EN UNA PREPARACldN COMERCIAL

..

...

Julio 20. 1995

ss.c

.466.95

/ydáFQ3

I

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LIC. JULIO DE LARA ISAggl

Coordinador de Sistemas Escolere~ P r e s e n t e

Por medio de la presmíe se heat constsf que el alumno cuyo8 datos se describen a duyd su ServÑio S d :

NOMBRE: LLAMA~ARES BERNARDO

MATRICULA:

LICENCIATURA:

PROYECTO: ificación y Caracterización de la Proieocls o Proteasas Contaminantes en Maxilact LX-5ooo

Se extiende la presente para los fines que al intererado convengan, a los veinte dias del mes de julio de mil novecientos noventa y cinco.

A T E N T A M E N T E

"CASA ABIERTA AL TIEMPO

M.

DIRECTORA

'LPC

~~~~ , - .

c W A D IZTAPALAPA

Av. Michoscin y La Purísima lztspalapa M6xico. D.F. A.P. 55-536 Fax: ₍₅₁ 612-80-83 Tels. 724-46.81 y 85

PROYECTO

DE

SERVICIO SOCIAL

DETERMINACI~N DE ACTIVIDAD PROTEOL~TICA EN UNA PREPARACldN COMERCIAL

DE

LACTASA

(MAXILACT

U-5000)

REPORTE FINAL

INTRODUCCION

Antecedentes GenQraleS:

Desde el año de 1925, se producen de manera comercid,

preparaciones enzimdticas aisladas en

forma

de

concentrados

con

la

finalidad de ser utilizados

como

aditivos en alimentos,

ya

sea

para

modificar sus caracterlsüca

o

para enriquecerlas. *

El caso de los alimentos derivados

de

la

leche no es

la exce+&M

y

a

paFtir de Enero de 1951,

la FDA

(Food

and Drug

AdrmmstreBon

Estados Unidos autoriz6

la

adicidn a la leche fluida

de

una

enzima

con

propiedades lactásicas.

.

) d e b

. .

La lactosa as un dlmero formado por D-glucosa y D-gakctoSa unidas

I 1 --

Este

artscar I

se

encuentra

en

proparciones aprecMMes en la

leche,

la

cual es su

única

fuente

de

consideración (47%)1, y

presenta

la

pewliaridad de

no

ser

hidrolkada por sacaras8 o invertasa. La

capacidad hidrolttica

de

este azúcar en el ser humano (y en

general

en

Los mamíferos) decae con los allos a parúr

del

m m t o del nacimiento.

Cabe senalar que la lactosa no es absorbida por el inteetino delgado en

su forma diménca, sino que es forzoso que se presente como

monómeros de glucosa y galactosa para poder ser absorbida por un mecanismo confirmado de transporte

activo

Es la producción misma de lactasa intestinal la

que

deoae

con

los &Mots, siendo así que en razas indoarábigas, indaamdcansb

y

a l a afroamencanas se presenta el rango mas crítico de intdsrsncia

.

iactosa

hasta 50 anos Estos rangon

no

son absolutos y dependen

de

mwhos

otros factores como la composición de la misma leche

Las razas nórdica, gala y germana presentan

tokmmms

- d a

La

intolerancia a la iactosa consiste,

en

diferentes grados,

en

no paler

niriroiii.ar la lactoss y

por

tanto, no ser absortwda en el intestino rielgaso pasanrio al intestino grueso donde la flora microbiana

ia

utiliza

como sustrato y produce una mezcla de gases y áados que generan

desde simples ruidos gástricos hasta vomito y diarrea perniciosas.

Son estas poblaciones a las que va dingida la produoción

de

preparaciones enzimáticas que hidrolizan la

lacbsa.

La adición

de

estas preparaciones hacen posible que personas normahnenta son

..

r

c ci P I r"

L

c

f

P

incapaces de consumir casi cualquier lacteo, ingieran desde leche fluida

hasta quesos, cremas, helados y dulces de leche

Por otra parte la Iactasa ofrece una ventaja técnica apreciable ya

que

la iactosa tiende a precipitarse en condiciones de bajo Aw o a bajas

Temperatiiras De esta manera e9 un verdadero problema técnica la prodiirxion estable de cajeta. helados y cremas para pastél a base de

leche de vaca o de cabra

De esta manera, han stirgido mercados crecientes a nivel mundial para

nmciiictos fabncados a partir de leche hidmlizada, tanto pasteurizada

como Oi-11 En ¡eche ei proceso de hidrolisis del disacándo se lleva a cano ii.tera riel organismo (hasta .hace iinos ai)Os), a d i c i o n d

la

en7imñ para después sobrepasar !.in periodo de incubación

a

una

ternperñttira adeciiada Fn leche lJHTi el proceso se lleva a cabo

antes

de

la

iiitrapasteiinzación con preparaciones comerciales o después

.WI~CICI~A~I-ICI yoysrñrmnes de Iactñsa esterilizadas por filtración.

1 =iq wi'tíis-w c.omerciaii?ienre qir;pnnih!eq yovienen de muy diferentes

orirjcnes raim nacterianos como n'ingicos L)e esta forma, las iactasas

r;omerciaies difieren en su rnicroorrpvsmo generador, en su pH c5ptirno

y en su temperatura de operación irreal Por io general, estas lactasas .;on obtenidas a partir de

tina

"sopa" microbiana obtenida por fractura

,.Wi _wir rip¡ microorganismo generador, 7ue contiene un gran número de

meranoiirns cie ins microorganismos Es dentro de esta mezda

memmiica q~ie se encuentran también . las llamadas "proteasas

i.:rmtaminanws", en7imas _{proteoiiiicas} a ¡as que se atribuye la

3

P- L r c

r

L P ! L

r

I-

.

r.

L

r

r

i

r

generación d.e sabores amargos

y

en casos severos, la coagulaci6n en leches huidliradas 1

Edas orevaraciones enzimaticas vanan como ya se mencionó, en su

pi

1re7a y poder enirimaticx, Aquellas lactasas comerciales más piinfrcadas (por métodos desde centníiigaci0n hasta microfiltración) son

(as 7iie poseen la mayor actwdad enzimática expmsade como tinidad& internacionales Una de las preparaciones más purificadas es

P

L

f

L

f.

d

c

.. '

I

L.

Antecedentes estxcíficos.

En

estudios sobre el desarrollo de enzimas inmobilizadas

para

la

manufactura de leches hidrolizadas, investigadores del Laboratorio de

Investigaci6n en I acteos CSIRO llevaron a rabo un estudio acerca del

nivel de cxmtaminacián proteoiittca en seis prepamones comercides3

La contarninacion por proteasas fué determinada por cuantíñcaci6n del

gmdo

#e

incremento en los grupos amino terminales en le leche

despues de la adición de lactasa e incubacion por un

periodo

determinado I os grupos amino terminales Rieron &terminados por

medio del tratamiento dei producto con fluorescina, seguido

de

una

aspecrrosnopia de fii iorescennia 1 1 os resultados mostraron una clara

reiacion inversamente proporcional entre la actividad protedftioa del

prodticto y SU precio al menudeo Esto se encuentra directsn«rte

retarionado a

la

ptirem de¡ prodticto

Fn lCrtll.I, Marschke y cok 2 desarrollaron ún método

de

m s d u W n

ineieram para d qiieso cneddar el cual involucraba

como

paso

useoc/~! 1-1 ?cicicin de Maxilact, en dcs presentaciones, una que reporta

rener iú .üuu unidades de GNPG (ortonitrofenii-p-D-lactopiranbsido) por gramo y otra con 40,Oi)O iinidades por gramo de preparación. Ellos determinaros que el tratamiento ligero de esta preparación

con

calor

inaciiva ia p-galactosidasa, pero no las proteasas contaminantes, las

wales _niostraron iin efecto mavimo

a

tin pi-i de 6 Fsto se deteminb en

fi:iIri.o riecnn crin leche nidrolizadñ tratada c m calor y sin el

trafamiento ewhihikndose un grado similar de proteolisis.

.

E

.. 5

r

Ir-

! ' k ?-- L

r-

L

r-

I L

r

L f- L

La degradaeón proteolítica

de

la caseina hasta péptidos y

aminoácidos

se lleva a

cabo

a

traves

de

la

maduración

del queso

Cheddar

y

es el

nivel

de

proteblisis el

que

por lo

general

es

utilizado como

parámetro de

maduracion ILa mayoria

de los

m6todos disenados para acelerar

la

madurez, implican necesariamente

un aumento en

Ia

proteiilisis

de

la

caseina Precisamente,,

uno

de los más

recientes metodos

de

maduracibn

de

quesns cmnsiste en

la

adicion

de

Maxilact,

la

cual se

ha

comprobado

presenta una actividad

protenlitica $ensibit).

Como

conclusion importante

se puede

afirmar que la presencia

de

estas

porteasas

contaminantes

caiisan

atgun tipo

de

aceleración

en

la

velocidad de rnafliirñcicin de Ins qtiesns sin

tener

un

efecto detrimental

ya sea en _iñ cornpnsicion d e 10s quesos o en et sabor

de

los mismos.

r

L .

'-

c

r

r

t.

P- b c c L !- i c- F I L r i

.

F ,

! L

r .

c L P Lr c

ORJETiVO GENERAL

Establecer la presencia de proteasas contaminantes en

la

preparacibn comercial de Maxilact LX-5000

i-)eterminar In actividad proteolitica de

la

preparación rmercial de

Maxilact I~ X-FiílOíl

por

i _in metodo con reptitihilidad

chwtificar ¡a actividad proteolitica de esta fracmón de la preparación

y

cornnarñrh con iina ennma prnteoiitica de tiso comercial (cuajo

miimniñnn)

Determinar 1r>s 7ar;irnetros en7imáricos de Modelo cje AntreMus, ~Tetmyeratiira Optima y perfil

de

ternperatiiras (inhibición) con

d

fin

de

r’?rírcfefi7ar 13 irñcrinn prnteniitica cfe ?.@ixilact LX-5000

( :iiin;larar io3 jleniies cfe rernperii!ira fie ¡a fraccifin proteolitica de la

METODoLOGiAS UTlLllADAS

ACTIVIDAD PROTEOLíTlCA

Para la

determinacit5n

de actividad enzimática de la

preparación

Gist-

Brocades

MAXILACT-LX5000 se

ponderaron

(ma

serie

de

posibilidades!

las

cuales

cuantidfican esencialmente

el

producto

de

la

yoroolists _tanto como péptidos

mkihies

como aminotícidos libres.

La

p m w i

caantincacibn se

hizo

por

medio de

una simple observación,

riasqda en F ~ I _metodo

descrito

por Hui15

tal

y como

sigue.

¡ il ti¡¡ d e /d ei7Ziriid diibida 1 10 Se dd¡CiGnd d Tambiem d Una

~ l u c i 6 n

rip I ?A m w n a

i n

agcia pnr tin

lapso

de 15

minutos.

Se

preparó

un

t.ianco ai ?\.!e no

se

adicionb

enzima

y otro al

que

no

se

adiGiond

raieina.

iranscurridos

10s 15 minutos. se adicionaron voiúmenes

Inii-les - - d e

!.ma

sol~icion a1 4% de TCA (&ido

tncloroacético) para

para

~a

r e w m h ~nrimatica y

separar

Ioc aminoácidos y peptidos

solubles

:!e

ia t r x c m f l i ?mteina

nn

_hidroliZm-7 por

precipitacibn.

Se filtró la

~ ~ ~ ! . t - t f . ~ car1 p:lpPi \&hatman a43

y

yw?flnrrnente se

observó

la

rcion i i t : w i i ' ! ' ' - -, de !a rniwstra 3 33:) nm.

!a

iuai

es

atribuida

a

los anlOS

presente3 en

los

aminoáciaos

arn~nñtirc's.

Las

observaciones

a

pffoff

rncrstrarcin

que

existía

!in atmento ?r, 13 cantidad de péptidos

solubles

y s e n t e s en ta _snli-ic~fin

ixprisai-ia

corno

lirosina según

la forma

mdittcada del método descrito por Hi.ilI. Erte alimento sae

encuentra

?t:t~t-trfo C%WP. kiegn, a !os

dos

b l w ~ o s .

e!

d i enzima y

el

de

sustrato.

En este momento

-.

se decidiii afinar el método

y

desarrollar las pfuebas

necesarias para cubrir los objetivos de caracterización enumerados anteriormente

Ai momento ae tratar de afinar

la

tecnica surgieron dificultatk?s en la

iectiira directa Al momento de

la

preciipitacion con TCA, todos los

tiihos de ensaye se enturbiaban por la precipitación de

las

proteínas.

Sin emt-tplrgo~ posterior a tina centnñigacihn a 5000 r~p.m. y un

whsecuente _filtrado con pepel Whatman # 43, las soluciones

precipitatias persistieron tiirbias Esto, cnmo es Iiigico, hace que la

lectiira en el rango tic? tlltravinleta no sea cnnñable dado que no rema soio ins peptidos soliihles sino _tambi6n fracciones de proteína

p w i p i t i d a aiin siispendida en la snliicinn

Para ¡a soiiicinn cle eqte prnDlema se trataron varias p o s i b i l m :

-I. Jitracentnii igaclon. S e

descano

aebido a la indisponihilidad del

equipo

+n P I mcmento y al rransiado ae rnt iesras que este implicaría.

tltir7«t> w ser13 de tinra rie vidrio s e considero como inosteabie para

ia realizaaon de una _ortieha qiie a esas alturas del estudio se

-Cambio de austrato.

Fn un principio se presumih que

el

enturbiamiento podría deberse a la naja solubilidad de

la

caseina en el m e d i acid0 presente después de la precipitación Por la anterior se hicieron pniehas de solubilidad ütilizanda 4 mismo m6tado de deteminaci6n a A280 a diferentes

concentraciones de caseina y del sustrato alternativo. Albirmina Sénca

Bovina (ASR), por la siguiente metodología.

(2sPins IC)'%

(wlv).

SP solub!!!zaron 3 ternper&m ambiente 259 de caselna Idictica de

ca!ic!ad

:ornorcia!

hasta

un

aforo

de 250

rnl

con agua destilada COR

u$r?ci!$!r: !Xnst3ntu

;'SY

0.054%

(WlV).

Se tonarm

0.329

de un rectivo de ASE (Merck G.A.

con

98.5% de

piireza) y se ilevaron a

YO0

nl

con agua dastilada, solubiikando pdatinamante con agua ligeramente fría. Cabe

señalar

que este stock de ASE3 be

debe

cwisei-gar sn isfrigei-ac;iSn debido a

la

inestabilidad

I . I C I ~ piie.s.rnta la proteína e11 miucih. Su solubiiización

es

casi

iiirriediaia aürt eft auua

-

ilia.

5~

i i e ~ w o n 82.0 g de acid<'

tnilor~aii5tiio

f-l.T.Baker, G.A. de

96.5%

C!P

pureza

con +!- 3% de himodsd) B ?O0

rnl

de

agua

de

manera

paulat!ni, evitando e! ci!entsrnicnto de !a sr?!ucibn y teniendo cuidado

!e

evitar

e! conkicto directo con el

reactivo

que es dañino

tanto

para

; X Y V S ~ S ccmc

para

pie!

y

q ~ s .

b!g fiié

recesano

el

uso

de

campana

.AL, I- vtw, J:ilL31U .t. I , ,3

q~lr

no

decoide vapcrrc

y

n3

gcnrra

proyeccibn.

CY:Ü s&ci&n 31 EO% ($ikv) se fué diluyendo cansecutivamente hasta

d t & ? e i ;os siquientas fracciones.

TCA 40% 1 O ml de Soln stock TCA y 1 O

rnl

de agua destilada TCA 20%' 5 In1 de Soln. stock ICA y 1

O

ml

de agua destilada.

TCA 10%: 5 ml de Soln stock y 20 ml de igua destilada

TCA 5%. 1 rnl de Soln

stock

y

8

rnl de agua destilada.

De

!a

so!lidtrn

ee

saselna se tomaron

2

ml

colocándclos en un tubo de

ensaye

para

p¿istvncrmer?te adicionaties 2

mililitros

de agua destilada inicialmente. Se centrifugaron a 3600

r.p.rn.

y el sobrenadante se ley6

a

280 nm.

La

operación se realizó de igual manera para las 4

concentraciones _de TCA, al igual que para la soluci6n de ASB,

por

duplica&, d3eni&xiosr

!os

siguientes resultados:

Opacidad dr: solución de caseina 10% i;: ;ri;>itaü~ a c!iferc:nt2s runccntracioncc de TCA

OpaCldad de soiuctán de

ASB

0.064%

precpiada a diferentes C o n c W i o n e r , cfe TCA

-*

P w io anterior. se determinó que la solución que menos turbidez ofrecía

posterior a ¡a ackiificación del medio era la de ASE 0.064% precipitada

con tin voiumen igual de TZA ai 5% Esto queda apoyado

por

casos

probaúos en bibliografía. En adelante, estas fueron las soluciones

iiiiiizadas para codas las determinaciones de proteólisis.

P<xierIor at cambio de sustrato, se reaiizaron otras pruebas también

a

!w~r!er+~!ra 3imbiente y siguió observandose una considerable turbidez

+ r i UI r(lew? Se inienrarnn niievamenie

¡a

centrifiigacián y ¡a filtración

WI iinn sin oatener resiiitados siiiisiacinoi-ins; por lo que se decidió

carnhiar de técnica de determinación

1 . 3 opción más viable fue ¡a mcontrada en el método del ácido ::ii !iki,!!k:riiw !Ti.iBOi citada por aradford, e¡ cual ofrece tina alta wc!sl&iimti er! io ijeiei inir!ac;iort de aniidades micromolares de grupos

L I- L T L i

f

~

r .

i

Ii-

r

L

c

f

r

DETERMINACIÓN »E CANTIDADES MI(;ROMC)~ ARES DE

PROTEíNA POR EL PRINCIPIO TIE iJNION TINTF-PROTFíNA SFGilN

HVADFORD 5

Soluciones pertinentes.

Buffer

de

perborato

de sodio 0.2M.

1 5355 _g

de

NaEO; 3fC)rsidos 3 100 rnl de sigua destilada. El pH a

9 2

se

pcrade

ajbstar

a n una sülución diluida del 5Oh de NaOH, en

baso ue ser rie(;esdilo (no

debe

aitecdr ei volcritieti final en más

{lei 2%)

SE ;c;!&i!izcin _a tcn:pzíztu;z

anbiente

24.99 g de fosfato ;;;ambSsicü de scciic; 22 53 *! d 2 agua destilada y se adicionan

0.2268g de UisulfitU da sodio para posteriormente aforarse a fOO

rnl

can agba destilada.

4 esta preyaracihr, se adiciona I mi dt?,TNBS 4mM. Se mezcla

temperatura ambiente durante 30 minutos Esta inciibaaón debe hacerse-al abngo de

la

luz.

Transcumdo este periodo se detiene la reacción de coloración por medio de la adición de 1 ml de solución de Na2SO3 en soluci6n de NaH2PO4

Se efectúan

!ecturas

a

420

nrn

contra un blanco de enzima con agua en lugar de sustrato.

Esta

técnica. según e1

autor,

permite determinar cantidades mitimolares

de prcMna susprndida en so!uci6n

con

una alta conñabilidad.

Con

lo

sual

cra

de esperarse que

los

tiempos de reaccibn

fueran

reducidos

-3 +'sticamrntr u

La

u u w a

putrbn para este

motodo

se puede realizar con

cuaklujer

min9ácido por to que se utiIiz6 Glicina Merck, grado

reactivo

a

vcncen:rac!ones desde

O

hasta 1 rnPJ preparada

como

sigue:

H &as soiuciories 3c3 les zip¡¡& la tktinica descrita por Bradford

por duplicado

i d s r~i.iei?is <Y- hiciróiisis prateica se efectuaron de la siguiente manera:

<e nl.!meraron dos series de tubos de

ensaye

(un0

de p w b a y

cvq _{ctctyic!c)! a}

!cm

qiie 5e

¡es

adicionaba ia enzima l : l O , se

tempenzaban durante

un

minuto

en

un

bafio de temperatura controlada a la temperatura de determinacion. Las temperaturas de determinación fueron, para todos

los

casos de 10,

15,

20, 25, 30, 35,40 y 45%.

Posteriormente se _adicionaba

la

_soluci6n de ASB

0.064%

y se

detenía

la

reacción ccn 1

rn!

de solución

de

TCA 5%

a

diferentes

tiempos que eran de O,

2,

4, 6 , S. I O y

12

rriinutos. Los tubos eran

ogitadGs yigorocamente por 3orteo y su contenido

era

transfgndo a

una celda de centrífuga para ser

somatido

a

3.500 r.p.m. durante 5

init7-utus. Postenorniente. -da muestra era filtrada en

pa@

Wialriiari del No. 1 de cuyo filtrado

se

tomabas

2

ml.

4 estos filtrados se ¡es apiicaoa la técnica descrita por Bradfonl.

En

un

principio. ¡os tubos presentaron un desarrollo de coloración conmcienrn I es decir. a mayor tiemoo de reacción enzima-sustrato,

mayor desarroiio de¡ coior amarillo caracterist.ico. Sin embarga,

al

momento de ¡a adición de ¡a solucion ae bisulfito de sodio, en

la

gran

rnayoria cie _¡os casos. la coloración se perdía considerablemente hasta nacer parecer que ei irianco presentaba mayor cantidad de hidrólisis

r i l ~ r ? is5 PrtleOaS

3nsieriwiieni.e. a verificar ios caicuios

en

buffers, soiuciones

y

demás

i.eaci.ivos. se ensayó con un cuajo rnici'obiano disponible en ese

momento,

el

cuai se utiiiz0 sir1 diiiiir

y

naciiatinarnente se fué variando la

wnceniración enzirnática sin ebiener ninycin resultado consistente.

cc L- F L

r

L, P L c Li L P L. P * ¿ P

.

: .. Li c ci c L i

- r

L

FI método de cuantificación reportado

por

Ansan es una vaflacibn del

método reportado

por

I owne en

el

cual se lleva a cabo tina reacción colorida con el reoctivo de Folin-Ciocalteñii

SI

pesm

3028Yg

c!e TRfS (PM de

121 14

glmol) y

se

disuehren

I:: 250

ml

CE t#ua

destilada.

_a)cist3ndo

el

pH

con

HCI

tratándo de

;;;

z k i x

c;

wlün;cn

cn más del 2% (5 ml).

3e biim 530 mg de ACB

hlerck

v

se disuelven en 40 ml de buffer Lie iYRIS-.iiSl pdld despuks ser afuradus a

50

ml con el mismo

bUilt?f.

. . . ^ ,

l'.:,H ? %

-.

La determinación de prote6íisis propiamente 55

realiza

corn9 sigue'

Se realizan las reacciones enamaticas pmendo en un tubo de ensaye 1

rnl

de solución de enzima y 1 rn! de solución de AS8

1

O?h,

anbas

en so!uci$n de TRIS-HCI O 1 M, pH 7 O

La reacci6n enzimática

se

drtene

por

medio

de la adici6n de 2 ml

de TCA 5%. Esta mezcla final se transfiere cuantitativamente a

una

cdua i se centnfuga a 3.530 r.p.iil. darante I O ;t,ii;utcs.

Se separa 7 ml del sobrenadante y sí! rxhca an bn tubo

de

ensayo

y

se

¡e

adicionan 2 nil de NaGi-i 0.JN w n

lo

que observa una

l;iari?iawh de ia soIuciCi-i pur una resoiubilizac;i6n de las í1.aciciiurit.s aicialirias iiidr oiiradas de la caseína.

se mcionan U 5mi cid rewtivo íenóiico de Foiin diluido 1:3 en

y t i a ntisriiacia Se me7r.ia For inversion y se incuba al abrigo

de

la

ltiz ~ ' . i r m t e 8 mn(ni.itrrs.

I irosina 25 pg/ml en _{Buffer de} TRIS:

Se

pesan

1.25

mg

de Tirosina Merck, grado

reactivo

y

se solubilizan con agitaci6n constante en

50

rnl

de solución de TRIS-

HUI 0.1M. pH 7.0 hasta

la

desaparician drl vdo fumado por

el

aminoacido. La

anterkr

solucibn debe manteflerse en refrigeración hasta su uso debido a ;a parcial insolubilización del aminoácido a kfipsratura ambients. Dado el peso molecular de la tirosina (181).

la

soiu~ión aiites ciescriia prupoic;iuna

un

stock

de 139 pMolar de iirosina, es decir U 139 pMollrni de solución.

-.

-

~3 wtenor soluciin fué util!zida como solución Stock de

la

cual

se

p r n ~ x i r i r ! ! I S riguimtes diluciones:

Determinacián del perfil ne temperaturas de la proteasa presente en Maxiiact u(-5000.

Ye prepar6 tina

sene

le

A tiibm, 4 de pnieba y 4 duplicados ehqiJetados cclwo !=Oh t=l h, i=2h y t=3h En dtcba sene de tubos

se cnloct~ 1

ml

de solución de

Maxilact u(-5000 1'2

en

buffer de

TRIS-HCI O Im, pH 7

Lss ouno

_tubcs

keron atemperados durante 5 minutos

en un

ban0

de

tcrnperatura

controlada, EijtiStadO ;I

la

temperatura de prueba

q ~ í e se determinara en ese

mornsnto;

las

temperaturas que se

piübarun para detorminar

el

perfil

ftiarm

de

2C,

25,

30,

35,

30, 45 y

5 0 T

u114

9e.i atempet'ados ius tciUu&. se ¡es adlckmó 1 till de ASB 1%.

Este

rrion!eriio

se wrisideió wrw iieiripo wiu. Fara

10s

tubos

rnarcadns como i=Gh. se adicionó

en

ese mismo momento 2 ml de

i <.:A 5% Estos tubos eran tomados como Dlancos de calibración.

-- .-

('crfcnn? se ctimplían iaa 1 , 2 o 3 horas de reaccibn, sin agitaci6n,

CP ~d!c!w?hm 3 !CIS demas tubos los 2 ml de TCA 5%, parando

la

rnxcien ol?Z!mt!C3.

Faralslo

a

la

detsrminaci3n c m

Pdaxilact,

se raalizb una determinación & aciividad proteolltica. i;ün un ctia,ju micrabiano comercial,

reaiizAndoss con

lac

mismas

cmciieimes

qua la anterior, solo que se

-iiilILj ull0 uilLb,ufi kij ;-igrir Us ,!.L c.umo para

al

caso de la

;u&;;.

L : l : - ' .,.- J'l ,,.y.: rl * o

,

&.. P - L e- L F

L

P Li P L f-

i

7

' L

..

r~.:

L

!- I L

r

L

c

- r

E Li

r

i b

AI final se obtuvieron 32 series de 8 tubos cada tina, a las cuales se les

aplicó un tratamiento estadistico de regresihn lineal para determinar la

correlation de los datos y de esa manera, estimar las velocidades iniciñlcts tmto de la enzima cnmo del ci~ajn microbiono

( h n i ~ intñmente a la determinacinn de proteólisis, se hizo la rleterminacinn de aciiviciad ennmPitica

para

la lactasa en sí presente en Mmcilacf I X-F;OT)O esto con el fin de cnmperar los perfiles de actividad

de 8rnn.w en7imas

20

i

I

CiNPG O

O68M.

I

I

i

Se pesan 20.5 mg de ONPG por cada mililitro de buffer a ser uúlizado Esta solución debe prepararse dianamente y permanecer

ul

abrigo de la luz y

a

baja temperatura. I

Se prepara una coiticibn CtGCk de ONP (o-nitrofenol, PM 138) 1.5

tnM de la siguiente forma:

3& pesctri íU.5 irig _de GNP y

se

llevar¡ a

50

in1

<;on Buffer de

iosíaios. i3e esta soiucibri se prepara una serie de ¡a siguiente

manera.

Se hicieron -un total de 10 experimentos por duplicado barriendo las

temperaturas de 20,

25:

30, 33 y 40°C ¡La extrapniación a

la

curva patrón fué realizda automáticamente dentro cid modo de 'Factor" dentro

del mismo modo de Kinetic del especrrofotametro Con las anteriores determinñcinnes se ingro idenrificar por e¡ modelo de Arrehnius, ¡a

remperatiira optima fie 10s dos griipos en estiidio> lacrasa y proteasas

presenles

Finñimenre para determinor la iahiliriad termico de las en~imas (tanto

y n r e s s i s presentes como iactñsa) se hizo la determinación de muerte

4NÁL1SlS

i3E

HESUL7ADOS

-_

Curra Patrdn

de

Tirosina

La curva

patr6n

de

trosina

para

el

método de

Anson

fue

obtenida de

la

,manera iguiente.

FMfirosina= * Q d 1 u I

(.:cm

recomendada p@r

el

autor ?ara

la

CUNa patr6n: O a 15 pg/ml

L.3 anterior implica

la

conversibn de pg!rnl a

mollrnl,

esto,

para

lognr

cbtener Ce

rnclnera

directa, 13s 'Jnidades internacionales

c'e

Prateasa

;fc:finiYus

carno:

UP.

i s

tiiia nicícmcl

de

tirxina prdticida per medio de

una

reaccidn

r;rútsul;:ica sn un

mililitro

de pradxio, 3iirants tin mintiio de

reacción.

r

L

3

r-

t

r

r

i

L

CURVA

PATRON

DE

TTWSNA

L3s

anteriores

:claciones arrojan las

siguientes

aproximaciones

liisaks.

Poi io ciritetior se esiaúie<;ió que la w v a a ser utilizada para

la

inteerpoiación de dato de protedisic seria la de prueba, debido ai mejor mxficiente de correiacion

c-

f-

' f

f

: c

Ddenninacitmes

de

PraQaóWsh

Las

determinaciones de actividad proteolltica

se

desamffarun paralelamente

para

Maxiiact

U-5000

y para cuajo microbiano de

calidad comercial. Las deteminaciones se encuentran

reportadas

en

orden de las temperaturas ensayadas.

A cada una de las pruebas se les realizó un análisis de regresibn lineal

de manera qua pudiera asegurarse que se encontraba denim dei rango

de veloadades iniciales.

el

cual

comprende el lapso entre

el

arranque

de la r+tcc;i<jn eitzimáiica y la cúspide de saturación o inhibici6n

eririri~áiica

-_

Mota. Las velocidades iniaales de cada uno de los expenmento8 fueron

obtenidas mtiítipiicando la pendiente de cada uno de los

expmm«rtas

f i r

Y

(ytip resuita de diwiv 10s O 5 ml de enzima onginal en los 4 ml

de

miucm tin3t

~t-tomtns

de

svmar

1

ml

de

mama 12 + 1

rnl

be

AS8 +

2

T!

l o T . 5 . 5951,

para

el

casc de

!Maxlact

Lx-5000;

y

multiplicando

por

54

(;'.?o

ros!=!t3 cis d w d r !os 9 125

rnl

de enuma origina en los 4

rnl

de

s3iuvi&-1

3riai oStenidos

de

sumar

1

rnl

de

enzima

1:8 +

1

ml

de AS8 +

2

rnl

de

?VA 5%)

para

e! caso

del cuajo microbiano.

Por

lo

ankrior debe entenderse que

las

velocidades

iniciales

que

se

rciímtan ñci sfier-a~ a ~ m o i da i3ruUbitulml

de

enzima original.

..

20%

-.

Tiempo

de

Ililaxihct

u(5ooo

CUa@

Reacción

(min)

Prueba

Duplicado

Prweba Duplicado

60 0.ÜUJ

o.

05G4 0.01

2

0.01 1

120 0.007 0.004 0.(32Y 0.025

1

so

0.014

_0.010

_0.034

_0.033

Resultados

c

k

rcgrrsicln: ;n= 7.G666~10-5 1.c3833x104

b=

-0.0094

b=

0.0087

con=

0.9507

con=

0.9816

Resultados

in=

2.4333xIO-S

m= ₁ "0'3 4 r - A

d e iegresibn: uu3 xiu '

b=

00006

b=

0.0016

MaxUiad

M a w

Cuajo

-.

30°C

Tiempo

de

Reacción (min) Prueba Duplicado Prueba Duplicado

60

o

u29

o

@¿ti 0.033

0.033

1

x!

9 0% O. 049 0.076

0.068

150 0 073

o

06% _0.098

0.989

Resultados

de _:cgrcsMn: m=

3.9333~104

m=

5.5166X104

b=

0.0016

b=

0.0016

torr=

0.9955

an= 0.9912

36°C

i iernpo ae iviaxiiact U-5üücí

Cuap

2eaccion {mtn) Prueba Diipircado Pruebe Duplica&

o

_U O

40°C

Tiempo de ltlaxllact

!%-5ooo

Cual0

2eacciÓn (min) Prueba Gupltcaáo Pnieoa

Ouplrcado

o

o

o

o

o

c;u

u

₍₂₂₉ (J 027

o

o41 O 039

12u 9.055 0.057 0 087 0.081

1 is0 0 O16

o

0% 0.112 0 ir36

Resultados

m=

6.3666xIu4

.Y. -

Uc

regrosibn.

$ 1 1 - 4.2333XIW

b=

0.0019

b=

0.0027

CUG

0.9974

con=

0.9933

Con los resultados antenores agrupados de Vo contra Temperatura, se

detminci el siguiente perf¡¡ de cornportemtento

Temperatura

0 y

I_

20

6.1333

x 104

1.2693

x

10-2

J V 31 W X 10-4 3

5306

x 19-2

.i5

47

333 x < U d 3 5200 x 1U-2

40 33 1 75 i(104 4 0746 x 10-2

45 19 466 x ?Q-2 1.8026 x 10-2

25

_{_ .} 13.456 x

10-4

1.5573

x 10-2

!

i

c-

t-

L

t'

[:

c

c

c

c

c

c

c

i:

c

_ I

c

c:

.

COFAPORTAAASENTO

TERlvltCO

DE

CUAJO

Maxilact

Lx-5000

T("

Kelvin)

-- 1/T Vo

mol/ml.min]

In

Vo

293

0.00341

29 6.1333

x1W

-7.3%60

298

0

0033557

13 4664 x !O-4

-6.61014

303 G

ou33Gu3

31.4664 x 10-4 -5.76 142

io8 U

iiG32467

47 332% x ,104

-5

35314

0 01)31948 3.3 0746 x 10-4 -5 71 157

.4 I .4

318 (?.m31446 19.4W4

x

I(U-4 -6.241 65

I

I /'

- - A -

-7 5

O.GO34129 0.003355i' _G.0033UGS 0.0032467 0.0031948 0.0031446

i / T

Cuajo Micmbiano

T(” Kelvin)

-

1/T

Vo ~ol/mi~min]

In

Va

293 _0.00341

29

1.2693

x

10-2

-4.36670

298

O

0033557

1

5573

x 10-2 -4 16221

303

O 0033003 3

5306

x 10-2 -3 34370

3i18 0 _0632467 3

5200

x 10-2 -3 34671 4 1 3 ( J fi(i3l 4 0740 x _IcJ-2 -3 20039 3’5

o

o031446 ₁

9026

x

_10-2 4.01594

I / I

..

. ,

..~.. _{. .} .

I

.

e -

!

G I

iP

d

! I

'

c- L i I

F

f

c

f

c

.c

-

c:

c

c

c

c,

f

-

C'

.

c

.-

f

r

L

Para o b t e m la temperatura optima de manera ñnaiítica, debernos

realtzar

dos

análisis de regresihn

de

manera qiie ¡os datos g'dcicados

%e adectten ai modelo cte Arehflws de la siguiente rnmerfí'

I e pnrnerFi recta denera mrnersco desde coi pnrner punto más hap de

"wric~i3c1 iogmrrnico (+.I 0031446, -7

.3%60)

, haste el y n t o mas

alto

!

oo.32467 -5.35314) _I 3 C;qmio rectR Cre'oer6 tomarse desde! el punto

mas wrh

!

(3i1.T246i -5 .35.314), y nasta ia veioadad logeritm~ca m&s

n a y nhtenida cicospiies del pcinta maximo (0 0034446, -6 24165)

I I

33

(Jna vez determinada

la

tempttrahira ciptima

para

ia proteasa

conaminante, se procedro a fleteminar el perfit

do

temperaturas

para la

I actasa por el método det CJWG

I 9 c;iicvo patron c1c3 <JNF se preporo iitiii7ando et meiodo desmto en la

rracrton de rnetocKit<xJias I os resciitarios finam fueron.

Cnnsentración le ONP .A.bsnr!?ancia 410 nm

[

;

m

9 m

I1

U.30 _0.000

0.15

0.129

::

3

0.268

0.45

0.408

V.0ü

0.551

u

75 0.686

fi 90 0.824

1 lj5

o

975

1 Pi) 1.102

I .3!j 1235

I.&?!! 1.369

AbsorhAmia a 410 nm

0 0.15 0.3 0.45 0.6 0.75 0.9 1.05 1.2 1.25 1.5

-.

20°C

Tiempo de h4axilaC.t M-5üOO

Reacci6n Absorbancia 41 Onrn Actividad

'f?3

Min [pmoliml]

O !U

2.0 2.5

3.0

3.5 2.3

o

o

0.354 0 ₃₈₈₉₈

o

410

0.48217

O.

52 1 0.57052

0.600 0.5504 1 0.677 0.7401 1

3.752

0.82164

Itn. in- 3.3671 x íG-3

b=

4.6669

x 10-2

30°C

-.

Tiempo

de

hbxiiact U 5 0 0 0

Reacción Absorbancia 41 Onrn Acbvidad

%!

Mio

[pnolirni]

!! (I O

o

O^ ₁₅

O 484

!Y

53030

120

2 0

o

620

0.67815

150

2.5

o

743

0.81

186

180

3.0

0.871

0.95101

-

3.5 3.381

1.07059

249

4.0

1

.G32

1 .I 31 26

- l r n

40°C

Tiempo

de

Maxilad u(-5OOO

Heacctón Absorbancia 410nm Actividad

i;eg Min ~rnolimll

0

90

120

7

50 1 _u0 21 3 2 43

(I r!

1 5

0.318

2.0

0.375

2.5

O. 450

3.0

0.580

-

3.5

3.639

4.0

0.691

!J

0.34984

0.41

181 0.49334

0.63466

0.69880

3.75533

0 04872 O 05307

O 06502 O. 06937

O. 07481 0.08024

Con los antenores resultados agntpados de Vo contra Temperatura, se determinti el Siguente perfil de compor?arn!ento.

Temperatura

"C

Lactasa

'Jo

[wollrnl

min]

G.12175 x _{10 -1}

8.41972 x 13 -1

A _962'29 x _{I O -1}

9.39250

x 10 -1

5.78021 x ₁₀ -1 5.87465 x 10 -2

F t . L J

L

F

f

c

c

i

F'

L

f

' C

' f

c

c

c

t

c

I.a primera recta .. debera tomarse desde el pnmer punto

m8s

bap de

velocidad iOgan'hnic0 (O 0031446, -0 490737) , hasta el plinto más alto ( íH132467, -0 09535). La segiinda recta dekrF1 tomarse desde el pinto

w i s alto ( 0032467,

-0

C)i)fiM!,

y

hñstñ la velocidad ¡oaritmica mhs haja

onrenida despii& del prtnto maximn

(O

CxX34446,

-2

8,74523).

c.

Como pntebe

final

se reaiizamn ensayos para

la

determin&n de

rnwrte

ttrmice parer las dos m&nas o gnipos de enzimas presentes en

Waxilact LX-,5QOo Para esto y sit-pmin e¡ procedimiento ya descrito y con tats ti?c,,nicas montados antenorrnente, se dererminamn los siguientes períites de actvidad:

Pmteasa

35%

_-

I 'I l b & . '"'O

I in-

Prueba Dciniicado Prueba Dupitcado

Lactasa

30

'C

t

incub.

Vo

Actividad relativa

a

Tdpema

PNeba Duuiicado Pruebe Duoircado

6

min

U

916348

0 316718

O9918

O9922

2 mio ü Y 0 4 W U914039

u

9/85

O

9893 4 mio (i

d

78t~57 O 691

81

7 O Y512 ú

$4495

35°C

-

t

irirut2 '10 Actividad

relativa a

Tbptimv

- prU&d Uucriii;aúo Prueb DuuiicajO

O

m n

ü 9296 i 2

o

330984

O

9891

O 3912

~ 9 0 2 ~ ~ - 5 a 09614

0.9587

4

m'n

ü ?YJ/c3.> r7 6644 IU U

9127

O

9200

2 rnin

? - - - - ?

-. 21 d J d Guoiicah Prueba

8.9715 0.9589 . . , .. .

.

, . .

4.: Y i .L4G I 0.900ij59

?Y' 9' 1 ~ 2 f ~ u ' ~ ?e Ict!vidad enz!r?!ara

rnrreiponde

a

una

Vo

de

Y

30250 x 10 -1 pvol/rnl Tin ex.presad3 en téminos de ONP y que

se

vkUec:r

a

la temperatura

de 25 OOOC.

PERFIL

DE

ACTIVIDAD

%

POR

TEMpmATwU

pmmasa

4 0

?O

o -

9í de actividad 120

..

- -

I 1

... 100

... ...

I

O ' I

Tiempo

de

1ric;ubacion

O O 120 100 240 240

lnvbldo a 30 r, + incubado a 36 C

-*

incubado a 4 0 c

c-

C'

c

c

c

c

t

c

c

c.

c

OBJETIVOS,Y METAS ALCANZADAS

Se

caracterizó

la

fracción pmtc?otitica

de

Maxtlact LX-5000 y se lograron determinar los ywhnetros rtcll Temperatura ciptima. Modelo de

4rrennitis Períil de innihicion por temperaturas y se montaron las

temicas y e permiten la repetitibrridad de est- detennrntlciones

DISCUSONES Y CONCLiISiONES

ne los anterjores resultados podemos discutir, en cuanto a la

sensibilided de las técnicas, qtie ranto la tecflica de proteasa de Anson

corno

la

tecnba de rkterkacihn de UNP son muy efectivos para este

tipo rie determinaciones y con esie tipo de siistmtos

I +I prep&acion e!mimatia de Maxilact I-X-5tMO presento une actividad

nroteniitico cwwhif! flentro de ctn rongo ampto de tiemps de mmtbn

incli isive ¡lega a tener niveles

c~e

proreoiisis (kitiiizancto una diliici6n 1'2) wniiRre$ a ins del ciiap de referencia en diitict n 1 8 Fsto es un nfvel ynificativo dt= actividad romando en c~ienta y e el cuajo microhano es

I _{i n i} proreasa mas purificarta y aislada especialmente

para

la

proteddtsis,

7 niferencia de ia proreasa

en

estimo que se considera une

enzima

I+ evidente que existe ia capacidad tie yr>rliicción de fracciones libres

c1e proreina ow como de arntnnacicios que son rnediblna bajo los

recnicas anrerionenie d~scnras rarnime4 descnk d fendmeno del iniremento en lo velocidad de fementacion del Yoghiirt A partir de iewe ni<trniizoda, In cirai piiedc! ester fuwiemente rcolacionado con iñ

presencia de maynr ni imem de R a

y

phptidos solcibles qi ie

en

la

lec.he

no

nrdrnli7;rda

mayor a la de

-_

la proteasa rantarninanre I o antenor se observa de las

gbficfjs de mu«te t(rnntca obtenidas rmrno determinaciones findes

chmo conck isiones generales se

piitxien

eniimerar ias siguientes

1 I as preparman enzirnetica fie Mexitact CX-5000 presenta iina

wmibk? actividad proteoiitica sobre ASR, la ciiat r e ve catatizada pnncipahnente por periodos proinngadoi rte reacción

7 Fsta actividad proteoiitica es cornparabtc? hasta

en

un 25%

a

aqijelh presentada por tin ciiajo microhiñoo de tiso m e m i a l para

la

prod11ccion de ql1”Sos

L

r

t

f

.

I:

>

r

L

enzim&titica yse ensaye solo con proteasa presente, lo

cual

aisia una de

18s varieWes de estudio

i .:orno complemento del presente trabqo, pueden reakarse

fermentociones lacticas

en

presencia de ambas fracciones y en

aiisenciñ de

la

frwcion Iactoiitica, lo ciial confirmaría o descartaría la

nr

-1 inrim hecha en

lo

introdiicmjn del dociimento

,

c

c-

c

c

c

c

c

: c

-r

c

E:

c

.

i

?

c

' C

I GARCíAaARI€3AY, M (1 992) Recumramon de enzimas

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' . ,

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.

c.

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