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Desarrollo de un método analítico para la determinación de aceites vegetales bromados en refrescos por cromatografía de líquidos de alta resolución

(1)UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. i s s i DESARROLLO DE IJN METODO ANALITICO PARA LA DETERMINACION DE ACEITES VEGETALES BROMADOS EN REFRESCOS POR CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCION. POR MA. MAYELA DE LA FUENTE DAVILA. Como requisito parcial para obtener el Grado de MAESTRIA EN CIENCIAS QUIMICAS CON ESPECIALIDAD EN QUIMICA ANALITICA. CD. UNIVERSITARIA.

(2) ' TM TP680 F8. c.l. J.

(3) 1080074505.

(4) UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. •ROLLO DE l'N M E T O D O A.\ \.i H C O PARA LA Di ? )E A C E I T E S V E G E T A L E S BUo.MADOS EN REFRL C R O M A T O G R A F I A DE LIQL'ÍOOS DE ALTA RESí. \'i)R. MA.MAYELA Dt. .! A F U E N T E 1>A\ ÍI.A. Como requisito parcial para obtener el Gnu 1 MAESTRIA EN C I E N C I A S QU.ÍMIC \ S Especialidad en Química Anal/ti-. <T>,UNIVERSITARIA. ABKÍ. l.W.

(5) FONDO. •rese maestria.

(6) UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS. DESARROLLO DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA LA DETERMINACIÓN DE ACEITES VEGETALES BROMADOS EN REFRESCOS POR CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN. Por. MA. MAYELA DE LA FUENTE DÁVILA Como requisito parcial para obtener el Grado de MAESTRÍA EN CIENCIAS QUÍMICAS con Especialidad en Química Analítica. DIRECTOR DE TESIS ta. DR. ARMANDO GARCÍA LUNA. f.

(7) DESARROLLO DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA LA DETERMINACIÓN DE ACEITES VEGETALES BROMADOS EN REFRESCOS POR CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN. Aprobación de la Tesis: r Dr. Armando García Luna. Dr. Ramiro Quintanilla Ucea. Dra. Norma Nelly Treviño Flores. Dr. Juan Manuel Alfaro Barbosa. Dr. Javier Macossay Torres. U/MOÒ Presidente. (Uf*. f. '¿¿/¿. Secretario. Vocal. Vocal. Vocal. M.C. Martha A. Suárez Herrera Coordinadora de la Escuela efe Graduaáos éh Ciencias.

(8) Jt fflopefa, fior el ¿ntm¿uaá¿e>. Ñuxmd¿c¿onaémcnt&'. m^ òrtndas w to<ùr momento-, ¿& £¿ec¿ic<h e$£& test*, ^ ¿e> doy ^racùz^jbor compartir m¿&. apiu/armes & a/caazar¿o&..

(9) ,4 GRADECIMIENTOS Quiero expresar mi más sincero agradecimiento ai Dr. Armando García Luna, Asesor de esta Tesis, quién ai brindarme la oportunidad de trabajar en ios laboratorios de CEDETEC me permitió no solo desarrollar este trabajo sino iniciarme en el interesante campo de la investigación. Al Dr. José María Viader Salvado y a ta Dra. Noemi Waksman de Torres, por su interés en ta revisión del anteproyecto de Tesis. En particular agradezco al Dr. Viader su valiosa sugerencia acerca. del uso de la. técnica de extracción en fase sólida. Al Dr. Ramiro Quintaniila Ucea, Dra. Norma Nelly Treviño Flores, Dr. Juan Manuel Aifaro Barbosa y Dr. Javier Macossay Torres, miembros del Comité de Tesis, quiénes cedieron parte de su valioso tiempo para ta revisión de! borrador de Tesis. Sin el apoyo material y económico que obtuve de la Facultad de Ciencias Químicas de ta Universidad Autónoma de Nuevo León, hubiera sido imposible la realización de esta investigación. Por ello quiero agradecer al M.D.O. Andrés Cerda Onofre y a la M.D.O. Gloria Esquivel Zamora las facilidades que me brindaron para el inicio de este proyecto, y ai tng. José Manuei Martínez Deigado y a ta Q.F.B. Gloria Nelly Páez Garza quiénes me apoyaron en la conclusión del mismo..

(10) Así mismo quiero gradecer Universidad Autónoma. a ia Secretaría Académica. de Nuevo León por ei apoyo. de ta. económico. otorgado para ta realización de esta Tesis. Un agradecimiento muy especia! a mi familia, en particular a mis padres, ing. Manuel de ta Fuente y Sra. Carmen Dávita, por el apoyo moral que siempre me han brindado..

(11) TABLA DE CONTENIDO Capítulo. Página. INTRODUCCIÓN. 1. 1. ANTECEDENTES. 3. 1.1 Naturaleza Química d e los Aceites Bromados 1.2 Aplicación d e los Aceites Vegetales 1.3 Regulación d e los Aceites Vegetales 1.4 Métodos de Análisis d e Aceites Bromados 1.5 Objetivos del Trabajo 1.5.1 Objetivo General 1.5.2 Objetivos Específicos. Vegetales Bromados Bromados Vegetales. 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Reactivos y Equipos 2.1.1 Reactivos 2.1.2 Equipo 2.2 Caracterización por CLAR d e los Ésteres Metílicos y d e sus Derivados Bromados 2.2.1 Introducción 2.2.2 Desarrollo del Método Cromatográfico d e Análisis por CLAR 2.3 Elaboración d e Curvas de Calibración 2.4 Caracterización por CLAR de AVB 2.4.1 Transesterificación d e los Aceites Vegetales y d e sus Derivados Bromados. 3 . . . . 5 . . . . 7 8 15 15 15 17 17 17 20 24 24 25 27 29 29.

(12) 2.4.2 Análisis d e los Aceites Vegetales y d e sus Derivados Bromados 2.5 Tratamiento d e la Muestra 2.5.1 Introducción 2.5.2 Preparación d e la Muestra 2.5.3 Extracción del AVB del Refresco 2.5.4 Transesterificación y Recuperación d e los Esteres Metílicos 2.5.5 Análisis por CLAR 2.6 Análisis d e un Refresco 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 32 33 33 34 35 36 36 36 38. 3.1 Caracterización por CLAR de los Ésteres Metílicos y d e sus Derivados Bromados 3.1.1 Análisis Cromatogràfico por el Método Isocrático 3.1.2 Análisis Cromatogràfico por el Método Gradiente 3.2 Elaboración de Curvas de Calibración 3.3 Caracterización por CLAR d e AVB 3.3.1 Transesterificación de Aceites Vegetales y d e sus Derivados Bromados 3.3.2 Análisis de los Aceites Vegetales y de sus Derivados Bromados 3.4 Tratamiento de la Muestra 3.5 Análisis d e un Refresco. 38 38 48 51 52 52 54 57 58. 4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. 60. BIBLIOGRAFÍA. 65. APÉNDICES. 68. APÉNDICE A.- CROMATOGRAMAS OBTENIDOS UTILIZANDO EL MÉTODO ISOCRÁTICO APÉNDICE B.-CROMATOGRAMAS EN FORMA TRIDIMENSIONAL APÉNDICE C.- ESPECTROS UV viii. 69 90 101.

(13) APÉNDICE D.- CROMATOGRAMAS OBTENIDOS UTILIZANDO EL MÉTODO GRADIENTE APÉNDICE E.- CURVAS DE CALIBRACIÓN. 110 128.

(14) LISTA DE TABLAS Tabla. Página. I.. Composición Química de Aceites Vegetales. 6. II.. Composición d e los Refrescos Empleados. 21. III.. Composición de las Soluciones Analizadas. 26. IV.. Composición d e la Solución Stock d e Metílicos Bromados. V.. Composición de las Soluciones Utilizadas para la Elaboración d e las Curvas d e Calibración. 29. VI.. Composición de la Solución Utilizada para la Evaluación del Procedimiento d e Extracción. 32. VII.. Pureza de Pico en el Cromatograma del Oleato d e Metilo Bromado. 41. VIII.. Pureza d e Pico en el Cromatograma del Linoleato de Metilo Bromado. 42. IX.. Pureza d e Pico en los Cromatogramas del HBEM Soluble y del HBEM Insoluble. 44. X.. Tiempos de Retención y Factores de C a p a c i d a d d e los Analitos bajo Estudio (Método Isocrático). .... 47. XI.. Tiempos de Retención y Factores de C a p a c i d a d de los Analitos bajo Estudio (Método Gradiente) . . .. 50. Ésteres. 28.

(15) XII.. Intervalo de Concentración Evaluado y Esperado Para C a d a Analito. XIII.. Resultados d e la Evaluación del Procedimiento d e Extracción Posterior a la Transesterificación. XIV. XV. XVI.. 52. .... 53. Composición del Aceite de Soya Bromado. 56. Resultados d e la Evaluación del Procedimiento d e Tratamiento d e Muestra. 57. Resultados de la Evaluación del Refresco. 59.

(16) LISTA DE FIGURAS Figura. Página. 1.. Molécula de Triglicérido. 4. 2.. Sistema de Extracción en Fase Sólida. 22. 3.. Cromatógrafo d e Líquidos. 23. 4.. Cromatograma del Oleato de Metilo. 70. 5.. Cromatograma del Linoleato d e Metilo. 71. 6.. Cromatograma del Linolenato d e Metilo. 72. 7.. Cromatograma del Palmitato de Metilo. 73. 8.. Cromatograma del Estearato d e Metilo. 74. 9.. Cromatograma Tridimensional'del Oleato d e Metilo. 91. 10.. Cromatograma Tridimensional del Linoleato d e Metilo. 92. 11.. Cromatograma Tridimensional del Linolenato de Metilo. 93. 12.. Cromatograma Tridimensional del Palmitato d e Metilo. 94. 13.. Cromatograma Tridimensional del Estearato d e Metilo. 95.

(17) 14. Cromatograma del Solvente A. 75. 15. Cromatograma del DBEM. 76. 16. Cromatograma del TBEM. 77. 17. Cromatograma del HBEM Soluble. 78. 18. Cromatograma del HBEM Insoluble. 79. 19. Cromatograma Tridimensional del DBEM. 96. 20. Cromatograma Tridimensional del TBEM. 97. 21. Cromatograma Tridimensional del HBEM Soluble . . . .. 98. 22. Cromatograma Tridimensional del HBEM Insoluble. 99. 23. Espectros UV del Oleato d e Metilo y del DBEM. 24. Espectros UV del DBEM. 25. Espectros UV del Linoleato d e Metilo y del TBEM . . . 104. 26. Espectros UV del TBEM. 27. Espectros UV del Linolenato d e Metilo y del HBEM. 28. Espectros UV del HBEM Soluble. 29,. Cromatograma del Heptadecenoato d e Metilo. 30.. Cromatograma del DBHM. 31.. Espectros UV del Heptadecenoato d e Metilo y del DBHM. 108. 32.. Cromatograma Tridimensional del DBHM. 100. 33.. Cromatograma d e la Mezcla d e Analitos (205nm). 34.. Espectros UV del Oleato d e Metilo y del DBEM . . . .. .... . . .. 102 103. 105 . . 106 107 .... 80 81. .... 82 109.

(18) 35. Cromatograma d e la Mezcla d e Analítos (220nm). 36. Cromatograma del Oleato d e Metilo. 111. 37. Cromatograma del Linoleato d e Metilo. 112. 38. Cromatograma del Linolenato d e Metilo. 113. 39. Cromatograma del Palmitato d e Metilo. 114. 40. Cromatograma del Estearato d e Metilo. 115. 41. Cromatograma del DBEM. 116. 42. Cromatograma del TBEM. 117. 43. Cromatograma del HBEM Soluble. 118. 44. Cromatograma del HBEM Insoluble. 119. 45. Cromatograma del DBHM. 120. 46. Cromatograma de la Mezcla de Analítos. 121. 47. Cromatograma del DBEM: (b) Con Gradiente. 122. 48. Curva de Calibración para el DBEM (Método Isocrático). 129. 49. Curva d e Calibración para el TBEM (Método Isocrático). 130. 50. Curva de Calibración para el HBEM Insoluble (Método Isocrático). 131. 51. Curva d e Calibración para el HBEM Soluble (Método Isocrático). 132. 52. Curva de Calibración para el DBEM (Método Gradiente). 133. 53. Curva d e Calibración para el TBEM (Método Graxiv. (a) Sin Gradiente,. .... 83.

(19) diente). 134. 54.. Curva d e Calibración para el HBEM Insoluble (Método Gradiente). 135. 55.. Curva d e Calibración para el HBEM Soluble (Método Gradiente). 136. 56.. Cromatograma d e la Solución no. 3 Utilizada en la Elaboración d e las Curvas d e Calibración (Método ¡socrático). 84. Cromatograma d e la Solución no. 3 Utilizada en la Elaboración de las Curvas de Calibración (Método Gradiente). 123. 57.. 58.. Cromatograma del Aceite d e Soya: (a) Sin Transesterificar, (b) Transesterificado. 85. 59.. Cromatograma del Aceite d e Soya. 86. 60.. Cromatograma del Aceite d e Maíz. 87. 61.. Cromatograma del Aceite d e Maíz Bromado. 62.. Cromatograma del Aceite d e Soya Bromado (Método Gradiente). 125. 63.. Cromatograma del Aceite d e Soya Bromado (Método Isocrático). 88. 64.. Cromatograma Reimer. 65.. Cromatograma Típico Obtenido al Evaluar el Procedimiento de Tratamiento d e Muestra. 66.. Cromatograma Típico Obtenido al Analizar Refresco J o y a d e Toronja. del. Aceite. de. . . . .. Haarmann &. el. 124. 126 89 127.

(20) NOMENCLATURA AVB. Aceites Vegetales Bromados. AOAC. Asociación Oficial d e Químicos Analistas. CLAR. Cromatografía d e Líquidos de Alta Resolución. Conc.. Concentración. CTR. Control Técnico y Representaciones S.A. d e C.V.. C.V.. Coeficiente de Variación. DBEM. Dibromoestearato d e Metilo. DBHM. Dibromoheptadecanoato d e Metilo. HBEM. Hexabromoestearato d e Metilo. ODS. Octadecilsilano. ppm. Partes por millón. Rec.. Recuperación. TBEM. Tetrabromoestearato d e Metilo. TH F. Tetra h id rof u ra n o. tR. Tiempo d e Retención. to. Tiempo muerto. UV. Ultravioleta.

(21) INTRODUCCIÓN Los aceites vegetales. bromados han sido. ampliamente. utilizados como aditivos para alimentos y específicamente en la industria d e refrescos como agentes ajustadores d e densidad d e los aceites cítricos saborizantes. A pesar d e que se ha permitido el uso de dichos compuestos como. aditivos. para. alimentos,. existe una. gran. cantidad. de. estudios1*9 que señalan la toxicidad de los mismos. Como resultado d e estos reportes, el uso de los aceites bromados ha sido prohibido en algunos países, y dónde sí se permiten, solo es posible utilizarlos hasta una concentración máxima d e 15 ppm10. Por lo que resulta importante desarrollar un método analítico para su cuantificación. Al. realizar. encontraron. un. estudio. reportados. bibliográfico. diversos. sobre. métodos11"20,. el. tema. se. destacando. la. cromatografía d e gases como una de las técnicas más utilizadas. Efectivamente, la cromatografía d e gases ha sido ampliamente.

(22) utilizada para el análisis d e los aceites vegetales bromados a pesar d e que las condiciones d e trabajo necesarias para el desarrollo d e dicha técnica provocan la descomposición d e los aceites bajo análisis21-23. Por otra parte, utilizando esta técnica se dificulta el análisis de los compuestos hexabromados a menos que se utilice una columna capilar 19 . La cromatografía de líquidos es la opción más viable para el análisis d e los compuestos que ocupan nuestro interés en éste estudio, ya que con esta técnica deben eliminarse los problemas de. la. descomposición. del. producto. bajo. análisis. y. de. la. determinación de los compuestos hexabromados. Lawrence, Chadha y Conacher 1 1 utilizaron un método d e cromatografía de líquidos con detección UV a 220 nm para la caracterización. de. aceites. vegetales. bromados,. pero. no. desarrollaron una metodología para el análisis d e los mismos en refrescos. En este trabajo se desarrolla un método analítico. para. cuantificar aceites vegetales bromados en refrescos, utilizando la técnica d e cromatografía d e líquidos d e alta resolución..

(23) CAPÍTULO 1 ANTECEDENTES 1.1 Naturaleza Química d e los Aceites Vegetales Bromados Los. aceites. vegetales. bromados. (AVB). se. obtienen. sometiendo los correspondientes aceites vegetales a una reacción d e bromación. Los aceites vegetales más utilizados para. este. propósito son el aceite d e maíz, el aceite d e soya y el aceite d e algodón; sin embargo, también se encuentra reportado en la literatura la bromación d e otros aceites como por ejemplo los de: ajonjolí, girasol, cañóla, jojoba y aguacate 2 4 . Dicha reacción se lleva a c a b o sobre la porción insaturada d e la molécula d e triglicérido que constituye el aceite vegetal y que en la mayoría d e los aceites proviene, principalmente, d e los ácidos oleico, linoleico y linolénico (figura 1). Por lo tanto, sí se somete. un. aceite. vegetal. bromado. a. una. reacción. de.

(24) O. CH2. O. C. R. O. CH. O. C. R. O. CH2. O. C. R. R = Cadena Derivada de Ácido Graso.. Figura 1. Molécula de Trigiicérido. Los Ácidos, de Dónde Proviene la Porción Insaturada de la Mayoría de los Triglicéridos, son los siguientes: Ácido Oleico: CH3 - (CH2)7 - CH = CH - (CH2)7 - COOH Ácido Linoleico: CHs -(CH2)4 -CH =CH -CH2 -CH = CH-(CH2}7- COOH Ácido Linolénico: CH3 - (CH2 - CH = CH)3 - (CH2)7 - COOH.

(25) transesterificación con metanol se deben obtener, principalmente, los siguientes derivados bromados: dibromoestearato d e (DBEM), tetrabromoestearato. de. metilo. (TBEM), y. metilo. hexabromo-. estearato d e metilo (HBEM). El porcentaje obtenido d e c a d a uno d e esos productos dependerá, evidentemente, d e la composición química del aceite vegetal d e partida. En la tabla I se reporta la composición química d e los aceites d e. maíz y d e soya. Se. obtiene del análisis de. esa. información que al transesterificar el aceite bromado d e maíz c a b e esperar la formación d e DBEM y TBEM; en el caso del aceite bromado d e soya, además d e los productos anteriores, se d e b e obtener el HBEM. 1.2 Aplicación d e los Aceites Vegetales Bromados Los refrescos con sabores cítricos como los de naranja y lima-limón se encuentran entre los favoritos d e los consumidores d e ese. tipo. de. bebidas.. Estos. sabores. están. principalmente por los aceites esenciales obtenidos. constituidos d e algunas. frutas: por ejemplo, naranja, limón, toronja, etc. Sin embargo, la dispersión d e estos aceites esenciales en el refresco constituye un problema debido a la insolubilidad d e los mismos en agua; eso.

(26) obliga a incorporar agentes emulsificantes en la formulación d e la bebida. Así mismo, considerando que la habilidad d e los agentes emulsificantes. para. mantener. el. aceite. en. suspensión. es. proporcional al tamaño d e partícula, las partículas d e aceite son reducidas por atomización. TABLA I C O M P O S I C I Ó N QUÍMICA DE ACEITES VEGETALES. ÁCIDO Mirístico Palmítico Palmitoleico Esteárico Oleico Linoleico Linolénico Araquídico Eicosenoico Docosanoico Tetracosanoico. % EN ACEITE DE MAÍZ. % EN ACEITE DE SOYA. <0.1 8 - 19 <0.5 0.5-4 19-50 34-62 <2.0 < 1.0 <0.5 <0.5 <0.5. <0.5 7- 14 0.5 1.4-5.5 19-30 44 - 62 4-11 <1.0 < 1.0 <0.5 -. Por otra parte, no es suficiente lograr la emulsión del aceite en el refresco, sino que además esta d e b e ser estable al menos seis meses. Un problema para conseguir dicha estabilidad es la baja densidad d e los aceites esenciales. En general, los aceites cítricos tienen una gravedad específica en el intervalo d e 0.845 a 0.890.

(27) g/cm 3 mientras que un refresco con un 10 a un 12% d e azúcar tiene una g r a v e d a d específica d e 1.038 a 1.046 g/cm 3 . Para solucionar este. problema. denominados compuestos. se. utilizan. agentes que. los. aditivos. ajustadores. se a ñ a d e n. a. de. de. peso,. densidad,. los aceites. aumentar su g r a v e d a d específica y ayudar a. y. también que. esenciales mantener. son para una. dispersión estable del aceite. Un ejemplo d e este tipo d e aditivos lo constituyen los aceites vegetales bromados. Los aceites vegetales bromados fueron utilizados por primera vez, como agentes ajustadores d e densidad d e aceites esenciales en bebidas en la d é c a d a d e los años 40. Los aceites vegetales bromados obtenidos a. partir del aceite d e oliva tienen. una. gravedad específica d e alrededor d e 1.24 g/cm 3 y los obtenidos a partir d e aceites d e soya, d e maíz o d e algodón, d e alrededor d e 1.33 g/cm 3 . Debido a su alta g r a v e d a d específica los AVB son considerados. como. agentes. ajustadores. de. densidad. muy. efectivos para los aceites cítricos. Además proporcionan turbidez u o p a c i d a d a los refrescos lo cuál en algunos casos es una ventaja. 1.3 Regulación d e los Aceites Vegetales Bromados Dependiendo de los aceites cítricos utilizados, normalmente.

(28) se requieren d e 120 a 160 ppm del AVB para lograr una emulsión estable del aceite saborizante en el refresco. Sin embargo, en 1966, el Comité d e Aditivos Para Alimentos d e la Agrupación "World Health Organizaron" expresa su preocupación a c e r c a d e la posibilidad d e la acumulación d e bromo en los tejidos del cuerpo c u á n d o los AVB fueran utilizados en productos alimenticios d e consumo humano. Desafortunadamente, diversos estudios sobre los efectos tóxicos d e los AVB en animales d e laboratorio'-9. han. confirmado esa sospecha. A. pesar. de. que. no. existen. pruebas. sobre. efectos. patológicos específicos en el ser humano, el uso d e los AVB como aditivos para alimentos fue prohibido en la India, Inglaterra y en otros países europeos. En algunos países como Estados Unidos, C a n a d á , Australia, España, Finlandia, Noruega, Israel, Kenya y Sudáfrica su uso fue limitado a 15 ppm10 en el refresco final. 1.4 Métodos d e Análisis d e Aceites Vegetales Bromados Considerando la estricta regulación a que están sometidos los AVB, se comprende la importancia d e contar con un método analítico. para. su cuantificación.. Al realizar una. investigación. bibliográfica sobre el tema se encontraron reportados diversos.

(29) métodos d e análisis d e AVB, destacando las contribuciones del grupo d e trabajo d e H.B.S. Conacher. A continuación se describen brevemente algunos d e los estudios más relevantes. Deana L. Turner12 desarrolló un método para cuantificar AVB en refrescos basado en la determinación d e bromo total en la muestra. Utilizando un procedimiento d e debromación en conjunto con un electrodo específico d e ion bromuro, y trabajando a niveles d e 15 ppm del AVB, se reporta un 93% d e recuperación, una precisión d e ± 1 ppm y una exactitud d e ± <1 ppm. Otro método, basado también en la determinación. de. bromo total, es el que reportan M.S. Green y G. Keen' 3 . Los autores describen un método colorimétrico dónde el bromo es liberado del aceite. utilizando. dicromato. de. potasio. y. ácido. sulfúrico. concentrado; posteriormente, este se h a c e reaccionar con una solución d e ácido barbitúrico-piridina en presencia d e cianuro d e potasio. para dar un color morado. De acuerdo a los autores los. resultados obtenidos en. la determinación. de. bromo en. AVB. coinciden c o n los d e otros métodos pero no proporcionan mas detalles. Los investigadores del Central Food Technological Research.

(30) Institute of Mysore14 desarrollaron una técnica rápida para detectar bajos. niveles. de. AVB. en. refrescos.. La. prueba. involucra. la. extracción del AVB del refresco y su tratamiento con polvo d e zinc para. convertir. el. bromo. orgánico. a. su. forma. inorgánica.. Posteriormente se trata la muestra con dióxido d e plomo, para liberar bromo, que puede ser d e t e c t a d o por el cambio d e color d e la fluoresceina con la que es puesto en contacto. Según los autores la prueba puede detectar hasta 1.5 ppm d e AVB en refrescos. H.B.S. Conacher métodos. de. y Arthur D. McKenzie 15. determinación. de. bromo. en. comparan. AVB:. 1). tres. titulación. yodométrica, 2) titulación potenciométrica y 3) titulación utilizando electrodo específico d e bromuro. Ellos concluyen que tanto la titulación potenciométrica como la yodométrica son aceptables para una determinación precisa d e bromo en AVB. Con la tercer técnica reportan resultados mas bajos y variables. En la revisión bibliográfica realizada se encontró que una d e las técnicas más empleadas para la cuantificación d e AVB era la cromatografía. d e gases. H.B.S. Conacher, R.K. Chadha. y M.R.. Sahasrabudhe 16 se encuentran entre los primeros en reportar el uso.

(31) d e esa técnica. El procedimiento utilizado por ellos involucra el tratamiento d e los aceites bromados con metóxido d e. sodio,. seguido del análisis por cromatografía d e gases d e los ésteres metílicos resultantes. Empleando una columna e m p a c a d a con 3% JXR en Gas Chrom Q, d e malla 110-120, y como estándar interno p e n t a d e c a n o a t o d e metilo logran recuperaciones en el intervalo de. 93.7 a. 102.4%.. Aplicando. su técnica. a. varios. refrescos. comerciales encontraron un contenido d e AVB en el intervalo d e 10 a 45 mg en. 10 onzas d e la bebida. Posteriormente H.B.S.. Conacher' 7 revisó este método y realizó un estudio colaborativo sobre la determinación por cromatografía d e gases d e aceite bromado d e ajonjolí en bebidas d e naranja. Los resultados del estudio colaborativo señalan recuperaciones de 94.6, 95.3 y 96.0% para refrescos conteniendo 3.1, 5.22 y 10.66 mg/10 onzas d e bebida. respectivamente,. con. los correspondientes valores. de. desviación estándar d e 0.4, 0.46 y 0.64. En base a este estudio se desarrolló el primer método oficial d e la Asociación Oficial d e Químicos Analistas (AOAC).. James F. Lawrence, Rajinder K. Chadha y H.B.S. Conacher 1 8 modificaron método. el método. alternativo. de. previamente. descrito. esterificación.. proponiendo. Estos. un. investigadores.

(32) transesterificaron. los. AVB. mediante. una. metanólisis. ácida,. procedimiento que involucra reactivos mas fáciles d e manejar que los del método oficial. Además d e la simplificación del método, se obtiene un cromatograma con picos simples para el DBEM, el TBEM y el HBEM; por el contrario, con la técnica del metóxido d e sodio el cromatograma obtenido es complejo, mostrando mezclas de picos para el TBEM y el HBEM. En los trabajos basados en la técnica d e cromatografía d e gases que han sido descritos, se utilizaron columnas d e empacadas.. Rajinder K. Chadha, James. tipo. F. Lawrence y H.B.S.. Conacher 1 9 probaron una columna d e tipo capilar, conservando el procedimiento. de. transesterificación. vía. metanólisis. ácida. desarrollado por ellos mismos. Su principal logro fue la detección del HBEM, analito que con las columnas e m p a c a d a s era difícil d e detectar y no se obtenían resultados reproducibles. También se describe en la literatura un método que utiliza espectrometría d e fluorescencia d e rayos-X para la detección y estimación semicuantitativa d e AVB en refrescos. El método fue desarrollado por H.B.S. Conacher, J.C. Merangery J . Leroux20 con el objetivo d e contar con una técnica rápida d e análisis que pudiera.

(33) utilizarse d e manera previa al análisis por cromatografía d e gases y así facilitar el trabajo en el caso d e tener un número elevado d e muestras. Finalmente se mencionará. la contribución d e J a m e s F.. Lawrence, Rajinder K. Chadha y H.B.S. Conacher 11 . Ellos emplearon un método d e cromatografía d e líquidos en fase normal y en fase reversa para la caracterización d e aceites vegetales bromados. Su principal objetivo fue la caracterización d e diferentes. aceites. comerciales y preparados en el laboratorio. Ellos estudiaron los aceites d e oliva, ajonjolí, maíz, algodón y soya, y el procedimiento que siguieron se describe brevemente a continuación. La muestra d e aceite es transesterificada mediante una metanolisis ácida y el producto obtenido se extrae con hexano. Después d e llevar a sequedad la fase orgánica, el residuo se disuelve en acetonitrilo-THF para la cromatografía en fase reversa y en hexano para la cromatografía en fase normal. Para la técnica en fase reversa se utilizó una columna Ultrasphere ODS d e 25 cm x 4.6 mm, d e 5 |x, y una fase móvil d e acetonitrilo-agua, 95:5. Para la técnica en fase normal emplearon una columna Ultrasphere Si d e las mismas dimensiones que la anterior y una fase móvil consistente.

(34) en hexano-isopropanol, 500:1. En ambos casos se utilizó detección UV a 220 nm. Los autores utilizaron la relación d e TBEM a DBEM así como la presencia o ausencia del HBEM para identificar el aceite involucrado, reportando que sus resultados coinciden con los obtenidos mediante la técnica d e cromatografía d e gases. No aplicaron esta técnica al análisis d e refrescos. De. los. cromatográficos diferentes. métodos. indicados,. son c a p a c e s. compuestos. de. solamente. diferenciar. bromados. e. los. métodos. identificar. individualmente. lo. los cuál. representa una ventaja. Sin embargo, la cromatografía d e gases presenta. algunos. inconvenientes. en. lo. que. respecta. a. la. posibilidad d e descomposición d e los compuestos bajo análisis; diversos autores, como Landowne y Lipsky21, Koehler et al.22 y H.B.S. Conacher 2 3 han encontrado evidencias d e dicha descomposición. Por otra parte, se dificulta la detección del HBEM, a menos que se utilice una columna capilar. Por lo tanto, la cromatografía. de. líquidos se convierte en una posibilidad más interesante, que sin embargo no ha sido ampliamente explotada. Así surge nuestro interés por el tema que se desarrolló en el presente trabajo d e investigación y cuyos objetivos se describen a.

(35) continuación. 1.5 Objetivos del Trabajo 1.5.1 Objetivo General Desarrollar un método analítico, utilizando la técnica cromatografía. de. líquidos. de. alta. resolución. (CLAR). de para. cuantificar aceites vegetales bromados en refrescos. 1.5.2 Objetivos Específicos 1.- Caracterización mediante una técnica d e cromatografía d e líquidos d e alta resolución d e los productos obtenidos en una reacción d e bromación d e un aceite vegetal. Para lograr este objetivo, los aceites vegetales serán transesterificados, por lo que los productos a caracterizar serán los correspondientes ésteres. 2.- Evaluación d e un sistema d e extracción en fase sólida para la recuperación d e los ésteres metílicos que son producto d e la transesterificación a la que serán sometidos los aceites vegetales bromados. 3.- Evaluación d e un sistema d e extracción en fase sólida.

(36) para la recuperación del aceite vegetal bromado contenido en un refresco.. 4.- Api icar el método d e análisis desarrollado, a refresco d e la localidad.. algún.

(37) CAPÍTULO 2 MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Reactivos y Equipo 2.1.1 Reactivos 2.1.1.1 Solventes. Se utilizaron éter etílico, hexano y metanol grado analítico d e Productos Químicos Monterrey. El metanol fue secado sulfato d e sodio se. utilizaron. los. anhidro (CTR). Para los análisis siguientes. solventes. grado. con. cromatográficos cromatográfico:. acetonitrilo (Mallinckrodt y Fisher Scientific), THF (Merck) y. agua. (Merck). En diferentes etapas del trabajo experimental se utilizó un solvente compuesto d e acetonitrilo y THF en proporción 4:1, el cual será denominado "solvente A"..

(38) 2.1.1.2 Ésteres Metílicos. Para ser utilizados como estándares en la caracterización d e los. aceites. vegetales,. y. para. la. preparación. de. los. correspondientes derivados bromados necesarios para el análisis d e los AVB, fueron adquiridos d e Aldrich los siguientes reactivos: oleato, linoleato, linolenato, estearato y palmitato d e metilo. Para la preparación del estándar interno se adquirió d e Sigma. el. h e p t a d e c e n o a t o d e metilo. 2.1.1.3 Derivados Bromados d e los Ésteres Metílicos. Los ésteres. metílicos. fueron. bromados. de. acuerdo. al. procedimiento descrito a continuación. 2.1.1.3.1 Oleato d e Metilo. Se disolvieron 500 mg del oleato d e metilo en 15 mL d e éter etílico en un matraz d e reacción d e 25 mL y la solución se llevó a 0°C mediante la inmersión del matraz en un baño d e agua-hielo-sal. Manteniendo dicha temperatura, y bajo agitación magnética constante, se dosificaron 0.15 mL d e bromo durante un período d e 20 minutos. Terminada la dosificación se. mantuvo. la. Posteriormente. agitación la. solución. a. 0°C. por. se. transfirió,. 10. minutos. añadiendo. más. 15 mL. adicionales d e éter, a un embudo d e separación que contenía 50.

(39) mL d e solución d e tiosulfato d e sodio al 10%. Se agitó y después se permitió la separación d e c a p a s para posteriormente descartar la fase acuosa; la fase etérea por su parte se lavó con dos porciones d e 10 mL d e agua y se secó con sulfato d e sodio anhidro. El éter se eliminó bajo corriente d e nitrógeno a temperatura ambiente. 2.1.1.3.2. Linoleato,. Linolenato. y. Heptadecenoato. de. Metilo. El resto d e los ésteres metílicos fueron bromados siguiendo el mismo procedimiento descrito, excepto que para el linoleato d e metilo se utilizaron 0.30 mL d e bromo y para el linolenato d e metilo 0.45 mL d e dicho reactivo. En esta última reacción, la bromación del linolenato d e metilo, se obtuvieron dos productos: uno soluble en el medio de reacción (denominado HBEM soluble) y otro que precipitó (denominado HBEM insoluble). 2.1.1.4 Aceites Vegetales y sus Derivados Bromados. Los aceites vegetales d e maíz y d e soya utilizados en este estudio fueron adquiridos en casas comerciales d e la localidad. Sus derivados bromados fueron preparados en el laboratorio siguiendo el mismo procedimiento descrito para la bromación d e los ésteres metílicos pero utilizando 0.2 y 0.3 mL d e bromo respectivamente. También se utilizó en este trabajo una muestra d e un aceite.

(40) bromado comercial d e la compañía Haarmann & Reimer. Se trata d e un aceite bromado d e maíz. 2.1.1.5 Solución Ácida d e Metanol. Se disolvieron 2 mL d e. ácido. sulfúrico grado. reactivo. (Desarrollo d e Especialidades Químicas) en metanol y se aforó a 100 mL con metanol. 2.1.1.6 Refrescos. Para el desarrollo del método d e tratamiento d e muestra se utilizó un refresco d e uva d e la marca 10-K (producto importado). Por otra parte, el método d e análisis propuesto en este trabajo se probó en un refresco d e toronja d e la marca J o y a (producto d e la localidad). La composición d e ambos refrescos se reporta en la tabla II. 2.1.2 Equipo 2.1.2.1 Sistema d e Extracción en Fase Sólida. En dos etapas del método d e análisis desarrollado en este estudio se utilizó un procedimiento d e extracción en fase sólida. En ambos casos se emplearon cartuchos e m p a c a d o s con 500 mg d e fase C-18 (Supelclean LC-18 d e Supelco) d e 6 mL d e c a p a c i d a d . El.

(41) sistema d e extracción seleccionado fue el d e presión positiva d e una. línea. de. nitrógeno. (figura 2); se utilizó nitrógeno. grado. cromatográfico (INFRA). TABLA II COMPOSICIÓN DE LOS REFRESCOS EMPLEADOS. COMPOSICIÓN. REFRESCO Refresco 10-K sabor uva. Refresco J o y a sabor toronja. 2.1.2.2 Cromatógrafo (CLAR).. Agua, azúcar, fructosa d e jarabe d e maíz, ácido cítrico, benzoato d e sodio, sorbato d e potasio, citrato d e sodio y d e potasio, sal, sabor natural, fosfato d e sodio y color caramelo. Agua carbonatada, azúcar d e c a ñ a , ácido cítrico, saborizantes naturales y artificiales, almidón modificado, aceite vegetal bromado y benzoato d e sodio.. de. Líquidos. de. Alta. Resolución. Se utilizó un cromatógrafo d e líquidos modelo 5000 d e Varian equipado con un detector d e arreglo d e diodos modelo Polychrom 9065 (figura 3). Para el control del detector así como el manejo d e la información resultante del análisis cromatográfico se utilizó el software Star Chromatography versión 4 d e Varian instalado en una computadora HP modelo Vectra VL2..

(42) Figura 2. Sistema de Extracción en Fase Sólida..

(43) Figura 3. Cromatógrafo de Liquidos..

(44) Se empleó una columna d e fase octadecil Silano enlazada (Supelcosil LC-18 d e Supelco) c o n las siguientes características: 25 c m d e largo, 4.6 mm d e diámetro interno y tamaño d e partícula d e 5 \xm. También se utilizò una columna d e guardia d e 2 c m d e longitud (Supelguard LC-18).. El volumen d e inyección fue d e 10 \il y la velocidad d e flujo d e 1 mL/min. Los eluentes utilizados fueron desgasificados utilizando helio grado cromatogràfico, (INFRA). Todas las muestras fueron filtradas, previamente a su inyección, c o n filtros d e jeringa d e 25 mm d e diámetro y 0.45 ¿im. t a m a ñ o d e poro (Iso-disc P-254 d e. Supelco).. 2.2 Caracterización por CLAR d e los Ésteres Metílicos y d e sus Derivados Bromados 2.2.1 Introducción Para la caracterización por CLAR d e los AVB estos serán sometidos a una reacción d e transesterificación para liberar los correspondientes ésteres, es decir, los derivados bromados del oleato y linoleato d e metilo en el. caso del. a c e i t e d e maíz, y. a d e m á s el del linolenato d e metilo en el caso del a c e i t e d e soya..

(45) Por otra parte, se d e b e tomar en cuenta que sí el a c e i t e no estuviera. por. completo. bromado. también. cabría. esperar. la. formación d e uno o varios d e los siguientes compuestos: oleato, linoleato y linolenato d e metilo. Adicionalmente, también se d e b e n considerar los ésteres provenientes d e la porción saturada. del. aceite, que para los aceites estudiados son el palmitato y el estearato d e metilo. Tomando en c u e n t a lo anterior, si se pretende caracterizar los AVB por CLAR, se d e b e desarrollar un método cromatogràfico que permita la resolución d e todos los analitos indicados, incluido el. que. será. utilizado. como. estándar. interno,. es. decir,. el. dibromoheptadecanoato d e metilo (DBHM). 2.2.2 Desarrollo del M é t o d o Cromatogràfico d e Análisis por CLAR Se prepararon soluciones d e los ésteres metílicos y d e sus productos d e bromación e n el solvente A (pp. 17). En la tabla III se muestra la composición d e c a d a una d e las soluciones preparadas; c a b e señalar que las concentraciones utilizadas se seleccionaron d e forma que la altura d e todos los picos fuera semejante y asi poder observarlos todos simultáneamente al analizar una mezcla d e los analitos..

(46) Considerando que se debían resolver 10 compuestos, y que uno d e ellos da dos picos (el TBEM), se tuvieron serias dificultades en el desarrollo d e un método cromatográfico eficaz; sin embargo, finalmente se lograron resultados a c e p t a b l e s c o n dos métodos que serán llamados en este trabajo "método ¡socrático" y "método gradiente" y que a continuación se describen. TABLA (II COMPOSICIÓN DE LAS SOLUCIONES ANALIZADAS. ANALITO Oleato d e metilo Linoleato d e metilo Linolenato d e metilo Estearato d e metilo Palmitato d e metilo H e p t a d e c e n o a t o d e metilo DBEM TBEM DBHM HBEM soluble HBEM insoluble. 1). Método. CONCENTRACIÓN (mg/mL) 0.94 0.20 0.1 10.1 10.4 10.0 1.1 2.54 1.2 8.30 2.86. ¡socrático: En este método se utiliza. como. eluente acetonitrilo. La longitud d e onda d e detección óptima para los analitos ¡nsaturados es d e 195 nm y para los analitos saturados es d e 210 nm; en el caso d e los analitos bromados es d e.

(47) 205 nm. Las soluciones indicadas en la tabla III y el solvente A, fueron analizados siguiendo éste método. 2). Método gradiente: En este método se utiliza. eluente una. mezcla. como. d e los solventes acetonitrilo y a g u a .. La. composición del eluente se modifica d e acuerdo a un gradiente por etapas, mismo que se describe a continuación. En la primera e t a p a , la cual tiene una duración d e 17 minutos, se trabaja c o n un 91% d e acetonitrilo. Posteriormente se cambia la composición del eluente a 100% acetonitrilo en dos minutos y así se mantiene. el tiempo restante. de. la. corrida. cromatogràfica. Una vez terminado el análisis, para preparar d e nuevo. el sistema. para. la. siguiente. inyección,. se c a m b i a. la. composición del eluente a 91% d e acetonitrilo en 5 minutos.. Las mismas soluciones que se analizaron bajo el método ¡socrático, fueron analizadas bajo las condiciones d e este método gradiente. 2.3 Elaboración d e Curvas d e Calibración Considerando que el objetivo primordial d e este estudio es la cuantificación d e AVB, y que esta se realizará a través d e la.

(48) cuantificación. de. sus. correspondientes. ésteres. metílicos,. es. necesario contar c o n curvas d e calibración para c a d a uno d e ellos. Por lo tanto se procedió a la elaboración d e curvas d e calibración para el DBEM, TBEM, HBEM soluble y HBEM insoluble. Se preparó una solución stock en el solvente A d e los analitos d e interés; su composición se reporta en la tabla Además se preparó. una solución, en. el mismo solvente,. IV. del. estándar interno, c o n una concentración d e 12.74 mg/mL. TABLA IV COMPOSICIÓN DE LA SOLUCIÓN STOCK DE ÉSTERES METÍLICOS BROMADOS ANALITO. CONCENTRACIÓN (mg/mL). DBEM TBEM HBEM soluble HBEM insoluble. 0.824 1.13 0.16 0.15. A partir d e la solución stock se hicieron 4 diluciones para preparar las soluciones empleadas en la elaboración d e la curva d e calibración.. A c a d a solución se le agregaron 100 \il d e la. solución d e DBHM. Las composición d e las soluciones resultantes se reporta en la tabla V..

(49) Las 4 soluciones fueron analizadas por CLAR siguiendo los dos. métodos. cromatográficos. desarrollados. C a d a solución se. inyectó tres v e c e s bajo las condiciones d e c a d a. uno d e los. métodos. TABLA V COMPOSICIÓN DE LAS SOLUCIONES UTILIZADAS PARA LA ELABORACIÓN DE LAS CURVAS DE CALIBRACIÓN. SOL'N No. 1 2 3 4. DBEM. TBEM. HBEM SOL. HBEM INS.. DBHM. (mg/mL). (mg/mL). (mg/mL). (mg/mL). (mg/mL). 0.659 0.330 0.165 0.0824. 0.902 0.451 0.226 0.113. 0.12 0.062 0.031 0.016. 0.12 0.061 0.030 0.015. 0.254 0.254 0.254 0.254. 2.4 Caracterización por CLAR d e AVB 2.4.1 Transesterificación. de. los Aceites. Vegetales. y. de. sus. Derivados Bromados Para transesterificar los aceites vegetales y sus derivados bromados. se. seleccionó. el. método. de. metanólisis. ácida. desarrollado por J . Lawrence, Rajinder K. y H.B.S. Conacher 1 8 pero modificado en lo que concierne a la extracción d e los ésteres metílicos al final d e la reacción..

(50) En seguida se describen los procedimientos d e transesterificación y d e extracción utilizados 2.4.1.1 Procedimiento d e Transesterificación. La muestra a transesterificar se c o l o c ó en un matraz d e reacción d e 100 mL y se le agregó 100 ¿iL d e la solución d e DBHM (estándar interno). El solvente d e la muestra y d e la solución del estándar interno se eliminó bajo corriente d e nitrógeno. Posteriormente se agregaron 25 mL d e la solución á c i d a d e metanol y se calentó a reflujo (63°C) bajo agitación magnética constante. El reflujo se mantuvo por una hora al término d e la cual la mezcla d e reacción se enfrió y se le añadió 40 mL d e a g u a . C a b e señalar que para evaluar este procedimiento. de. transesterificación se preparó una solución d e a c e i t e d e soya en el solvente A, y fue analizada, sin transesterificar, utilizando el método ¡socrático. El resultado obtenido se comparó c o n el d e una muestra del mismo a c e i t e q u e sí se sometió a este tratamiento d e transesterificación 2.4.1.2. Procedimiento Metílicos.. de. Extracción. de. los. Esteres. Se utilizó un procedimiento d e extracción en fase sólida. El.

(51) cartucho se acondicionó c o n 3 mL d e metanol seguidos por 5 mL d e a g u a a pH 3. Después del acondicionamiento se hizo pasar la mezcla d e reacción. por el cartucho a un flujo d e 2.5 mL/min, y al finalizar. esta, se pasaron 5 mL d e a g u a . Antes d e proceder a la elución d e los analitos retenidos en el cartucho, este se secó c o n la ayuda del flujo d e nitrógeno. Los ésteres metílicos fueron eluídos c o n 10 mL d e hexano, utilizándose un flujo d e 1 mL/min. El hexano se secó c o n sulfato d e sodio anhidro y después d e filtrarlo se eliminó bajo corriente d e nitrógeno y el residuo se recuperó con 3 mL d e solvente A. Para evaluar este procedimiento d e extracción se preparó una. solución, en. el solvente A, c o n. los derivados. bromados. estándar. La composición d e esa solución se reporta en la tabla VI. Dicha solución se sometió al procedimiento d e transesterificación y al d e extracción previamente descrito, por triplicado.. En c a d a. caso se utilizó una alícuota d e 1 mL. La solución obtenida al final se analizó por CLAR utilizando el método isocrático. Para determinar los porcentajes d e recuperación d e los diferentes analitos, se aprovecharon. las curvas d e. calibración. cuya. elaboración. se.

(52) describió en la sección 2.3. Los resultados d e esta evaluación se presentan en el capítulo 3. TABLA VI C O M P O S I C I Ó N DE LA SOLUCIÓN UTILIZADA PARA LA EVALUACIÓN DEL PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN. ANALITO. CONCENTRACIÓN (mg/mL). DBEM TBEM HBEM soluble HBEM insoluble. 1.04 1.78 0.19 0.16. 2.4.2 Análisis. de. los Aceites V e g e t a l e s y d e sus Derivados. Bromados Finalmente,. una. vez. evaluados. los. procedimientos. de. transesterificación y d e extracción descritos, con los estándares, se procedió a trabajar con. los aceites vegetales y sus derivados. bromados. Uno d e los objetivos d e esta e t a p a era la caracterización d e los AVB y para ello se trabajó. c o n el a c e i t e d e maíz y c o n el d e. soya y c o n sus respectivos productos d e bromación. El a c e i t e bromado d e. Haarmann & Reimer también se sometió a. este.

(53) tratamiento d e transesterificación En c a d a caso se trabajó c o n 3 mg d e muestra y la solución obtenida, después d e la extracción d e los ésteres metílicos, fue analizada por CLAR utilizando el método ¡socrático o el método gradiente, según fuera necesario. Por otra parte, también se evaluó la composición del a c e i t e d e soya bromado ya que este fue utilizado para la evaluación del tratamiento d e muestra. Para lograr este objetivo, se sometió el a c e i t e al procedimiento d e transesterificación descrito y la solución resultante se analizó por CLAR utilizando el método ¡socrático; los analitos correspondientes fueron cuantificados. Este procedimiento se hizo por triplicado e m p l e a n d o en c a d a caso 3 mg d e muestra.. 2.5 Tratamiento d e la Muestra 2.5.1 Introducción Un punto muy importante en el desarrollo d e un método d e análisis es el tratamiento d e la muestra. En este caso, los AVB que se pretenden analizar se encuentran dispersos en un refresco por lo que es necesario contar c o n un método d e extracción d e los mismos. El método. oficial d e. análisis d e. los AVB. utiliza. una. extracción con éter etílico pero en este trabajo se propone un.

(54) procedimiento d e extracción en fase sólida. Para la evaluación d e dicho procedimiento d e extracción se preparó, en primer lugar, una muestra d e composición semejante a la. de. un. refresco. Posteriormente. se. y. con. probó. una en. cantidad. dicha. conocida. muestra. el. de. AVB.. método. de. extracción propuesto; el extracto obtenido fue transesterificado y el. producto. cuantificado. por. CLAR. para. poder. calcular. el. porcentaje d e recuperación. A continuación se describen brevemente las diferentes etapas mencionadas. 2.5.2 Preparación d e la muestra Para lograr tener una matriz lo mas semejante posible a la d e los refrescos que serían analizados c o n el método propuesto, se decidió utilizar, precisamente, un refresco que no contuviera AVB. El refresco elegido fue uno d e sabor uva d e la marca 10-K. Se decidió preparar la muestra c o n 15 ppm del AVB, que es la concentración máxima permitida para dichos compuestos en un refresco. Se seleccionó el AVB d e soya para esta. evaluación. porque es el que contiene todos los analitos bromados d e interés..

(55) No fue fácil la dispersión del a c e i t e en el refresco y los primeros intentos resultaron en porcentajes d e recuperación muy bajos. Sin embargo, resultaba a p a r e n t e que el problema era la deficiente dispersión del AVB y no el procedimiento d e extracción. Después d e evaluar diversas maneras se encontró que el procedimiento d e dispersión mas efectivo consistía en utilizar una solución al 15% del solvente A en el refresco. Primero se disolvió el a c e i t e bromado. en. el. solvente. y. luego. se. agregó. el. refresco.. Procediendo d e esa forma se evaluó también una muestra con 10% d e solvente A.. 2.5.3 Extracción del AVB del Refresco Se utilizó un procedimiento d e extracción en fase sólida. El cartucho se acondicionó c o n 3 mL d e metanol y 5 mL d e agua. Posteriormente se hicieron pasar 200 mL d e la muestra d e refresco a tratar, mezclados c o n 100. d e la solución d e DBHM, a un flujo. d e 2.5 mL/min. Después d e pasar la muestra el cartucho se lavó c o n 5 mL d e a g u a y se secó bajo el flujo d e nitrógeno. El contenido del cartucho fue eluído c o n 10 mL d e hexano (flujo d e 1 mL/min). La solución obtenida se secó c o n sulfato d e sodio y después d e filtrar se transfirió al matraz. d o n d e se efectuaría. la transesteri-.

(56) ficación. 2.5.4 Transesterificación y R e c u p e r a c i ó n d e los Ésteres Metílicos Para llevar a c a b o la transesterificación se eliminó el hexano d e la solución obtenida d e la extracción previamente descrita. El residuo se sometió al procedimiento d e transesterificación descrito en la sección 2.4.1.1 a partir del punto d ó n d e se agrega la solución á c i d a d e metanol. Al término d e la reacción d e transesterificación los. ésteres. metílicos. obtenidos. se. recuperaron. siguiendo. el. procedimiento d e extracción descrito en la sección 2.4.1.2.. 2.5.5 Análisis por CLAR Finalmente,. la. solución. obtenida. se. analizó. por. CLAR. utilizando el método ¡socrático. C a b e señalar que tanto la muestra preparada c o n 10% d e solvente c o m o la que se hizo c o n 15% fueron sometidas a todo este tratamiento d e muestra por duplicado.. 2.6 Análisis d e un Refresco El. refresco seleccionado para ser analizado fue uno d e.

(57) sabor toronja d e la marca J o y a cuya etiqueta d e composición indicaba la presencia d e a c e i t e v e g e t a l bromado. El refresco se sometió al tratamiento d e muestra descrito en la sección 2.5 agregándole un 15% del solvente A. La muestra fue analizada por triplicado. En c a d a caso el análisis por CLAR se realizó por los dos métodos desarrollados..

(58) CAPÍTULO 3 RESULTADOS Y D I S C U S I Ó N 3.1 Caracterización por CLAR d e los Ésteres Metílicos y d e sus Derivados Bromados 3.1.1 Análisis Cromatográfico por el M é t o d o Isocrático 3.1.1.1 Análisis d e los Ésteres Metílicos. En las figuras 4-8 (Apéndice A, pp. 70-74) se pueden observar los cromatogramas obtenidos al analizar los ésteres metílicos bajo las condiciones del método isocrático. Por otra parte, en las figuras 9-13 (Apéndice B, pp. 91-95) se reportan los mismos cromatogramas pero en forma tridimensional para que se puedan apreciar los diferentes picos a pesar d e tener diferentes máximos d e absorción. C a b e señalar que el pico d e tiempo d e retención (ti?) 3.2 minutos que a p a r e c e en todos los cromatogramas corresponde al solvente d e las muestras c o m o se confirmó al inyectar éste bajo las mismas.

(59) condiciones (el cromatograma correspondiente se encuentra en la figura 14, Apéndice A, pp. 75). Con este trabajo quedaron establecidos los tiempos. de. retención d e los analitos no bromados, así como sus espectros UV, información que es necesaria para el análisis d e sus derivados bromados. Observamos que el tiempo d e retención se incrementa a medida. que. disminuye. el grado. de. insaturación.. En. lo. que. concierne a la resolución d e estos componentes, los resultados obtenidos muestran que los únicos picos que se traslaparían son los correspondientes al oleato y palmitato d e metilo. No se hizo ningún intento. de. resolverlos. ya. que. dichos. analitos. no. serían. cuantificados. 3.1.1.2 Análisis d e los Ésteres Metílicos Bromados. En la literatura se reporta 24 que al llevar a c a b o la reacción d e bromación d e aceites vegetales se forman simultáneamente productos d e adición y d e deshidrobromación y por ello en este trabajo. era. interesante. determinar. el. número. de. derivados. bromados formados al bromar los ésteres metílicos. Por supuesto que esto q u e d a sujeto a que dichos derivados sean detectables.

(60) mediante el análisis cromatogràfico utilizado. En las figuras 15-18 (Apéndice. A,. pp.. 76-79). se. presentan. los. cromatogramas,. obtenidos bajo las condiciones del método ¡socrático, para c a d a producto bromado. Por otra parte, en las figuras 19-22 (Apéndice B, pp. 96-99) se reportan los mismos cromatogramas pero en forma tridimensional para que se aprecien los diferentes picos a pesar d e tener diferentes máximos d e absorción. A continuación se describen los resultados obtenidos para c a d a uno d e los productos d e bromación. 3.1.1.2.1 O l e a t o d e Metilo Bromado. Al comparar las figuras 4 y 15 (Apéndice A, pp. 70 y 76) observamos los diferentes tiempos d e retención obtenidos, en un caso para el oleato d e metilo, y en otro para su producto bromado y en la figura 23 (Apéndice C, pp. 102) se aprecia la diferencia en sus espectros UV; con ambos datos se confirma que la bromación se llevó a c a b o . Por otra parte, la ausencia d e un pico a 11.3 minutos en el cromatograma del oleato d e metilo bromado nos indica que la bromación fue completa. En lo que concierne al número d e productos obtenidos al bromar el oleato d e metilo observamos en el. cromatograma. correspondiente un pico principal d e tiempo d e retención d e 9.7.

(61) minutos; ese pico d e b e corresponder al dibromoestearato metilo que es el producto principal esperado en la. de. reacción. e f e c t u a d a . Se observa a d e m á s un pico d e muy p o c a intensidad c o n un tiempo d e retención d e 8 minutos y un espectro. UV. diferente al del pico principal c o m o se p u e d e apreciar en la figura 24 (Apéndice C, pp. 103). No se determinó a que compuesto corresponde, sin embargo, es p o c o probable que pertenezca a un derivado bromado sin dobles enlaces C-C ya que c o m o se verá mas a d e l a n t e dichos compuestos tienen espectros muy similares entre ellos. C a b e agregar que se determinó pureza d e pico en c a d a caso, y en base a los índices d e correlación encontrados (tabla VII),. se. determinó. que. cada. uno. corresponde. a. un. solo. componente. TABLA VII PUREZA DE PICO EN EL CROMATOGRAMA DEL OLEATO DE METILO BROMADO. PICO. M E J O R CORRELACIÓN. PEOR CORRELACIÓN. 8.0 min 9.7 min. 0.999492 0.999997. 0.994062 0.999985.

(62) 3.1.1.2.2 Linoleato d e Metilo Bromado. En el cromatograma correspondiente a este producto (figura 16, Apéndice A, pp. 77) observamos dos picos principales; a pesar d e que el tiempo d e retención del segundo es similar al del linoleato d e metilo (figura 5, Apéndice A, pp. 71) podemos afirmar que la bromación si se llevó a c a b o considerando las diferencias entre los respectivos espectros UV (figura 25, Apéndice C, pp. 104). Por otra parte se confirma q u e la bromación es completa al determinar la pureza del pico d e tiempo d e retención d e 7.9 minutos. También se analizó la pureza del pico d e tiempo d e retención. de. 7.5 minutos.. En ambos casos se concluye. que. corresponden a un solo componente, c o m o lo señalan los índices d e correlación reportados en la tabla VIII. TABLA VIII PUREZA DE PICO EN EL CROMATOGRAMA DEL LINOLENATO DE METILO BROMADO. PICO. M E J O R CORRELACIÓN. PEOR CORRELACIÓN. 7.5 min 7.9 min. 0.99999Ó 0.999983. 0.999975 0.999878. En lo que respecta al número d e productos obtenidos ya se.

(63) ha señalado la obtención d e dos componentes principales, los cuales. pueden. estearato. de. correponder. metilo,. como. a. dos. se. isómeros. reporta. en. del la. tetrabromo-. literatura11.. Sin. embargo no se confirmó la identidad d e dichos compuestos por algún otro método. Además d e los dos picos principales indicados, se presentan en el cromatograma una serie d e picos, d e muy baja intensidad, a 5.6, 6.0, 6.4 y derivados. 10.7 minutos que. bromados. sin. no p a r e c e n. insaturaciones. C-C. corresponder analizando. a sus. espectros UV (figura 26, Apéndice C, pp. 105). 3.1.1.2.3 Linolenato d e Metilo Bromado. C o m o ya se había mencionado en el capítulo anterior, al bromar el linolenato d e metilo se obtienen dos productos c o n diferente solubilidad en el medio d e reacción (denominados HBEM soluble y HBEM insoluble). Ambos fueron analizados por separado. Al comparar los cromatogramas del linolenato d e metilo y d e sus derivados bromados (figuras 6, 1 7 y 18, Apéndice A, pp.72,78 y 79), se observa una gran similitud entre sus respectivos tiempos d e retención. Sin embargo, al igual que en los casos anteriores, son las diferencias entre el espectro UV del material d e partida y los.

(64) espectros UV d e los derivados (figura 27, Apéndice C, pp. 106) lo q u e nos permite afirmar que sí se llevo a c a b o la reacción d e bromación. Para verificar que la bromación fue completa se determinó pureza d e pico del único pico del HBEM insoluble y del pico principal del HBEM soluble; considerando los índices d e correlación encontrados (tabla IX) se concluye que ambos picos corresponden a. un solo componente y por lo tanto que la bromación. fue. completa. TABLA IX PUREZA DE PICO EN LOS CROMATOGRAMAS DEL HBEM SOLUBLE Y DEL HBEM INSOLUBLE. PICO. M E J O R CORRELACIÓN. PEOR CORRELACIÓN. HBEM ins., 6.2 min HBEM sol., 6.4 min. 0.999993 0.9999 66. 0.999828 0.999918. C o m o p u e d e observarse en el cromatograma del HBEM insoluble, dicho producto solo consta. d e un componente.. En. cambio, en el caso del HBEM soluble se obtiene un pico principal y tres d e menor intensidad. Tanto el pico principal c o m o los picos d e tiempos d e retención d e 6.2 y 7.0 minutos presentan espectros UV.

(65) muy similares entre ellos (figura 28, Apéndice C, pp. 107) y c o n respecto a los d e los derivados bromados d e los otros ésteres; ello hace. suponer que. se trata. de. tres productos. bromados. sin. insaturaciones C-C, al igual que el HBEM insoluble. El pico d e tiempo d e retención d e 8.0 minutos presenta un espectro UV diferente. En base a lo anterior se tendrían 4 productos principales derivados d e la bromación del linolenato d e metilo. Lawrence, C h a d h a y Conacher 1 1 , solo reportan la obtención d e dos isómeros, d e diferente solubilidad, coincidiendo con éste trabajo en que el isómero más insoluble eluye primero en el sistema cromatográfico. 3.1.1.3 Análisis del Estándar Interno. En las figuras 29 y 30 (Apéndice A, pp. 80 y 81) se reportan los cromatogramas obtenidos, bajo las condiciones del método ¡socrático, para el h e p t a d e c e n o a t o d e metilo y para su derivado bromado (DBHM) respectivamente. Al comparar los tiempos d e retención d e ambos productos y sus respectivos espectros UV (figura 31, Apéndice C, pp. 108) se confirma q u e la bromación se llevó a. cabo.. Por otra. retención d e. parte la ausencia. 9.2 minutos en. el. del pico d e tiempo. cromatograma. del. de. producto.

(66) bromado indica que la bromación fue completa. En la figura 32 (Apéndice B, pp. 100) se reporta el cromatograma. del. DBHM d e. forma. tridimensional y. ahí. se. puede. comprobar que solo se obtiene un pico. Además, el análisis d e pureza d e pico del mismo nos indica que se trata d e un solo c o m p o n e n t e (mejor correlación = 0.999968, peor correlación = 0.998945). 3.1.1.4 Análisis d e Mezcla d e Analitos. En la tabla X se resumen los tiempos d e retención y los factores d e c a p a c i d a d que se obtuvieron, bajo las condiciones del método ¡socrático, para todos los analitos estudiados. C a b e hacer la aclaración que en el caso del TBEM se consideraron los dos picos principales y en el caso del HBEM soluble solo se consideró el pico principal. Por otra parte, para el cálculo del factor d e c a p a c i d a d se consideró un tiempo muerto. (to) d e 3.2 minutos; este. tiempo. corresponde al obtenido para el solvente d e la muestra y fue corroborado mediante la inyección d e una solución d e uracil, siendo este compuesto un trazador r e c o m e n d a d o en la literatura sobre el tema 25 ..

(67) TABLA X TIEMPOS DE RETENCIÓN Y FACTORES DE CAPACIDAD DE LOS ANALITOS B A J O ESTUDIO (MÉTODO ISOCRÁTICO). ANALITO. TIEMPO DE RETENCION (min). FACTOR DE CAPACIDAD^. Oleato d e metilo Linoleato d e metilo Linolenato d e metilo Palmitato d e metilo Estearato d e metilo DBEM TBEM (1° pico) TBEM (2o pico) HBEM sol. HBEM ins. DBHM. 1 1.4 8.2 6.4 11.6 17.2 9.7 7.5 7.9 6.4 6.2 8.1. 2.5 1.6 1.0 2.6 4.4 2.0 1.3 1.5 1.0 0.9 1.5. t Factor d e c a p a c i d a d = (tu - to ) / to. Del análisis d e la información presentada e n la tabla X. se. p u e d e predecir que se tendrán problemas d e resolución, por una parte, entre los picos del DBHM, del linoleato d e metilo y del TBEM, y por otra, entre los picos del linolenato d e metilo y sus derivados bromadost . Para corroborar lo anterior se inyectó una mezcla d e todos los analitos, utilizando las condiciones del método ¡socrático. El cromatograma resultante se muestra en la figura 33 (Apéndice A,. También se traslaparían los picos del oleato y del palmitato de metilo pero, c o m o ya se había señalado, dichos analitos no serán cuantificados y por eso no es necesaria su completa resolución.. f.

(68) pp. 82) confirmándose las predicciones. Como se observa, si la muestra a analizar está por completo bromada no se tendrían problemas c o n el uso d e este método cromatográfico; incluso, si la muestra contiene restos d e compuestos insaturados sin bromar, aún es posible utilizar el método ¡socrático siempre y c u a n d o se utilice c o m o longitud d e onda d e detección 220 nm y se esté dispuesto a perder sensibilidad. En efecto, a. dicha. longitud d e onda. los. compuestos insaturados disminuyen su absorción en mayor grado que los derivados bromados c o m o p u e d e comprobarse al analizar la figura 34 (Apéndice C, pp. 109); e n dicha figura se comparan los espectros UV d e. un compuesto insaturado y d e un derivado. bromado. Por otra parte en la figura 35 (Apéndice A, pp. 83) se reporta el cromatograma d e la mezcla d e analitos a una longitud d e onda d e 220 nm.. 3.1.2 Análisis Cromatográfico por el M é t o d o Gradiente Para lograr la resolución d e todos los analitos se utilizó c o m o eluente una mezcla d e a g u a y acetonitrilo. Después d e probar diversas composiciones d e fase móvil se llegó a la conclusión d e que c o n un 9% d e a g u a se lograban los mejores resultados. Es decir, se obtenían los picos d e linolenato d e metilo, HBEM soluble,.

(69) HBEM ¡nsoluble y línoleato d e metilo c o m p l e t a m e n t e resueltos y parcialmente resueltos los picos del TBEM y del DBHM. El siguiente paso fue intentar un gradiente para tratar d e mejorar la resolución d e los picos del TBEM y del DBHM, y disminuir los tiempos d e retención d e los diferentes analitos. Los mejores resultados se obtuvieron con el método descrito e n el capítulo 2 y que fue denominado "método gradiente". Aunque no se logró una completa. resolución. de. los picos. mencionados,. ésta. mejoró,. pasando d e un valor d e 0.9 a 1.2 entre el primer pico del TBEM y el pico del DBHM; el segundo pico del TBEM se obtiene c o m o pico cola del DBHM en todos los casos. En las figura 36-45 (Apéndice D, pp. 111-120) se reportan los cromatogramas obtenidos bajo las condiciones d e este método cromatográfico para c a d a uno d e los analitos estudiados y en la tabla XI se resumen los tiempos d e retención y los factores d e c a p a c i d a d d e todos ellos. El cromatograma. obtenido para la. mezcla d e analitos bajo estas condiciones cromatográficas se p u e d e apreciar en la figura 46 (Apéndice D, pp.121). En base a estos resultados se concluye que si el a c e i t e no está por completo bromado es preferible utilizar este método cromatográfico..

(70) En lo que respecta al tiempo d e análisis éste se logró acortar c o n el método desarrollado, c o m o p u e d e observarse en la figura 47. (Apéndice. cromatogramas. D, pp.122). obtenidos. En. dicha. para. el. figura DBEM. se bajo. comparan las. los. siguientes. condiciones: elución ¡socrática c o n el eluente acetonitr¡lo:agua, 91:9, y elución bajo las condiciones del método gradiente; se p u e d e observar que a d e m á s d e lograr tiempos d e análisis más cortos se logran picos más angostos lo que repercutirá en una mayor sensibilidad.. TABLA XI TIEMPOS DE RETENCIÓN Y FACTORES DE CAPACIDAD DE LOS ANALITOS B A J O ESTUDIO (MÉTODO GRADIENTE). ANALITO. TIEMPO DE RETENCION (min). FACTOR DE CAPACIDAD. Oleato d e metilo Linoleato d e metilo Linolenato d e metilo Palmitato d e metilo Estearato d e metilo DBEM TBEM (1° pico) TBEM (2o pico) HBEM sol. HBEM ins. DBHM. 26.6 19.1 12.5 26.8 31.8 24.7 19.5 20.6 15.9 15.0 20.4. 7.3 5.0 2.9 7.4 8.9 6.7 5.1 5.4 4.0 3.7 5.4.

(71) 3.2 Elaboración d e Curvas d e Calibración Para cuantificar los analitos d e interés se utilizó un método d e estándar interno y se trabajó en base a las alturas d e pico. En las figuras 48-51 (Apéndice E, pp. 129-132) se reportan las curvas d e calibración, promedio d e tres réplicas, para c a d a. uno d e los. analitos que se cuantificaron, por el método ¡socrático; por otra parte, en las figuras 52-55 (Apéndice E, pp. 132-136) se muestran las curvas correspondientes para el método gradiente. C a b e aclarar que los dos compuestos d e HBEM obtenidos se cuantificaron por separado y que en el caso del TBEM se sumaron las alturas d e los dos picos obtenidos. En c a d a figura se muestra, además, la línea d e regresión d e y en x obtenida y el cuadrado del coeficiente d e correlación resultante. Así mismo se reporta en c a d a gráfica la e c u a c i ó n d e la línea d e regresión. Como obtenidos. puede. observarse,. nos indican. cromatográfico. es. que. lineal e n. la el. los. valores. de. correlación. respuesta. de. nuestro. sistema. intervalo. de. concentraciones. e v a l u a d o para c a d a analito, mismo que se reporta en la tabla XII. En dicha tabla también se incluyen los intervalos d e concentración.

(72) esperados. para. cada. analito;. esos. valores. se. calcularon. considerando que la concentración del a c e i t e bromado en el refresco sea d e 15 ppm y tomando en cuenta la composición típica d e los aceites d e maíz y d e soya (tabla I, pp. 6). TABLA XII INTERVALO DE CONCENTRACIÓN EVALUADO Y ESPERADO PARA CADA ANALITO. ANALITO. INTERVALO DE C o n c . ESPERADO (mg/mL). INTERVALO DE C o n c . EVALUADO (mg/mL). HBEM Soluble HBEM Insoluble TBEM DBEM. 0.016 0.015 0.1 13 0.0824. - 0.12 - 0.12 - 0.902 - 0.659. 0.030.030.4 0.1 -. 0.08 0.08 0.7 0.5. En las figura 56 (Apéndice A, pp. 84) y en la figura 57 (Apéndice. D,. pp.. 123). se. muestran. cromatogramas. típicos. obtenidos en c a d a método cromatográfico. 3.3 Caracterización por CLAR d e AVB 3.3.1 Transesterificación d e Aceites V e g e t a l e s y d e sus Derivados Bromados Al comparar e n la figura 58 (Apéndice A, pp. 85) los croma-.

(73) togramas obtenidos para el a c e i t e d e soya antes y después d e ser transesterificado confirmamos que la reacción se llevó a efectivamente,. observamos. la. desaparición. de. los. cabo; picos. correspondientes al a c e i t e y la aparición d e los picos relacionados c o n sus derivados metílicos. Por otra parte, en lo que concierne a la evaluación del procedimiento. de. resultados.. la. En. extracción tabla. XIII. se se. obtuvieron reportan. el. los. siguientes. porcentaje. de. recuperación promedio d e c a d a analito así c o m o el coeficiente d e variación en porciento (% C.V.) correspondiente. Observamos que los porcentajes d e recuperación son buenos aunque podrían mejorarse y que el coeficiente d e variación se encuentra dentro del valor esperado tomando en cuenta el nivel d e concentración que se está manejando para los analitos. TABLA XIII RESULTADOS DE LA EVALUACIÓN DEL PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN POSTERIOR A LA TRANSESTERIFICACIÓN ANALITO. % DE RECUPERACIÓN. % C.V.t. DBEM TBEM HBEM Soluble HBEM Insoluble. 85.4 86.5 78 82. 3.8 13.5 18.6 7.4. t % C.V. = (Desviación Estándar x 100) / Valor Promedio.

(74) 3.3.2 Análisis. de. los Aceites. Vegetales. y. de. sus. Derivados. Bromados Al analizar los cromatogramas correspondientes a los aceites vegetales d e soya y d e maíz transesterificados (figuras 59 y 60, Apéndice A, pp. 86 y 87) se p u e d e n identificar, por sus tiempos d e retención y sus espectros UV, los componentes esperados: oleato, linoleato y linolenato d e. metilo. En realidad. no se. esperaba. detectar el linolenato d e metilo en el caso del a c e i t e d e maíz ya que su porcentaje e n el mismo suele ser muy bajo; sin embargo se p u e d e observar en el cromatograma correspondiente un pico que coincide tanto en tiempo d e retención c o m o en espectro UV c o n el del linolenato d e metilo. En lo que respecta a los componentes saturados, es decir, palmitato y estearato d e metilo, estos no fueron detectados tal vez debido a su bajo factor d e respuesta. En. el. cromatograma. transesterificado. (figura. del. aceite. 61, Apéndice. de. D, pp.. maíz. bromado. 124) se. y. pueden. identificar los picos correspondientes al TBEM y al DBEM; no se observan los picos del HBEM debido posiblemente a. la. baja. concentración del linolenato d e metilo en el a c e i t e d e. maíz.

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