Selección de Bacillus spp productores de quitinasas aislados de suelos de la Universidad Nacional de Trujillo, Perú, 2016

Texto completo

(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. PARASITOLOGÍA. CI EN. Selección de Bacillus spp. productores de quitinasas aislados de suelos de la Universidad Nacional de. DE. Trujillo, Perú, 2016 ”. BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO. BI. BL. IO. TE. CA. TESIS PARA OBTENER”EL TÍTULO DE. AUTOR: Br. Brian Erick Neira Chamorro ASESORA: Dra. Eva Elizabeth Villanueva Tarazona TRUJILLO – PERÚ 2017. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CI EN. CI. AS. BI. O. RECTOR. LO. Dr. Orlando Gonzáles Nieves. G. IC. AS. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. DE. Dr. Rubén Vera Véliz. BI. BL. IO. TE. CA. VICERRECTOR ACADÉMICO. Dr. Steban Ilich Zerpa SECRETARIO GENERAL. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. IC. Dr. Freddy Mejía Coico. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. DECANO. Dr. William Zelada Estraver. Dra. Bertha Soriano Bernilla. BL. IO. TE. CA. DE. SECRETARIO. BI. DIRECTORA E.A.P. DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN Señores Miembros del Jurado:. AS. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y. IC. Títulos de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología de la. G. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra. LO. consideración y criterio la presente tesis titulada: “Selección de Bacillus spp. productores. O. de quitinasas aislados de suelos de la Universidad Nacional de Trujillo, Perú, 2016”. Trujillo, julio del 2017. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. con la cual pretendo obtener el Título profesional de Biólogo-Microbiólogo.. ______________________________. BI. BL. IO. Br. Brian Erick Neira Chamorro. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MIEMBROS DEL JURADO Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido ejecutada en. AS. concordancia con las normas de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y. O. LO. G. IC. Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.. BI. __________________________________. AS. Dr. Heber Robles Castillo. CI EN. CI. PRESIDENTE. __________________________________. DE. Ms.C. Anibal Quintana Díaz. BI. BL. IO. TE. CA. SECRETARIO. __________________________________ Dra. Eva Villanueva Tarazona VOCAL. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN Los profesores que suscriben, miembros del jurado examinador, declaran que el presente. AS. informe de Tesis titulado: “Selección de Bacillus spp. productores de quitinasas. IC. aislados de suelos de la Universidad Nacional de Trujillo, Perú, 2016” ha cumplido. BI. O. LO. G. con los requisitos formales y fundamentales, siendo APROBADO por UNANIMIDAD.. AS. __________________________________ Dr. Heber Robles Castillo. CI EN. CI. PRESIDENTE. DE. __________________________________. SECRETARIO. BI. BL. IO. TE. CA. Ms.C. Anibal Quintana Díaz. __________________________________ Dra. Eva Villanueva Tarazona VOCAL. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CERTIFICACIÓN DE LA ASESORA La que suscribe, profesora asesora de la tesis: “Selección de Bacillus spp.. AS. productores de quitinasas aislados de suelos de la Universidad Nacional de Trujillo,. IC. Perú, 2016”, que ha sido desarrollada de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad. G. de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad. LO. con su correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado acogiendo las. O. observaciones y sugerencias alcanzadas.. BI. Por lo tanto, autorizo al Br. Brian Erick Neira Chamorro continuar con el trámite. Trujillo, julio del 2017.. CA. DE. CI EN. CI. AS. del Reglamento correspondiente.. TE. __________________________________. IO. Dra. Eva Villanueva Tarazona. BI. BL. ASESORA. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. AS. A Dios, por ser mi creador, porque en su amor infinito me ha dado salud y fortaleza. G. IC. para lograr mis objetivos trazados.. LO. A mi padre Santos Neira, por su apoyo en todo aspecto de mi vida, enseñándome con. O. su ejemplo el esfuerzo, la dedicación y el. BI. sacrificio que uno debe poner para lograr. CI EN. haberme traído al mundo, por su amor. CI. A mi madre Martha Chamorro, por. AS. sus objetivos.. abnegado, dedicación y apoyo constante en. DE. mi vida.. A mi Abuela Eulalia, por su infinito amor,. CA. preocupación, motivación y ternura, con lo cual llena mi alma de fuerza y deseos de. BL. IO. TE. seguir progresando.. A Claudia Durand, por su amor, confianza,. BI. compañerismo, respeto, y por ser mi inspiración para lograr mis metas y objetivos.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO A mi asesora de tesis, Dra. Eva Elizabeth Villanueva Tarazona, por sus orientaciones,. AS. consejos, sus valores y principios que han sido una fuente de motivación y ejemplo para. IC. seguir en el trascurso de mi vida.. G. A mis padres Santos y Martha, porque sin su apoyo nada de lo que estoy logrando hubiera. LO. sido posible, gracias a su amor incondicional, ejemplo y consejos he podido alcanzar hasta. O. el presente mis metas trazadas, y aún faltan alcanzar muchas más; sé y confió que ellos. BI. siempre estarán ahí para mí.. AS. A mi abuelita Eulalia, por su inmenso amor que siempre me demuestra, lo cual es una. CI. fuente inagotable de fuerzas y motivación para poder seguir avanzando en la vida.. CI EN. A Claudia Durand, por su gran aporte, apoyo y motivación en todo momento durante esta. BI. BL. IO. TE. CA. DE. investigación.. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN. En esta investigación se seleccionó cultivos del género Bacillus spp. productores de. AS. quitinasas, aislados a partir de 35 muestras de suelo de áreas agrícolas y no agrícolas de la. IC. Ciudad Universitaria de la Universidad Nacional de Trujillo. Para ello las muestras de. G. suelo fueron pre enriquecidas con polvo de residuos de caparazones de cangrejos; luego. LO. fueron tratadas a 81±1°C durante 20 minutos. Después de hacer diluciones seriadas se. O. sembraron en Agar Nutritivo y se incubaron a 30°C durante 48 horas. Se aislaron 150. BI. cultivos, 100 a partir de suelo de áreas agrícolas y 50 de suelo de áreas no agrícolas, de los. AS. cuales los cultivos MIT-A12-1, MIT-A13-4, MIT-A14-1 y MIT-A16-3 fueron. CI. seleccionados por presentar actividad quitinolítica a los cuales se recomienda identificarlos. CI EN. molecularmente y evaluar la posibilidad de ser utilizados en el control biológico de hongos. DE. fitopatógenos.. BI. BL. IO. TE. CA. Palabras clave: quitina coloidal, quitinasas, Bacillus. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT. AS. In this research was selected crops of the genus Bacillus spp. producers of chitinases, 35. IC. isolated from soil samples of agricultural and non-agricultural areas of the Campus of the. G. National University of Trujillo. To do this the soil samples were pre enriched with dust. LO. waste of shells of crabs; they were then treated to 81±1°C for 20 minutes. After making. O. dilutions were sown on nutrient agar and incubated at 30°C for 48 hours. A total of 150. BI. crops were isolated, 100 from soil from agricultural areas and 50 from soil from non-. AS. agricultural areas, of which MIT-A12-1, MIT-A13-4, MIT-A14-1 and MIT-A16-3 were. CI. selected because they present chitinolytic activity and it is recommended to identify them. CI EN. molecularly and to evaluate the possibility of being used in the biological control of. DE. phytopathogenic fungi.. BI. BL. IO. TE. CA. Key words: colloidal chitin, chitinases, Bacillus. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INDICE AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ..................... ii. AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ....................... iii. IC. PRESENTACIÓN............................................................................................................ iv. G. MIEMBROS DEL JURADO ............................................................................................ v. LO. APROBACIÓN................................................................................................................ vi. O. DEL ASESOR ................................................................................................................ vii. BI. DEDICATORIA ............................................................................................................ viii. AS. AGRADECIMIENTO ..................................................................................................... ix. CI. RESUMEN ....................................................................................................................... x. CI EN. ABSTRACT ..................................................................................................................... xi. DE. ÍNDICE ........................................................................................................................... xii INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1. CA. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 7. TE. MATERIAL Y MÉTODOS .............................................................................................. 8. IO. RESULTADOS............................................................................................................... 12. BL. DISCUSIÓN ................................................................................................................... 22 ENUNCIADO RESUMEN ............................................................................................. 27. BI. RECOMENDACIONES ................................................................................................. 28 REFRENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 29 ANEXOS ........................................................................................................................ 35. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ANEXO 1.. Croquis de la ciudad universitaria de la Universidad Nacional de Trujillo, donde se identificaron las áreas agrícolas y ubicaron. 25 puntos de. muestreo como también se identificaron las áreas no agrícolas y se. Área no agrícola seleccionada a partir del cual se tomó la muestra a una. IC. ANEXO 2.. AS. ubicaron 10 puntos de muestreo.. LO. G. profundidad de 10 cm. El área se limpió de ramas, piedras y otras. Muestras de suelo tamizadas y homogenizadas colocadas en recipientes de. BI. ANEXO 3.. O. partículas gruesas.. Muestras de suelo a las que se les agregó. polvo de caparazones de. CI. ANEXO 4.. AS. plástico, codificados.. ANEXO 5.. CI EN. cangrejo (como parte del pre-enriquecimiento). Muestras de suelo protegidas con malla, durante el proceso de pre-. Tratamiento térmico en baño de agua a 80°C durante 20 minutos, de las. CA. ANEXO 6.. DE. enriquecimiento con polvo de triturado de caparazones de cangrejo.. TE. muestras de suelo. ANEXO 7.. Diluciones decimales de las muestras de suelo después del tratamiento. BL. IO. térmico a 80°C durante 20 minutos.. BI. ANEXO 8.. Siembra por superficie en placas conteniendo Agar quitina coloidal, de las muestras de suelo tratadas térmicamente a 80°C durante 20 minutos y diluidas con Agua destilada estéril.. xiii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ANEXO 9:. Colonias con características macroscópicas de Bacillus spp. aisladas a partir de suelo de áreas agrícolas y no agrícolas de la Ciudad Universitaria. AS. de la Universidad Nacional de Trujillo, Perú, 2016. ANEXO 10: Cultivos de Bacillus spp. aislados en base a características macro y. IC. micromorfológicas de las colonias, los cuales fueron codificados. LO. Cultivos de Bacillus spp., aislados en agar nutritivo, procedente de 25 recolectadas de la Ciudad. BI. muestras de suelo de áreas agrícolas. O. ANEXO 11.. G. adecuadamente.. Cultivos de Bacillus spp., aislados en agar nutritivo, procedente de 10. CI. ANEXO 12.. AS. Universitaria de la Universidad Nacional de Trujillo, Perú, 2016.. recolectadas de la Ciudad. CI EN. muestras de suelo de áreas no agrícolas. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Universitaria de la Universidad Nacional de Trujillo, Perú, 2016.. xiv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. I. INTRODUCCIÓN. AS. Las poblaciones de bacterias en el suelo no se distribuyen al azar; factores como la. IC. composición de los suelos, la materia orgánica, el pH, el agua y la disponibilidad de. G. oxígeno, junto con la planta huésped, desempeñan un papel importante1. La complejidad. LO. estructural del suelo y los sedimentos son importante para la diversificación en el nivel de. O. poblaciones, porque permite que los recursos sean fraccionados y se creen nuevos nichos. BI. con los que se incrementa la especialización y división en especies ecológicas nuevas2.. AS. La mayoría de las comunidades terrestres sufren perturbaciones intermitentes como. CI. escasez de alimento, congelamiento/descongelamiento, sequía o la actividad humana. Estas. CI EN. condiciones ambientales alteradas y los recursos que se liberan crean oportunidades para que nuevas especies se establezcan. Así, la perturbación asegurará que las comunidades. DE. incluyan una mezcla de los diferentes estadios de sucesión3. La vida microbiana que se desarrolla en los suelos se sustenta en dos grandes. CA. elementos, la materia orgánica y la biomasa microbiana. La biomasa microbiana. TE. transforma los aportes orgánicos que llegan al suelo, produciendo en forma simultánea: a). IO. la mineralización biológica de las fracciones orgánicas menos resistentes, lo que permite. BL. liberar nutrientes asimilables por las plantas y, b) la síntesis de complejos orgánicos. BI. estables que conduce a la formación de humus. Esto tiene relación con la conservación y la productividad del suelo, junto con las propiedades físicas, químicas y biológicas del sistema edáfico4.. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las bacterias son el grupo más abundante de microorganismos en el suelo por su capacidad de crecimiento rápido, una gran adaptabilidad tanto fisiológica como genética y la utilización de gran variedad de compuestos como el nitrógeno y el fósforo que son. AS. nutrimentos que las plantas requieren en mayor proporción4. Se las encuentra presentes en. IC. un rango aproximado de 106 y 108 células por Gramo de suelo pesando aproximadamente. G. 10 000 kg/ha, que representa el 5 % del total de material orgánica seca presente en el. LO. suelo5.. BI. O. La concentración de bacterias por gramo de suelo que se haya alrededor de las raíces de las plantas en la rizósfera es mucho mayor que en el resto del suelo, esto se puede. AS. deber a los altos niveles de nutrientes que se haya en la zona que rodea a las raíces que. CI. permiten el desarrollo de poblaciones microbianas1. En un trabajo realizado en el 2008, se. CI EN. estudió la diversidad microbiana en la rizósfera del cultivo de papa en los departamentos de Huancavelica y Puno. Se encontró que las bacterias del género Bacillus constituían un. DE. grupo importante5.. El género Bacillus fue descrito por primera vez por Cohn y comprende un grupo de. CA. especies filogenética y fenotípicamente heterogéneas. Incluye más de 100 especies y sus. TE. miembros se consideran ubicuos. En una etapa temprana de la clasificación de las especies. IO. del género Bacillus se tienen en cuenta estas características fundamentales: ser Gram. BL. positivos, de forma bacilar, catalasa positiva, aerobios estrictos o anaerobios facultativos y. BI. formadores de endosporas. Esto hace que exista una gran cantidad de especies de este género ocupando una gran variedad de hábitats6. Este género de bacterias es uno de los más comunes de vida libre presentes en el suelo; en este hábitat, se ubica desde las capas más superficiales hasta las más profundas y. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. también colonizan la rizósfera de las plantas. Estas bacterias han demostrado tener una amplia distribución en todas las regiones geográficas del planeta, alcanzando alrededor del 24% del total de bacterias aisladas en el suelo7. Las bacterias pertenecientes a este género. AS. están ampliamente distribuidas en la naturaleza y además del suelo, se encuentran en el. IC. agua y como parte de la flora intestinal normal de algunos mamíferos, incluyendo al. LO. G. hombre8.. Taxonómicamente según la segunda Edición del Manual Bergey's. El género. BI. O. Bacillus pertenece a la familia I Bacilliaceae, del orden I Bacillales de clase tres Bacilli, del fillum BXIII firmicutes del Dominio bacteria. La diferenciación entre especies del. AS. género Bacillus se centró en los resultados en la fermentación de lactosa, sorbitol, manitol,. CI EN. CI. melobiosis, hidrólisis de la urea, y descarboxilación de la lisina9. Este género comprende una amplia diversidad de tipos fisiológicos, donde se destacan características como la degradación de la mayoría de los sustratos derivados de. DE. plantas y animales, incluyendo celulosa, almidón, pectina, proteínas, agar, hidrocarburos y otros; además su capacidad para la producción de antibióticos, la nitrificación, la. CA. desnitrificación, la fijación de nitrógeno, la litotrofía facultativa, la acidofilia, la alcalofilia,. TE. la psicrofilia, la termofilia y el parasitismo, ejemplifican su capacidad de sobrevivir en. IO. diversos ambientes6.. BL. Su ciclo de vida se divide en dos fases: crecimiento vegetativo y esporulación.. BI. Durante el primer estado, la bacteria crece de forma exponencial cuando se encuentra en un medio donde las condiciones son favorables. Cuando los nutrientes comienzan a escasear, la bacteria esporula, formando una endospora, la cual puede permanecer viable en el ambiente por largos períodos de para volver a su forma vegetativa. También se ha visto. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. que existe una gran distribución de estas endosporas, estructura que les permite sobrevivir en condiciones extremas de temperatura desecación, pH entre otros6.. AS. Tienen la ventaja de poseer diversos mecanismos para asegurar su sobrevivencia ante condiciones físicas desfavorables; bajo estas condiciones Bacillus spp. inicia una serie. IC. de respuestas; si estas respuestas fallan se mantienen en estado vegetativo y se induce la. LO. G. esporulación10. La habilidad de las especies de Bacillus de formar endosporas altamente. O. resistentes les da una ventaja competitiva muy importante en un ambiente como el suelo11.. BI. La endospora es una estructura especializada resistente a los efectos letales del. AS. calor, sequedad, congelación, radiación y químicos tóxicos. En consecuencia, las bacterias. CI. forman esta estructura para resistir las condiciones adversas del ambiente, también la. CI EN. pueden llegar a formar como una defensa metabólica. Por lo tanto, la formación de la endospora está dada por las condiciones del medio en que se encuentran estas bacterias. Estas endosporas pueden ser aisladas desde una gran variedad de sustratos, dada su. DE. resistencia al aire seco, al largo período de sobrevivencia bajo condiciones adversas, y a sus características termorresistentes, ya que pueden llegar a soportar desde 80°C a 100°C. CA. de temperatura. La resistencia al calor de las endosporas fue reconocida en Bacillus subtilis. TE. por Cohn en 18778.. IO. Una gran variedad de microorganismos producen enzimas de diferentes tipos que. BL. actúan contra otros microorganismos que están presentes en su hábitat. Entre ellas, se. BI. destacan las quitinasas, hidrolasas y proteasas que actúan fundamentalmente sobre los hongos. Se ha demostrado la producción de este tipo de metabolitos en Bacillus subtilis y. entre ellos, se destacan lipasas, proteasas y β glucanasas que actúan sobre el patógeno fúngico Fusarium oxysporum. Por otra parte, también se ha informado la producción de. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. quitinasas por parte de Bacillus cereus, lo que podría estar involucrado en el biocontrol de hongos fitopatógenos6.. AS. Esta capacidad de ser metabólicamente muy diversos les permite tener una colonización exitosa en el ambiente rizosférico. Entre algunos mecanismos promotores de. IC. crecimiento identificados en el género Bacillus, se encuentran la solubilización de. LO. G. fosfato12, la síntesis de fitohormonas como el ácido indol acético13 y la capacidad de controlar algunos hongos patógenos en la rizósfera14. Las especies este género son un. AS. fuente de producción de enzimas extracelulares15.. BI. O. grupo importante de bacterias con aplicación en biotecnología, ya que tienen interés como. CI. Diversos estudios han señalado que el género Bacillus produce enzimas hidrolíticas. CI EN. como proteasas y quitinasas lo cual ha permitido su aplicación en la industria y en control biológico respectivamente. El sistema de quitinasas, tiene un papel importante en la degradación de quitina, por lo que es crucial en la hidrólisis de la pared celular de. DE. hongos16.. CA. La quitina es un polímero, que estructuralmente, se compone de una cadena de. TE. enlaces ß-1,4-glucosídico enlazan unidades de N-acetil- D-glucosamina y es un componente común de exoesqueleto de insectos, caparazón de crustáceos y pared celular. IO. de hongos17. Se ha determinado la producción de quitinasas por algunas especies de. BL. Bacillus con potencial para el control biológico, además, se ha observado que B.. BI. thuringiensis. subsp. aizawai, produce quitinasas las cuales son utilizadas contra hongos. fitopatógenos ya que atacan su pared celular y, por tanto, inhiben el crecimiento del hongo.15. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las quitinasas de B. thuringiensis var. israelensis producidas por la fermentación del caparazón de camarón, como fuente de quitina, muestra tener actividad contra hongos. AS. fitopatógenos como Sclerotium rolfsii18,22. Actualmente la Universidad Nacional de Trujillo, cuenta con varias áreas agrícolas. IC. y no agrícolas; que rodean las distintas facultades de la Ciudad Universitaria, donde es. LO. G. posible realizar investigaciones y lograr aislar microorganismos del suelo como los del género Bacillus y poder llegar a seleccionar cultivos nativas; que posteriormente pueden. BI. O. ser identificadas a nivel molecular.. AS. Es por eso que el objetivo general de este trabajo fue aislar y seleccionar bacterias. CI. nativas del género Bacillus spp. productores de quitinasas a partir de suelo agrícola y no. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. agrícola de la Ciudad Universitaria de la Universidad Nacional de Trujillo.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. II.. OBJETIVOS. 1. Aislar cultivos de Bacillus spp. productores de quitinasas a partir de muestras de. IC. AS. suelos de la Universidad Nacional de Trujillo.. G. 2. Seleccionar cultivos de Bacillus spp. productores de quitinasas a partir de cultivos. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. aislados de muestras de suelos de la Universidad Nacional de Trujillo. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. III. MATERIAL Y MÉTODOS 1. MATERIAL BIOLÓGICO Universitaria de la. AS. 25 muestras de suelo de áreas agrícolas de la Ciudad. IC. Universidad Nacional de Trujillo.. G. 10 muestras de suelo de áreas no agrícolas de la Ciudad Universitaria de la. O. LO. Universidad Nacional de Trujillo.. BI. 2. METODOLOGÍA. AS. 2.2. RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS DE SUELO. CI. Se delimitó las zonas de muestreo de áreas agrícolas y no agrícolas y se ubicó. CI EN. cada punto de muestreo (Anexo 1); se limpió cada área superficialmente, eliminando piedras, ramas u otras partículas gruesas (Anexo 2) y se recolectó aproximadamente 150 g de suelo a 10 cm de profundidad con una espátula. DE. estéril; las muestras fueron recolectadas en bolsas de polietileno de primer uso con cierre hermético, debidamente rotuladas de acuerdo al lugar de. CA. recolección, luego se transportaron al laboratorio para su posterior. IO. TE. tratamiento.15. BL. 2.3. PRE-ENRIQUECIMIENTO DE LAS MUESTRAS. BI. a. OBTENCIÓN DEL POLVO DE RESIDUOS DE CAPARAZONES DE CANGREJO Se recolectaron restos de caparazones de cangrejo del balneario de Huanchaco, los que se autoclavaron para luego en condiciones asépticas, y usando material estéril se trituraron hasta obtener polvo homogéneo.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. b. PRE-ENRIQUECIMIENTO DE LAS MUESTRAS Cada muestra se tamizó, homogenizó y colocó en recipientes de plástico. AS. (Anexo 3), a los cuales se les agregó polvo de residuos de caparazones de. IC. cangrejos (Anexo 4) y se homogenizó la muestra; luego, se las humedeció. G. con Agua Destilada Estéril (ADE) cada dos días durante siete días, evitando. O. LO. el exceso de agua (Anexo 5).. BI. 2.4. TRATAMIENTO TÉRMICO DE LA MUESTRA. AS. Pasado el tiempo de pre-enriquecimiento se pesó 2.5 g de cada muestra en. CI. condiciones asépticas; los que fueron vertidos en un tubo de ensayo. CI EN. conteniendo 22.5 de ADE. Se mezcló vigorosamente durante 5 minutos y se calentó en baño de agua a 81±1°C durante 20 minutos (Anexo 6); cumplido este tiempo, se pasó por baño de hielo para evitar el sobrecalentamiento de la. CA. DE. muestra. 15, 19, 20. 2.5. AISLAMIENTO. Y. CARACTERIZACIÓN. DE. BACTERIAS. QUE. TE. PRESENTEN CARACTERÍSTICAS DEL GÉNERO Bacillus. IO. Después del último tratamiento se realizó diluciones decimales con ADE. BL. (Anexo 7) y se sembró por superficie, 100 uL de las dos últimas diluciones. BI. (10-2 - 10-3) en placas con Agar nutritivo (AN) (Anexo 8); se incubó a 30°C durante 48 horas. Cumpliendo el tiempo de incubación se realizó la caracterización macro y micromorfológicas de las colonias desarrolladas15, 19, 20. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las colonias con características del género Bacillus, tomando en cuenta sus características macromorfológicas típicas, tales como: color blanquecino, opaco, aplanado, de bordes irregulares (Anexo 9); y sus características. AS. micromorfológicas típicas: formas bacilares y formadoras de endosporas, se. IC. aislaron en frasquitos de vidrio conteniendo Agar nutritivo y se incubaron a. G. 30°C durante 48 horas (Anexo 10). A los cultivos obtenidos se les realizó. LO. coloraciones de Gram para verificar su pureza, y tinción de Wirtz para. BI. AS. catalasa positivos o negativos. 15, 19, 20. O. evidenciar la presencia o ausencia de espora. Finalmente se determinó si son. CI. 2.6. SELECCIÓN PRIMARIA DE Bacillus spp. PRODUCTORES DE. CI EN. QUITINASAS. A los cultivos puros aislados con características del género Bacillus se les. DE. evaluó la capacidad de producir quitinasas, para lo cual se sembró por puntura de los cultivos puros, en placas conteniendo medio mínimo de sales más. CA. quitina coloidal, cuya composición fue para cada 100 mL de medio: 0.1g de. TE. (NH4)2SO4; 0,7g de K2HPO4; 0,3g de KH2PO4; 0,01g de MgSO4.7H2O; 0,05g de C6H5Na3O7. 2H2O; 0,2g de extracto de levadura, y 1,5g de Agar; a pH 7),. IO. más 0.5g de quitina coloidal como fuente de carbono. Las placas se incubaron. BI. BL. a 30°C durante 48 - 96 horas. Después del tiempo de incubación se evaluó la capacidad de producir quitinasas, mediante la presencia de halos transparentes alrededor de las colonias desarrolladas. Se midieron los diámetros de las colonias y los diámetros de hidrólisis de la quitina, y se registraron los datos adecuadamente en las tablas previamente elaboradas.15, 21. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.7. CONSERVACIÓN. DE. LOS. CULTIVOS. DE. Bacillus. spp.. SELECCIONADOS Los cultivos puros con características de Bacillus, y con capacidad quitinolítica. AS. se conservaron en AN y sus esporas, previamente cuantificadas, en tubos. IC. conteniendo arena estéril. Todos los tubos fueron rotulados con los códigos. G. establecidos en el Laboratorio de Microbiología Industrial de la UNT.. LO. Los cultivos en AN se conservaron entre 9±1 °C y los conservados en Arena. BI. O. estéril, a temperatura ambiental.. AS. 2.8. RECOLECCIÓN DE DATOS. CI. El número de cultivos con características macroscópicas y microscópicas del. CI EN. género Bacillus aislados a partir de suelo de áreas agrícolas y no agrícolas, así como los cultivos seleccionados fueron organizados en tablas y figuras, asi mismo se calcularon los porcentajes correspondientes. Los diámetros de. CA. DE. hidrólisis de quitina también se organizaron en tablas y figuras.. 2.9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO. TE. Los halos de hidrólisis de quitina producidos por cada uno de los cultivos de. IO. Bacillus spp. fueron analizados mediante la prueba estadística del Análisis de. BL. Varianza (ANOVA) con una significancia del 0.05 % para establecer si existe. BI. o no diferencia significativa entre ellos.. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IV. RESULTADOS En la Tabla 1, se muestran los datos de 100 cultivos puros de Bacillus spp. aislados en. AS. agar nutritivo, procedentes de 25 muestras de suelo de áreas agrícolas, recolectados de la. IC. Ciudad Universitaria de la Universidad Nacional de Trujillo, los que fueron aislados. G. tomando en cuenta las características macromorfológicas tales como forma, elevación,. LO. bordes y aspecto de la colonia; y las características micromorfológicas como forma,. O. respuesta a la tinción de Gram, y a la tinción de Wirtz para observar si son esporulados o. BI. no. Se obtuvieron cuatro cultivos puros de cada muestra, debido a que se eligieron colonias. AS. con distintas características macromorfológicas entre sí, pero con características típicas del. CI EN. CI. género Bacillus.. En la Tabla 2, se muestran los datos de 50 cultivos puros de Bacillus spp. aislados en agar nutritivo, de las 10 muestras de suelo de áreas no agrícolas recolectados de la Ciudad. DE. Universitaria de la Universidad Nacional de Trujillo, tomando en cuenta las características macromorfológicas como: forma, elevación, bordes y aspecto de la colonia; y las. CA. características micromorfológicas como: forma, respuesta a la tinción de Gram y a la. TE. tinción de Wirtz para observar si son esporulados o no. Se obtuvieron cinco cultivos puros. IO. de cada muestra, se tomaron en cuenta diferencias en las características macromorfológicas. BI. BL. de las colonias entre sí, pero con características típicas del género Bacillus.. En la Tabla 3, se muestran los datos de los cultivos puros seleccionados dentro de todos los cultivos puros que se aislaron, esta selección efectuó mediante la capacidad de degradar quitina, donde dicha actividad se evidenció con la formación del halo alrededor de las. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. colonias formadas. En esta tabla se detalla el número de muestra, tipo de suelo, código del cultivo puro, el diámetro de la colonia y el diámetro del halo de hidrolisis de quitina.. AS. Los 150 cultivos puros aislados tanto de las muestras de suelo de áreas agrícolas como las. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. de áreas no agrícolas (Tabla 1 y 2) resultaron positivos frente a la prueba de la catalasa.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. Tabla 1. Cultivos de Bacillus spp., aislados en agar nutritivo, procedente de 25 muestras de suelo de áreas agrícolas recolectadas de la Ciudad Universitaria de la Universidad Nacional de Trujillo, Perú, 2016.. LO. plana. BORDES. lobulados. ASPECTO. seco. estreptobacilos Gram + esporulados. CI AS. BI. irregular. ELEVACION. O. FORMA. plana. lobulados. rugoso. bacilos cortos Gram + esporulados. convexo. redondeados. mucoso. bacilos cortos Gram + esporulados. irregular. plana. elevados. seco. bacilos Gram + esporulados. irregular. elevada. filamentoso. rugoso. bacilos Gram + esporulados. irregular. convexo. redondeados. mucoso. cocobacilos cortos Gram + esporulados. EN. irregular. CI. MIT-A1-1 / MIT-A2-2 / MIT-A3-1 / MIT-A4-4 / MIT-A5-4 / MIT-A6-4 / MIT-A7-3 / MIT-A8-1 / MIT-A9-1 / MIT-A10-1 / MIT-A11-3 / MIT-A12-1 / MIT-A13-4 / MIT-A14-4 / MIT-A15-4 / MIT-A16-2 / MIT-A17-1 / MIT-A18-1 / MIT-A19-1 / MIT-A20-1 / MIT-A21-2 / MIT-A22-3 / MIT-A23-1 / MIT-A24-4 / MIT-A25-3 MIT-A1-2 / MIT-A2-1 / MIT-A3-3 / MIT-A4-1 / MIT-A5-1 / MIT-A6-3 / MIT-A7-1 / MIT-A9-3 / MIT-A10-2 / MIT-A11-1 / MIT-A12-4 / MIT-A13-3 / MIT-A15-3 / MIT-A16-3 / MIT-A17-2 / MIT-A18-3 / MIT-A20-3 / MIT-A21-1 / MIT-A22-1 / MIT-A23-2 / MIT-A24-1 / MIT-A25-1 MIT-A1-3 / MIT-A2-4 / MIT-A3-2 / MIT-A4-3 / MIT-A5-3 / MIT-A6-1 / MIT-A7-2 / MIT-A8-3 / MIT-A9-2 / MIT-A10-3 / MIT-A11-2 / MIT-A12-3 / MIT-A13-2 / MIT-A14-3 / MIT-A15-1 / MIT-A16-1 / MIT-A17-3 / MIT-A18-2 / MIT-A19-3 / MIT-A20-2 / MIT-A21-4 / MIT-A22-2 / MIT-A23-3 / MIT-A24-3 / MIT-A25-2 MIT-A1-4 / MIT-A2-3 / MIT-A3-4 / MIT-A5-2 / MIT-A8-4 / MIT-A9-4 / MIT-A10-4 / MIT-A13-1 / MIT-A14-1 / MIT-A16-4 / MIT-A17-4 / MIT-A19-4 / MIT-A20-4 / MIT-A21-3 / MIT-A23-4 MIT-A4-2 / MIT-A7-4 / MIT-A8-2 / MIT-A11-4 / MIT-A12-2 / MIT-A14-2 / MIT-A18-4 / MIT-A19-2 / MIT-A22-4 / MIT-A24-2 / MIT-A25-4. G. CARACTERÍSTICAS MACROMORFOLÓGICAS(COLONIAS) MICROMORFOLÓGICAS. CÓDIGO DE CULTIVOS. BI. MIT-A6-2 / MIT-A15-2. BL I. O. TE CA. DE. circular. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. muestras de suelo de áreas no agrícolas,. IC AS. Tabla 2. Cultivos puros de Bacillus spp, aislados en agar nutritivo, procedentes de 10. recolectadas de la Ciudad Universitaria de la Universidad Nacional de Trujillo, Perú, 2016.. G. CARACTERÍSTICAS CÓDIGO DE CULTIVOS. MICROMORFOLÓGICAS. rugoso. bacilos Gram + esporulados. convexo. redondeados. mucoso. bacilos cortos Gram + esporulados. irregular. plana. lobulados. seco. estreptobacilos Gram + esporulados. EN. CI AS. circular. elevada. filamentoso. rugoso. bacilos Gram + esporulados. plana. elevados. seco. bacilos Gram + esporulados. convexo. redondeados. mucoso. cocobacilos cortos Gram + esporulados. CI. irregular. irregular. TE CA. MIT-NA1-3 / MIT-NA2-4 / MIT-NA3-5 / MIT-NA4-2 / MIT-NA5-5 / MIT-NA6-2 / MIT-NA7-5 / MIT-NA8-5 / MIT-NA9-4 / MIT-NA10-3 MIT-NA1-4 / MIT-NA2-1 / MIT-NA3-2 / MIT-NA4-4 / MIT-NA5-2 / MIT-NA6-4 / MIT-NA7-2 / MIT-NA8-2 / MIT-NA9-1 / MIT-NA10-4 MIT-NA1-5 / MIT-NA2-3 / MIT-NA4-5 / MIT-NA5-3 / MIT-NA6-5/ MIT-NA7-3 / MIT-NA8-3/ MIT-NA9-3 / MIT-NA10-5 MIT-NA3-1 / MIT-NA4-3 / MIT-NA5-1 / MIT-NA6-3 / MIT-NA7-1 / MIT-NA8-1. lobulados. ASPECTO. DE. MIT-NA1-2 / MIT-NA2-5/ MIT-NA9-5 / MIT-NA10-2. elevada. O. MIT-NA1-1 / MIT-NA2-2 / MIT-NA3-4 / MIT-NA4-1 / MIT-NA5-4 / MIT-NA6-1 / MIT-NA7-4 / MIT-NA8-4 / irregular MIT-NA9-2 / MIT-NA10-1. BORDES. BI. ELEVACION. LO. MACROMORFOLÓGICAS(COLONIAS) FORMA. BI. BL I. O. circular. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Figura 1. Colonias con características macroscópicas de Bacillus spp. aisladas a partir de suelo de áreas agrícolas y no agrícolas de la Ciudad Universitaria de la Universidad Nacional de Trujillo, Perú, 2016. Las muestras de suelo, fueron sometidas a 80°C durante 20 minutos y sembradas en Agar Nutritivo e incubadas a 30°C durante 48 horas. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 3. Cultivos puros de Bacillus spp. seleccionados por su actividad quitinolítica.. MUESTRA. CÓDIGO DE CULTIVO. DIÁMETRO DE LA COLONIA(mm). Agrícola. 12. MIT-A12-1. 7. Agrícola. 13. MIT-A13-4. 11. Agrícola. 14. MIT-A14-1. 10. Agrícola. 16. MIT-A16-3. 2. DIÁMETRO DEL HALO (mm). AS. TIPO DE SUELO. 20 13 28. p > 0.05. O. LO. G. IC. 15. BI. Las colonias fueron evaluadas en Agar mínimo de sales más quitina coloidal al 0.5% e incubadas a 30°C. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. durante 48 - 96 horas.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. (b). AS. BI. O. LO. G. IC. AS. (a). (d). BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. (c). BI. Figura 2.. Observaciones microscópicas mediante la Tinción de Gram de cuatro cultivos seleccionados por su capacidad de producir quitinasas. (a): Cultivo MIT-A12-1 (b): Cultivo MIT-A13-4 (c): Cultivo MIT-A14-1. (d): Cultivo MIT-A16-3.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. (b). CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. (a). (d). BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. (c). Figura 3.. Observaciones microscópicas mediante la Tinción de Wirtz de cuatro cultivos seleccionados por su capacidad de producir quitinasas. (a): Cultivo MIT-A12-1 (b): Cultivo MIT-A13-4 (c): Cultivo MIT-A14-1. (d): Cultivo MIT-A16-3.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. O. LO. G. MIT-A13-4. IC. MIT-A16-3. AS. MIT-A12-1. Figura 4.. TE. CA. DE. CI EN. CI. MIT-A14-1. Halos de hidrólisis de quitina de cuatro cultivos de Bacillus spp.: MIT-A12-1,. IO. MIT-A13-4, MIT-A14-1 y MIT-A16-3 aislados a partir de suelo de áreas agrícolas. BL. de la Ciudad Universitaria de la Universidad Nacional de Trujillo, Perú, 2016.. BI. Los cultivos se sembraron en Agar mínimo de sales más quitina coloidal al 0.5% e incubadas a 30°C durante 48 - 96 horas.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DE. Figura 5. Número y porcentaje total de cultivos con morfología de Bacillus spp. quitinolíticos y no quitinolíticos, aislados de muestras de suelo de la Ciudad Universitaria de la. BI. BL. IO. TE. CA. Universidad Nacional de Trujillo, Perú, 2016.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. V. DISCUSIÓN. El suelo es un ecosistema de enorme riqueza microbiana. Los estudios sobre los. AS. microorganismos del suelo son numerosos, sin embargo hasta la fecha no se ha. IC. determinado completamente la biodiversidad necesaria, en lo que se refiere a 23. y además. G. microorganismos, para que un suelo agrícola funcione de manera óptima. LO. dentro de la ciudad universitaria aun no existen suficientes investigaciones que den a. O. conocer la biodiversidad microbiológica presente en el suelo, debido a ello se tomó como. BI. punto de partida esto, con el objetivo de conocer más la microbiota presente en el suelo. AS. dentro de la ciudad universitaria, específicamente se direccionó esta investigación al. CI. aislamiento de Bacillus spp. y selección de los que presentaron la capacidad de producir. CI EN. quitinasas.. La mayor parte de los problemas fitosanitarios son causados por hongos, insectos y. DE. virus, quienes colonizan diversas partes de la planta, provocando desde la disminución de 24. . El control de plagas y. CA. la calidad del producto y hasta la pérdida total de la planta. enfermedades depende, en gran parte, de la aplicación de productos químicos. Sin. TE. embargo, el uso indiscriminado de estos, ha ocasionado severos problemas de. IO. contaminación ambiental y generando la selección de organismos altamente resistentes. Es. BL. por estas dos razones que se requieren nuevas estrategias para el control de plagas y. BI. enfermedades. La utilización de microorganismos en el control biológico de plagas y de enfermedades es una alternativa atractiva24.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Siendo asi, el aislamiento y selección de Bacillus spp. quitinasa productores viene a ser de suma importancia debido a que puede ser usado como controlador biológico dado que las quitinasas son enzimas que tiene un papel importante en la degradación de quitina,. G. IC. insectos, que pueden ocasionar problemas fitopatológicos en los cultivos.. AS. siendo crucial en la hidrolisis de la pared celular de hongos y en el exoesqueleto de algunos. LO. Se recolectaron en total 35 muestras de suelos de la ciudad universitaria de la. O. Universidad Nacional de Trujillo: 25 de áreas agrícolas (designación dada a áreas donde. BI. había sembríos y/o áreas verdes) y 10 de áreas no agrícolas (designación dada a áreas. CI. AS. desérticas y/o áridas).. CI EN. Todas las muestras de suelo se pre-enriquecieron con polvo de residuo de caparazones de cangrejos (Anexo 4), los que fueron autoclavados antes de ser aplicados en las muestras para evitar llevar flora foránea a la muestra. Luego se trató térmicamente en. DE. baño de agua a 80°C durante 20 minutos (Anexo 6) con el objetivo de eliminar la flora. CA. acompañante y quedarnos solo con la flora que pueda soporte el calor, características de. TE. bacterias esporulados como es el caso del Genero Bacillus.. IO. De las muestras procesadas se aislaron 150 cultivos: 100 de muestras de suelos de. BL. áreas agrícolas y 50 de muestras de suelos de áreas no agrícolas, con características macro. BI. y micromorfológicas que los ubican dentro del género Bacillus (Tabla 1 y 2).. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La observación macroscópica de las colonias formadas mostro colonias con forma irregular, planas, con bordes lobulados, color blanquecinas, opacas, como también colonias circulares con bordes regulares, convexas, de apariencia mucosa, rugosa o filamentosa. AS. (Figura 1) que en contraste con estudios de Escobar y col, que usaron de base los. IC. siguientes criterios: tamaño de las colonias (puntiforme, pequeñas, medianas, grandes);. G. color; forma (regulares, redondas, ovaladas, irregulares, filamentosas, rizoides); elevación. LO. de las colonias (plana, elevada, convexa monticular); bordes (entero, ondulado, aserrado,. O. filamentoso y rizado); superficie; olor (amoniacal, fétido, dulzón) y crecimiento 25. , coinciden con los. CI. AS. resultados obtenidos en este trabajo de investigación.. BI. (abundante, moderado, escaso), para identificar al género Bacillus. CI EN. Otro estudio realizado por Zaragoza, logro aislar cepas de Bacillus spp. que mostraron una morfología macroscópica propia de lo reportado por el género. Se pudieron observar colonias medianas y grandes, de color crema, borde irregular, aspecto ceroso. 26. ,. CA. DE. así como los identificados macroscópicamente en este estudio.. La observación al microscopio mostró la presencia de células vegetativas de forma. TE. bacilar y formación de esporas a las 72 h (Figura 2 y 3). Todas resultaron ser catalasa. IO. positivas, y la tinción de Gram las clasificó como Gram positivas. La forma bacilar Gram. BL. positiva, formadora de endosporas y catalasa positiva es característica especial del género. BI. Bacillus27 y es utilizada como parámetro para determinar especies del género Bacillus 20.. El aislamiento de Bacillus spp. a partir de suelos de la Universidad Nacional de Trujillo, realizado en este estudio, concuerda con Travers et ál.19 y Sosa López et ál.20. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. quienes señalan que las especies de Bacillus habitan en los suelos como microorganismos saprófitos por lo que es muy probable aislarlas de este medio. Esto se confirmó ya que se aislaron todas las muestras analizadas. El aislamiento de cultivos de Bacillus es común a. AS. partir de suelos, principalmente por la búsqueda de Bacillus thuringiensis, sin embargo, se. IC. han encontrado cepas de Bacillus sp. en residuos de caparazón de camarón28, así como. G. cepas de Bacillus sp. aislados de suelos alcalinos productoras de proteasas29. Por esta razón. LO. la búsqueda de especies del género Bacillus puede realizarse en una amplia gama de tipos. BI. O. y condiciones de suelos.. Del total de 150 cultivos de Bacillus spp. aislados, solo cuatro formaron halo de. AS. hidrólisis en el medio mínimo en sales más quitina coloidal (figura 4), lo que representa el. CI. 3% de cultivos que presentaron actividad quitinolítica (Figura 5) por lo que fueron. CI EN. seleccionados. El cultivo MIT-A16-3 presentó el mayor diámetro del halo en quitina coloidal, con un halo de 28 mm, proveniente de la muestra 16 de suelo de área agrícola.. DE. Seguido del cultivo MIT-A13-4 con un halo de 20 mm proveniente de la muestra 13 de suelo de área agrícola, seguido del cultivo MIT-A12-1 con un halo de 15 mm procedente. CA. de la muestra 12 de suelo de área agrícola, y por último el cultivo MIT-A14-1 con un halo. TE. de 13 mm procedente de la muestra 14 de suelo de área agrícola. (Tabla 3). No obstante al. IO. aplicar la prueba estadística ANOVA a los diámetro de hidrolisis producidos por los. BL. cultivos seleccionados se determinó que no existe diferencia significativa (p>0,05) entre. BI. ellos.. Estos resultados confirmarían que las enzimas quitinolíticas de los cultivos de Bacillus spp. tienen un rol nutricional secundario, y que la quitina no es una fuente importante de carbono y nitrógeno30. El aislamiento de cultivos quitinolíticos es realizado en ambientes. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. con presencia de residuos con fuente de quitina21,30,31. No obstante, en este estudio se comprueba que pueden ser recuperadas de ambientes sin aparente presencia de residuos quitinosos. La producción de quitinasas viene acompañada con la producción de proteasas,. AS. posiblemente como un complejo necesario para degradar compuestos quitinoproteicos, por. IC. lo que también sería importante evaluar la capacidad de producir proteasas de los cultivos. LO. G. seleccionados como quitinolíticos.. O. Se espera que los cultivos quitinolíticos aislados de suelo de la ciudad universitaria. BI. de la Universidad Nacional de Trujillo, sean identificados molecularmente en estudios. AS. posteriores, como también se evalué su potencial como controlador biológico de hongos. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. fitopatógenos.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. VI. ENUNCIADO RESUMEN. Se aislaron 150 cultivo de Bacillus spp. a partir de 35 muestras de suelos de la Ciudad. AS. Universitaria de la Universidad Nacional de Trujillo, Perú, 2016. De esos 150 cultivos, 100. G. IC. fueron aislados a partir de suelos de áreas agrícolas y 50 de suelos de áreas no agrícolas.. LO. A partir de los 150 cultivos de Bacillus spp. aislados, se seleccionaron cuatro cultivos que. O. representan el 3% del total de cultivos que presentaron actividad quitinolítica. Los cultivos. BI. seleccionados fueron codificados como: MIT-A12-1, MIT-A13-4, MIT-A14-1 y MIT-A16-. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. 3.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. VII. RECOMENDACIONES.  Se recomienda disolver la quitina coloidal por separado en ADE caliente para. IC. AS. facilitar su disolución al momento de la preparación del Agar Quitina Colidal.. LO. G.  Proseguir esta investigación, identificando bioquímica y molecularmente los. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. cultivos aislados para poder conocer la especie al que pertenecen.. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1. Calvo P, Zúñiga D. Caracterización Fisiológica de Cepas de Bacillus spp. Aisladas. IC. AS. De la Rizósfera de Papa (Solanum tuberosum). Ecol apl. 2010; 9(1): 31-39.. G. 2. Torsvik V, Øvreås L, Thingstad TF. Prokaryotic diversity-magnitude, dynamics,. O. LO. and controlling factors. Science. 2002; 296(5570): 1064-1066.. BI. 3. Connell JH. Diversity in Tropical Rain Forest and Coral Reefs. Science. 1978;. CI. AS. 199(4335): 1302-1310.. CI EN. 4. Alvarado Herrejón M, Beltrán Nambo MA, Ríos Chávez P, Martínez Trujillo M,. Amora Lazcano E, Carreón Abud Y. Dinámica estacional de comunidades. CA. 16(1): 19-24.. DE. microbianas en huertas de aguacate con diferente uso de suelo. Biológicas. 2014;. TE. 5. Calvo Vélez P, Reymundo Meneses L, Zúñiga Dávila D. Estudio de las poblaciones. microbianas de la rizósfera del cultivo de papa (Solanum tuberosum) en zonas. BL. IO. altoandinas. Ecol apl. 2008; 7(1,2): 141-148.. BI. 6. Tejera Hernández B, Rojas Badía MM, Heydrich Pérez M. Potencialidades del. género Bacillus en la promoción del crecimiento vegetal y el control biológico de hongos fitopatógenos. CENIC Ciencias Biológicas. 2011; 42(3): 131-138.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 7. Orberá Ratón T, Pérez Portuondo I, Ferrer Salas D, Cortés Ramos N, González. Giro Z. Aislamiento de cepas del género Bacillus sp. con potencialidades para la bioprotección y la estimulación del crecimiento vegetal. Rev Cubana de Química.. IC. AS. 2005; 17(1): 189-195.. G. 8. Castillo Colombo C, Sosa Briceño, Scorza J. Evaluación de la termorresistencia en. LO. metabolitos antifúngicos producidos por esporulados del género Bacillus. Rev. Soc. [Internet]. 2004 Ene [citado 2016 Jun 03]; 24(1-2): 65 67.. O. Ven. Microbiol.. en:. BI. Disponible. AS. http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S13152556200400010. CI EN. CI. 0011&lng=es.. 9. Anderson TH. Microbial eco-physiological indicators to asses soil quality. Agric. DE. Ecosyst Environ. 2003; 98: 285-293.. CA. 10. Petersohn A, Brigulla M, Haas S, Hoheisel J, Volker U, Hecker M. Global Analysis. of the General Stress Response of Bacillus subtilis. J. Bacteriol.. 2001;. 183:. IO. TE. 5617–5631.. BL. 11. Stephens C..Bacterial sporulation: A question of commitment Current? Curr Biol.. BI. 1998; 8(2): 45-48.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(45) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 12. Chatli AS, Beri V, Sidhu BS. Isolation and characterisation of phosphate. solubilizing microorganisms from the cold desert habitat of Salix alba Linn. in trans. AS. Himalayan region of Himachal Pradesh. Indian J Microbiol. 2008; 48(2): 267-273.. IC. 13. Gupta G, Parihar SS, Ahirwar NK, Snehi SK, Singh V. Plant Growth Promoting. G. Rhizobacteria (PGPR): Current and Future Prospects for Development of. O. LO. Sustainable Agriculture. J Microb Biochem Technol. 2015; 7(2): 96-102.. CI. AS. Manejo Integrado de Plagas. 2001; 62: 96-100.. BI. 14. Fernandez O, Vega L. Microorganismos antagonistas para el control fitosanitario.. CI EN. 15. Rodas Junco BA, Quero Bautista M, Magaña Sevilla HF, Reyes Ramírez A.. Selección de cepas nativas con actividad Quitino-Proteolítica de Bacillus sp.. DE. aisladas de suelos tropicales. Rev. Colomb. Biotecnol. 2009; 9(1): 107-113.. CA. 16. Watanabe T, Oyanagi W, Suzuki K, Tanaka H. Chitinase system of Bacillus. circulans WL-12 and importance of chitinase A1 in chitin degradation. J Bacteriol.. IO. TE. 1990; 172(7): 4017-4022.. BL. 17. Molano J, Bowers B, Cabib E. Distribution of chitin in the yeast cell wall. An. BI. ultrastructural and chemical study. J Cell Biol. 1980; 85(2): 199-212.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(46) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 18. Reyes Ramírez A, Escudero Abarca BI, Aguilar Uscanga G, Hayward Jones PM,. Barboza Corona E. Antifungical activity of Bacillus thuringiensis chitinase and its potencial for the Biocontrol of phytopathogenic fungi in soybean seeds. J Food. IC. AS. Science. 2004; 69(5): 131-134.. O. LO. Bacillus spp.” Appl Environ Microbiol. 1987; 55: 1263-1266.. G. 19. Travers R, Martin P, Reicheldy C. Selective process for efficient isolation of soil. BI. 20. Sosa López A, Pazos V, Torres D. Aislamiento y selección de bacterias. AS. pertenecientes al género Bacillus con potencialidades para el control biológico en. CI EN. CI. semilleros de tabaco. Centro Agrícola. 2005; 32 (3): 25-30.. 21. Sastoque Cala L, Mercado Reyes M, Santiago Salgado M, Quevedo Hidalgo B,. Pedroza Rodríguez AM. Producción de quitinasas extracelulares con una cepa. DE. alcalófila halotolerante de Streptomyces sp. aislada de residuos de camarón. Revista. CA. Mexicana de Ingeniería Química. 2007; 6 (2): 137-146.. TE. 22. Ammos D, Rampersad J, Khan A. Usefulness of staining parasporal bodies when. BL. IO. screening for Bacillus thuringiensis. J Invertebr Pathol. 2002; 79: 203-209.. BI. 23. Stewart W. The important to sustainable agricultura of biodiversity among. invertebrates and microorganisms. In: D. L. Hawksworth (ed) The biodiversity of microorganisms and invertebrates: Its role in sustainable agricultura. Redwood Press, Melksham, UK. 1991; 3–5.. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(47) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 24. Ibarra J, Del Rincón Castro M, Galindo E, Patiño M, Serrano L, García R et al.. Los microorganismos en el control biológico de insectos y fitopatógenos. Rev. AS. Latinoam Microbiol 2006; 48 (2): 113-120.. IC. 25. Escobar N, Mora J, Romero J. Identificación de poblaciones microbianas en. G. compost de residuos orgánicos de fincas cafeteras de Cundinamarca. Bol Cient Mus. O. LO. Hist Nat. 2012; 16 (1): 75-88.. BI. 26. Zaragoza J. Aislamiento de cepas de Bacillus productoras de proteasas con. AS. potencial uso industrial. Tesis para obtener el Grado de Maestría en Ciencias con. CI. Orientación en Microbiología Industrial, Universidad Autónoma de Nuevo León;. CI EN. 2011.. 27. Holt J, Krieg N, Staley J, Williams S. Bergey`s manual of determinative. CA. DE. bacteriology. USA: Williams and Wilkins. 1994.. 28. Rojas L, Cruz R, Guerrero M, Rodríguez R, Ibarra J. Selection and characterization. TE. of a proteo-chitinolytic strain of Bacillus thuringiensis, able to grow in shrimp. BL. IO. waste media. World Journal & Biotechnology. 1999; 15: 299-308.. BI. 29. Khosravi K, Falahatpishe H, Jalali M. Alkaline protease production on date waste. by an alkalophic Bacillus sp. 2-5 isolated from soil. Afr J Biotechnol 7. 2008; 10:. 1536-1542.. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(48) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 30. Barboza J, Contreras C, Velazquez R, Bautista J, Gomez M, Cruz R, Ibarra J.. Selection of chitinolytic strains of Bacillus thuringiensis. Biotechnology Letters.. AS. 1999; 21: 1125-1129.. IC. 31. Rojas I, Cruz R, Guerrero M, Rodriguez R, Ibarra J. Selection and characterization. G. of a proteo-chitinolytic strain of Bacillus thuringiensis, able to grow in shrimp. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. waste media. World Journal & Biotechnology. 1999; 15: 299-308.. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(49) AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. ANEXOS. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(50) BI. BL I. O. TE CA. DE. CI. EN. CI AS. BI. O. LO. G. IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ANEXO 1. Croquis de la ciudad universitaria de la Universidad Nacional de Trujillo, donde se identificaron las áreas agrícolas y ubicaron 25 puntos de muestreo (aa) como también se identificaron las áreas no agrícolas y se ubicaron 10 puntos de muestreo (aa). 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(51) CA. DE. CI. EN CI. AS. BI O. LO. G. IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ANEXO 2. Área no agrícola seleccionada a partir del cual se tomó la muestra a una. TE. profundidad de 10 cm. El área se limpió de ramas, piedras y otras partículas. BI. BL. IO. gruesas.. 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..