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Estudio en modelos animales de las quimerinas como supresores de tumores en el intestino

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Academic year: 2020

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Estudio en modelos animales de las quimerinas

como supresores de tumores en el intestino

Candidato: Fco. Javier Fernández Gañán

Directora del proyecto: Mª José Caloca Roldán

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1.- INTRODUCCIÓN

La cura del cáncer siempre ha sido uno de los objetivos de la ciencia. Los esfuerzos dedicados a esta labor siempre serán de una gran ayuda a contribuir a la erradicación de esa enfermedad. El descubrimiento de las quimerinas abre un abanico amplio de posibilidades para conocer el desarrollo del cáncer.

FAMILIA DE LAS GTPasas RHO/Rac Y SUS PROTEÍNAS REGULADORAS

Las quimerinas son proteínas GAPs (GTPase-activating proteins) que modulan la actividad de la familia de proteínas Rac. Las proteínas Rac pertenecen a la subfamilia Rho, que se encuentra dentro de la superfamilia de proteínas Ras.

La superfamilia de Ras GTPasa son un grupo numeroso de proteínas monoméricas pequeñas homólogos a la proteína Ras. Son también llamadas pequeñas GTPasas con un peso molecular de unos 21 KDa y, por lo general, sirven como interruptores moleculares para una gran variedad de rutas de transmisión de señales celulares. Basado en sus secuencias de aminoácidos y sus propiedades bioquímicas, la superfamilia Ras se divide en cinco subfamilias: Ras, Rho, Rab, Arf y Ran [1].

La familia Rho se identificó a mediados de 1980 y, en mamíferos ya se han identificado 22 miembros [2,3] que se agrupan en ocho subfamilias: Rho, RND, Rhod / F, RhoH, Rac, Cdc42, RhoU / V y RhoBTB (Figura 1).

Figura 1: Árbol filogenético de la familia Ras/Rho [2].

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La primera función descrita para las GTPasas Rho fue la regulación del citoesqueleto en respuesta a diversos estímulos extracelulares. Hoy en día se sabe que las GTPasas Rho participan en el control de numerosos procesos celulares desde el control de la polaridad celular, la morfología, la migración, la endocitosis, progresión del ciclo celular, crecimiento y la apoptosis.

El hecho de que las GTPasas Rho controlen tan amplia variedad de procesos biológicos implica que una desregulación de la actividad de estas proteínas genera una señalización deficiente que puede causar distintas patologías. Entre las principales enfermedades asociadas a esta desregulación de las proteínas Rho podemos encontrar enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica [4], síndromes asociados con el retraso mental, alteraciones cardiovasculares [5,6], inmunodeficiencias como el síndrome de deficiencia de Rac2 [7,8,9] o el síndrome de Wiskott‐Aldrich [10], infecciones bacterianas [11,12] y el cáncer [13]. Las alteraciones causantes de estas enfermedades pueden aparecer a nivel de las Rho GTPasas, de sus proteínas reguladoras o de sus efectores.

Todas las GTPasas actúan como interruptores moleculares que les permite encender o apagar la transducción de señales [4]. El interruptor ocurre por medio del cambio unidireccional de la GTPasa de la forma activa (unida a GTP) a la forma inactiva (unida a GDP) [14,15]. Este cambio se efectúa por hidrólisis del GTP por medio de la actividad intrínseca de la misma GTPasa, logrando pasar el interruptor al estado apagado. Esta reacción es iniciada por proteínas específicas denominadas proteínas activadoras de GTPasa (GAP) [16].

La inactivación de la GTPasa puede ser revertida a su estado de encendido por efecto de otras proteínas llamadas factor intercambiador de nucleótido de guanina (GEF) que causan que se disocie el GDP de la GTPasa, conllevando a su asociación con un nuevo GTP. Ello cierra el ciclo al estado activado de la GTPasa, el cual es el único estado en el que la GTPasa puede transducir una señal a una reacción en cadena downstream (Figura 2).

Figura 2: Regulación del ciclo GTPasa. La fase inactiva se produce cuando Rho está unida a

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Los GDIs (GDP‐dissociation Inhibitors), son también un grupo de reguladores negativos de las proteínas Rho GTPasas que actúan uniéndose a las GTPasas en su estado inactivo y bloqueando el acceso de los GEFs y la asociación de las GTPasas a las membranas [17].

ESTRUCTURA Y PROPIEDADES BIOQUÍMICAS DE LAS QUIMERINAS

Originariamente, las quimerinas se definieron como una quimera entre el dominio C1 de Protein Kinasa C (PKC) y el dominio GAP de BCR, una proteína involucrada en la translocación del cromosoma Philadelphia en la leucemia mieloide crónica [18].

En mamíferos, los genes CHN1 y CHN2 codifican para las cuatro isoformas más conocidas: α1, α2, β1 y β2. Las isoformas α1 y β1 presentan un dominio C1 y un dominio de GAP, mientras que α2 y β2 poseen un dominio adicional SH2 (Figura 3).

Figura 3: Isoformas de las quimerinas y estructura de la β2 quimerina.

Se indica el sitio de unión a fosfotirosina (dominio SH2), el sitio de unión a DAG y ésteres de forbol y la zona de actividad específica de Rac-GAP.

SH2 C1 Rac-GAP

SH2 C1 Rac-GAP

C1 Rac-GAP

C1 Rac-GAP CHN1- α1 quimerina

CHN2 - β1 quimerina

CHN1- α2 quimerina

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El dominio C1, rico en cisteína, es una estructura de unos 50 aminoácidos, originariamente definidos como dominios de unión a lípidos en los isoenzimas de PKC. El dominio C1 se ha clasificado en dos grupos, los dominios típicos y los atípicos. Los dominios C1 típicos unen ésteres de forbol, como el PMA (acetato de forbol miristato), y DAG. El dominio C1 es muy importante en la regulación posicional de las quimerinas. Es esencial para su capacidad de unir ésteres de forbol y para translocar las quimerinas en membranas.

El dominio GAP se compone de unos 150 aminoácidos y es homólogo con el dominio GAP de BCR. La actividad GAP de las quimerinas es sensible a la presencia de lípidos, especialmente a la presencia de DAG y ésteres de forbol.

El dominio N-terminal SH2 (dominio de homología 2 de la proteína Src) es similar a los dominios SH2 de otras proteínas salvo que contiene un residuo de ácido glutámico al inicio del dominio. En comparación con otros dominios SH2, el dominio SH2 de las α2 y β2 quimerinas, es una hélice α más corta.

QUIMERINAS Y CÁNCER: FUNCIÓN DE LAS QUIMERINAS COMO SUPRESORES DE TUMORES

Se ha descrito que las quimerinas pueden actuar como supresores tumorales en mama, adenocarcinomas de duodeno y gliomas malignos [19].

Los mecanismos moleculares de las β2-quimerinas en el cáncer están asociados a su capacidad de inhibir a Rac.

El papel de Rac y otras Rho GTPasas en la regulación de la morfología, movimiento celular, invasión, metástasis, proliferación y transformación maligna se ha descrito ampliamente [20, 21]. Todos estos eventos son cruciales para el desarrollo y progresión del cáncer [22] (Figura 4).

A B

Figura 4: A) Fases en la progresión tumoral y GTPasas Rho implicadas. B) Diferentes

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La primera asociación entre las quimerinas y el cáncer se describió en un estudio para identificar genes con expresión diferencial en tejido normal y astrocitomas de bajo grado en comparación con glioblastomas [23]. Este estudio reveló la disminución de la expresión de β2‐quimerina en glioblastomas, descubrimiento que respalda el papel de esta proteína como gen supresor de tumores e implican la desregulación de la actividad de Rac.

Se ha señalado el papel crucial de Rac como mediador de la respuesta a factores de crecimiento en cánceres de mama. EGF y HRG (Heregulina β) causan aumentos significativos en los niveles de Rac‐GTP en las líneas de cáncer de mama MCF7 y T‐47D, y promueven la migración de las células de cáncer de mama y la proliferación de una manera dependiente de Rac1. β2‐quimerina inhibe la migración y proliferación inducidas por HRG en células de cáncer de mama a través de la inactivación de Rac, señalando un papel de esta proteína β2‐quimerina en la interrupción de la respuesta dependiente de Rac mediada por factores de crecimiento [24].

La sobreexpresión de β2-quimerina en células con cáncer de mama suprime el crecimiento dependiente de la activación de Rac, por lo que permite una reducción de la proliferación del tumor. Este efecto en proliferación está mediado por la inactivación de ERK [25]. Todo indica que las quimerinas actúan downstream del receptor del factor de crecimiento para inactivar Rac y modular la señalización del factor de crecimiento a través de ERK. Además, la modificación de las uniones adherentes produce cambios en las uniones célula a célula, tan importantes en la proliferación de las células cancerígenas a través de la modificación de la actividad de Rac de las células epiteliales.

(Figura 5).

Figura 5: Modelo de señalización de las quimerinas en el tejido epitelial.

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Aunque no existen datos de la asociación de la isoforma α2-quimerina con el cáncer, el hecho de que tiene una ruta de señalización similar a la β2-quimerina [26], hace suponer que también es posible su implicación en la transformación maligna.

Además de modular la señalización mediada por el receptor de EGF, las quimerinas actúan en la señalización de los receptores de Ephrinas. Numerosos estudios demuestran las funciones esenciales de los receptores de Ephrinas (Eph) y sus ligandos en el control de posicionamiento celular y los patrones de tejidos durante el desarrollo normal y el oncogénico [27] Figura 6.

A

B

Figura 6: Representación esquemática de la morfogénesis de adenomas en

intestino delgado de ratones ApcMin/+ mostrando la diseminación de células mutantes en la frontera celular en ausencia de los receptores de eprinas.

En la figura 6A se muestra el desarrollo del tejido tumoral normal en el intestino de los ratones ApcMin/+. Se mantiene el tumor dentro de los límites celulares. En la figura 6B se muestra el diferente desarrollo tumoral en ausencia del receptor de ephrinas. Se desempaqueta el tumor fuera de los límites celulares.

Estos estudios sugieren múltiples funciones, a veces contradictorias de señalización. Bajo diferentes condiciones, pueden promover tanto la difusión y la adhesión célula-célula como el colapso del citoesqueleto, dar una conformación redondeada de las células y también pueden promover la adhesión y la segregación de célula a célula [28, 29].

CÁNCER INTESTINAL Y EL GEN APC

El gen APC es conocido como supresor de tumores [30]. Se ha encontrado inactivado en más del 80% de los tumores colorectales.

El gen APC codifica una proteína de gran tamaño con numerosos dominios y sitios de interacción con otras proteínas. Se ha visto que esta proteína participa en diversos procesos celulares que influyen en la proliferación, diferenciación, adhesión, migración y segregación cromática. Los ratones knockout del gen APC, poseen una mutación sin sentido en el codón 850. Esta mutación trunca la región amino-terminal. Esta región es necesaria para la función dependiente de b-catenina.

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Varios estudios han demostrado la participación de las quimerinas en las rutas de señalización mediadas por ambos receptores. Por esta razón de han elegido los ratones ApcMin/+ como modelo para estudiar el impacto de la eliminación de las isoformas β2-quimerina (gen chn2) y α2-quimerina (gen chn1) en el desarrollo de cáncer gastrointestinal.

HIPÓTESIS DE TRABAJO

Las proteínas de la superfamilia Ras GTPasa funcionan como interruptores moleculares para una gran variedad de rutas de transmisión de señales celulares.

A esta superfamilia pertenece la subfamilia Rho. Dentro de la subfamilia Rho se encuentra la familia de proteínas Ras.

Las quimerinas son proteínas GAPs ( GTPase-activating proteins) que modulan la actividad de la familia de proteínas Rac.

La actividad de Rac GTPasa se modula a través del receptor EGF y los receptores de ephrinas.

Las quimerinas regulan los niveles de activación de Rac tras la activación de las rutas de señalización mediadas por el receptor EGF y los receptores de ephrinas.

Señalizaciones aberrantes derivada de ambos receptores son causantes de la progresión tumoral y metástasis.

En el presente trabajo se va a estudiar la proliferación del cáncer propiciado por la inactivación de las quimerinas aplicado en el intestino.

OBJETIVOS

El objetivo general de este proyecto es estudiar la implicación de las quimerinas en el cáncer de intestino de ratón.

Este objetivo general se va a dividir en dos objetivos específicos:

Objetivo 1.- Análisis de la expresión de las isoformas α2 y β2 –quimerina en intestino. Se pretende demostrar la presencia de las isoformas α2 y β2 quimerina en el intestino de ratones ApcMin/+ (control) frente a las líneas mixtas de chn1-/-, ApcMin/+ y chn2-/-, ApcMin/+.

La diferente creación de los knock-out va a condicionar los ensayos a realizar para la consecución del presente objetivo.

1. 1.- Análisis de la expresión de las α2 –quimerina en intestino de ratón. 1.1.1.- Análisis mediante tinción de X-Gal

1.2. Análisis de la expresión de la β2 –quimerina en intestino de ratón. 1.2.1.- Análisis mediante western blot

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Objetivo 2.- Evaluación en modelos animales del papel de las quimerinas en la formación de tumores en intestino.

2.1.- Papel de la isoforma α2 –quimerina en la formación de tumores en ratones Apc Min/+

2.1.- Papel de la isoforma β2 –quimerina en la formación de tumores en ratones Apc Min/+

La aparición de mayor número de tumores en los ratones knock-out demostraría la implicación de las quimerinas en la supresión tumoral.

2.- MATERIALES Y MÉTODOS

ANIMALES

El laboratorio dispone de unas líneas mixtas de ratón que se han generado mediante cruces con los ratones ApcMin/+ y ratones knock-out de dos isoformas de las quimerinas, α2 y β2-quimerina. Los ratones ApcMin/+

tienen una mutación en el gen APC y son modelo de cáncer colorectal que desarrolla numerosos adenomas en intestino delgado e intestino grueso. Los ratones knock-out de las quimerinas, α2 y β2-quimerina fueron creadas previamente por la compañía Lexicon Genetics como se ilustra en la figura 7.

El knockout de α2-quimerina se ha creado insertando un casette que incluye β-galactosidasa en el gen chn1 lo que permite la detección de la proteína mediante tinción con X-Gal.

gen chn1 (Cromosoma 2) SAβ-Geo poliA Pgk Puro SD

STOP

5 7 8 10 12 14

2 3 4

1 6 9 11

gen chn 2 (Cromosoma 6) SA βeo poliA Pgk Puro SD

STOP

5 7 8 10 12 13

2 3 4

1 6 9 11

A

B

Figura 7: Representación esquemática de la inserción del vector gen-trap para la

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Las líneas utilizadas en este estudio han sido:

- Línea ApcMin/+ : línea heterocigota para la mutación del gel APC que utilizaremos de control

- Línea chn1-/-, ApcMin/+: línea KO para α2-quimerina y heterocigota para la mutación del gel APC

- Línea chn2-/-, ApcMin/+: línea KO para β2-quimerina y heterocigota para la mutación del gel APC

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA.

La concentración de proteína de la muestra se determina por el método de Bradford usando el reactivo Bio-Rad Protein Assay (BIO-RAD). Para ello se realiza una curva patrón usando como estándares cantidades crecientes de albúmina bovina sérica (BSA). La absorbancia de la muestra patrón y de las muestras problema (GST-RBD) se determinará a 595nm.

OBTENCIÓN DE EXTRACTOS PROTEICOS DE INTESTINO DE RATÓN

El primer paso consiste en la extracción del intestino delgado, ciego y colon del ratón.

La distinción entre duodeno, yeyuno e ileon se realiza promediando en tres partes el intestino desde la finalización del estómago gasta el ciego, que se ve como una protuberancia antes del colon. En la práctica se separa haciendo una forma en U en tres partes iguales cada lado. La preparación de las muestras requiere que se mantengan en todo momento húmedas con PBS 1X. Se deben limpiar bien los restos fecales para que no interfieran en el ensayo. La extracción de proteínas se realiza en el siguiente tampón de lisis: TRIS HCl 50 mM, NaCl 150 mM, Triton x-100 1%, EDTA 2mM, DTT 2 mM, NaDOC 0,2 %, Complete (inhibidor de proteasas), en una proporción 1:10 (tejido:buffer de lisis). El tejido se homogeneiza con un politrón, se centrifugan durante 10 minutos a 13200 rpm y se extrae el sobrenadante, que se congela hasta su utilización.

WESTERN BLOT

Utilizamos esta técnica para detectar la presencia de las proteínas de estudio en nuestras muestras. En nuestro caso la expresión de β2-quimerina en los ratones control.

Se utilizarán geles de poliacrilamida al 10%, donde se separarán las muestras de los lisados obtenidos como se indicó en el apartado anterior. Antes de cargarlas en el gel, las muestras congeladas se deben diluir 1:1 con SPLB (sample buffer) y se hierven durante 5 minutos. En el gel cargamos 30 µg de cada muestra, según la cantidad de proteína calculada mediante el método Bradford.

El anticuerpo primario que se utiliza es anti β2-quimerina (chn2). La dilución es 1/500. El anticuerpo es de SIGMA.

Se incuba toda la noche a 4º C en agitación.

El anticuerpo primario está preparado sobre rata, por lo que el anticuerpo secundario es un anti rat de SIGMA.

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El revelado se realiza con un kit comercial: Pierce ECL western blotting detection reagent. Se compone de dos líquidos: Luminol enhancer solution (1ml) y Peroxide solution (1ml). Thermo scientific.

Se contrasta con anti tubulina sobre la membrana del experimento.

Se lava la membrana en TTBS 1x y se deja 45 minutos en azida sódica 0,05%. Se prepara el anticuerpo primario frente a tubulina (ONCOGENE) hecho en mouse, en TTBS 1x y leche. Se prepara en una proporción 1/1000. Se lava y se añade el anticuerpo secundario anti mouse (GE Heatlhcare) en una proporción 1/3000 en TTBS 1x y leche.

Se lava y se revela por quimioluminiscencia con el Kit Pierce ECL 1 minuto y se expone en película radiográfica.

INMUNOHISTOQUÍMICA

La inmunohistoquímica se utiliza para detectar la β2-quimerina en los ratones control frente a los knockout de CHN2. Se utilizarán muestras incluidas en parafina. Para poner a punto las condiciones de tinción se utilizaron muestras de cerebro porque esta descrita la expresión de β2-quimerina en cerebelo. Posteriormente se aplicaron las mismas condiciones de tinción a las muestras de intestino. Las condiciones son las siguientes:

Lo primero que se debe hacer es desparafinar las muestras. Se deben sumergir las muestras en las distintas soluciones:

Tiempo (minutos)

5 Xileno

5 Xileno

4 Alcohol 100%

4 Alcohol 96%

5 Alcohol 96% + H2O2 0,3%

4 Alcohol 70%

4 Agua Milli Q

Se probó el desenmascaramiento del antígeno con tampón citrato en microondas pero no dio buenos resultados por lo que se prescindió de este paso.

Se bloquea con NGS 2% y PBS 0,2 M Tween 20 0,1%. Se utiliza el rotulador blocker y se añade 75μl/porta de la solución de bloqueo.

Se lavan las muestras y se incuba el anticuerpo anti β2-quimerina (CHN2), de Sigma Aldrich, creado en Rabbit, en una proporción 1/50 con PBS 0,2 M Tween 20 0,1%. Se añaden 50 μl/porta.

Se deja over nigh (O.N.) a 4ºC. Se mantienen con humedad para que no se sequen durante la noche.

Se lava el primario y se añade el anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario es anti- Rabbit biotinilado, la dilución es 1/400 en PBS 1x. Se deja dos horas incubando temperatura ambiente.

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Se añade DAB, se tiene un KIT de Vector laboratories, con tres compuestos: buffer pH 7,5 substrate reagent, DAB y peróxido de hidrógeno, se espera hasta que haga reacción, unos 10 minutos.

Se lava con agua destilada.

Se deshidrata y se hace el montaje de las muestras con medio de montaje (Entellán).

Se realizan fotos de las muestras en el microscopio Nikon Eclipse 90i.

TINCIÓN DE X-GAL

La tinción de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido) se utiliza para detectar la presencia de α2-quimerina en los ratones knockout de CHN1 debido a la forma de creación de estos ejemplares.

En este caso se ha insertado el gen LacZ del operon Lac junto al represor del gen chn1. La enzima β-galactosidasa se va a expresar en los tejidos en los que se expresaría la quimerina α2 y se detecta mediante esta tinción que resulta en un color azulado en la región donde se localiza la proteína de estudio.

Se prepara el ejemplar y se le sacrifica. Se extraen los órganos (intestino delgado y colon) y se fijan en formaldehído al 2% con 2mM MgCl2.

Se mantienen en sacarosa al 20% con 2mM MgCl2, durante toda la noche a 4ºC. Se incluyen en OCT y enfrían en nieve carbónica. Se mantienen a -70ºC hasta la preparación de las muestras para el corte de criosecciones. El corte se realiza a 10μm. Después se dejan calentar las muestras a temperatura ambiente durante una hora

Se lavan las muestras en PBS+ 2mM MgCl2 a 4ºC. La solución de lavado es: 100mM PBS, 2mM MgCl2, 0,01% desoxicolato sódico y 0,02% NP-40.

Se tiñen las muestras con la solución de tinción: 5mM de ferrocianuro potásico, 5mM de ferricianuro potásico, 0,01% NP-40, 2mM MgCl2, 1mg/ml X-gal. Con preparar 40 ml de solución ya es suficiente para la cubeta utilizada en el laboratorio.

Se mantienen toda la noche a 30ºC en oscuridad.

Se contratiñen con eosina alcohólica durante 2 segundos, se deshidratan y se montan. Se deben ver en el microscopio en las primeras 24 horas porque la tinción de X-gal se va degradando y se pierde la señal.

Se realizan fotos de las muestras en el microscopio Nikon Eclipse 90i.

PREPARACION DEL INTESTINO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE TUMORES

La disección de los ejemplares se realiza para extraer los intestinos (intestino delgado y colon) que se utilizarán en los diferentes ensayos.

Uno de los experimentos que se realizan es demostrar que las quimerinas son eficaces represores de tumores.

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Se fijan posteriormente en formaldehído toda la noche a temperatura ambiente y al día siguiente se lavan en PBS. Acto seguido se tiñen en azul de metileno al 0,5-1% en agua durante dos minutos y se destiñe el exceso en PBS.

Una vez se tienen contrastados, se analizan los adenomas utilizando una lupa binocular Leica, midiendo el tamaño de cada pólipo con el programa LAS EZ.

PREPARACION DEL INTESTINO COMO “SWISS ROLL” PARA ANÁLISIS INMUNOHISTOQUÍMICO

Para realizar los estudio histopatológicos e inmunohistoquímicos, los intestinos, obtenidos y procesados como se indicó en el apartado anterior, se enrollan (“swiss roll”) y se incluyen en parafina. De esta manera se puede visualizar secciones enteras de intestino. Posteriormente, se realizan los cortes en el microtomo de entre 6 y 10 y se teñirán con hematoxilina eosina. Los tumores y sus características histológicas se examinarán en el microscopio Nikon Eclipse 90i y el programa de adquisición es NIS elements B.R. 3.1 imaging software.

PROLIFERACIÓN DE LAS CÉLULAS TUMORALES

La proliferación de las células tumorales se va a estudiar a través de un ensayo de Invitrogen: Click-it EdU Imagin Kits. La detección se basa en la reacción covalente entre un ácido, en nuestro caso Alexa Fluor y una base, en nuestro caso EdU (5-etinil-2´deoxyuridina). Este componente, EdU, proporciona una nucleósido análogo a la timidina, que se incorpora en el DNA durante la síntesis activa de DNA.

El ensayo consiste en añadir EdU a los ratones antes de sacrificarlos, para que así se incorpore en componente en el DNA y posteriormente se pueda detectar con Alexa Fluor.

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3.- RESULTADOS

Los resultados del presente proyecto se van a agrupar en dos objetivos:

Objetivo 1.- Análisis de la expresión de las isoformas α2 y β2 –quimerina en

intestino.

No se ha descrito en la literatura la presencia de las isoformas α2 y β2-quimerina en intestino. Se va poner como primer objetivo del proyecto la puesta a punto de las técnicas de detección de ambas quimerinas.

1.1.- Análisis de la expresión de las α2 –quimerina en intestino de ratón.

En el mercado no se encuentran anticuerpos específicos para la isoforma α2-quimerina con resultados contrastados.

La expresión de isoforma α2-quimerina se va a detectar de manera indirecta a través de la tinción de X-gal.

La creación específica del knock-out de la isoforma α2 mediante la inserción de un casette que incluye β-galactosidasa en el gen chn1 nos va a permitir detectar la presencia del gen chn1 comprobando la presencia de β-galactosidasa a través de la tinción de X-gal en los ratones knock-out.

1.1.1.- Análisis mediante tinción de X-Gal

Mediante la tinción con X-gal se ha podido observar la presencia de β-galactosidasa en el intestino de los ratones knockout del gen chn1. La β-galactosidasa, que se encuentra en el gen chn1 para inactivar la α2-quimerina, ha reaccionado con el X-gal y se puede observar de color azulado. De esta forma podemos conocer la localización de la α2-quimerina en el intestino. (Figura 8).

DUODENO KO 40x YEYUNO KO 40x ILEON KO 40x COLON KO 40x

DUODENO CONTROL 20x

YEYUNO CONTROL 10x

ILEON CONTROL 20x COLON CONTROL

20x

Figura 8: Cortes histológicos con la tinción de X-gal contrateñida con eosina en

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La β-galactosidasa que ha sido detectada mediante X-gal en los diferentes cortes histológicos, nos demuestra que se encuentra en los ratones knock-out y no en los ratones control. Se observa que en ileon del ratón control hay reacción inespecífica de β-galactosidasa.

Esta detección nos permite demostrar que hay presencia de α2-quimerina en el intestino de los ratones.

Tanto en el intestino delgado como en el intestino grueso, la α2-quimerina se localiza en zonas cercanas a la luz del tubo intestinal, por lo que tiene la posibilidad de interaccionar en la proliferación tumoral.

2.2. Análisis de la expresión de las β2 –quimerina en intestino de ratón.

La β2-quimerina se va a poder detectar mediante anticuerpos comerciales ya contratados. De esta forma, es una detección directa de β2-quimerina en el intestino de los ratones control.

2.2.1.- Análisis mediante western blot

La detección de la expresión de la β2-quimerina se realiza a través del ensayo western-blot. Con este ensayo se detecta la proteína mediante anticuerpos específicos.

La banda de la β2-quimerina se encuentra alrededor de los 40 Kda. Se ha podido reconocer mediante la banda de marcadores tipo (Figura 9).

Duodeno Yeyuno Ileon Colon

WT KO WT KO WT KO WT KO

Β2-quimerina

Tubulina

Figura 9: Ensayo western blot para detectar la presencia de β2-quimerina.

La β2-quimerina se encuentra en los ratones wild type, encontrándose ausente en los ratones knockout de β2-quimerina. En el duodeno se observa menos señal al haber menos cantidad de proteína.

La tubulina se encuentra en todos los ratones wild type y en los ratones knockout de β2-quimerina, como era de esperar. Se ve menos muestra en el duodeno.

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2.2.2.- Análisis mediante inmunohistoquímica

El ensayo de inmunohistoquímica nos sirve para detectar la presencia de la β2-quimerina en los ratones control frente a los knockout de chn2. Los ratones sobre los que se ha realizado la inmunohistoquímica son: control de chn2 y knock-out de chn2.

(Figura 10).

DUODENO KO 10x YEYUNO KO 10x ILEON KO 10x COLON KO 10x

DUODENO CONTROL 10x

YEYUNO CONTROL 10x

ILEON CONTROL 10x COLON CONTROL

10x

Figura 10: Inmunohistoquímica de β2-quimerina en cortes de intestino.

La β2-quimerina se encuentra marcada de color más oscuro en los ratones control, encontrándose ausente en los ratones knockout de β2-quimerina.

La detección de β2-quimerina se ha podido realizar en los ratones control, se puede observar de color más marcado, con una tonalidad más oscura. En duodeno yeyuno y colon se puede observar mayor expresión de proteína. La localización de la β2-quimerina se observa en los extremos de las vellosidades intestinales. Con este resultado se puede estudiar la posibilidad de acción de las quimerinas como supresores tumorales.

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Objetivo 2.-Evaluación en modelos animales del papel de las quimerinas en la formación de tumores en intestino.

Estando ya demostrada la presencia de las isoformas α2 y β2-quimerina en intestino se va a evaluar su posible función supresora de tumores.

2.1.- Papel de la isoforma α2 –quimerina en la formación de tumores en

ratones Apc Min/+

Para investigar el papel desempeñado por la α2-quimerina se va a realizar el estudio de formaciones tumorales en el intestino las siguientes líneas de ratones:

- Línea ApcMin/+ : línea heterocigota para la mutación del gel APC que utilizaremos de control

- Línea chn1-/-, ApcMin/+: línea knock-out para α2-quimerina y heterocigota para la mutación del gel APC

Durante la realización del presente trabajo se han sacrificado siete ejemplares del genotipo control y siete ejemplares del genotipo knock-out.

Se ha realizado la suma de los pólipos contabilizados en los diferentes intervalos de cada ratón sacrificado de este genotipo. Los resultados se muestran calculando el promedio de las sumas de los pólipos contabilizados (Figura 11).

65,14 62,85

2,14 1,14

0 10 20 30 40 50 60 70

N

º de

pólipos

/a

nim

a

l

Delgado Grueso

Intestino control ko

Figura 11: Promedio de los pólipos totales en el genotipo chn1

En esta gráfica se observa una pequeña diferencia en el número total de pólipos desarrollados a favor de los ratones control. Con estos resultados no se puede corroborar nuestra hipótesis de partida, ya que se deberían observar mayor número de pólipos en los ratones knock-out.

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Para comprobar estas posibles diferencias se han agrupado lo tumores en función de tamaño en las siguientes categorías:

Intervalos: <1,5mm >=1,5-2,49 >=2,5-2,99 >=3

Se ha calculado el promedio de los pólipos contabilizados clasificados por intervalos de tamaño en el intestino delgado y en el intestino grueso (colon y recto)

(Figura 12).

A

<1,5

m m 1,5-2,5

m m

2,5-3m m >3m m

Control chn1 KO chn1 18,14 28 8,6 7,3 13,9 30,3 11,3 9,7 0 5 10 15 20 25 30 35 N º d e p ó lip o s /a n im a l

Diámetro de los pólipos

Control chn1 KO chn1

B

<1,5 mm

1,5-2,5

mm 2,5-3mm >3mm

Control chn1 KO chn1 0,43 0,14 0,29 1,14 0,43 0,57 0,29 0,86 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 N º d e p ó lip o s /a n im a l

Diámetro de los pólipos

(19)

Con estos resultados obtenidos en el intestino delgado y en el intestino grueso podemos observar que no se confirma la hipótesis de partida en todos los intervalos.

Hay intervalos como en el de pólipos menores de 1,5 mm en el intestino delgado o en el de pólipos mayores de 3 mm en el intestino grueso que sí confirman la hipótesis de partida, pero no en el resto.

La isoforma α2-quimerina, con el número de ejemplares sacrificados hasta el momento, no confirma en todos los intervalos de tamaños de pólipos la hipótesis de partida, que debería incrementar el número de pólipos en los ratones knock-out.

2.2.- Papel de la isoforma β2 –quimerina en la formación de tumores en

ratones Apc Min/+

La evaluación del papel desempeñado por la β2-quimerina se ve en los datos de formación de tumores en los diferentes ejemplares.

Durante el transcurso del proyecto se han podido sacrificar tres ejemplares del genotipo control y tres ejemplares del genotipo knockout.

- Línea ApcMin/+: línea heterocigota para la mutación del gel APC que utilizaremos de control

- Línea chn2-/-, ApcMin/+: línea KO para β2-quimerina y heterocigota para la mutación del gel APC

La imagen macroscópica del intestino en dos ejemplares de la línea chn2 nos muestra la proliferación de los tumores (Figura 13).

CONTROL CHN2

DUODENO 8x YEYUNO 8x ILEON 8x COLON 8x

KO CHN2

DUODENO KO 8x YEYUNO KO

8x

ILEON KO 8x COLON KO 8x

Figura 13: Proliferación tumoral en ratones control y ratones knockout de chn2.

(20)

Se ha realizado la suma de los pólipos contabilizados en los diferentes intervalos de cada ratón sacrificado de este genotipo. Los resultados se muestran calculando el promedio de las sumas de los pólipos contabilizados (Figura 14).

74

58,66

1 0,66 0

10 20 30 40 50 60 70 80

N

º d

e

p

ó

li

p

o

s

/a

n

im

a

l

Delgado Grueso

Intestino

control ko

Figura 14: Promedio de los pólipos totales en el genotipo chn2

En esta gráfica se observan también diferencias en el número total de pólipos desarrollados a favor de los ratones control. Con estos resultados no se puede afirmar que nuestra hipótesis de partida se cumple, ya que se deberían observar mayor número de pólipos en los ratones knock-out.

Aunque no existen diferencias en el número total de pólipos se va a estudiar si hay diferencias en el tamaño de los pólipos.

Para comprobar estas posibles diferencias se han agrupado lo tumores en función de tamaño en las siguientes categorías:

Intervalos: <1,5mm >=1,5-2,49 >=2,5-2,99 >=3

Se ha calculado la media aritmética de los pólipos contabilizados clasificados por intervalos de tamaño en el intestino delgado y en el intestino grueso (colon y recto)

(21)

A <1,5 mm 1,5-2,5 mm 2,5-3mm >3mm Control chn2 KO chn2 15,33 26,33 10,66 6,33 27,66 33,33 5,66 7,33 0 5 10 15 20 25 30 35 N º de pól ipos /a ni m a l

Diámetro de los pólipos

Control chn2 KO chn2

B

<1,5

mm 1,5-2,5

mm 3mm2,5- >3mm

Control chn2 KO chn2 0 0 0 0,66 0,33 0 0 0,66 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 N º de pól ipos /a ni m a l

Diámetro de los pólipos

Figura 15: Promedio del número de pólipos separados por tamaños en intestino delgado

(22)

Con estos resultados obtenidos en el intestino delgado y en el intestino grueso podemos observar que no se confirma la hipótesis de partida en todos los intervalos.

Hay un intervalo, en el de pólipos entre 2,5 y 3 mm en el intestino delgado que sí confirma la hipótesis de partida, pero no en el resto.

La isoforma β2-quimerina, con el número de ejemplares sacrificados hasta el momento, no confirma en todos los intervalos de tamaños de pólipos la hipótesis de partida, que debería incrementar el número de pólipos en los ratones knock-out.

Por último se ha querido comprobar si existen diferencias en los diferentes tramos de intestino.

Se muestran datos según el intestino proximal (duodeno), medio (yeyuno) y distal (ileon), y en colon en ratones control y knock-out de chn1 (Figura 16).

A B

C D

Figura 16: Promedio del número de pólipos separados por tamaños en intestino

proximal (A), medio (B) y distal (C) y en intestino grueso (colon y recto) (D) del genotipo chn2.

En este caso sí se ven diferencias en alguna de las zonas estudiadas. En el intestino proximal, en todos los intervalos se ve un mayor número de pólipos en los ratones knock-out. En el intestino distal también se encuentran diferencias, hay mayor número de pólipos en todos los intervalos salvo en el de mayor de 3 mm.

Según estos datos, se puede constatar una pequeña disminución en el adenocarcinoma de duodeno e ileon debido a la β2-quimerina.

1 1 3 6 0 2 0 0 0 1 2 3 4 5 6 N º d e p ó li p o s /a n im a l

<1,5 mm >=1,5-2,49 >=2,5-2,99 >=3

Diámetro de los pólipos

WT KO 22 4 14 11 1 1 0 0 0 5 10 15 20 25 N º d e p ó li p o s /a n im a l

<1,5 mm >=1,5-2,49 >=2,5-2,99 >=3

Diámetro de los pólipos

31 32 25 31 1 5 4 1 0 5 10 15 20 25 30 35 N º de pól ipos /a ni m a l

<1,5 mm >=1,5-2,49 >=2,5-2,99 >=3

Diámetro de los pólipos

1

0 0 0 0 0 0 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 N º de pól ipos /a ni m a l

<1,5 mm >=1,5-2,49 >=2,5-2,99 >=3

(23)

El número de animales analizados todavía es insuficiente para sacar unas conclusiones definitivas. Se va a continuar el estudio hasta tener al menos de 20 a 30 ejemplares de cada genotipo.

Análisis histopatológico de los tumores:

Otro aspecto que hay que analizar son las diferencias morfológicas en la distribución y compartimentalización de los tumores. Es necesario evaluar los cortes histológicos y por eso se ha puesto a punto la técnica swiss-roll.

Mediante esta técnica se puede observar la distribución y estructura de las formaciones tumorales (Figura 17).

La localización de los tumores y su distribución en compartimentos es importante en la posterior difusión tumoral.

A B

Figura 17: Localización de tumor en yeyuno de knock-out. (A) Microscopio de campo

claro 4x. (B) Microscopio de campo claro 10x.

En esta figura se observa un pólipo y las estructuras adyacentes, la técnica nos resulta de utilidad para estudiar la morfología y compartimentalización de los tumores.

Las secciones se analizan, primero en binocular, y posteriormente en microscopio de campo claro para observar mejor las células adyacentes al tumor

(Figura 18).

La distribución se puede observar en ratones control y ratones knockout.

(24)

DUODENO KO 10x YEYUNO KO 8x ILEON KO 8x COLON KO 10x

bi

no

cul

a

r

DUODENO KO 4x YEYUNO KO 4x ILEON KO 40x COLON KO 4x

m

icro

sco

p

io

DUODENO CONTROL 10x

YEYUNO CONTROL 10x

ILEON CONTROL 10x

COLON CONTROL 10x

bi

no

cul

a

r

DUODENO CONTROL 4x

YEYUNO CONTROL 20x

ILEON CONTROL 4x

COLON CONTROL 10x

m

icro

sco

p

io

Figura 18: Swiss Roll. Se pueden observar los swiss-roll en binocular y en microscopio

de campo claro.

Los tumores se localizan a lo largo de todo el intestino, aunque las mayores diferencias se han observado en duodeno e ileon. Se necesita tener mayor número de ejemplares para poder sacar unas conclusiones más precisas.

PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS TUMORALES:

(25)

El ejemplar utilizado en este experimento es un kock-out del gen chn2.

DUODENO 10x DUODENO 10x

TUMOR

YEYUNO 10 x

Figura 19: Ensayo EdU. Tinción con Hoechst. Se muestran los núcleos celulares y

mitocondrias a través de microscopio de fluorescencia..

Con este ensayo se ha intentado comprobar la proliferación tumoral, cuando se tenga a punto la técnica se comprobará en las zonas con mayores diferencias significativas.

4.- DISCUSIÓN

Las quimerinas pueden ser supresores de tumores, pero todavía tenemos datos preliminares de los experimentos debido al pequeño número de ejemplares estudiados. No obstante, tenemos algunos datos obtenidos a partir de las investigaciones en el presente trabajo que son concluyentes.

En un primer paso se ha evaluado la expresión de la α2 –quimerina. Para detectar esta proteína no se ha podido utilizar un anticuerpo específico puesto que los que hay comerciales no están contrastados. Se ha realizado la detección de esta isoforma de manera indirecta. La detección ha resultado positiva en todas las muestra tanto de intestino delgado como de intestino grueso. De esta forma se puede concluir que α2 – quimerina se expresa en el intestino de los ratones. También se ha comprobado la expresión de β2 –quimerina a través de western blot y por inmunohistoquímica utilizando a los ratones knock-out como control. La distribución de la proteína, en un principio, se observa en las zonas exteriores de las microvellosidades.

La evaluación en modelos animales del papel de las quimerinas en la formación de tumores se ha realizado mediante el estudio de aparición de tumores en los ratones control frente a ratones knock-out. Es de suponer que, si las quimerinas son supresores tumorales, los ratones knockout van a desarrollar mayor número de tumores en el intestino que los ratones control.

(26)

La isoforma α2-quimerina, con el número de ejemplares sacrificados hasta el momento, no confirma en todos los intervalos de tamaños de pólipos la hipótesis de partida, que debería incrementar el número de pólipos en los ratones knock-out

También se ha evaluado el papel de la β2-quimerina, con los resultados obtenidos en el intestino delgado y en el intestino grueso podemos observar que no se confirma la hipótesis de partida agrupando los pólipos según tamaños en diferentes intervalos. Hay un intervalo, en el de pólipos entre 2,5 y 3 mm en el intestino delgado que sí confirma la hipótesis de partida, pero no el resto.

Por último se ha querido comprobar si existen diferencias en los diferentes tramos de intestino. En este caso sí se ven diferencias en alguna de las zonas estudiadas. En el intestino proximal, en todos los intervalos se ve un mayor número de pólipos en los ratones knock-out. En el intestino distal también se encuentran diferencias, hay mayor número de pólipos en todos los intervalos salvo en el de mayor de 3 mm. Según estos datos, se puede constatar un pequeño aumento en el adenocarcinoma de duodeno e ileon debido a la ausencia de β2-quimerina.

La localización de los tumores y su distribución en compartimentos es importante en la posterior difusión tumoral. Mediante el uso de las técnicas inmunohistoquímicas puestas a punto en este proyecto se podrá observar la distribución y estructura de las formaciones tumorales.

El número de animales analizados todavía es insuficiente para sacar unas conclusiones definitivas, de momento se puede continuar con el estudio puesto que sí encontramos datos que confirman la hipótesis inicial. Cuando se tenga un mayor número de ejemplares sacrificados se podrán tener datos más precisos.

5.- CONCLUSIONES

“La cura del cáncer siempre ha sido uno de los objetivos de la ciencia. Los esfuerzos dedicados a esta labor siempre serán de una gran ayuda a contribuir a la erradicación de esa enfermedad”.

Con estas frases comenzábamos la redacción de este proyecto. Hemos estudiado la relación de las quimerinas con el desarrollo del cáncer.

Las conclusiones preliminares que podemos obtener con los datos obtenidos en la realización del presente proyecto son:

1.- La isoformas α2 y β2 quimerina se expresan en el intestino de ratón.

(27)

intestino proximal (duodeno), en todos los intervalos se ve un mayor número de pólipos en los ratones knock-out. En el intestino distal (íleon) también se encuentran diferencias, hay mayor número de pólipos en todos los tamaños de intervalos salvo en el de mayor de 3 mm. En los otros de momento no se encuentran diferencias significativas. Según estos datos, se puede constatar un pequeño aumento en el adenocarcinoma de duodeno e ileon debido a la ausencia de β2-quimerina.

En el laboratorio se va a continuar con el estudio de la proliferación tumoral para así demostrar estadísticamente la actividad de las quimerinas como supresores de tumores.

6.- BIBLIOGRAFÍA

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Figure

Figura 1: Árbol filogenético de la familia Ras/Rho [2].
Figura  2: Regulación del ciclo GTPasa.  La fase inactiva se produce cuando Rho está unida a  GDP y se activa al fosforilarse con la ayuda  de GEF
Figura 3: Isoformas de las quimerinas  y estructura de la β2 quimerina.
Figura 4: A) Fases en la progresión tumoral y GTPasas Rho implicadas. B) Diferentes
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Referencias

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