EVALUACIÓN DE DOS MEDIOS DE PROPAGACIÓN DE Rhizobium RC 402 01 Y Bradyrhizobium RC 391 01 PARA LA OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS EN Oryctolagus cuniculus

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. AS. UNIDAD DE INVESTIGACIÓN. AS. BI. O. LO. G. IC. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. CI. EVALUACIÓN DE DOS MEDIOS DE PROPAGACIÓN DE Rhizobium RC 402 -01 Y. CI EN. Bradyrhizobium RC 391- 01 PARA LA OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS EN. DE. Oryctolagus cuniculus.. TESIS. CA. PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE:. TE. BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO. IO. AUTOR: Br. SANDRA VICTORIA CAMPOS ARTEAGA. BL. ASESOR: Dra. BERTHA SOLEDAD SORIANO BERNILLA. BI. CO-ASESORA: Dra. MANUELA NATIVIDAD LUJÁN VELÁSQUEZ. TRUJILLO - PERÚ 2018. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC. AS. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO- MICROBIÓLOGO. O. LO. G. Dr. Orlando Gonzáles Nieves RECTOR. CI. AS. BI. Dr. Rubén Vera Veliz VICERRECTOR ACADÉMICO. DE. CI EN. Dr. Weider Portocarrero Cárdenas VICERRECTOR DE INVESTIGACIÓN. BI. BL. IO. TE. CA. Dr. Steban Ilich Zerpa SECRETARIO GENERAL. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO. CI EN. CI. AS. BI. Dr. William Zelada Straver SECRETARIO. O. LO. G. IC. Dr. Freddy Mejia Coico DECANO. Dra. Bertha Soriano Bernilla DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Y PARASITOLOGÍA. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. AS. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:. IC. En cumplimiento a las disposiciones establecidas en el reglamento de Grados y Títulos de. G. la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra. LO. consideración y claro discernimiento la presente tesis titulada:. O. Evaluación de dos medios de propagación de Rhizobium Rc 402 -01 y Bradyrhizobium. BI. Rc 391- 01 para la obtención de anticuerpos en Oryctolagus cuniculus, Trujillo - La. CI EN. CI. AS. Libertad, para obtener el Título Profesional de Biólogo-Microbiólogo.. ______________________________________ Br. Sandra Victoria Campos Arteaga.. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Trujillo, Enero de 2018. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MIEMBROS DEL JURADO. AS. Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido ejecutada en. IC. concordancia con las normas de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y. AS. BI. O. LO. G. Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.. CI. _______________________________ Ms.C. Juan Wilson Krugg. DE. CI EN. PRESIDENTE. SECRETARIO. BI. BL. IO. TE. CA. _______________________________ Dra. Manuela Luján Velásquez. _______________________________ Dra. Bertha Soriano Bernilla VOCAL. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. AS. Los profesores que suscriben, miembros del Jurado dictaminador, declaran que el presente. IC. informe de tesis titulado: Evaluación de dos medios de propagación de Rhizobium Rc 402 -. G. 01 y Bradyrhizobium Rc 391- 01 para la obtención de anticuerpos en Oryctolagus. LO. cuniculus, Trujillo - La Libertad, ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales,. AS. BI. O. siendo APROBADO por UNANIMIDAD.. _______________________________. CI. Ms.C. Juan Wilson Krugg. DE. CI EN. PRESIDENTE. _______________________________. SECRETARIO. BI. BL. IO. TE. CA. Dra. Manuela Luján Velásquez. _______________________________ Dra. Bertha Soriano Bernilla VOCAL. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CERTIFICACIÓN DEL ASESOR. AS. El que suscribe, Dra. Bertha Soriano Bernilla, Profesora de la Universidad Nacional de Trujillo y asesor de la presente tesis titulada: Evaluación de dos medios de propagación de. G. IC. Rhizobium Rc 402 -01 y Bradyrhizobium Rc 391- 01 para la obtención de anticuerpos en. LO. Oryctolagus cuniculus, Trujillo - La Libertad, certifica que esta investigación ha sido. O. ejecutada de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de Ciencias Biológicas de la. BI. Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad con su correspondiente proyecto, y. AS. que el informe ha sido redactado acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas.. CI EN. TE. CA. Trujillo, Enero del 2018. DE. reglamento correspondiente.. CI. Por lo tanto, autorizo al Br. Sandra Victoria Campos Arteaga continuar con el trámite del. BI. BL. IO. _______________________________ Dra. Bertha Soriano Bernilla ASESOR. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. A Dios, por guiar mi camino, por protegerme y. AS. haberme permitido llegar hasta este punto con. G. IC. salud para lograr uno de mis objetivos.. LO. A mi seres queridos que están en cielo,. O. pero en especial a mí. BI. PAPÁ ARTEAGA gracias por tus consejos. AS. y este logro es para ti también papito,. DE. CI EN. CI. Los quiero a todos.. A mis padres Martha, Victor y A MI FAMILIA por haberme apoyado en todo momento, por sus consejos, su motivación constante, pero más que nada. CA. por su amor y su apoyo. TE. incondicional en todo. IO. momento, los quiero mucho.. BL. GRACIAS FAMILIA.. BI. A mi esposo Eduardo por su apoyo incondicional, A mi hijo Mathias que es mí fuerza para salir adelante.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTOS. AS. A través de estas líneas quiero expresar mi más sincero y profundo agradecimiento a la. IC. Dra. Bertha Soriano Bernilla y a la Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez, profesoras del. G. Departamento Académico Profesional de Microbiología y Parasitología de la Facultad de. LO. Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, por haberme brindado la. O. oportunidad de recurrir a su capacidad y conocimiento científico, así como también haberme. BI. tenido la paciencia para guiarme durante todo el desarrollo de la tesis en un marco de. AS. confianza, afecto y amistad, fundamentales para la concretar este trabajo.. CI. Y para finalizar, también agradezco al Sr. Timoteo Eusebio Rodríguez y a la Sra. Kelly. CI EN. Castillo Diestra, por su amistad, apoyo, sus enseñanzas laborales en Laboratorio Clínico que me han aportado en mi aprendizaje y en mis ganas de seguir adelante en mi carrera. BI. BL. IO. TE. CA. DE. profesional.. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN En la presente investigación se evaluó dos medios de propagación de Rhizobium Rc40201 y Bradyrhizobium Rc391-01 para la obtención de anticuerpos en Oryctolagus cuniculus,. AS. para lo cual se reactivaron las cepas de Rhizobium Rc402-01 y Bradyrhizobium Rc391-01. Luego se sembraron en los medios de propagación a evaluar (Extracto de Levadura, Manitol,. IC. Agar, Rojo de Congo) ELMARC y Agar Nutritivo y a partir de cada uno de estos se realizó la. LO. G. suspensión en solución salina fisiológica de Rhizobium Rc402-01 y Bradyrhizobium Rc39101 respectivamente, a una concentración de 9 x 108 cel /ml equivalente al tubo Nº3 del. BI. O. Nefelómetro de Mac Farland y se llevó a baño maría por 30 minutos. Se agregó 1 ml de la. AS. suspensión bacteriana en un tubo, luego se adicionó 1 ml del Adyuvante completo de Freund y se inoculó 1 ml por vía intramuscular a Oryctolagus cuniculus. Después de 15 días de la. CI. primera inoculación, se inoculó con adyuvante de Freund incompleto y luego cada 7 días. CI EN. durante 3 semanas. Siete días después de la última inoculación, se obtuvo suero para la determinación del título de anticuerpos mediante la prueba de aglutinación en tubo. Se. DE. concluyó que el Agar nutritivo es el medio de propagación de Rhizobium Rc 402-01 y. BI. BL. IO. TE. CA. Bradyrhizobium Rc 391-01 que permite obtener el más alto título de anticuerpos.. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ÍNDICE Pág. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO……………...ii. AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS……………….iii. IC. PRESENTACIÓN……………………………………………………………………......iv. G. MIEMBROS DEL JURADO…………………………………………………..……..…..v. LO. APROBACIÓN………………………………………………………………………......vi. O. CERTIFICACIÓN DEL ASESOR……………………………………………………...vii. BI. DEDICATORIA………………………………………………………………………..viii. AS. AGRADECIMIENTOS……………………………………………………….................ix. CI. RESUMEN…..…………………………………………………………………………....x. CI EN. ÍNDICE….……………………………………………………………………………… xi I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………...01 II. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………………....07. DE. III. RESULTADOS……………………………………………………………………......11. CA. IV. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………..14 V. CONCLUSIÓN…………………………………………………………………………17. TE. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………….......18. BI. BL. IO. ANEXOS………………………………………………………………………………......22. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. I.. INTRODUCCIÓN. El nitrógeno es el elemento mayoritario en la atmósfera terrestre y sin embargo es el principal factor limitante para el desarrollo de las plantas, después del agua. Esta paradoja se. AS. debe a que el nitrógeno molecular (N2), no es asimilable por los seres vivos. (Fernández,. IC. 2002; Valdez et al., 2016). G. Los sistemas biológicos sólo pueden incorporar el N2 de forma combinada como nitrato. LO. NO3 - o como amonio NH3+, por lo que la aplicación de fertilizantes nitrogenados es una. O. práctica común en los sistemas agrarios. Sin embargo, el uso creciente de fertilizantes. BI. nitrogenados para conseguir un aumento de la productividad agrícola implica un elevado. AS. coste y ocasiona acumulación de compuestos nitrogenados tóxicos en el medioambiente, con. CI. el consiguiente daño para la salud humana. (Fernández y De Felipe, 2004, p. 21). CI EN. Actualmente Rhizobium se usa en la biotecnología agroindustrial para inducir la formación de estructuras especializadas denominados nódulos en las raíces o tallo de las leguminosas,. DE. dentro de los cuales permite fijar el nitrógeno gaseoso a amonio. Estas bacterias se sienten atraídos por los flavonoides liberados por las leguminosas. Se estima que este proceso. CA. contribuye entre el 60-80% de la fijación biológica de nitrógeno, y esta simbiosis aporta una. TE. parte considerable del nitrógeno combinado en la tierra y permite a las plantas leguminosas. IO. crecer sin fertilizantes nitrogenados y sin empobrecer los suelos. Es marcado el interés que. BL. estas bacterias representan para la agricultura, que se emplean como biofertilizantes. Ejemplo de ello es el Rhizobium, que fue la primera bacteria producida a gran escala y se ha añadido. BI. como inoculante durante 105 años a diversos cultivos agrícolas, con éxito en muchos casos. (Cuadrado et al., 2009, p. 80) La habilidad competitiva del Bradyrhizobium para invadir la raíz de la leguminosa, parece ser un factor importante en la eficiencia de fijación, pero la competencia entre las cepas de. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. rizobios presentes en el suelo, así como las condiciones climáticas, parecen determinar la efectividad y el predominio de una u otra cepa de rizobios en la asociación simbiótica. (Effio et.al., 2016). AS. Según Effio et.al., (2016) “Una leguminosa puede preferir una o más cepas de Rhizobium o. IC. Bradyrhizobium para formar nódulos, las diversas cepas de rizobios pueden diferir en su. G. selectividad por la planta huésped, es decir, por su capacidad de nodulación”. (Moreno et al.,. LO. 2016). O. El medio de cultivo comúnmente utilizado para el aislamiento de rizobios es el ELMARC. BI. (Extracto de Levadura, Manitol, Agar, Rojo de Congo), que además contiene fosfato. AS. dipotásico, sulfato de magnesio, cloruro de sodio y carbonato de calcio. El extracto de. CI. levadura le proporciona a las bacterias productos de degradación de las proteínas, sustrato. CI EN. para la respiración, vitaminas y ciertos elementos. El manitol funciona como fuente de carbono, mientras que el rojo congo ayuda a diferenciar los rizobios de otras bacterias, en general las colonias de rizobios presentan tensión débil con éste colorante, en tanto que las. DE. colonias de muchas otras bacterias adquieren un color más intenso (la coloración varía con la. CA. concentración de los reactivos, edad del cultivo y la exposición de la caja a la luz). La temperatura óptima de crecimiento de rizobios en condiciones artificiales es de 25ºC – 28°C. IO. TE. y su tolerancia al pH está en el rango de 5 a 8. (Nápoles et al., 2016; Paredes, 2013). BL. En un estudio realizado con las especies del género Rhizobium las colonias encontradas, se caracterizaban por tener un crecimiento rápido (3 a 5 días), de reacción ácida en un medio con. BI. sales minerales conteniendo manitol, fueron productores de abundante lipopolisacáridos extracelulares, por consiguiente formaron colonias de aspecto mucilaginoso; semitranslúcidas y opacas, circulares, convexas, de color blanco o ligeramente rosadas, midiendo de 2 a 7 mm de diámetro a los 3- 5 días de incubación en medio ELMARC (Agar Manitol Extracto de levadura); a diferencia del género Bradyrhizobium donde las especies seleccionadas se 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. caracterizaron por el crecimiento lento que presentaron (3 a 10 días) con colonias pequeñas circulares puntiformes y midiendo de 1 a 2 mm de diámetro y produciendo una reacción alcalina en el medio. (Bécquer et al., 2012). AS. Se registró un estudio realizado con bacterias fijadoras del nitrógeno en donde se realizó. IC. repiques en agar nutritivo con adición de 2% de cloruro de sodio para mantenimiento de las. G. cepas, ya que este medio es poco selectivo y es usado para bacterias con escasos. LO. requerimientos nutricionales, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie,. O. por lo que se distinguen mejor las colonias pequeñas, debido a que en este medio no hay. BI. formación de biopolímeros ya que no esta compuesta a base de sales. (Fajardo et al., 2012;. AS. González, 2006). CI. En el trabajo con marcadores serológicos, los conejos son comúnmente utilizados para la. CI EN. inmunización con los antígenos preparados de células de Rhizobium. Como resultado de las inyecciones de antígeno, las reacciones inmunológicas complejas resultan en el conejo con la producción. de. proteínas. especiales. llamadas. inmunoglobulinas.. Las. clases. de. DE. inmunoglobulinas (Ig) en seres humanos y la mayoría de los mamíferos, incluyendo los. CA. conejos son IgG, IgM, IgD, e IgE. Para la investigación de Rhizobium, los más importantes son los anticuerpos IgG e IgM debido a su abundancia en el suero de conejo y también a. IO. TE. causa de su participación en las reacciones serológicas e inmunoensayos. (Villa et al., 2010). BL. Se determinó serológicamente la competitividad simbiótica, de una cepa nativa de Bradyrhizobium sp. RC 458-01 eficientemente simbiótica, comparándola con una cepa patrón. BI. Bradyrhizobium sp. CIAT 71. La competitividad se evaluó mediante el porcentaje promedio de ocupancia de nódulos en Vigna unguiculata “Caupí”. Para la evaluación serológica se realizó la producción de anticuerpos de las dos cepas de Bradyrhizobium sp., para lo cual se procedió a inmunizar en Oryctulagus cunniculus “conejo”, vía intramuscular 1 mL de antígeno de rizobios más 1 mL de adyuvante completo de Freund; a los 14 y 21 días se 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. inoculó con 1 mL de antígeno de rizobios más 1 mL de adyuvante incompleto de Freund, posteriormente se tomaron muestras de sangre para la obtención del suero inmune. El porcentaje promedio de ocupancia de nódulos se determinó mediante aglutinación. Se. AS. encontró que la cepa Bradyrhizobium sp. CIAT 71 mostró el mayor porcentaje de ocupancia de nódulos de Caupí respecto a la cepa Bradyrhizobium sp. RC 458-01 simbióticamente. G. IC. eficiente en la fijación de nitrógeno. Al análisis estadístico mediante “t” student se encontró. LO. diferencia significativa entre. Se concluye que la cepa de Bradyrhizobium sp CIAT 71 es más. O. competitiva simbióticamente en Vigna unguiculata “Caupi” respecto a la cepa de. BI. Bradyrhizobium sp RC 458-01. (Effio et al., 2016). AS. Los adyuvantes son sustancias o preparados químicos que, incorporados al antígeno o. CI. inyectados simultáneamente con él, hacen más efectiva la respuesta inmune. Con su empleo. específicos. (Uberos, 2013, p. 1). CI EN. se logra una economía de antígeno y de tiempo, así como un mayor nivel de anticuerpos. El antígeno libre normalmente difunde con mucha rapidez desde los tejidos locales que. DE. rodean el sitio de inoculación, y una de sus funciones importantes es crear un reservorio o. CA. depósito del antígeno de larga vida. El adyuvante completo de Freud (FCA) ha sido utilizado durante más de 50 años en la producción de antisueros en animales y es empleado con. TE. frecuencia cuando se dispone de cantidades limitadas de antígenos o cuando presentan una. BL. IO. baja inmunogenicidad. (Morris et al., 1999) La identificación de cepas de Rhizobium, sobre todo el aislamiento de cepas nativas, sigue. BI. siendo uno de los principales problemas relacionados con estudios de competencia. Dado que no existe ningún método universalmente aceptado, el método de elección depende de las preferencias, experiencia y equipo; es decir, para emprender cualquier tipo de evaluación de cepas de Rhizobium en condiciones naturales, competitividad, persistencia en suelo, uso apropiado de inoculantes y en estudios fisiológicos, bioquímicos y genéticos; es indispensable 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. su identificación. La información existente acerca de la especificidad y la variación de efectividad en la fijación de nitrógeno por parte de Rhizobium, al igual que la producción de anticuerpos específicos de los rizobios nativos nos ayudaría de manera rápida y segura a. AS. identificar a los rizobios específicos infectivos y efectivos y puedan ser empleados con provecho en la agricultura, eliminando en cierta medida los químicos contaminantes. Por otro. G. IC. lado, es necesario la optimización de un método de inmunización que permita obtener el. LO. mayor título de anticuerpos contra cepas patrón de rizobios, y que permita utilizar estos. O. anticuerpos frentes a cultivos nativos de forma que se puede a realizar en futuros estudios de. BI. serogrupos o determinación de la competitividad entre rizobios presentes en el suelo.. AS. (Bécquer & Prévost, 2014, p. 302). CI. Los géneros pertenecientes a la familia Rhizobiaceae no son particularmente exigentes en. CI EN. materia de nutrición, pueden usar azúcares, alcoholes y ciertos ácidos como fuentes de energía, el extracto de levadura provee factores de crecimiento y vitaminas que usualmente mejora el crecimiento, algunas especies pueden producir sus propios factores de crecimiento.. DE. (Recintos y García, 2007; Rojas, 2008). CA. Por tal motivo el presente trabajó permite evaluar otro medio de cultivo alternativo el cual permita la producción de antígenos de Rhizobium Rc 402 - 01 y Bradyrhizobium Rc 391 – 01. TE. sin formación de biopolímeros que interfieran en la técnica de aglutinación para determinar el. IO. título de anticuerpos. Pues la característica de este medio es que no es costoso, y sobre todo. BI. BL. que es un medio de cultivo para bacterias poco exigentes como la familia Rhizobiaceae.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Objetivo general:  Evaluar en cuál de los dos medios de propagación tanto para Rhizobium RC 402 -01. AS. como para Bradyrhizobium RC 391- 01 favorece la obtención de anticuerpos en. IC. Oryctolagus cuniculus.. LO. G. Objetivos específicos:. O. 1. Propagar en medio ELMARC las cepas de Rhizobium RC 402 -01 y Bradyrhizobium. BI. RC 391- 01.. AS. 2. Propagar en Agar nutritivo las cepas de Rhizobium RC 402 -01 y Bradyrhizobium RC 391- 01.. CI EN. CI. 3. Obtener anticuerpos Anti - Rhizobium RC 402 -01 y Anti - Bradyrhizobium RC 39101 a partir de cada medio de propagación ELMARC y Agar nutritivo, inoculando Rhizobium RC 402 -01 y Bradyrhizobium RC 391- 01 en Oryctolagus cuniculus.. DE. 4. Evaluar en cual de los medios de propagación ELMARC y Agar nutritivo se obtiene el más alto título de anticuerpos Anti - Rhizobium Rc402-01 y Anti -Bradyrhizobium. BI. BL. IO. TE. CA. Rc391- 01.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. II.. MATERIAL BIOLÓGICO:. AS. 1.. MATERIAL Y MÉTODOS. IC.  Cepa de Rhizobium Rc402-01 proporcionado por el Laboratorio de Microbiología. G. Ambiental, Departamento de Microbiología y Parasitología.. O. Ambiental, Departamento de Microbiología y Parasitología.. AS. BI.  4 Ejemplares de Oryctolagus cuniculus.. MÉTODOS:. CI. 2.. LO.  Cepa de Bradyrhizobium Rc391-01 proporcionado por el Laboratorio de Microbiología. CI EN. 2.1.Reactivación de las cepas de Rhizobium Rc402-01 y Bradyrhizobium Rc391-01 y obtención de cultivos puros:. DE. La reactivación fue realizada en el Laboratorio de Microbiología Ambiental, según la metodología sugerida por el CIAT. Las cuales fueron sembradas por estría en placas Petri,. CA. conteniendo el medio Agar Extracto Levadura Manitol (ELMARC); luego se incubaron a. TE. 28ºC por 3-5 días. Posteriormente a partir de las colonias obtenidas, se evaluó el crecimiento. IO. y pureza de las colonias, mediante coloración Gram, obteniendo cultivos puros de cada una de. BI. BL. las cepas en el Medio ELMARC. (ANEXO 01).. 2.2. Evaluación de los medios de cultivos empleados para la producción de antígenos:. Siembra de Rhizobium Rc402-01 y Bradyrhizobium Rc391-01 en medio ELMARC:. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A partir de la reactivación y con los cultivos puros obtenidos se cultivaron Rhizobium Rc40201 y Bradyrhizobium Rc391-01 en Medio ELMARC. (ANEXO 02, 03) Se incubaron a 28°C por 4 a 5 días.. AS. 2.3. Evaluación de los medios de cultivos empleados para la producción de antígenos:. G. IC. Siembra de Rhizobium Rc402-01 y Bradyrhizobium Rc391-01 en Agar nutritivo:. LO. A partir de la reactivación y con los cultivos puros obtenidos se cultivaron Rhizobium Rc402-. O. 01 y Bradyrhizobium Rc391-01 en Agar Nutritivo. (ANEXO 04, 05). AS. BI. Se incubaron a 28°C por 4 a 5 días.. CI. 2.4. Preparación del antígeno de Rhizobium Rc402-01 y Bradyrhizobium Rc391-01. CI EN. del medio ELMARC y de Agar nutritivo:. De cada medio de cultivo utilizado se suspendieron con solución salina fisiológica la masa. DE. celular de Rhizobium Rc402-01 y Bradyrhizobium Rc391-01; se preparó una suspensión a una. CA. concentración de 9 x 108 cel /ml equivalente al tubo Nº3 del Nefelómetro de Mac Farland y. IO. TE. se llevó a baño maría por 30 minutos. (ANEXO 07).. BL. 2.5. Inmunización del Oryctolagus cuniculus:. BI. De los medios de cultivos empleados como Medio ELMARC y Agar nutritivo de Rhizobium Rc402-01 como de Bradyrhizobium Rc391-01 se procedió de la siguiente manera: A partir de la suspensión de antígeno preparada de cada bacteria utilizada se agrego un 1 ml en un tubo, luego se adicionó 1 ml del Adyuvante de Freund completo. De la mezcla se extrajo 1 ml con una jeringa de tuberculina y se inoculó por vía intramuscular al Oryctolagus 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. cuniculus en el muslo correspondiente de la pata trasera a los 15 días de la primera inoculación, se inoculó con adyuvante incompleto de Freund y luego cada 7 días durante 3 semanas.. AS. Siete días después de la última inoculación, se llevó a cabo la extracción de sangre a través de. LO. G. IC. punción cardiaca para la obtener el suero. (ANEXO 08).. O. 2.6. Determinación del título de anticuerpos:. BI. A partir de las muestras de suero obtenidos se determinó el título de anticuerpos mediante la. AS. prueba de aglutinación en tubo para lo cual se preparó diluciones medias de Rhizobium. CI. Rc402-01 sembradas tanto en medio ELMARC como en Agar Nutritivo, de la misma manera. CI EN. para Bradyrhizobium Rc391- 01.(ANEXO 09 -12). DE. 2.7. Determinación del título de anticuerpos de Rhizobium Rc402 – 01 y Bradyrhizobium Rc391 – 01 cultivadas en medio ELMARC y en Agar nutritivo:. CA. Para ello se preparó una suspensión bacteriana tanto de Rhizobium Rc402 - 01 como de. TE. Bradyrhizobium Rc391- 01 equivalente al tubo N° 3 del Nefelómetro de Mac Farland y se. IO. llevó a baño maría por 30 minutos.. BL. Luego se procedió a realizar las diluciones para ambas bacterias. Se utilizó 10 tubos de. BI. ensayo, agregando al primer tubo 0,1 de suero más 0,9 de solución salina fisiológica y a partir del segundo tubo se les agregó 0,5 de solución salina fisiológica más 0,5 de la mezcla anterior a cada tubo. Después se le agregó 0,5 de suspensión bacteriana previamente realizada de Rhizobium Rc402 - 01 ó de Bradyrhizobium Rc391 - 01. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Finalmente se incubó en estufa a 27°C por 24 horas, para su respectiva lectura. Se realizó el mismo procedimiento a partir de los cultivos bacterianos sembrados en medio. AS. ELMARC así como también los sembrados en Agar nutritivo.. G. IC. 2.8. Lectura:. LO. Después de 24 h de incubación se realizo la lectura de las diluciones de Rhizobium Rc402-01. O. y Bradyrhizobium Rc391- 01 en medio ELMARC o en Agar Nutritivo, se utilizó 10 tubos. BI. enumerados de la siguiente manera desde 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280,. AS. 1/2560, 1/5120; se consideró como el título más alto hasta donde se observó la aglutinación. CI. en tubo.. CI EN. 2.9. Análisis de datos:. Los datos obtenidos se agruparon en tablas comparativas determinado el título más alto de. BI. BL. IO. TE. CA. rizobiano y/o cepa patrón.. DE. anticuerpos producidos en el conejo (Oryctolagus cuniculus) inmunizado con el cultivo. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS. AS. III.. IC. En la determinación de los títulos de anticuerpos de Anti - Rhizobium Rc402-01 y Anti -. G. Bradyrhizobium Rc391- 01 a partir de estas rizobacterias propagadas en los medios. LO. ELMARC y Agar nutritivo. Se encontró que el menor título se obtuvo de las cepas. O. propagadas en medio ELMARC y el mayor título de anticuerpos se obtuvo de las cepas. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. propagadas en Agar nutritivo (Tablas 1 y 2).. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. Tabla 1. Titulo de anticuerpos Anti - Rhizobium Rc402-01 según el medio de propagación de. LO. G. IC. la rizobacteria.. TÍTULO. DE. ANTICUERPOS. O. MEDIOS DE PROPAGACIÓN. AS. BI. ANTI - Rhizobium Rc402-01. 1280. CI EN. CI. MEDIO ELMARC. 2560. BI. BL. IO. TE. CA. DE. AGAR NUTRITIVO. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. Tabla 2. Titulo de anticuerpos Anti - Bradyrhizobium Rc391- 01 según el medio de. LO. G. IC. propagación de la rizobacteria.. TÍTULO. DE. ANTICUERPOS. O. MEDIOS DE PROPAGACIÓN. AS. BI. ANTI - Bradyrhizobium Rc391- 01. 80. CI EN. CI. MEDIO ELMARC. 320. BI. BL. IO. TE. CA. DE. AGAR NUTRITIVO. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IV.. DISCUSIÓN. Se evaluó dos medios de cultivo MEDIO ELMARC Y AGAR NUTRITIVO para la. AS. propagación Rhizobium Rc402- 01 como de Bradyrhizobium Rc391-01, a fin de determinar. IC. en cuales de estos medios de propagación de estas rizobacterias se obtuvo el más alto título de. LO. G. anticuerpos producidos en Oryctalagus cuniculus.. De acuerdo a los resultados obtenidos como en las Tablas 1 y 2 se observa que el título. BI. O. más alto tanto para Rhizobium Rc402- 01 en 2560 y para Bradyrhizobium Rc391-01 en 320 se presentó a partir del Agar nutritivo empleado como medio de propagación. de estas. AS. rizobacterias; esto según González (2006) se debería a que como el AGAR NUTRITIVO no. CI. esta compuesto de sales no forma biopolímeros que interfieran en el crecimiento de estas. CI EN. rizobacterias. (p. 130). En cambio en el Medio ELMARC empleado como medio de propagación se obtuvo para. DE. Rhizobium Rc402- 01 un título de 1280 y Bradyrhizobium Rc391-01 en 80. Los títulos de anticuerpos de estas rizobacterias en este medio fueron menores con respecto a los obtenidos. CA. en el medio de propagación Agar nutritivo; Probablemente debido a que el medio ELMARC. TE. (Extracto de Levadura, Manitol, Agar, Rojo de Congo), que además contiene fosfato. IO. dipotásico, sulfato de magnesio, cloruro de sodio y carbonato de calcio; tiene fuente de sales,. BL. carbohidratos, estas mismas sales permiten la formación de una monocapa de biopolímeros. BI. los cuales interfieren en el crecimiento de las bacterias. (Nápoles et al., 2014). La consistencia mucosa o mucilaginosa se produce más abundantemente si el medio contiene manitol el cual estimula su producción. (Paredes, 2013, p. 16). 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Según la investigación realizada por Cuadrado et al., (2009) señalan que Jordan (1984) describió que las cepas de crecimiento lento, como las del género Bradyrhizobium, no pueden crecer al 2% de NaCl.. AS. El tiempo que demoraron en crecer Rhizobium Rc402 y Bradyrhizobium Rc391-01 en el. IC. medio de propagación ELMARC también se vio afectado por la composición de este medio;. G. ya que es un medio a base de sales y unos de sus componentes es NaCl. Según Mpepereki &. LO. et al.,(1997) aislaron cepas de Rhizobium de V. unguiculata tolerantes a concentraciones por. O. encima de 5,5% de NaCl. Así mismo Ghittoni & Bueno (1996), señaló que los rizobios de. BI. rápido crecimiento más tolerantes que los de lento crecimiento; en otras palabras: Rhizobium. AS. y Bradyrhizobium han demostrado marcada variación en la tolerancia a la sal. (p. 20). CI. Como lo afirma Cuadrado et al., (2009), se ha demostrado la habilidad de las bacterias del. CI EN. género Rhizobium para asimilar una gama de carbohidratos mayor a la del género Bradyrhizobium, por lo cual esta propiedad se considera de alta significancia taxonómica, en. DE. particular para este grupo.. En el presente investigación se utilizó la técnica de aglutinación en tubo, la ventajas de las. CA. reacciones de aglutinación desde el punto de vista de su utilidad en el laboratorio es que son. TE. muy sencillas de realizar, no requieren de ningún equipamiento para su lectura, son rápidas,. IO. fáciles de implementar y de bajo costo. Además, presentan una mayor sensibilidad que las. BL. reacciones de precipitación. (Aguilar, 2004, p. 50). BI. Ya se mencionó que las reacciones de aglutinación son útiles para la detección y titulación. de Ac en distintos fluidos biológicos. Es importante destacar que NO es posible determinar la concentración de Ac sino que, en el mejor de los casos, será posible calcular un título de Ac. Para ello, se realiza la incubación de diluciones seriadas del suero del paciente con cantidades constantes de Ag y se elige arbitrariamente como título la inversa de la máxima dilución de. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. suero que produce aglutinación visible. Las reacciones de aglutinación, involucran una interacción secundaria entre Ag-Ac que llevará a la aparición de un aglutinado que se. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. visualiza como grumos. (Lomonte, 2007, p. 53). 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. V.. CONCLUSIÓN. AS. El Agar nutritivo es el medio de propagación de Rhizobium Rc 402-01 y Bradyrhizobium. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. Rc 391-01 que permite obtener el más alto título de anticuerpos.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS. Aguilar, V. (2004). Reacciones de aglutinación. Revista méxicana - Gac Méd, 140(3),. AS. 50 - 52.. IC. Bécquer, C., & Prévost, D. (2014). Potencial de formación de nódulos en leguminosas. G. forrajeras y de granos de rizobios, nativos de Sancti spíritus, Cuba. Revista Cubana de. LO. Ciencia Agrícola, 48(3), 301-307.. BI. O. Bécquer, C., Nápoles, J., Álvarez, O., Ramos, Y., & Palmero, L. (2012). Comportamiento de la simbiosis leguminosa-rizobio en Centrosema plumieri. AS. inoculada con Bradyrhizobium sp.ensayo de campo. Revista Cubana de Ciencia. CI EN. CI. Agrícola, 35(2), 175-186.. Cuadrado, B., Rubio, G., & Santos, W. (2009 ). Caracterización de cepas de Rhizobium y Bradyrhizobium (con habilidad de nodulación) seleccionados de los. DE. cultivos de fríjol caupi (Vigna unguiculata) como potenciales bioinóculos. Rev.. CA. Colomb. Cienc. Quím. Farm., Vol. 38 (1), 78-104. Effio, W., Luján, M., Soriano, B., Valdez, R., Prado, G., & Zavaleta, D. (2016).. TE. Determinación serológica de la competitividad simbiótica entre Bradyrhizobium sp.. IO. Nativo eficiente y cepa patrón, inoculados en Vigna unguiculata “Caupí”.. BL. Agroindustrial Science, 59 - 67.. BI. Fajardo, N., Palmero, L., Ávila, U., Álvarez, O., Ramos, Y., Quintana, M., y otros. (2012). Efecto de la inoculación con Bradyrhizobium sp.y de la fertilización nitrogenada en dos variedades de sorgo grano (Sorghum bicolor L. Moench). Revista Cubana de Ciencia Agrícola, 35(1), 67-78.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Fernández, M. (2002). Fijación biológica de nitrógeno: factores limitantes. Ciencia y Medio Ambiente - CCMA-CSIC , 195 -202. Fernández, M., & De Felipe, A. (2004). Efecto del glifosato sobre la simbiosis. AS. "Lupinus Albus - Bradyrhizobium" sp.("Lupinus")( Tesis doctoral). Universidad. IC. Complutense. Madrid. G. Ghittoni, N., & Bueno, M. (1996). Changes in the cellular content of trehalose infour. LO. peanut rhizobia strains cultured under hypersalinity. Revista Argentina - Biomonthly,. BI. O. 114 - 117.. González, F. (2006). Bacterias fijadoras de nitrógeno en el comportamiento. AS. agronómico del tomate Lycopersicon esculentum var. Río Grande. Revista del caribe -. CI EN. CI. Instituto de Estudios Caribeños., 7, 125 - 132.. Lomonte, B. (2007). Manual de Métodos Inmunológicos. Costa Rica: Instituto Clodomiro Picado.. DE. Moreno, Z., Valdez, R., Soriano, B., & Ruesta, N. (2016). Eficiencia en la nodulación. CA. por rizobios nativos, procedentes de nódulos de Pisum sativum “arveja” colectados de. TE. diferentes departamentos del Perú. Scientia Agropecuaria, 7(3), 165 – 172. Morris, H., Martínez, C., Abdala, R., & Campos , D. (1999). Adyuvantes. BL. IO. Inmunológicos. Rev Cubana, 18(2), 130 - 137.. BI. Mpepereki, S., Makonese, F., & Wollum, A. G. (1997). Physiological characterization of indigenous rhizobia nodulating Vigna unguiculata in Zimbabwean soils. Science and Education Publishing, 3(2), 65 - 75.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Nápoles, M., Cabrera, J., Onderwater, R., Wattiez, R., Hernández, L., Martínez, L., y otros. (2016). Señales producidas por Rhizobium leguminosarum en la interacción con frijol común (Phaseolus vulgaris L.). Revista cubana - INCA, 37(2), 37 - 44.. AS. Nápoles, M., González, G., Ferreira, A., Rossi, A., Hernández, L., & Costales, D.. G. condiciones de estrés. Revista Cubana - INCA, 35(4), 45-51.. IC. (2014). Efectos de diferentes inoculantes sobre la nodulación de la soya cultivada en. LO. Paredes, M. C. (2013). Fijación biológica de nitrógeno en leguminosas y gramíneas. O. (Tesis pregrado). Argentina: Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Católica.. BI. Argentina.. AS. Recintos, D., & García, F. (2007). Aislamiento, evaluación y selecciónde cepas. CI. simbioticas nativas de Rhizobium sp., en Phaseolus vulgaris L., de suelos agricolas de. CI EN. El Salvador( Tesis pregrado).Ciudad Universitaria. El salvador Rojas, D. (2008). Estandarización de un medio de cultivo complejo para la. CA. Javeriana. Bogotá. DE. multiplicación de la cepa C50 de Rhiobium sp.(Tesis pregrado).Pontificia Universidad. Uberos, J. (2013). Adyuvantes en vacunas. Rev. Española - Sociedad de Pediatría de. TE. Andalucía, 6(4), 1 - 5.. IO. Valdez, R.A, Soriano, B., Prado, G., Zavaleta, D., Matsubara, M., Zuñiga, D., y otros.. BL. (2016). Symbiotic and Agronomic Characterization of Bradyrhizobial Strains. BI. Nodulating Cowpea in Northern Peru. In A, Fernando González, & J, Euan. (Ed).. Biological Nitrogen Fixation and Beneficial Plant - Microbe Interacions, UK: Springer Publishing. p.p. 195 - 212.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Villa, A., Pueyo, R., Baselga, J., & Navarro, A. (2010). El examen serológico con. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. muestras de sangre obtenidas. Rev. AVEPA de Barcelona, 37(4), 171 - 175.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. ANEXOS. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CI. ANEXO 01: Reactivando las cepas de Rhizobium RC402-01 y Bradyrhizobium RC391-. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. 01 en medio ELMARC.. ANEXO 02: Colonias de Rhizobium Rc402-01 (H) en medio ELMARC.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. ANEXO 03: Colonias de Bradyrhizobium Rc391-01 (E) en medio ELMARC. ANEXO 04: Colonias de Rhizobium Rc402-01 (H) en Agar nutritivo.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. ANEXO 05: Colonias de Bradyrhizobium Rc391-01 (E) en Agar nutritivo.. ANEXO 06: Oryctolagus cuniculus (conejos) en su jaula de crianza. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) A. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. B. CI EN. ANEXO 07: Suspensión de Rhizobium Rc402-01 (A) y Bradyrhizobium Rc391-01 (B). BI. BL. IO. TE. CA. DE. para la Inmunización del Oryctolagus cuniculus.. ANEXO 08: Extracción de sangre a través de punción cardiaca a Oryctolagus cuniculus.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Bradyrhizobium Rc391-01. Rhizobium Rc402- 01. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. ANEXO 09: Diluciones de Bradyrhizobium Rc391-01 cultivado en medio ELMARC.. ANEXO 10: Diluciones de Rhizobium Rc402- 01 cultivado en medio ELMARC.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. BI. O. LO. G. IC. Bradyrhizobium Rc391-01. Rhizobium Rc402- 01. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. ANEXO 11: Diluciones de Bradyrhizobium Rc391-01 cultivado en Agar nutritivo.. ANEXO 12: Diluciones de Rhizobium Rc402- 01 cultivado en Agar nutritivo. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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