1981), la raza (Guy et al., 1994) factores ambientales (Nordone et al., 1997; Sheare et al., 1992), y el número de lactaciones (Leviux and Ollier, 1999), entre otros muchos.

La capacidad del recién nacido para absorber las inmunoglobulinas del calostro se encuentra restringida por al menos tres factores importantes: el tiempo de ingestión, la masa

ingerida y la concentración de inmunoglobulinas presentes en el calostro (Kruse, 1970;

Sheare et al., 1992).

-

E

l

tiempo en el que se realiza la ingesta, es un factor predominante, ya que por la

función que desempeñan estas proteínas, deben llegar intactas al torrente sanguíneo, atravesando el epitelio intestinal, lo cual

solo

puede ocurrir en las primeras horas de vida de la cría. Matte et al., (1982) plantean un período de absorción de 24 hasta 36 horas después

del parto, mientras que Selman et al., (1 970) proponen que durante las primeras 6 horas se

tiene la mayor eficiencia de absorción y ésta se reduce rápidamente a las 24 horas después

del parto.

El

incremento de inmunoglobulinas en el

suero

es una consecuencia de la masa ingerida de éstas, y siendo que la taza de absorción intestinal no logra ser del

loo%,

debemos considerar UM masa mayor de la encontrada normalmente en la sangre dl becerro.

Kruse (1970) sugiere que las crías recien nacidas consumen en

sus

primereas 12 horas de

vida al menos 100 g de inmunoglobulinas calostrales, masa suficiente para.aumentar la

concentración plasmática a valores que representan menores riesgo de salud para el animal.

Por

lo que

la

masa ingerida es un factor detexminante en la sobrevivencia del becerro

El becerro tiene un limite de ingestión, por lo que es importante saber la

concentración de inmunoglobulinas en el cdostro, ya que si esta

es

baja, necesitará ingerir grandes cantidades de calostro para poder lograr la masa requerida, en el memor tiempo posible. Se debe tomar

en

cuenta la capacidad de ingestión del becerro, lo cual también se convierte en UM limitante, ya que el

becerro

no tomará más de 4 litros de c ,lostro por día,

por

lo

que resulta muy importante que el calostro tenga UM concentración de al menos

15

a

20 m g / d de inmunoglobulinas

Trabajos realizados por Dawe et al (1982), han demostrado que la utiiización de

análogos del cortisol, como la dexametasona, producen una disminuci6n

en

las I

concentraciones de inmunoglobulinas calostrales. Por otra parte Brandon et al (1975)

reportaron

una

disminución de

IgGi

en el calostro de animales a

los

que se les aplico acetato

11

i1

b

DE.-

'E

'

1:

a

de dexametasona tnmetilada, aunque en este caso los animales se encontraban a 6-8 semanas del parto.

Es

bien conocido que la administración de glucocorticoides reduce el número de

linfocitos, monocitos y eosinófilos circulan1 es, principalmente al aumentar su desplazamiento

fuera de la circulación. También reducen la producción de linfocitos y las funciones mediadoras y efectoras de estas células. (&on and Tyrrell, 1995).

La vasodilatación y el aumento de la permeabilidad vascular que se producen durante la inflamación junto con la liberación de sustancias quimiotácticas, genera un aumento del niimero de leucocitos en el área inflamada. Estas reacciones están mediadas en gran parte

por las prostaglandinas y leucotrienos. El cortisol induce la síntesis de lipocortina, que inhibe la actividad de la fosfolipasa A?, dando como resultado un bloqueo de la generación de

ácido araquidónico, precursor de las prostaglandinas y los leucotnenos, evitando con este bloqueo, la inflamación.

El cortisol inhibe también la liberación de histamina por las células cebadas y los basóñlos, y al estabilVar la membrana de los lisosomas de las células fagocíticas, impide la liberación de las enzimas proteolíticas.

Los

glucocorticoides tienen acciones muy marcadas sobre los macrófagos y

linfocitos

T,

ya que son capaces de inhibir la liberación de interleucina 1 que aumenta la proliferación de los liiocitos T, y de inhibir también la interleucina 2 liberada por lo

linfocitos T activados, que producen el intexferón, produciendo así una inhibición de la

actividad de los macrófagos y de las células citotóxicas espontáneas, que juegan un papel muy importante en la inmunidad específica, además de su participación en la respuesta infirmatoria.

En dosis elevadas los glucocorticoides pueden producir la muerte de los linfocitos,

por lo que órganos como el timo, el bazo y los ganglios Idáticos involucionan y disminuyen

que sobre los

T.

El cortisol en dosis fisiológicas aumenta la síntesis de inmunoglobulinas,

pero en dosis fannacológicas disminuye el número de inmunoglobulinas circulantes, la

proliferación de las células

B

e incluso puede producir su citolisis

Los factores liberados por las células inmunológicas, la interleucina 1 y la

interleucina 2, el interferón y los factores tímicos actúan sobre el eje suprarrenal,

produciendo un aumento del cortisol plasmático.

Es

decir, la activación del sistema

inmunitario induce la liberación de factores que, entre otras acciones, estimulan la secreción

de cortisol. El cortisol a su vez, al inhibir la actividad del sistema kmunitario y la secreción

de sus factores, previene o modula la intensidad de la respuesta inmunológica, se forma así

un circuito regulador, perfectamente contrlolado y el sistema inmunitario, a pesar de tener

una

autorregulación intrínseca, queda bajo la dependencia del sistema neuroendócrino

(Tresguerres, 1990).

Por otra parte, la retención de la placenta (permanencia de las membranas fetales por

más de 12 horas después del parto) en la vaca, se ha asociado con situaciones estresantes,

tales como el estrés de transporte previo al parto, en donde los animaies que sufrieron este

estrés y prexntaron retención de la placenta, mostraron una marcada reducción de la

actividad quimiotktica (Heuwieser, W. and Gmnert, E. 1987). Otros autores,

han

señalado

que los niveles plasmáticos de cortisol se incrementan significativamente durante el preparto

en los animales

con

retención de membranas fetales (Matton et al., _1979; Peter and Bosu,

1987).

Así

mismo en trabajos en los que se indujo el parto con análogos de cortisol se

observo que entre el 62 y el 83% de las vacas tratadas presentaron RP (6ninert and Jochle,

1975; Mendez and Wiltbank, 1986). Aparentemente una de las causas de este padecimiento

es el incremento de c6rtisol materno, que ocurre como parte de la respuesta de estrés.

Así

en

el caso de la vaca, el incremento de cortisol hacia el momento del parto, disminuye la

actividad fagocitaria (Heuwieser, W. and Grunert, E. 1987) y de colagenasa (Eiler and

HopKins, 1992), indispensables para el desprendimiento normal de las membranas fetales;

produciendo entonces la retención.

De esta manera el incremento de cortisol materno podría ser el hilo conductor que

explique

la

relación entre la observación que los productores han hecho sobre la mala

calidad del calostro en vacas que presentaron retención de las membranas fetales.

I

OBJETIVO

Definir si exifte U M diferencia en la composición del calostro en vacas con y sin

retención de placenta.

OBJETIVOS PARTICULARES

a) Determinar las concentraciones de grasa presentes en el calostro de vacas

con

y

sin retención de placenta.

b) Determinar las concentraciones de proteínas totales presentes en el calostro de

vacas con y sin retención de placenta.

c)

Determinar las concentraciones de caseína presente en el calostro de vacas con y

sin retención de placenta.

d) Determinar las concentraciones de inmunoglobulinas presentes en el calostro de

vacas con y sin retención de placenta.

MATERZALES Y METODOS

Muestras

Las muestras de calostro fueron colectadas en el "Rancho La Palma", ubicado en

Coacalco, México ya que presenta una alta incidencia de retención de placenta. Se utilizaron

13 vacas que presentaron partos normales, y 14 vacas con retención de placenta, en las que

la placenta fue expulsada después de 12 horas siguientes al parto. De cada vaca se

obtuvieron aproximadamente 100

ml

de calostro a los que se les adicionó 5 ml de H202

(30% vív), se mantuvieron en refrigeración para su traslado y se congelaron

a

-20" C hasta

la determinación de su composición.

E1

calostro fue tomado inmediatamente después del parto y posteriormente, se

clasificaban en limpias o con retención de placenta. Llamaremos vacas limpias a los animales

que presentaron partos normales.

Para definir si existe una diferencia. en la composición de los calostros, analizamos

algunos de sus componentes más importantes como lo son: la grasa, proteínas totales,

caseína

e inmunoglobulinas.

A continuación desglosamos la metodología utilizada para la

separación de cada una de las fiacciones mencionadas y posteriormente la form de

cuantificarlas.

Separación de Grasa. Se tomaron 10 nil de cada muestra y se centrifugaron durante

2.

horas a 3 O00 x g a 4'

C,

formándose

una

placa de grasa fácil de separar de la fase acuosa

con una espátula, inmediatamente se peso cada placa (Butler and Maxwell, 1972). Se

tomaron duplicados de las muestras para corroborar los resultados.

Separación de proteínas totales. De cada muestra desgrasada, se tomó U M fracción para

prepara una dilución, para cuantificarlas por una modificación del método de Biuret

(Copeland, 1994)

Separación de Caseína. A las muestras ya desgrasadas, se les adicionó ácido acético gota a

gota hasta obtener

un

pH de 4.6, en agitación constante

a

temperatura ambiente. Una vez

formado el precipitado, se incubaron las muestras durante 30 minutos, posteriormente se

centrifugaron a 15 O00 x g a 4' C (modificado de Butler and Maxwell, 1972), guardando el

sobrenadante y _{separando el precipitado, el cual fue resuspendido} a _{su volumen} original,

para su posterior cuantificación por una mod~cación del método de LOV (Copeland,

1994).

Separación de Inmunoglobulinas.

Los

sobrenadantes anteriores, se llevaron a pH 7

con

una solución de NaOH, 1 M. Se les adicionó el mismo volumen de UM solución saturada

(100%) de sulfato de amonio (("I)SO4), para precipitar las proteínas restantes, adicionándose lentamente con agitacihn constante y permitiendo que se incorporara

perfectamente bien a la muestra. Se incubaron por 30 minutos y posteriormente se

obtuvieron los precipitados por centrifugación a 5 O00 x g

a 4'

C, durante 30 minutos,

descartando el sobrenadante y resuspendiendo el boton en dos terceras partes de su volumen

inicial y añadiendo una terc-xa parte de su volumen inicial de una solución al 100% de

sulfato de amonio (NHq)SO4. Se incubaron por 30 minutos a temperatura an.oiente y se

(Williams et al., 1975). El boton fue resuspendido

en

el volumen inicial, para su

cuantificación por UM modificación del método de Lowry (Copeland, 1994)

ESTANDARES

Se utilizaron 3 estandares diferentes para cuantificar las diferentes fracciones

proteicas: albúmina sérica bovina (Sigma Chemical Co., A2153), caseína e

inmunoglobulinas. Estos dos últimos se obtuvieron

a

partir de las muestras colectadas y

siguiendo la metodología descrita a continuación.

De los mismos calostros se tomaron fracciones, obteniéndose 60 mi, los cuales fue

desgrasado, posteriormente

se

centrifugó durante 2 horas

a

3 O00 x g a 4' C, formándose en

la superficie una placa de grasa fácil de separar (Butler and Maxwell, 1972).

Obtención de estandar de caseína. Se acidifid la muestra con ácido acético, agregándolo

gota a gota con agitación constante, hasta obtener un pH de 4.6. Se incubó

a

temperatura

ambiente durante 30 minutos y posteriormente se centnfugó a 15 O00 x g

a

4' C

(modificado de Butler and Maxwell, 1972), guardando el sobrenadante y separando el

precipitado. El peso del precipitado

fue

de 15.2 g. Ya que no se cuenta con una

leoíiliiadora, la muestra se seco

en

homo a 37°C promedio, hasta obtener la fkacción seca,

con un peso de 4.90 g. De esta fracción

seca,

se tomó 1 g el cual

se

diluyó en 100

mi

de

agua destilada y desionizada, siendo esta la solución madre de caseína, con una

concentración de 10 m@mi.

Obtención de estandar de inmunoglobulinas. El sobrenadante del precijtado de caseína,

se u t i l i para obtener la fracción que contiene las inmunoglobulinas. Se elevó el pH a 7 con

18

!

una solución de NaOH 1 M. Se adicionó el mismo volumen de una solución saturada

(100%) de sulfato de amonio (("4)SO4), lentamente con agitación constante y permitiendo

que se incorporara perfectamente bien a la muestra. Se incubó por 30 minutos y

posteriormente se obtuvo el precipitado centrifugando a 5 O00 x g a 4' C, descartando el

sobrenadante y resuspendiendo el precipitado en dos terceras partes de

su

volumen inicial y

añadiendo una tercera parte de la solución de sulfato de amonio saturada, para obtener una

solución al 33% de sulfato de amonio, e incubando por 30 minutos a temperatura ambiente.

Se centrifugó

a

5 O00 x g a 4' C, por 30 minutos, estos lavados se realizaron hasta obtener

un sobrenadante claro, obteniendo en el precipitado la fracción de inmunoglobulinas

(Williams et ai., 1975). El precipitado se disolvió en el mínimo volumen de agua y se dialió

en una membrana de celulosa, previamente lavada con agua destilada y NaOH 1 N. La

diáiisis se reaiiió en un cuarto f30

a

4°C realuandc cambios de agua destilada dos veces por

día hasta obtener el agua libre de sulfato de amonio,

lo

cual se comprobó, reaiiido una

prueba con una solución de cloruro de bario saturada, ya que la presencia de iones sulfato

formará

un precipitado blanco (sulfato de bario) con la solución (Campbell et al., 1964).

Una

vez libre de sulfato de amonio,

se

colocó el

mismo

tubo de diálisis en un matraz

Kitasato, el cual se

conectó

a una bomba de vacío, para poder extraer la mayor cantidad de

agua posible, obteniendo una "pasta" ya que no se cuenta

con

una leofiiiidora.

Se tomó

un

gramo de la fracción hidratada y se seco en homo a 37°C promedio,

hasta obtener la fracción seca y _registrando un peso de 0.25 g

,

con lo cual podemos inferir

el porcentaje de agua que contiene la fracción hidratada, siendo que

un

1 g de ésta equivale

a

0.25 g de la fracción de inmunogl0bulina.i secas.

Se dividió entonces la fracción hidratada en 5 frascos, conteniendo 2 g cada uno.

Uno de ellos se diluyó en 50 mi de agua destilada y desionizada, siendo esta la solución

madre de inmunoglobulinas, y partiendo de ésta se realizó otra dilución con una

concentración de 1 mg/mi, que fue la utilizada para estandarizar la metodología para

cuantificar proteínas.

fu

u

COMPROBACION DE LOS ESTANDARES

Para corroborar las concentraciones de los estandares obtenidos, se realizaron varias

curvas de estos contra albúmina sérica bovina comercial, obteniendo las siguientes gráficas y

ajustando UM regresión lineal para cada una, para su comparación.

-

Caseína

--c Albúmina

Regresión lineal

9mi

A!bímina

Inminogbkilinas

MEDICION DE PROTEhAS

Para la cuantificación de todas las fracciones protéicas, se estandarizaron dos métodos de medición: Biuret y Lowry, ya que los rangos de proteínas a cuantificar eran muy

amplios. Los protocolos para ambas técnicas fueron tomados de Methods for protein analysis:

a

practical guide to laboratory protocols. R.A Copelan, 1994. Chapman & Hall, New York

Proteínas totales. Se utilizó UM modificación de Biuret, con un rango de detección de 0.5 a

80 mg/mi, ya que las concentraciones de proteínas totales del calostro reportadas en la

literatura oscilan entre 176-190 g/L (Ruckebusch y col., 1994). El reactivo de Biuret se preparó en el laboratorio siguiendo el protocolo descrito por Copelan (Cuadro 1 y

Apéndice).

Para la curva estandar se utilizó Albumina Sérica Bovina, con una concentración en la solución madre de 1 O mg/mi

Para la medición se tomo la muestra con una dilución 1:25, ya que la cantidad de proteina que presenta rebasa

la

sensibilidad de la técnica. Para la lectura en el espectrofotómeíro se utilizó uno de la marca Beckman de la sene 600 y

se

utilizaron celdas

desechables de poliestireno, con capacidad de 1.5 ml.

Cuadro 2. Procedimiento de la Prueba de Biuret

Mezclar vigorosamente e

incubar

45 minutos

a

3OoC en baño

con

Curva

de

Albúmina

I I

0.0 1.5 3.0 4.5 6.0

o.

oo-,

Concentración (niglmi)

E

l

d k & correlación fue de 0.9890 a P < 0.05

Caseína e inmunoglobulinas. Se u t i l i una modificación de Lowy (Copelan, 19941,con

una sensibilidad que va de

1

hasta 300 plíml, y el reactivo de Lowry se preparó en el

laboratorio siguiendo el protocolo descrito por Copeland (Apéndice). Se prepararon las

soluciones base y para cada ensayo solo se preparaba la cantidad

a

utilizar.

El protocolo seguido para la medición de las muestras, así como la curva patrón, se muestra a continuación y se incluye la precipitación de proteínas debido a la concentración de éstas en la muestra.

Reactivo de Folin

I

300 pl Cuadro 3

300

fl

I

300pl

P

m a

e

al

.o

O

Concentración (pglmi)

C u r v a de Inmunoglobulinas

o'601

Curva d e Caseína

o'601

*

.g 0 . 4 5 Q o

L

U

m 'c> 0.30

a c

o O

In

m

u n og lo b u lin as

I

30 4 0 5 0

Con can tración ( p glm I)

El coeficiente de corrdación de l a curvas fue de 0.9467 para caseína y de 0.9289

para inmunogiobuiina, ambos a

P

< 0.05.

RESULTADOS

En

todos los casos se presentan los valores en g/i y solo el promedio del peso de los

duplicados o triplicado de cada animal, presentando el promedio y la desviación estándar

para cada grupo al final de cada columna.

La

cantidad de grasa de valoró por duplicado,

no

se

observa diferencia entre los

grupos, y los valores presentan U M dispersión moderada, ya que tenemos valores desde 1.6

hasta 18.9 gil de grasa en el calostro (Cuadro 4).

Cuadro 4.

Las proteínas totales se comeron por triplicado, ambos grupos, presentan valores bajos 40.7 g/l para vacas

con

RP y 58.46

s/i

para vacas limpias; ambos grupos presentan valores dentro de

lo

reportado en la literatura, pero las vacas que tuvieron retención de

placenta poseen una desviación estándar menor que las limpias.

No

existe diferencia entre

ambos grupos (Cuadro 5)

9a 1 Oa

76.83 9b 90.76

88.92 1 Ob 138.44

Para el caso de las Casemag ei grupo que presento

RP

solo tiene 10 animales, ya que

las muestras

se

perdieron en

d

manejo, mientras que

en

el grupo de vacas limpias solo se

perdió una muestra. En este caso si existe diferencia significativa (p

<

0.05) entre los

grupos, presentándose niveíesmryons

en

las vacas con

RP

que en las vacas limpias. Ambos

grupos presentan desviaciones 6aih-e~ (Cuadro 6).

26

1 la 70.27

12a 102.25

-

13a 197.16

14a 126.03 Promedio

f

9.33331 7.49

I

l l b 75.8 12b 165.46 13b 200.19

Cuadro 6

Promedio

llb 46.76

I

12b 30.48

38.61 f 17.05

1

27.60 f 12.71

Las inmunoglobulinas presentan una diferencia significativa, las vacas con retención

de placenta tienen la mitad de la concentración que las vacas limpias. Poiiemos ver que muchos animales con retención de placenta poseen un nivel menor

a

10

gA

y algunos no alcanzan lg/tnl, contra los animales con partos normales, la mayoría presenta ai menos concentraciones por arriba de los 10

gA

(Cuadro 7).

Cuadro 7

5 88 20 48

7.58 f 6.72! 15.13 f 8.56

Promedio

Componentes Retención de Placenta Limpias

calostrales X f d . e .

(a)

X f d. e.

(a)

Grasa Proteína Total

Caseína

8.57 i 4.73 (n = 'i4)

99.33 f 47.49 (n = 14)

38.61 I 17.05 (n =, 10)

9.72 f 5.81 (n = 13)

125.33 k 48.7 (n = 13)

27.60

+

12.71 (n = 12)

Inmunoglobulinas 7.58f6.72(n= 11) 15.13 +8.56(n= 11)

En el cuadro 8 se presenta la comparación de los promedios por grupo más desviación estándar, así como la P en la prueba t de Student para cada componente.

P

0.27

O. 17

0.049 0.018

I

DIS

I

L,

.

i variación entre los animales del mismo grupo, no permite ver que exista una relación entre la presentación o no de retención de placenta y la concentración de grasa, pero existen trabajos' donde reportan que es uno de los componenetes del calostro con más

variación con respecto a

raza,

estado nutnció y número de parto (Schmidt,

G.H.

1971).

Las diferencias entre los grupos mas marcada se presenta en la concentración de inmunoglobulinas; en las vacas con retención de placenta es la mitad de la presente en vacas limpias, 7.58 contra 15.13 gll. Las concentración de éstas proteínas en vacas Holstein oscilan entre O hasta 120 m g h l de calostro, siendo la raza con más variación y niveles más bajos de inmunoglobulinas (Guy et al., 1994; Tyler et al., 1999). Guy y colaboradores reportaron concentraciones de 14.4 f 4.0 m g í d que son muy similare a las que presentan

las vacas limpias de este experimento (1 5.13 :ir 8.56 mg/d).

Por el contrario la caseína se incrementa en vacas que presentan retención de placenta con respecto a las vacas limpias. Ganguiy y colaboradores (1980), mostraron que la

prolactins y el cortisol poseen una acción sinérgica sobre la estimulación de la expresión del gen de la caseína en la glándula mamana, además produce un incremento de la concentración de caseína y de su mRNA dentro de la glándula mamaria.

E

l

calostro contiene un porcentaje alto de proteínas totales, que va del 14 al 19%,

contra el 3.3% presente en la leche, (Ruckebusch et al., 1994; Schmidt, 1971).

Los

valores obtenidos en este trabajo son similares a los reportados en la literatura y no se ven afectado por la presencia de retención de placenta.

El

decremento en las inmunoglobulinas en vacas con retención d * placenta debería

refiejarse en la concentración de proteínas totales, pero el incremento que sufre la caseína provoca que la concentración total no se vea alterada; es decir, el contenido de proteínas totales es igual en ambos grupos,

lo

que se modifica es la proporción de cada componente: la caseína y las inmunoglobulinas.

La utilización de técnicas de uso rutinario,

como

10 son los protocolos de medición de proteínas puede darnos información relevante, sin tener que pensar que se necesitan equipos y _{experimentos sofisticados para obtener resultados; en este caso estas herramientas}

permitieron plantear una asociación entre la retención de membranas fetales y

una

baja

concentración de inmunoglobulinas en el calostro de vacas lecheras, la descripción de esta asociación tiene importancia académica y prktica pues permite por un lado avanzar

mas

en el conocimiento de los mecanismos relacionados con la formación de calostro y por otro desde un principio permite sugerir a los productores que se administre colostro de vacas sanas a los becerros nacidos de vacas con retención de placenta.

31

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APE

N

D

I C

E

Reactivo

de

Biuret

Sulfato de Cobre (CuS04-5H20) Tartrato de sodio y potasio Sol. de NaOH al 10%

1.5 g 6.0 g 300 ml

Disolver los 2 primeros reactivos en 500 ml de agua destilada, adicionar los 300 ml

de la sol. de NaOH al 10% y aforar a 1 litro con agua destilada y almacenar en una botella color ambar. El reactivo puede almacenarse bajo estas condiciones por tiempo indefinido.

Reactivos para

reactivo

de Lowry Reactivo A

Tartrato de sodio (Baker

Carbonato de sodio 10 g

0.2 g

Sol. de NaOH al 3.2% 69 ml

Disolver las sales en los 69 ml de NaOH y diluirlo

a

100 mi con agua destilada.

Reactivo

B

Tartrato disódico 29

Sulfato de cobre I g Sol. de NaOH al 3.2% 12 5 ml

Disolver las sales en los 12.5 ml de NaOH y diluirlo

a

₁₀₀

ml

con agua destilada

Reacti 'o C

25 volumenes de NaOH 18 volumenenes de reactivo A 2 volumenes de reactivo B

Preparar inmediatamente antes de usarse.

S Y

Reactivo de Foiin (FoiinCiocaiteu)

2 volumenes de

H,O

1 volumen de reactivo de Folin

Preparar justo antes de utilizarse.

Reactivos para precipitar proteínas a) Acido tncloroacético

Aforar a 100

mi

con agua destilada.

24 8

b) Dioxicolato de sodio If3 Aforar

a

100 mi con agua destiiada.

Estandar de Albúmina Albúmina senca Bovina

Aforar

a

5 ml con agua destilada. Checar la concentración espectrofotometncamente

a

280

nm (A= 6.60) y ajustar.

Membrana para diáiisis Marca: spectrapor

M.W. cutoff= I2

-

14 O00 voUcm = 3.2 ml

diámetro en seco = 20.4

mm

Ciri

abisrla ₁₁ lismpo

u

tl

IVER S I DAD AUTO NO MA M

ETR

O

P

O

LlTAN

A

DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

DR.

JESUS GERARD0 SAUCED0 CASTANEDA