Susceptibilidad de pseudomonas aeruginosa, staphylococcus aureus y aspergillus flavus al aceite esencial de la corteza de cinnamomum verum “canela”

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE MEDICINA. át ica. yC. om un. ica ció. n. ESCUELA DE MEDICINA. Susceptibilidad De Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Aspergillus. m. flavus Al Aceite Esencial De La Corteza de Cinnamomum verum “Canela”. In. fo r. TESIS. de. PARA OPTAR GRADO DE:. AUTOR:. AUGUSTO CÉSAR URIOL DIAZ. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. as. BACHILLER EN MEDICINA. ASESOR: Dra. ELVA MEJÍA DELGADO TRUJILLO-PERU 2014. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. n. A Dios, por cada una de las. ica ció. maravillosas bendiciones con las. om un. que llena mi vida.. A mis queridos padres César y. yC. Elva, por representar en mi vida. át ica. la expresión más noble y sublime de amor. Su cariño inmenso,. constante, iluminan siempre mi camino.. de. In. fo r. m. invalorable esfuerzo y apoyo. as. A mis hermanos Héctor y. em. Eduardo, por su sincera. Si st. amistad, por el gran ejemplo y la grata compañía que. Di re cc. ió. n. de. significan en mi vida.. Los amo con mi vida.. pág. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. n. AGRADECIMIENTOS. ica ció. A la Gloriosa Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo,. om un. por haberme acogido en sus aulas, por haber cobijado mis sueños de aprender el arte. yC. y ciencia de la Medicina y brindarme la oportunidad de cumplirlos a cabalidad.. át ica. A mis maestros, en especial a la Dra. Elva Mejía Delgado, por sus consejos,. fo r. m. tiempo y dedicación y por compartir desinteresadamente sus amplios conocimientos. de. In. y experiencia.. em. as. A mis querida Promoción XLVIII, por la gran amistad que se forjó al haber. Si st. iniciado juntos esta increíble experiencia en las aulas universitarias y por compartir. n. de. la ilusión de ser excelentes personas y médicos.. Di re cc. ió. A Jimena Lisset, Sarita Rocío y Karla Yulissa, por su entrañable amistad y. valioso apoyo en la realización de la presente investigación, por esa complicidad y. aprecio que compartimos siempre. Gracias por hacer de esta noble experiencia, un. recuerdo maravilloso.. pág. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. INDICE RESUMEN…………………………………………………………………………..5. n. ABSTRACT………………………………………………………………………….6. ica ció. I.INTRODUCCION……………………………………………………............7. om un. II.MATERIALES Y METODOS………………………………………………15. yC. III.RESULTADOS………………………………………………………………31. át ica. IV.ANALISIS Y DISCUSION………………………………………………… 47. fo r. m. V.CONCLUSIONES…………………………………………………………...55. In. VI.RECOMENDACIONES…………………………………………………….56. as. de. VII.REFERENCIAS BIBLIOGRAFIAS………………………………………...57. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. VIII.ANEXOS…………………………………………………………………….65. pág. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN. Objetivos: Evaluar la Susceptibilidad de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Aspergillus flavus al aceite esencial de la corteza de Cinnamomum verum “Canela”, y determinar a qué concentración del aceite esencial 15%, 30%, 60%, 90%, se produce inhibición del crecimiento microbiano.. om un. ica ció. n. Material y Método: La extracción del Aceite esencial a partir de la corteza de Cinnamomum verum, se realizó utilizando el método de destilación por arrastre con vapor de agua. Luego se realizó la separación por concentraciones a 15%, 30%, 60%, 90%. Las cepas de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213 y Aspergillus flavus ATCC 16404 fueron cultivadas, y sembradas en placas Petri conteniendo Agar Mueller Hinton.. át ica. yC. Se realizó la prueba de susceptibilidad utilizando la Técnica de Kirby y Bauer. Se prepararon discos de papel filtros estériles Whatman N°4 y se les sumergió dentro de cada una de las concentraciones de aceite esencial; después, fueron colocados sobre los cultivos de los microorganismos. Existieron grupos controles, los fármacos Imipenem y Vancomicina, Fluconazol y alcohol al 96%. Las placas se incubaron a 37°C durante 24 horas. Finalmente la lectura se llevó a cabo a las 24 horas. as. de. In. fo r. m. Resultados: Existe diferencia significativa entre los diámetros promedios de inhibición según la concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum sobre Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Aspergillus flavus. En relación a Pseudomonas aeruginosa, se encuentran 3 grupos significativamente diferentes entre sí a un nivel de significancia de 0.05, alcanzando un halo de inhibición promedio máximo de 19.00 mm, con una concentración de aceite esencial al 60%, presentando una susceptibilidad media de acuerdo a la escala de Duraffourd.. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. Para la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 29213 se encontró 5 grupos significativamente diferentes entre sí a un nivel de significancia de 0.05, y el promedio más alto de diámetro de inhibición de 32.17 mm se obtuvo con una concentración de aceite esencial al 60%, Con respecto a la cepa de Aspergillus flavus ATCC 16404 se evidencio 5 grupos significativamente diferentes entre sí a un nivel de significancia de 0.05, y el promedio más alto de diámetro de inhibición de 40.67 mm, se corresponden con una concentración de aceite esencial al 30%, considerándose las dos últimas cepas en estudio sumamente sensibles, de acuerdo a la escala de Duraffourd. Conclusiones: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Aspergillus flavus, son susceptibles al aceite esencial de la corteza de Cinnamomum verum “Canela”. La inhibición del crecimiento de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213 y Aspergillus flavus ATCC 16404, se produce con todas las concentraciones del aceite esencial de Cinnamomun verum. Palabras clave: Aceite esencial, Cinnamomum verum, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Aspergillus flavus pág. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. ica ció. n. Objective: To recognize the susceptibility of Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Aspergillus flavus to the bark essential oil of Cinnamomum verum, and also to determine which concentration of the essential oil at 15%, 30%, 60%, 90%, produces microbial growth inhibition.. yC. om un. Material and Methods: The extraction of essential oil from the bark of Cinnamomum verum, was performed using the Distillation with steam Method. The different concentration of essential oil were spliced into 15%, 30%, 60%, 90%. Strains of Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213 and ATCC 16404 Aspergillus flavus were cultured and seeded in Petri plates containing Mueller Hinton Agar.. fo r. m. át ica. Susceptibility testing was performed using the Kirby Bauer technique. Discs of sterile Whatman filter paper No. 4 were prepared and were immersed into each of the concentrations of essential oil; then were placed on the culture of microorganisms. Controls groups were formed by, Imipenem, Vancomycin, Fluconazole drugs, and 96% alcohol. The plates were incubated at 37 ° C for 24 hours. Finally reading was performed at 24 hours. em. as. de. In. Results: There is significant difference between the average diameters of inhibition depending on the concentration of essential oil of Cinnamomum verum on Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Aspergillus flavus. Regarding P. aeruginosa, there are 3 groups that differ significantly at a level of significance of 0.05, reaching average maximum inhibition halus of 19.00 mm, with a concentration of essential oil at 60%, with an average susceptibility according to Duraffourd scale.. Di re cc. ió. n. de. Si st. For Staphylococcus aureus strain ATCC 29213 5 groups that differ significantly at a level of significance of 0.05, and the highest diameter of 32.17 mm average inhibition found was obtained with a concentration of 60% essential oil. With respect to the strain of Aspergillus flavus ATCC 16404, it presents 5 groups that differ significantly at a level of significance of 0.05, and the highest diameter of 40.67 mm average inhibition was evident, corresponding to a concentration of 30% essential oil, considering the last two strains highly sensitive study, according to the scale of Duraffourd. Conclusions: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Aspergillus flavus, are susceptible to essential oil of Cinnamomum verum bark "Canela". Growth inhibition of Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213 and ATCC 16404 Aspergillus flavus occurs with all concentrations of the essential oil of Cinnamomum verum. Keywords: Essential oil, Cinnamomum verum, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Aspergillus flavus. pág. 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. 1.1. INTRODUCCION. ANTECEDENTES. n. Los aceites esenciales (también llamado aceites volátiles o etéreo, porque se evaporan. ica ció. al ser expuestos a calor en contraste con aceites fijos) son compuestos olorosos y volátiles que se encuentran sólo en el 10% del reino de las plantas y se almacenan en especiales secretoras frágiles de la planta, tales como glándulas,. om un. estructuras. conductos, cavidades secretoras o conductos de resina.1 El contenido total de aceite. át ica. yC. esencial de las plantas es generalmente muy baja y rara vez supera el 1%. 2. m. Los Aceites esenciales de plantas se han utilizado durante cientos de años como. 3. Una planta muy estudiada es el Cinnamomum verum. In. bacterias, hongos y virus.. fo r. medicinas naturales para combatir una gran variedad de patógenos, incluyendo. de. conocida en nuestro país como “Canela”; El género Cinnamomum, pertenece a la. em. as. familia Lauraceae, nativa de Sri Lanka, comprende varias especies, son árboles de. Si st. hojas perennes y la mayoría son aromáticas. Su sabor es debido a sus aceites esenciales aromáticos, que comprende 0.5% a 1% de su composición. Los aceites. de. esenciales se obtienen por destilación en corriente de vapor de agua de las distintas. Di re cc. ió. n. especias de Cinnamomum, tales como C. verum C. Zeylanicum y C. Cassia.4. Según la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO, 2006), el aceite de hoja de canela (C. zeylanicum) contiene 75-85% de Eugenol con una alta actividad antibacterial, y contiene 5% de Cinamaldehído, el cual contribuye con su carácter aromático y características antimicrobianas.5. pág. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En un estudio realizado recientemente, Freire (2011) determinó que la composición química del aceite de canela obtenida por cromatografía de gas acoplada a espectrómetro de masa (GC/MS) revela que el mayor componente de dicho aceite. ica ció. n. esencial es el aldehído cinámico (87,7%) seguido de α-pineno (7,98%) y β-pineno. om un. (4,23%). 6. La fragancia y composición química de los aceites esenciales puede variar en función. yC. de la ubicación geográfica y climática, y las condiciones de crecimiento (tipo de suelo,. át ica. el clima, la altitud y la cantidad de agua disponible), estación del año, y la hora del. fo r. m. día en que se logra la cosecha. 7. In. Además, hay otro factor importante que influye en la composición química de los. de. aceites esenciales, a saber, la composición genética de la planta. Todos estos factores. as. biotópicos (genéticos y epigenéticos) influyen en la síntesis bioquímica de los aceites. em. esenciales en un determinada planta. Por lo tanto, la misma especie de planta puede. Si st. producir un aceite esencial similar, sin embargo con diferente composición química,. ió. n. de. que resulta en diferentes actividades terapéuticas. 8. Di re cc. Cuminaldehido o aldehído cinámico, ha demostrado tener una amplia gama de actividades beneficiosas para la salud, pues posee efecto antiviral, antimicrobiano, y diversos efectos sistémicos como tónico, vasodilatadores, hipotensor, calmante, antipirético, sedante, antiespasmódico.9. pág. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Una de las posibilidades de acción del aceite esencial de Cinnamomum verum es la generación de un daño irreversible a la membrana de las células bacterianas, que inducen pérdidas de material (citoplásmica), las fugas de iones, la pérdida de energía. ica ció. n. sustrato (glucosa, ATP), que conduce directamente a la lisis de bacterias (citólisis) y por lo tanto a su muerte. Otra posibilidad de acción es la inhibición de la producción. om un. de amilasa y proteasa que resulta en la parada de la producción de toxinas, el flujo de electrones y resulta en la coagulación del contenido de la célula.10. yC. Extractos esenciales de la corteza de las plantas del género Cinnamomum tiene. át ica. actividad antibacteriana hacia una gama de microbios, incluyendo Pseudomonas. fo r. m. aeruginosa y Staphylococcus aureus.11, 12, 13. In. Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram-negativa encontrada en el suelo, el. de. agua y los animales, pero también es un patógeno oportunista en los seres humanos.. as. Puede infectar las vías pulmonares y urinarias, heridas y quemaduras y provocar. em. devastadoras complicaciones médicas por la formación de biopelículas en. Si st. dispositivos médicos, tales como catéteres. Las biopelículas formadas por. de. Pseudomonas aeruginosa permiten que este patógeno pueda evadir el tratamiento con. Di re cc. ió. n. antibióticos y causar persistentes, y a veces mortales, infecciones.14. Staphylococcus aureus, una bacteria Gram- positiva puede existir tanto como un comensal y como patógeno. Como un patógeno, esta bacteria es responsable de una amplia gama de enfermedades, desde infecciones superficiales de la piel a graves infecciones sistémicas. El tratamiento de S. aureus se complica por resistencia a los. pág. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. antibióticos, que es especialmente problemático en cepas multidrogo-resistentes, tales como S. aureus resistente a la meticilina (SARM).14. ica ció. n. En un estudio realizado por Bouhdid (2010), La exposición al aceite esencial de Cinnamomum verum, indujo alteraciones en la membrana bacteriana de. om un. Pseudomonas aeruginosa, que condujo al colapso de potencial de membrana, como se demuestra por tinción de bis-oxonol, y la pérdida de permeabilidad selectiva de la. yC. membrana, tal como se indica por el eflujo de K + y la acumulación de yoduro de. át ica. propidio. Por lo tanto, la actividad respiratoria fue inhibida, lo que lleva a la muerte. fo r. m. celular.15. In. En Staphylococcus aureus, las células tratadas con el aceite entraron en un estado. de. viable pero no cultivables (VNC). El aceite inicialmente causó una considerable. as. disminución en la actividad metabólica y en la capacidad de replicación de estas. em. células bacterianas. La pérdida de integridad de la membrana aparece más tarde,. de. Si st. como se indica por bis-oxonol y tinción con yoduro de propidio (PI).15. ió. n. En el trabajo publicado por Bouhdid (2010) utilizando datos proporcionados por. Di re cc. microscopia por transmisión de electrones (TEM) encontró diferentes efectos estructurales en respuesta al aceite esencial de canela. Así, en. Pseudomonas. aeruginosa se observó material citoplasmático coagulado, y material intracelular se observó en el medio ambiente circundante, mientras que en cepas de Staphylococcus aureus tratadas con aceite esencial de canela se demostró fibras que se extienden desde la superficie de la célula. De ello concluye que el aceite esencial de canela daña pág. 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. la membrana celular de Pseudomonas aeruginosa, lo cual lleva a la muerte celular, en tano que existe evidencia de un estado viable pero no cultivable (VNC) de. ica ció. n. Staphylococcus aureus tras la exposición al aceite esencial de canela.15. Djilani (2012) menciona que las acciones antimicóticas son bastante similares a las. om un. descritas para las bacterias. Sin embargo, se destacan otros dos fenómenos que inhiben la acción de la levadura: la creación de un gradiente de pH a través de la. át ica. que implican la ruptura de la membrana fúngica.8. yC. membrana citoplasmática y el bloqueo de la producción de energía de las levaduras. fo r. m. Khans (2011) encontró que cinamaldehído es más activo que el eugenol en cuanto a. flavus es un patógeno transmitido por los alimentos, ampliamente. de. Aspergillus. In. su actividad antifúngica contra organismos del genero Aspergillus y Trichophyton.. as. distribuido en la naturaleza, con capacidad para producir aflatoxinas, que puede. em. causar hepatitis aguda, inmunosupresión, y carcinoma hepatocelular. La ausencia de. Si st. alguna regulación de la detección del hongo también tiene una alta prevalencia de. de. hepatitis viral, aumentando altamente el riesgo de carcinoma hepatocelular.16. ió. n. Para evaluar el posible modo de acción de cinamaldehído, se llevaron a cabo los. Di re cc. estudios de microscopía electrónica. Las observaciones revelaron múltiples sitios de acción de cinamaldehído principalmente en las membranas celulares y estructuras endomembranosas de la célula fúngica.16. Además, el aceite esencial de canela también fue probado por su actividad antivirulencia. Más de 70% de reducción en la actividad de la elastasa fue encontrada en pág. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Aspergillus fumigatus por los aceites de Cinnamomum verum, La reducción máxima (96,56%) en la actividad de la elastasa fue producido por cinamaldehído, mientras que, geraniol causó una inhibición máxima (97,31%) de la actividad de queratinasa.. ica ció. n. Dichos resultados ponen de relieve la actividad anti-elastasa y anti-queratinasa de los aceites esenciales mencionados como una nueva propiedad para ser explotados en el. om un. control de las micosis invasoras y superficiales.16. yC. Yousef y Tawil (1980) y Tantaoui-Elaraki y Beraoud (1994) demostraron que el. át ica. aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum Blume) presenta un efecto antifúngico. Morozumi (1978) demostró que el aceite esencial de canela es altamente. fo r. m. efectivo en el control del desarrollo de Aspergillus flavus y Aspergillus. parasiticus.. In. Montes-Belmont y Carvajal (1998) encontraron que los aceites esenciales obtenidos. de. de canela, hierbabuena (Mentha piperita L.), orégano, epazote (Teloxys ambrosioides. as. (L.) Weber, clavo y tomillo causaban la inhibición total del desarrollo de Aspergillus. Si st. em. flavus.17. de. Varios aceites esenciales confieren actividad microbiana al dañar la pared celular y la. ió. n. membrana, promoviendo la lisis celular, la fuga de contenido de la célula, y la. Di re cc. inhibición de fuerza motriz de protones.18 Además, hay evidencia de que efectivamente, dichos aceites son capaces de matar las bacterias sin promover la adquisición de resistencia.19, 20. pág. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Por último, muchos aceites esenciales son relativamente fáciles de obtener, tienen baja toxicidad para los mamíferos, y se degradan rápidamente en el agua y el suelo,. 1.2. ica ció. n. haciéndolos relativamente respetuoso del medio ambiente.21. JUSTIFICACION. om un. La creciente aparición de especies patógenas con resistencia intrínseca o adquirida, la. yC. toxicidad e interacciones farmacológicas de antibacterianos y antifúngicos tradicionales, así como uso indiscriminado de drogas esteroides, cirugías y. át ica. trasplantes, está ocasionando fallas en la terapéutica antimicrobiana a diversos. m. compuestos, lo que está fomentado la búsqueda de nuevas alternativas entre productos. fo r. naturales, y siendo nuestro país uno de los más ricos en biodiversidad, es nuestro. In. desafío vincular y convertir el conocimiento de los recursos biológicos en compuestos. de. o productos útiles en beneficio de nuestra sociedad. Existen numerosas plantas. em. as. utilizadas en la medicina alternativa pero no todas son avaladas científicamente, es. Si st. por ello que se propone realizar la presente investigación, acerca de la susceptibilidad de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Aspergillus flavus al aceite. ENUNCIADO. Di re cc. 1.3. ió. n. de. esencial de la corteza de Cinnamomum verum “Canela”.. ¿Cuál es la susceptibilidad de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Aspergillus flavus al aceite esencial de la corteza y hojas de Cinnamomum verum “Canela”?. pág. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.4. HIPOTESIS.  Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Aspergillus flavus, son. 1.5. ica ció. n. susceptibles a la acción del aceite esencial de canela (Cinnamomum verum).. OBJETIVOS. om un.  General . Evaluar la Susceptibilidad de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus. yC. aureus y Aspergillus flavus al aceite esencial de la corteza de Cinnamomum. át ica. verum “Canela”.. fo r. m.  Específicos . In. Determinar a qué concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum. de. “Canela” 15%, 30%, 60%, 90%, se produce inhibición del crecimiento de. em. as. Pseudomonas aeruginosa.. Si st. . Determinar a qué concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum. de. “Canela” al 15%, 30%, 60%, 90%, se produce inhibición del crecimiento de. Di re cc. ió. n. Staphylococcus aureus.. . Determinar a qué concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” 15%, 30%, 60%, 90%, se produce inhibición del crecimiento de Aspergillus flavus.. pág. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II.. MATERIAL DE ESTUDIO. n. 2.1. MATERIAL Y METODOS. ica ció. 2.1.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN. om un. La investigación tipo cuasi experimental comparativa, se desarrolló en los ambientes del laboratorio del departamento de Ciencias Básicas, sección de. yC. Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de. át ica. Trujillo.. 2.1.2. DEFINICIÓN DE POBLACIÓN MUESTRAL. fo r. m. La población muestral fue creada de acuerdo a los parámetros microbiológicos. In. experimentales revisados, quedando constituida por cepas estandarizadas de. de. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213 y. em. as. Aspergillus flavus ATCC 16404.. Si st. 2.1.3. DISEÑO ESTADISTICO DE MUESTRA. de. UNIDAD DE ANÁLISIS. n. La unidad de análisis la constituyeron cada uno de los 12 repeticiones realizadas. Di re cc. ió. con los discos de difusión preparados, para cada patógeno en estudio, con las cuatro diferentes concentraciones de aceite esencial de Cinnamomum verum, el fármaco control para cada patógeno y alcohol de 96% en las placas Petri. UNIDAD DE MUESTREO. pág. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El marco muestral lo conformó. el conjunto de repeticiones, establecidas. estadísticamente, realizadas con los discos de difusión preparados, para cada patógeno en estudio, con las cuatro diferentes concentraciones de aceite esencial. ica ció. n. de Cinnamomum verum, el fármaco control para cada patógeno y alcohol de 96% en placas Petri.. om un. TAMAÑO MUESTRAL. (Z α/2 + Z β)2 2 S2. =. át ica. n. yC. El cálculo para el número de ensayos se hizo con la siguiente fórmula:. (X1 – X2)2. In. Z α/2 = 1.96 para α = 0.05. fo r. m. Siendo n= el número de repeticiones a efectuar en cada investigación. as. de. Z β = 0.84 para β = 0.20. em. S = 0.9 Valor asumido por no haber estudios previos. Si st. (X1 – X2) = 12mm, zona mínima de inhibición. 22. de. Con estos datos se determinó una muestra de 12 observaciones para cada. n. concentración de aceite esencial de Cinnamomum verum: “canela” para cada. Di re cc. ió. patógeno en estudio.23  12 repeticiones de aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” al 15%,  12 repeticiones de aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” al 30%  12 repeticiones de aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” al 60%  12 repeticiones de aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” al 90%. pág. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación.  12 repeticiones de aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” con el fármaco control.  12 repeticiones de aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” con el. ica ció. n. control negativo, alcohol al 96%. 2.1.4. CULTIVOS CONTROL Y BALANCE. om un. Fueron excluidos del estudio aquellos cultivos en los que se observó. yC. deficiencias en la manipulación, en los cuales no fue posible realizar una. át ica. adecuada y estricta medición de los halos de inhibición. 2.2. METODOS Y TECNICA. fo r. m. 2.2.1 INSTRUMENTO DE RECOLECCION DE DATOS. In. Los datos fueron registrados en una ficha (Anexo 01, 02, 03), que contienen la. de. información recolectada sobre la susceptibilidad de los distinto patógenos. em. as. evaluados al Aceite Esencial de Cinnamomum verum (Canela), en sus distintas. Si st. concentraciones y a los controles positivos (fármaco control para cada. de. patógeno) y controles negativos (alcohol 96%).. n. 2.2.2. MATERIAL BIOLOGICO Y QUIMICO. Di re cc. ió.  MATERIAL BOTANICO Las muestras de la corteza de Cinnamomum verum (Canela) fueron recolectadas y enviadas desde la ciudad de Tarapoto y luego entregadas al Herbarium Truxillense (HUT) de la Universidad Nacional de Trujillo para su reconocimiento taxonómico, donde se obtiene el certificado que especifica la variedad de Cinnamomum utilizada en la presente investigación. pág. 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Posteriormente las muestras de corteza, fueron trasladadas al Laboratorio de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, para la extracción del Aceite esencial de Cinnamomum. ica ció. n. verum (Canela).. om un.  CEPAS BACTERIANAS. Las cepas bacterianas Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa y la. yC. cepa fúngica de Aspergillus flavus fueron proporcionadas por el laboratorio. át ica. de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de. In.  FARMACO CONTROL. fo r. m. Trujillo.. de.  Imipenem. 500mg polvo para inyección vía intravenosa. as.  Vancomicina. 500mg polvo para inyección vía intravenosa. Si st. em.  Fluconazol. 2mg/ml solución inyectable vía intravenosa. de. 2.2.3. DISEÑO PROCEDIMENTAL. ió. n. 2.2.3.1. ELABORACION DE ACEITE ESENCIAL DE CANELA. Di re cc. RECOLECCION E IDENTIFICACION TAXONÓMICA La corteza de Cinnamomum verum “canela”, fue recolectada de la localidad de Tarapoto, en la región San Martín (Perú) ubicada a 250 m.s.n.m. 24 Para una precisa identificación de la especie se llevó un ejemplar de la corteza del árbol de canela al Herbarium Truxillense (HUT) de la Universidad. pág. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Nacional de Trujillo para su verificación taxonómica según el sistema. n. filogenético de la especie.. ica ció. OBTENCIÓN DEL ACEITE ESENCIAL DE LA CORTEZA DE. om un. Cinnamomum verum “canela”. El material recolectado fue transportado al laboratorio de Farmacognosia. yC. de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, en donde se eliminó las sustancias extrañas presentes en la corteza. át ica. y aquellas que se encontraban en mal estado.. m. La obtención del aceite se realizó por el método de “destilación por arrastre. In. fo r. de vapor de agua” (convencional) el cual permite un buen rendimiento.. de. El aceite esencial fue extraído a partir de 3 kg de corteza, previamente. as. cortadas en partes pequeñas (1x1 cm), se colocó en un balón de fondo plano. em. y se la sometió a una corriente de vapor de agua sobrecalentada; de esta. Si st. manera se arrastró la esencia que posteriormente por acción del. de. refrigerante, fue condensada. El destilado se separó tomando en cuenta sus. n. propiedades de inmiscibilidad y diferencia de densidades entre el agua y el. Di re cc. ió. aceite esencial, utilizando una pera de separación de vidrio, se deshidrato las impurezas de agua en el aceite esencial con Na2SO4 anhidro, se filtró, guardándose en un frasco de vidrio color ámbar (para evitar la descomposición por la luz) y bajo refrigeración a una temperatura de 4 oC. Se obtuvo 16.2 mL de aceite con un porcentaje de rendimiento de 0,54% (ver anexo 04), de los cuales 10.2 mL de aceite esencial se utilizó para pág. 19. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. medir la densidad, siendo 1,050 g/mL (ver nexo 05) y 6 mL de aceite para. n. preparar la diferentes concentraciones del aceite esencial.. ica ció. PREPARACION DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE. ACEITE ESENCIAL DE LA CORTEZA DE Cinnamomum verum. om un. “Canela”. Concentración (%). 3 mL. 15. 0.9 mL. 2.1 mL. 3 mL. 1.8 mL. 1.2 mL. 3 mL. 2.7 mL. 0.3 mL. 3 mL. de. In. fo r. m. át ica. Volumen final. 0.45 mL. Volumen de alcohol 96% 2.55 mL. Concentración mg/mL (densidad 1.050 g/mL) 157.5 mg/mL. 30. 315 mg/mL. 60. 630 mg/mL. 90. 945mg/mL. as. Volumen de aceite. yC. Las concentraciones se prepararon según el siguiente cuadro:. em. Luego, se colocaron cada una de las concentraciones en frascos de vidrio. Si st. de color ámbar, para protegerlas de la luz, colocandose, posteriormente en. n. de. refrigeración a 4 ºC, hasta la realización del análisis microbiológico.. Di re cc. ió. 2.2.3.2. OBTENCION DE CEPAS La cepa de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213 y Aspergillus flavus ATCC 16404 fueron obtenidas del laboratorio MediMark. R. Europe que envió la muestra al laboratorio de. Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo. pág. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.3.3. PREPARACION DE CEPA Las cepas de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus. n. aureus ATCC 29213 fueron cultivadas en tubos de ensayo con Agar Soya. ica ció. Tripticasa, incubándose a 37 °C con el fin de obtener colonias jóvenes.. om un. La cepa de Aspergillus flavus ATCC 16404 fue cultivada en tubos de ensayo con tapa rosca en medio Agar Sabouraud dextrosa 4% a 25°C.. yC. Luego de 24 horas de cultivadas, se toma una muestra de cada cultivo con. át ica. una asa bacteriológica, a las cuales se les agregó solución salina estéril, hasta obtener una turbidez semejante al tubo número 0,5 de la escala de. fo r. m. Mac Farland (1.5 x 108 UFC/ml), estableciéndose dicha comparación de. In. manera visual.. de. Los tubos que contienen los patógenos en estudio, fueron girados entre las. as. manos durante 30 segundos, antes de proceder al sembrado, para distribuir. Si st. em. los microorganismos adecuadamente. A continuación, con un hisopo estéril, el cual fue embebido en el tubo del. de. cultivo preparado y a una distancia de 10cm de la llama de un mechero, se. Di re cc. ió. n. sembró en placas Petri conteniendo 15 ml de Agar Mueller-Hinton, hisopando uniformemente sobre toda la superficie del agar y girando cada placa 30 grados por 10 veces aproximadamente. Las placas recién sembradas fueron colocadas dentro de una estufa a 37 ºC de temperatura durante 24 horas. Importante mencionar que se tomaron todas las medidas de bioseguridad exigidas para la realización de la presente investigación,. pág. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. consideradas dentro de ellos: lavado de manos antes y después de cada procedimiento; uso de guantes, mascarillas, batas y lentes protectores; desinfección y esterilización de instrumental; ventilación natural o. punzocortante. om un. 2.2.3.4. DETERMINACION DE SUSCEPTIBILIDAD. ica ció. n. iluminación adecuada de ambientes y manejo apropiado de material. yC. Para la prueba de susceptibilidad se preparó 4 diluciones de aceite esencial de Cinnamomum verum a las concentraciones de 15%, 30%, 60%, 90%.. fo r. m. át ica. Dichas diluciones se conservaron a 4°C para el estudio microbiológico.. In. Luego de realizar el sembrado de las cepas de Pseudomonas aeruginosa. de. ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213 y Aspergillus flavus. as. ATCC 16404 en placas Petri, se realizó la prueba de susceptibilidad. em. utilizando la Técnica de Kirby y Bauer o el método de Difusión en Discos.. Si st. Se prepararon discos de papel filtro estériles Whatman N°4 de 6 mm de. de. diámetro y se les sumergió dentro de cada una de las concentraciones de. n. aceite esencial; y después, con aguja estéril fueron colocados sobre cada uno. Di re cc. ió. de los cultivos de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213 y Aspergillus flavus ATCC 16404 en placas Petri, preparados previamente. Hubo dos grupos controles, un control dado por los fármacos Imipenem y Vancomicina para las bacterias, Fluconazol para los hongos y un segundo. pág. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. control con alcohol al 96%. Posteriormente las placas se incubaron a 35°C durante 24 horas. La siembra del microorganismo fue para cada una de las 4 concentraciones. ica ció. n. del aceite esencial del Cinnamomum verum. Los valores que se obtuvieron. om un. se compararon con los controles.. yC. Finalmente la lectura se llevó a cabo a las 24 horas. En algunos caso en los que no hubo suficiente crecimiento al observar el control, se reincubó y se. át ica. observó a las 48 horas. Se midieron los halos de inhibición (susceptibilidad). m. de cada una de las concentraciones, incluyendo el área del disco de papel de. fo r. filtro con una regla milimetrada, procediéndose de igual manera con ambos. as. de. In. controles.25. Variable. Si st. em. 2.2.3.5. VARIABLE Y ESCALA DE MEDICION Indicador. Tipo. Escala. de. Independiente:. ió. n. Aceite esencial de. Concentraciones al 15%, Cuantitativa 30%, 60%, 90%, del. Cinnamomum. aceite esencial.. Di re cc. la corteza de. Ordinal. verum.. pág. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Dependiente Susceptibilidad de. Diámetro del halo de Cuantitativa. cepas de. inhibición. Ordinal. ica ció. n. Pseudomonas aeruginosa,. om un. Staphylococcus aureus y. át ica. yC. Aspergillus flavus. m. 2.2.3.6. DEFINICION OPERACIONAL. In. fo r.  Variable Independiente: Aceite esencial de Cinnamomum verum:. de. El aceite esencial es un líquido de color marrón pálido, con olor intenso a. as. canela; similar apariencia y consistencia de aceites grasos, volátil, no deja. em. huella ni mancha grasosa; que se obtiene de la destilación por arrastre de vapor. de. Si st. de la corteza de Cinnamomum verum.. ió. n.  Variable dependiente: Susceptibilidad de cepas:. Di re cc. Capacidad para detener la reproducción del bacterias y hongos, determinado luego de medir el crecimiento de los microbios mediante la longitud del diámetro del halo de inhibición (diámetro del papel filtro=6mm, por ello se consideró inhibición valores mayores a 6mm).  Halo de Inhibición: pág. 24. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Zona alrededor del disco donde una sustancia antibacteriana es capaz de impedir el crecimiento de la bacteria al cabo de 18 a 24 horas de incubación. Se utilizó como medida los diámetros de estas zonas en mm,. ica ció. n. según la escala de Duraffourd.. om un.  Escala de Duraffourd: Escala utilizada para determinar cualitativamente. yC. el efecto inhibitorio in vitro, según diámetro de inhibición (Duraffourd).26. át ica.  Nula (-) para un diámetro inferior a 8 mm.. fo r. entre 8 a 14 mm.. m.  Sensibilidad límite (sensible = +) para un diámetro comprendido. In.  Medio (muy sensible = ++) para un diámetro entre 14 y 20 mm.. em. as. de.  Sumamente sensible (+++) para un diámetro superior a 20 mm.. Si st. 2.2.3.7. ANALISIS E INTERPRETACION DE INFORMACION. de. Se utilizaron tablas estadísticas de resumen así como graficas. Di re cc. ió. n. estadísticas para presentar los resultados de la investigación. Para determinar la susceptibilidad, se procedió a medir el diámetro inhibitorio de las 4 concentraciones del aceite esencial. Se halló el diámetro máximo medible y el promedio de las repeticiones.. pág. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La comparación de resultados obtenidos en la investigación, se realizó mediante la prueba de análisis de varianza ANOVA, considerando un. n. nivel de significancia de 0,05.. ica ció. Luego se utilizó la prueba de Duncan para determinar las diferencias significativas entre pares de grupos, considerándose significativa su p<. om un. 0.05.. yC. El análisis estadístico se realizó utilizando el programa Microsoft Excel. át ica. 2010 y el sistema estadístico Minitab 15 español.. m. 2.2.3.8. CONSIDERACIONES ETICAS. fo r. Con respecto a la ética, por realizarse el presente trabajo de investigación. In. in vitro, no hay incumplimiento de normas éticas. Sin embargo en el. de. presente trabajo se respetó el principio ético adoptado en el capítulo 6 del. as. código de ética del Colegio Médico del Perú titulado: “Del trabajo de. Si st. em. investigación”, específicamente el 6 Art. 48°, donde habla de la veracidad en la publicación de los resultados obtenidos en el estudio. Así mismo, se. de. tuvieron en cuenta los principios de bioseguridad correspondiente a. Di re cc. ió. n. trabajos in vitro. 27. 2.2.4. DISEÑO EXPERIMENTAL. pág. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PREPARACION DEL ACEITE ESENCIAL DE LA CORTEZA DE Cinnamomum verum “Canela”. ica ció. n. Aceite Esencial de Cinnamomum verum “Canela”. om un. • Volumen: 6ml • Densidad: 1.05 gr/ml. m. át ica. yC. Aceite Esencial de Cinnamomum verum “Canela” al 15 % Volumen de Aceite Esencial: 0.45ml Volumen de Etanol 96%: 2.55ml Densidad: 157.5 mg/ml. as. de. In. fo r. Aceite Esencial de Cinnamomum verum “Canela” al 30 % Volumen de Aceite Esencial: 0.9 ml Volumen de Etanol 96%: 2.1ml Densidad: 315 mg/ml. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. Aceite Esencial de Cinnamomum verum “Canela” al 60 % Volumen de Aceite Esencial: 1.8 ml Volumen de Etanol 96%: 1.2 ml Densidad: 630 mg/ml. Aceite Esencial de Cinnamomum verum “Canela” al 90 % Volumen de Aceite Esencial: 2.7 ml Volumen de Etanol 96%: 0.3 ml Densidad: 945 mg/ml. Para la prueba de susceptibilidad se utilizó el método de Difusión en Discos. Se prepararon discos de papel filtro estériles y se les sumergió dentro de cada una de las concentraciones de aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela”. pág. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Susceptibilidad De Pseudomonas aeruginosa Al Aceite Esencial De La Corteza. om un. ica ció. n. De Cinnamomum verum “Canela”. yC. Cultivadas en tubos de ensayo con Agar Soya Tripticasa por 48 horas, incubándose a 37 °C. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. as. de. In. fo r. m. át ica. Cepas de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Se les agregó solución salina estéril, obteniéndose una turbidez semejante al tubo número 0,5 de la escala de Mac Farland (dilución de la cepa).. Las placas recién sembradas fueron colocadas dentro de una estufa a 37 ºC de temperatura durante 10 minutos, preparándose 12 cajas Petri para evaluar la susceptibilidad de Staphylococcus aureus al aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela”. Con un hisopo estéril, el cual fue embebido en el tubo del cultivo preparado y a una distancia de 10cm de la llama de un mechero, se sembró en placas Petri contenido Agar Mueller Hinton. pág. 28. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Susceptibilidad De Staphylococcus aureus Al Aceite Esencial De La Corteza De. yC. om un. ica ció. n. Cinnamomum verum “Canela”. Cultivadas en tubos de ensayo con Agar Soya Tripticasa por 48 horas, incubándose a 37 °C. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. as. de. In. fo r. m. át ica. Cepas de Staphylococcus aureus ATCC 29213. Se les agregó solución salina estéril, obteniéndose una turbidez semejante al tubo número 0,5 de la escala de Mac Farland (dilución de la cepa).. Las placas recién sembradas fueron colocadas dentro de una estufa a 37 ºC de temperatura durante 10 minutos, preparándose 12 cajas Petri para evaluar la susceptibilidad de Staphylococcus aureus al aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela”. Con un hisopo estéril, el cual fue embebido en el tubo del cultivo preparado y a una distancia de 10cm de la llama de un mechero, se sembró en placas Petri contenido Agar Mueller Hinton. pág. 29. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Susceptibilidad De Aspergillus flavus Al Aceite Esencial De La Corteza De. om un. ica ció. n. Cinnamomum verum “Canela”. yC. Cultivadas en tubos de ensayo con Agar Soya Tripticasa por 48 horas, incubándose a 37 °C. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. as. de. In. fo r. m. át ica. Cepas de Aspergillus flavus ATCC 16404. Se les agregó solución salina estéril, obteniéndose una turbidez semejante al tubo número 0,5 de la escala de Mac Farland (dilución de la cepa).. Las placas recién sembradas fueron colocadas dentro de una estufa a 37 ºC de temperatura durante 10 minutos, preparándose 12 cajas Petri para evaluar la susceptibilidad de Staphylococcus aureus al aceite esencial de Cinnamomun verum “Canela”. Con un hisopo estéril, el cual fue embebido en el tubo del cultivo preparado y a una distancia de 10cm de la llama de un mechero, se sembró en placas Petri contenido Agar Mueller Hinton.. pág. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III.. RESULTADOS. n. En la Tabla N°1 se muestra el resumen de Susceptibilidad de la cepa de Pseudomonas. ica ció. aeruginosa ATCC 27853 de acuerdo a las distintas concentraciones del aceite esencial. om un. de la corteza del Cinnamomum verum, el fármaco control Imipenem y alcohol 96%. Se indican las medidas de los halos de inhibición de los seis grupos experimentales. Se. át ica. yC. aprecian sus promedios y desviaciones estándar.. m. En la Tabla N°2 se puede apreciar la tabla de Análisis de varianza, la cual muestra que. fo r. si existe diferencia significativa entre grupos de investigación sobre la cepa de. In. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 dado que el valor de P de la tabla de ANOVA. em. as. de. es menor que 0.05. (p = 0.000). Si st. En la Tabla N°3 se presenta la prueba de DUNCAN para determinar grupos. de. significativos de las distintas concentraciones del Aceite Esencial de la corteza de. n. Cinnamomum verum (Canela), el fármaco control Imipenem y alcohol 96%, sobre la. Di re cc. ió. cepa de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. La tabla muestra que existe diferencia entre las concentraciones de aceite esencial de Cinnamomum verum (Canela) de 30, 60 y 90%, entre las concentraciones del 15% y el fármaco Imipenem y estos dos últimos con alcohol 96%.. pág. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El Grafico N°1 indica el Promedio de susceptibilidad de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 de acuerdo a las distintas concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” y a los controles Imipenem y alcohol de 96%. En ella. ica ció. n. se evidencia que el grupo Aceite Esencial de Canela al 60% y el grupo al 90%, registran. om un. los promedios más altos de diámetro de inhibición entre los grupos de investigación.. yC. En la Tabla N°4 se muestra el resumen de Susceptibilidad de la cepa de Staphylococcus. át ica. aureus ATCC 29213 de acuerdo a las distintas concentraciones del aceite esencial de la corteza del Cinnamomum verum, el fármaco control Vancomicina y alcohol 96%. .. In. fo r. m. Se aprecian sus promedios y desviaciones estándar.. de. En la Tabla N°5 se aprecia la tabla de Análisis de varianza, la cual muestra que si existe. em. as. diferencia significativa entre grupos de investigación sobre la cepa de Staphylococcus. n. de. (p = 0.000). Si st. aureus ATCC 29213, dado que el valor de P de la tabla de ANOVA es menor que 0.05.. Di re cc. ió. En la Tabla N°6 se presenta la prueba de DUNCAN, en la cual se evidencia diferencias entre las concentraciones de aceite esencial al 60%, la concentración de 90%, las concentraciones de 15% y 30%, el fármaco Vancomicina y alcohol 96%, constituyéndose así 5 grupos significativamente diferentes que inhiben el crecimiento de Staphylococcus aureus ATCC 29213.. pág. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El Grafico N°2: indica el Promedio de susceptibilidad de Staphylococcus aureus ATCC 29213 de acuerdo a concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” y Vancomicina y alcohol de 96%, donde se destaca que el grupo Aceite Esencial de. ica ció. n. Cinnamomum verum (Canela) al 60% y el grupo al 90%, registran los promedios más. om un. altos de diámetro de inhibición.. yC. En la Tabla N°7 se muestra el resumen de Susceptibilidad de la cepa de Aspergillus. át ica. flavus ATCC 16404 de acuerdo a las distintas concentraciones del aceite esencial de la corteza del Cinnamomum verum, el fármaco control Fluconazol y alcohol 96%. . Se. In. fo r. m. aprecian sus promedios y desviaciones estándar.. de. En la Tabla N°8 se puede apreciar la tabla de análisis de varianza, en la que se evidencia. em. as. que si existe diferencia significativa entre grupos de investigación sobre la cepa de. Si st. Aspergillus flavus ATCC 16404, dado que el valor de P de la tabla de ANOVA es menor. n. de. que 0.05. (p = 0.000). Di re cc. ió. En la Tabla N°9 se presenta la prueba de DUNCAN, en la cual se muestra que existe diferencia entre la concentración de aceite esencial de 30, las concentraciones de 60% y 90%, entre la concentración de 15%, el fármaco Fluconazol y alcohol 96%, quedando constituidos así 5 grupos significativamente diferentes que inhiben el crecimiento de Aspergillus flavus ATCC 16404.. pág. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El Grafico N°3 indica el promedio de susceptibilidad de Aspergillus flavus ATCC 16404 de acuerdo a concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” y de los controles Fluconazol y alcohol de 96%, destacándose que el grupo Aceite. ica ció. n. Esencial de Canela 30% y el grupo 60%, registran los promedios más altos de diámetro. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. as. de. In. fo r. m. át ica. yC. om un. de inhibición.. pág. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Susceptibilidad De Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Aspergillus flavus Al Aceite Esencial De La Corteza de Cinnamomum verum “Canela”. ni. Aceite Esencial Canela 15%. 12. Aceite Esencial Canela 30%. 12. Aceite Esencial Canela 60%. 12. Aceite Esencial Canela 90%. Desv. Est. 3.029. 19.00. 2.045. 12. 18.58. 1.564. 12. 13.33. 4.559. 10.33. 1.614. fo r. 12. 14.92 17.50. 2.680. yC. át ica m. Imipenem Alcohol 96%. Promedio. om un. Grupo de Investigación. ica ció. n. Tabla Nº 1: Susceptibilidad de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 según concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela”, fármaco control Imipenem y alcohol 96%.. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. as. de. In. FUENTE: Datos obtenidos por el grupo investigador.. pág. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Susceptibilidad De Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Aspergillus flavus Al Aceite Esencial De La Corteza de Cinnamomum verum “Canela”. Tabla Nº 2: Concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.. Tratamientos. 688.94. 5. Error. 510.17. 66. Total. 1,199.11. 71. FUENTE: Datos obtenidos por el grupo investigador.. P. 137.789 17.826 7.730. 0.000. yC. GL: Grados de libertad. SC: Suma de Cuadrados. MC: Cuadrados medios.. F. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. as. de. In. fo r. m. át ica.   . C. M.. n. G.L.. ica ció. S. C.. om un. F. V.. pág. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Susceptibilidad De Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Aspergillus flavus Al Aceite Esencial De La Corteza de Cinnamomum verum “Canela”. Tabla Nº 3: Grupos significativos de concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” que inhiben el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Grupos para Alfa = 0.05. n. ni. G1. 12. Aceite Esencial Canela 15%. 12. Aceite Esencial Canela 30%. 12. Aceite Esencial Canela 90%. 12. Aceite Esencial Canela 60%. 12. G2. G3. 13.33. om un. Imipenem. 10.33. 14.92. yC. 12. át ica. Alcohol 96%. ica ció. Grupo de Investigación. 17.50 18.58 19.00. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. as. de. In. fo r. m. FUENTE: Datos obtenidos por el grupo investigador.. pág. 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Si st. em. as. de. In. fo r. m. át ica. yC. om un. ica ció. n. Grafico n° 1: Susceptibilidad de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 de acuerdo a las distintas concentraciones de aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela”, fármaco control Imipenem y alcohol 96%.. Di re cc. ió. n. de. FUENTE: Datos obtenidos por el grupo investigador.. pág. 38 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Susceptibilidad De Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Aspergillus flavus Al Aceite Esencial De La Corteza de Cinnamomum verum “Canela”. ni. Promedio. Desv. Est.. Aceite Esencial Canela 15%. 12. 25.25. 2.734. Aceite Esencial Canela 30%. 12. 24.08. Aceite Esencial Canela 60%. 12. 32.17. Aceite Esencial Canela 90%. 12. 27.92. Vancomicina. 12. 15.83. Alcohol 96%. 12. 11.58. 2.875. om un. 3.857 1.881. yC. 0.937 1.443. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. as. de. In. fo r. m. át ica. FUENTE: Datos obtenidos por el grupo investigador.. ica ció. Grupo de Investigación. según. n. Tabla Nº 4: Susceptibilidad de Staphylococcus aureus ATCC 29213 concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela”.. pág. 39 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Susceptibilidad De Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Aspergillus flavus Al Aceite Esencial De La Corteza de Cinnamomum verum “Canela”. Tabla Nº 5: Concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” sobre Staphylococcus aureus ATCC 29213. C. M.. F. 3,550.94. 5. 710.189. 114.790. Error. 408.33. 66. 6.187. Total. 3,959.28. 71. Tratamientos. FUENTE: Datos obtenidos por el grupo investigador.. yC. GL: Grados de libertad. SC: Suma de Cuadrados. MC: Cuadrados medios.. 0.000. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. as. de. In. fo r. m. át ica.   . P. n. G.L.. ica ció. S. C.. om un. F. V.. pág. 40 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Susceptibilidad De Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Aspergillus flavus Al Aceite Esencial De La Corteza de Cinnamomum verum “Canela”. Tabla Nº 6: Grupos significativos de concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” que inhiben el crecimiento de Staphylococcus aureus ATCC 29213. Grupos para Alfa = 0.05. n. ni G1 12. Vancomicina. 12. Aceite Esencial Canela. 11.58 15.83. Aceite Esencial Canela. 25.25. át ica. Aceite Esencial Canela. 12. 27.92. Aceite Esencial Canela. 12. 32.17. In. 60%. fo r. m. 90%. G5. 24.08. 12. 15%. G4. yC. 12. 30%. G3. om un. Alcohol 96%. G2. ica ció. Grupo de Investigación. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. as. de. FUENTE: Datos obtenidos por el grupo investigador.. pág. 41 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Si st. em. as. de. In. fo r. m. át ica. yC. om un. ica ció. n. Gráfico N°2: Susceptibilidad de Staphylococcus aureus ATCC 29213 de acuerdo a las distintas concentraciones de aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela”, fármaco control Vancomicina y alcohol 96%.. Di re cc. ió. n. de. FUENTE: Datos obtenidos por el grupo investigador.. pág. 42 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Susceptibilidad De Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Aspergillus flavus Al Aceite Esencial De La Corteza de Cinnamomum verum “Canela”. Grupo de Investigación. ni. Aceite Esencial Canela 15%. 12. 29.67. n. Tabla Nº 7: Susceptibilidad de Aspergillus flavus ATCC 16404 según concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela”.. Aceite Esencial Canela 30%. 12. 40.67. 3.651. Aceite Esencial Canela 60%. 12. 36.42. 6.067. Aceite Esencial Canela 90%. 12. Fluconazol. 12. Alcohol 96%. 12. yC. om un. ica ció. 3.312. 34.33. 5.382. 1.17. 2.725. 6.92. 5.501. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. as. de. In. fo r. m. át ica. FUENTE: Datos obtenidos por el grupo investigador.. Promedio Desv. Est.. pág. 43 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(44) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Susceptibilidad De Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Aspergillus flavus Al Aceite Esencial De La Corteza de Cinnamomum verum “Canela”. Tabla Nº 8: Concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” sobre Aspergillus flavus ATCC 16404. G.L.. Tratamientos. 16,555.11. 5. Error. 1,405.50. 66. Total. 17,960.61. 71. C. M.. ica ció. 21.295. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. as. de. In. fo r. m. át ica. yC. GL: Grados de libertad. SC: Suma de Cuadrados. MC: Cuadrados medios.. P. 3,311.022 155.480 0.000. FUENTE: Datos obtenidos por el grupo investigador.   . F. n. S. C.. om un. F. V.. pág. 44 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(45) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Susceptibilidad De Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Aspergillus flavus Al Aceite Esencial De La Corteza de Cinnamomum verum “Canela”. Tabla Nº 9: Grupos significativos de concentración del aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela” que inhiben el crecimiento de Aspergillus flavus ATCC 16404. Grupos para Alfa = 0.05. n. ni G1. 12. Aceite Esencial Canela 15%. 12. Aceite Esencial Canela 90%. 12. Aceite Esencial Canela 60%. 12. Aceite Esencial Canela 30%. 12. 1.17 6.92. G4. G5. om un. Alcohol 96%. G3. 29.67. 34.33. yC. 12. át ica. Fluconazol. G2. ica ció. Grupo de Investigación. 36.42 40.67. Di re cc. ió. n. de. Si st. em. as. de. In. fo r. m. FUENTE: Datos obtenidos por el grupo investigador.. pág. 45 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(46) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Si st. em. as. de. In. fo r. m. át ica. yC. om un. ica ció. n. Gráfico N°3: Susceptibilidad de Aspergillus flavus ATCC 16404 de acuerdo a las distintas concentraciones de aceite esencial de Cinnamomum verum “Canela”, fármaco control Fluconazol y alcohol 96%.. Di re cc. ió. n. de. FUENTE: Datos obtenidos por el grupo investigador.. pág. 46 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(47) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV.. ANALISIS Y DISCUSION. n. En el estudio realizado por Freire (2011), se determinó que la composición química del. ica ció. aceite de canela obtenida por Cromatografía de gas acoplada a Espectrómetro de masa (GC/MS) revela que el mayor componente de dicho aceite esencial es el aldehído. yC. om un. cinámico (87,7%) seguido de α-pineno (7,98%) y β-pineno (4,23%). 6. Azeredo (2014), por su parte, en un reciente análisis del aceite esencial de. át ica. Cinnamomun verum por GC-MS, mostró que éste se constituye principalmente de (E). m. -cinnamaldehyde (81,52%) y eugenol (16,68%) y dentro de los componentes. fo r. secundarios se encontraron (E)-caryophyllene (1.19%), (E)-cinnamyl acetate (0.01%). de. In. y α-humulene (0.12%). 28. as. Similares componentes también son identificados por Ramadan (2014), quien mediante. em. GC-MS, encuentra como componte principal al trans-Cinnamyl aldehyde (57.37%).. Si st. Además, identificó al L-Bornyl acetato (13.06%) y Eugenol (2.26%), como. n. de. componentes secundarios.29. Di re cc. ió. Las sutiles diferencias encontradas por los investigadores en cuanto a la composición exacta del aceite esencial de Cinnamomum verum permiten comprender que ésta y su fragancia dependen del genotipo de la planta, así como de las condiciones ambientales y agronómicas en que ésta se desarrolle, ya que puede variar en función de la ubicación geográfica y climática, las condiciones de crecimiento (tipo de suelo, el clima, la altitud y la cantidad de agua disponible), la estación del año, y la hora del día en que se logra pág. 47 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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