Unidad: lztapalapa Trimestre: 00-0 Título del Proyecto: Manipulación

(1)

Manipulación y efecto de la R-l,3-glucanasa en la

formación de megaesporas de tabaco, maíz y trigo.

Francisco Zárate Pérez

(2)

Nombre: Francisco Zárate Pérez

Matrícula: 88239932 Teléfono: 5 7428016

Licenciatura: Biología Experimental División: Ciencias Biológicas y de la Salud Unidad: lztapalapa

Trimestre: 00-0

Título del Proyecto: Manipulación y efecto de la B-l,3-glucanasa en la reproducción de maíz y en la apomixis diploespórica.

Título del Servicio Social: Manipulación y efecto de la B-?,3-glucanasa en la formación de megaesporas de tabaco, maíz y trigo.

Nombre del Asesor Interno:

Nombre del Asesor Externo:

Dra. Laura Pérez Flores

Dr. José Antonio Serratos Hernández

Lugar de Realización: Centro Internacional de Mejoramiento de

Maíz

y

Trigo (CIMMYT). Texcoco, México

(3)

C I M M Y T

INTERNATIONAL MAIZE AND WHEAT IMPROVEMENT CENTER

CENTRO INTERNAClONAr DE MEJORAMIENTO DE M A f Z Y TRIGO

Sustainable Maize and Wheat Systems for the Poor

Dr.

Jos6 Luis Arredondo Figueroa

Director de la Divisi6n de

Ciencias Biológicas y de l a Salud (Jniversidnd Autbnoma Mctropolitana Ullidad lztapalapa

El Batrin, Texcoco, México a 8 d e Noviembre del 2000

L a presente tiene por objetivo manifestar que el alumno cuyos datos aparecen abajo, cclnclnycí

satisfactoriamente el trabajo de Servicio Social que le fue encomendado. Quiero enfatizar clue el

a l u m n o Zirate Pdrez realizó una magnifica labor en nuestra institución y S U desempeiio fuc, en

general, sobresaliente en cada una de las actividades que se le asignaron.

Nombre: Francisco Zirnte PCrcz Mátricula: 88239932

Licenciatura: Biología Experimental

Título: Manipulación y efecto de la b-1,3-glucanasa en la formación de rnegaesporas de maíz y trigo

Inicio: 2 de febrero del 2000

Terminación: 2 de Septiembre del 2000 Datos de los Asesores

Dr. José Antonio Serratos Hernindez Científico Adjunto, INIFAP

Centro de Biotecnología Aplicada, CIMMYT

Dra. Laura J. Perez Flores

(4)

1. Nombre y Adscripción del Asesor: Dr.

José

Antonio Serratos Hernández Científico Adjunto, INIFAP

Centro de Biotecnología Aplicada

2. La naturaleza del proyecto del que procede el servicio social es: a) proyecto de servicio social asociado a la investigación que se realiza en la

3 áreas departamentales

Interno X Externo

Por convenio

3. Nombre del Proyecto del que deriva el servicio social e institución u

Manipulación y efecto de la &",3-glucanasa en la reproducción de maíz y en la

Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo INIFAP

CONACYT

organismo que

lo

avala:

apomixis diploespórica.

4. Desglosar las actividades que desarrolló el asesor para favorecer e l

cumplimiento de los objetivos planteados en el proyecto inicial de servicio social.

A lo largo del periódo de desarrollo del serivicio social se hizo un seguimiento continuo del trabajo de laboratorio que desarrolló el Sr. Zárate, así como de una asesoria de

los

diferentes aspectos técnicos y teóricos necesarios para llevar a cabo el los objetivos planteados en el presente trabajo de servicio social.

5. Como evalua el desempeño del alumno prestador de servicio social?

Considera que la formación que el alumno recibe en la UAMI es adecuada y suficiente para su desempeño profesional y porque?

(5)

6. Anote las fortalezas y debilidades detectadas por usted copn respecto a

En

términos generales el Sr. Zárate tiene una buena preparación académica en

la formación del estudiante.

el área de ciencias biológicas y en particular sobre biología y genética molecular, aunque desde mi punto de vista deberá trabajar más intensamente para desarrollar su capácidad analítica.

(6)

Casa abierta al tiempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA

METROPOLITANA

DI-. (;cI-:lrdo S;~ucetlo C;lstaíícda

Director de la Divisith de Ciencias Biológicas y de la Salud

I lnivcrsidad Aut6noma Metropolitana IJnidrrd Iztapalapa

Por medio de la presente me permito manifestarle que el Sr. Francisco Zirate Pérez concluyó satisfactoriamente su Servicio Social. Debo sefialar que el Sr. Zárate realizó de

mmcra sobresalicntc SLI labor cn todas las actividades que llevó a cabo clurantc la

rcalización del proyecto.

Quicro aíiadir que debido a que el Dr. J.A. Serratos tuvo actividades fuera dc Mexico, no file posible presentar en el tiempo señalado el reporte correspondiente al trabajo de servicio social.

Sin m i s por el momento, reciba u n cordial saludo

Dra. Ladra ?J. Pérek’FIores

Datos del Alumno:

Nombre: Francisco Zárate Pérez Matrícula: 88239932

Licenciatura: Biología Expcrirnental

Datos del Trabajo:

Título: Manipulación y efecto de la B-1,3-glucanasa en la

Inicio: 2 de febredo del 2000

Terminación: 2 de septiembre del 2000 form;rcih de lnegaesporss de malz y trigo

Datos de los Asesores:

Dr. José Antonio Serratos Hernández

Científico Adjunto, INIFAP

Centro de Biotecnología Aplicada, ClMMYT Dra. Laura J. Perez Flores

(7)

1. Nombre y :Idscripcii,n del asesor:

Dra. Laura .I. Pdrez Flores

Profesor Titular C. tiempo completo Departamento de Ciencias de l a Salud

Divisi6n de Ciencias Biológicas y de l a Salud

I IAbl? Iztapnlapa

2. I,;I natur:llcza del proyecto del que procede cl servicio social es:

Ill terno Externo

P o r convenio X

3 . L;I naturaleza del proyecto dcl que deriva el Servicio Social e Institucibn u organismo que 10 avilla:

h4anipulaci6n y efecto de la B-1,3-glucanasa en l a reproducción de maíz y en l a apomixis diploesp6rica.

Ccntro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT)

J. 1)esglosar las actividades que dcsarrolli, el asesor para favorcccr el cumplimiento tie

los ohjetivos plilnte:ldos en el proyecto inicial de servicio social.

So hizo u n seguimiento del trabajo realizado por el Sr. Zárate a través de reportes de los

;lvances de desarrollo del proyecto, así como l a exposicitjn de un seminario en la

UAM,

Iztapalapa con avances del proyecto.

5. i,Como evalúa el desempeño del alumno prestador de servicio social? ;Considera que l a formacibn que el alumno recibe en la UAMI es adecuada y suficiente para s u desempeño profesional y porque?

El trabajo realizado por el Sr. Zjrate durante l a realización de este trak medida l a formación que tuvo durante sus estudios de licenciatura;

considero que su preparacibn es buena y apropiada para llevar a cabo propias de esta área de investigación.

ajo, refleja en gran

(8)

Considero que el Sr. Zrirate tiene una buena preparación académica así como una adecuada

cspcricncia cn cl laboratorio, adquirida durante sus estudios de licenciatura, esto le permite afrontar diversos problemas que se presentan en cualquier proyecto de investigación de esta naturaleza. Por otro lado, considero que el Sr. Zárate deberá poner mris atención en cucstiones como l a disciplina en el manejo de información durante el proceso de desarrollo

dc u n proyecto de investigación

(9)

I

Francisco Zárate Pérez Matrícula:88239932 Biología Experimental

MANIPULACION Y EFECTO DE LA I3-1,3-GLUCANASA EN LA FORMACION

DE MEGAESPORAS DE MAlZ Y TRIGO

Clave de registro: BE.002.00 10 de octubre de 20000

Asesores:

Dr. José Antonio Serratos Hernández Científico Adjunto, INIFAP

Centro de Biotecnología Aplicada, CIMMYT

Dra. Laura Pérez Flores

Departamento de Ciencias de la Salud División de Ciencias Biológicas y de la Salud UAM, lztapalapa

(10)

i

Manipulación y efecto de la R-l,3-glucanasa en la formación de megaesporas de maíz y trigo.

Introducción.

La apomixis se define como la reproducción asexual de plantas a través de la semilla, en otras

palabras, las plantas apomícticas producen descendientes que son copias exactas del genotipo

materno. La reproducción apomíctica se presenta en varias especies de gramíneas entre los

cuales se encuentra Tripsacurn dactyloides, un pariente silvestre del maíz. La apoesporia es el

tipo más común de apomixis, se caracteriza por la aborción de la meiosis o de los productos de la meiosis y su reemplazo por una o varias células nucelares sin reducción. El otro tipo de apomixis se le conoce como diploesporia y es el que se presenta en Tripsacurn dactyloides. La

diploesporia tiene como característica fundamental la formación del saco embrionario a partir de

la célula madre megaespora, el cual puede desarrollar un gametofito sin pasar por el proceso de

la meiosis. En ambos tipos de apomixis el embrión se desarrolla a partir del huevo sin fertilizar,

mientras que el endosperm0 se desarrolla de la fertilización de los núcleos polares. La apomixis, en general, no es obligatoria sino facultativa. Los organismos con apomixis obligada producen

..* 1 progenies que son completamente maternas, mientras que los apomícticos facultativos

producen dos tipos de plantas: la mayoría de tipo materno y unos cuantos fuera de norma o

’.

atípicos que son el resultado de la fertilización de una célula huevo sin reducción (2n+n y10

n+O), o bien, un producto sexual convencional (n+n).

La reproducción apomíctica es una característica que de ser posible su transferencia al maíz, en el contexto de la producción de este cereal, representaría un potencial muy alto de beneficio

para los productores y en general para la economía del sector agrícola. Este tipo de

reproducción eliminaría la necesidad de adquirir semilla mejorada cada año y además permitiría

simplificar las estratégias de mejoramiento, reducir los costos de la producción de híbridos de maíz y permitir el mejoramiento en nichos particulares. En este sentido, la apomixis podría

(11)

U.

A.

M. IZfAPAlAPA

BIBLIOTECA

acceder a algunos otros atributos como resistencia a insectos, patógenos y sequía (Savidan y Berthaud, 1994).

Función de la B-1,3-glucanasa: La pared de callosa y la callasa.

La apomixis difiere de la reproducción sexual en dos aspectos fundamentales, uno es la falla o

disrupción de la meiosis y el segundo es el desarrollo partenogenético del embrión. Además de

. estos dos aspectos característicos de la apomixis, éSta se ha asociado con la ausencia de la

formación de callosa alrededor de los meiocitos femeninos en algunas especies appmícticas diploespóricas (Peel, 1993).

Con relación a lo anterior, Leblanc y Savidan (1994) estudiaron los tiempos cruciales del desarrollo megaesporogénico, por medio de métodos citoembriológicos, en el Tripsacum

apomíctico y el sexual. Se observó que la diferenciación de células nucelares hipodérmicas a

megaesporocitos en tripsacum sexual y apomíctico ocurre en los estadios pistilares que se determinan por la longitud del ovario (en los ovarios menores a 0.5 mm). Se nota una diferencia

entre ambos tipos de desarrollo cuando los ovarios miden de 0.5 a 1.0 mm. La mayoría de los

megaesporocitos determinados sexualmente tuvieron paredes de callosa, mientras que los

megaesporocitos diploespóricos se caracterizaron por la ausencia de ésta. El crecimiento del

megaesporocito se llevó más tiempo en las plantas diploespóricas (el tamaño de los ovarios varió de 1 mm a 2 mm) que en las sexuales. Empero, el engrosamiento del megaesporocito

diploespórico tomó menos tiempo que la meiosis (el tamaño ovárico variaba de 0.75 mm a 2.25

..+ mm). De hecho, la primera división mitótica en megaesporas funcionales ocurrió más temprano

en óvulos diploespóricos que en los óvulos sexuales. ' "

La diploesporia se asocia con la ausencia de la pared de callosa alrededor de los meiocitos.

Esto se observó por primera vez en Elymus rectisetus (Crane y Carman, 1987), después en

Tripsacum (Leblanc et al., 1995) y posteriormente en otras especies diploespóricas (Peel et al.,

en preparación). Aún cuando la pared de callosa no represente un aislamiento perfecto de los

tejidos maternos vecinos (nucelo), la ausencia de callosa puede modificar la presión osmótica y

las interacciones de célula a célula. Se ha dudado si esto tiene un efecto directo en la meiosis

normal, ya que las especies tetraespóricas que no poseen pared de callosa tienen una meiosis

normal y, por otra parte, la disolución de pared de callosa alrededor de los microesporocitos no

(12)

tabaco transgénico por medio de la introducción de un gene de callasa, asociado con

promotores específicos del tapetum, dio como resultado la androesterilidad. Establecer un

paralelismo entre la esterilidad inducida y la apomixis es muy atractivo, al menos para entender

cual sería el papel de la callosa en la regulación de la meiosis en plantas con reproducción

sexual en comparación con la falla meiótica de las plantas apomícticas diploespóricas.

Avances en la investigación de transferencia de apomixis a maíz.

A continuación se hace un resumen de los principales logros obtenidos hasta la fecha en la investigación de la transferencia de apomixis de Tripsacurn a maíz (Savidan et al., 1996).

1) La colección y el establecimiento de más de 1,000 accesiones nuevas de Tripsacurn de doce

especies, con diploides sexuales (2n=2x=36) y poliploides apomícticos.

2) La producción de alrededor de 1,200 híbridos F1 nuevos, a partir de maíz y una serie de accesiones de Tripsacurn con diferentes niveles de ploidía.

3) La observación de que los híbridos F1 entre maíz y Tripsacurn tetraploide apomíctico,

segregan 1 :1 en cuanto a los modos de reproducción.

4) La identificación de una serie de marcadores RFLP (Polimorfismos en la longitud de los

fragmentos de restricción) ligados a la apomixis, a partir de un análisis de segregación masal

basado en híbridos F A de maíz y Tripsacurn, los cuales pueden ser usados, junto con técnicas

citoembriológicas, como herramientas de escrutinio de apomixis en progenies segregantes.

..*

’ ”

5) La cuarta retrocruza de F l s apomícticos androestériles. Esto significa la superación exitosa

de la barrera representada por la escasez de progenies (1 a 3 %) no maternas y de utilidad para progresar hacia la reducción del número de cromosomas ajenos, por medio de un proceso muy

eficiente de citometría de flujo.

6) La confirmación de que la ausencia de apomixis en diploides se debe a una ausencia de la

transmisión de apomixis a través de gametos haploides, y la superación de esta barrera con la

(13)

7) La generación de formas adicionales (BC4s) que combinan desde el juego completo de cromosomas de maíz (20Mz) hasta un número variable de cromosomas de Tripsacurn (0-16 Tr).

Transferencia de genes por biolística

La transferencia de genes por biolística puede definirse como la introducción de sustancias en células intactas y tejidos a través del uso de microproyectiles a alta velocidad. El término biolística fue acuñado para describir la naturaleza de la introducción de ADN externo dentro de células o tejido a través de bombardeo por un aparato de biolística (pistola de partículas). El proceso permite la transformación de muchas especies de granos que son difíciles de transformar por otros métodos. En los últimos años han habido reportes de genes externos que han sido introducidos y expresados tanto en mono como en dicotiledoneas, incluyendo especies económicamente importantes como maíz y trigo (Klein T.M. et al., 1989 y Vasil V. et al. 1991) .

La tecnología de microaceleración de ADN tiene tres componentes básicos:

1) Un aparato de aceleración de partícula

2) Partículas de metal asociadas con el ADN.

3) Tejidos vegetales blanco que son regenerables y accesibles a la penetración de partículas

..* ,

El sistema de biolística fue descrito por primera vez por Sarford y colaboradores en 1987. La evolución de la tecnología comenzó con la invención de una aparato de cámara dual que funcionaba con pólvora. Después de desarrollar y probar el aparato de manera exitosa, John Sanford y sus colaboradores comenzaron a trabajar con la corporación DuPont para hacer comercial el (TM) PDS 1000/He Biolistic (Kikkert J.R. 1993). La eficiencia de la transferencia de ’ -.

genes por biolística depende tanto de factores físicos como biológicos.

A la fecha , la eficiencia de la introducción de genes dentro de las células por este método es

(14)

. .

la fecha, se desconoce el mecanismo exacto por el cual el ADN es integrado al genoma cuando

se utiliza esta técnica. En las plantas la transferencia directa de genes conduce a una

integración no homóloga dentro de los cromosomas, caracterizada por múltiples copias y un

cierto grado de arreglo. Otras desventajas relacionadas con el uso de esta técnica son la aparición de plantas quiméricas (que necesitan ser clasificadas y estabilizadas), y una ausencia de control sobre la velocidad del bombardeo, lo que con frecuencia conduce a un daño de las

células blanco (reduciendo de esta forma el número de plantas que pueden ser transformadas).

Hay sin embargo, muchas ventajas para usar la técnica de biolística. La técnica es clara y

segura; distribuye más uniformemente los microacarreadores sobre las células blanco que otros

métodos; y cuando esta correctamente calibrada, se pueden obtener mejores resultados para la

producción de plantas transformadas en las especies tratadas que con otras tecnologías.

Además la transformación directa de tejidos totipotenciales debe minimizar la subsecuente

variación momaclonal genotipo independiente.

Las transformaciones exitosas dependen de diversos factores que afectan la proporción de

células en el área del blanco que son tanto competentes como regenerables para integrar el

ADN introducido por el bombardeo. Estos factores incluyen:

Parámetros de liberación de ADN

Los plásmidos usados para la transformación El material vegetal utilizado para el bombardeo

Medios de cultivo

Expresión, integración y la heredabilidad del gene insertado

Precisión del análisis de las plantas transgénicas utilizando herrramientas

físicas y moleculares

Bioensayo en hoja

Una alta frecuencia de transferencia esta relacionada con el uso apropiado de carga de ADN para el bombardeo sobre células regenerables. Una carga inadecuada podría causar un daño

excesivo e impedir la sobrevivencia y regeneración de la célula. La eficiente selección del

análisis de plantas transformadas sumado a una frecuencia mínima de cambios genéticos

indeseables contribuyen a una integración estable del ADN externo. Las principales

variaciones en la frecuencia de la transferencia genética puden ser causadas por: una técnica

(15)

partículas antes de la precipitación del ADN; una cinética de precipitacion alterada atribuible a

cambios en la temperatura, pureza, concentración de ADN o los agentes de la reacción; la

agregación de las partículas durante la precipitación antes del bombardeo. Las variaciones

también pueden ser causadas cuando el ADN se desprende de las partículas a las que estaba

unido por una excesiva sonicación (Pellegrineschi et a/. 1999)

Parámetros de descarga del ADN

Los parámetros para el PDS-lOOO/He afectan la tasa de una transformación estable

determinando el número de partículas que penetran la pared celular y el grado de daño a la

célula. La presión óptima de helio, la distancia entre el microacarreador y el disco de ruptura, la

distancia del macroacarreador al microacarreador, deben ser determinados empíricamente para

cada tipo celular. Adicionalmente, factores biológicos como el preacondicionamiento de la

célula, las prácticas de manejo posteriores al bombardeo y las construcciones con promotores

específicos también afectan en gran medida la tasa de transformación estable. Las partículas de

tugsteno, que son más baratas y más heterogeneas en tamaño y forma que las de oro, son

usadas como microacarreadores para las unidades manejadas por disparo de pólvora. Las

desventajas del tugsteno son que puede degradar catalíticamente al ADN y pueden ser tóxicas

para algunos tipos celulares. En contraste, las partículas de oro son más redondas, más

uniformes y biológicamente inertes (Luthra R. et al., 1997 y Hagio T. 1998).

Una desventaja de la partículas de oro es que tienden a aglomerarse irreversiblemente en

.:* soluciones acuosas. El ADN es precipitado en los microacarreadores por la adición de CaCI2 y

espermidina.

. .

Uso de plásmidos para la transformación

Los genes nucleares vegetales consisten de distintas regiones cada una con diferentes

funciones, involucradas en la trascripción de mARN. Comenzando con el extremo 5’ hay: una región promotora que está involucrada en la iniciación de la transcripción, junto con las regiones

aumentador/silenciador (enhancer/silencer) que confieren la regulacion de la expresión, un

(16)

terminación, y seguido por un terminador en el extremo 3’ con una señal de poliadenilación. No hay requerimientos especiales para la forma del DNA que será transferido por bombardeo de partículas. La frecuencia de transformación se incrementa cuando el plásmido es linearizado O

superenrrollado, pero hay algunas indicaciones de que los plásmidos muy grandes (> 10 kbp)

son más proclives a la fragmentación durante el bombardeo. Para la expresión en células vegetales, los genes externos necesitan tener el promotor adecuado, las secuencias 5’ lider y 3’ teminal para asegurar una transcripción eficiente, estabilidad y traducción del mARN. Los virus vegetales que dependen de transcripción vegetal y de factores de traducción han sido usados como fuentes de elementos reguladores. El más común de éstos es el promotor del gen de ARN 35s del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35s). Este promotor es activo en todo el tejido, pero varia su actividad dependiendo del tipo celular. Un desarrollo posterior es el uso del promotor derivado de la deshidrogenasa alcoholica del maíz 1 (Adhl) con el extremo 5’ , que

muestra un nivel de expresión en monocotiledoneas equivalente o mayor que el del promotor CaMV 35s.

Los genes usados para transformación son: 1) genes reporteros para detectar o cuantificar la eficiencia de un gene transferido. Estos incluyen el gene de B-glucuronidasa (Gus), luciferasa (Luc), que codifica un sustrato orgánico para la emision de luz y es detectado por una película de rayos X o un luminómetro; la proteína de la flourescencia verde (GFP) de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria; cloranfenicol acetiltransferasa (Cat) y el gen de antocianina (Cl) (Gruber, M.Y & Crosby W.L. 1993)

,.,*’ Estos genes reporteros han sido usados ampliamente para analizar la función de los promotores y otras secuencias reguladoras de genes. La disponibilidad de estos genes reporteros que dan ensayos enzimáticos sensibles convenientes y confiables han incrementado grandemente su uso para ensayos trascientes. De hecho el ensayo para la actividad de Gus es tan sensible que puede ser usado para visualizar por célula que expresa Gus usando un ensayo histoquímico. Este ensayo ha sido ampliamente usado para determinar la frecuencia, tipo y distribución de la actividad expresada por las células después de la introducción de ADN por bombardeo por micropartículas. Una desventaja de este gen reportero para aplicaciones relacionadas con estudios de expresión genética es la alta estabilidad de la enzima Gus, que puede persistir por días o semanas después de la transcripción (Futteter, 1995)

(17)

.

La selección de la células transformadas es un factor clave en el desarrollo de métodos exitosos para la transformación genética. Un marcador genético selecto permite un crecimiento preferencial de las células transformadas en presencia del correspondiente agente selectivo. Varios factores afectan la eficacia de los reactivos usados para la selección. El agente de selección debe ser tóxico para las células vegetales, aunque no tanto para evitar que mate a las céulas transformadas. Las tóxinas más efectivas son aquellas que inhiben el crecimiento o que matan lentamente a las células no transformadas. Una óptima presión de selección usa el nivel más bajo de toxina necesario para matar a los tejidos no transformados.

Los genes marcadores selectos que se usan para probar una integracion estable con los cereales transformados son:

Antibióticos que afectan las actividades de traducción de las células.

El gene de neomicina fosfotransferasa (nptll) con transposón Tn5 que es detoxificado por fosforilacion, neomicina, kanamicina y G418.

El gene de higromicina fosfotransferasa (htp) de E. coli que confiere resistencia a higromicina

Estos marcadores genéticos no son apropiados para algunas especies de monocotiledóneas cuyo crecimiento no se ve significativamente afectado por los antibióticos.

Han sido desarrollados sistemas de selección óptima que utilizan herbicida para muchas especies de monocotiledóneas. El gen de fosfonitricina acetiltransferasa (bar) aislado de

,:* Streptomyces hygroscopicus confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (PPT) -el ingrediente activo en Bialafos y Basta. Glifosato es el ingrediente activo del herbicida de amplio espectro Roundup (Mosanto), que inhibe la enzima ácido 5-enol-piruvilshimi 3 fosfato sintasa (EPSPS). Versiones modificadas de EPSPS aisladas de E. coli o Salmonella typhimurium confieren resistencia al glifosato entre las plantas transformadas.

' "

Blanco biolístico

(18)

células embriogénicas de rápido crecimiento y división son más apropiadas para la

transformación. Todos los cultivos celulares vegetales son una mezcla heterogénea de tipos

celulares, de los cuales no todos son totipotenciales. Las células vegetales difieren en su

capacidad de respuesta a los bombardeos, en un fenómeno denominado competencia. Una

muy pequeña cantidad de células en el tejido vegetal son competentes tanto para la

transformación como para la regeneración

La composición relativa de las poblaciones celulares en los tejidos está determinada por el

genotipo, el tipo de órgano, el estado de desarrollo del órgano y aún por la historia individual de

la planta experimental. La elección del genotipo, es sin embargo, el factor más importante para

la transformación (Díaz, M. et al., 1999)

En cualquier cultivo vegetal hay dos tipos celulares: meristemático, que son células pequeñas e

isodiamétricas, con citoplasma denso y gran núcleo; y diferenciadas, que son grandes, de

formas variadas y con muchas vacuolas y poco citoplasma y núcleo inconspicuo. Los

embriones inmaduros o maduros tienen una especial capacidad para la embriogénesis bajo condiciones de cultivo controladas. Esto es especialmente prevaleciente en la región del

epitelium donde el scutellum es altamente meristemático; prolifera rápidamente y forma

embrioides somáticos que producen poblaciones grandes de plantas fenotípicamente normales.

Las células con vacuolas grandes pueden ser mas sensibles al daño por microproyectiles

debido a la ruptura de la compartamentalización celular.

.'I

Para la transformación de cereales se utilizan comunmente dos tipos de tejidos:

1. Organizados: meristemos apicales, embriones somáticos, brotes secundarios, microesporas,

polen, tejido de hojas y semillas.

Estos explantos pueden ser cortados y regenerados a plantas en todo tipo de especies

vegetales con un tiempo mínimo en cultivo de tejido, pero es probable que una elevada

proporción de plantas regeneradas sean quiméricas.

2. No organizados: (indiferenciados) callos tipo I, tipo I I , suspensiones de scutellum y protoplastos. Con estos tipos de tejidos, es posible la producción directa de plantas

transformadas uniformemente, pero los periódos largos de cultivos de tejido bajo una presión de

selección lleva a un incremento de variación somaclonal y/o esterilidad.

(19)

Medios de cultivo para transformación vegetal

Los componentes del medio son:

l. macro y micro-nutrientes inorgánicos 2. Una fuente de nitrógeno

3. Una fuente de energía o carbono

4. Vitaminas

5. Factores de crecimiento

Se ha mostrado que las concentraciones y proporciones de los factores de crecimiento son el factor crítico para el inicio del cultivo y la morfogénesis. Otras condiciones de cultivo incluyen: intensidad y calidad de luz, fotoperiódo y temperatura.

Agentes de selección

Los agentes de selección tienen una toxicidad diferente en cada planta, lo cual es determinado por el tamaño y el estado de desarrollo de las células vegetales o el tejido.

Las diferentes especies tambien tienen diferentes sensibilidades a los agentes de selección. El

-,*' agente de selección se aplica generalmente al inicio del sistema de selección vegetal para

asegurar la eliminación de las células no transgénicas o permitir una mejor selección y continuar el cultivo de las células transgénicas. La resistencia al agente de selección puede ser conferido por la sobreproducción de la proteína que es el blanco del agente de selección, la producción de una proteína blanco que es resistente al agente de selección, o la producción de una proteína que detóxifica al agente de selección.

+ "

(20)

Los herbicidas son mas tóxicos al tejido celular que los antibioticos debido a su modo específico de acción en las celulas vegetales. La fosfinotricina (PPT) inhibe la síntesis de

glutamina, causando una rápida acumulación de amoníaco que conduce a la muerte de la

planta. Bialaphos es un antibiótico tripéptido que consiste de PPT y dos residuos de L-alanina.

El crecimiento de tejidos de callos de maíz puede inhibirse totalmente por 5-7 mg/l de bialaphos

y PPT para células de maíz tropical y 10 mg/l de bialaphos y PPT para células de trigo .

OBJETIVOS

Objetivo general

Inducir la expresión del gene de la callasa (befa-7,3-g/ucanasa) a partir del meiocito y

determinar su efecto en la megaesporogenesis de maíz y trigo.

Objetivos específicos

:f Probar promotores que tengan la capacidad para la expresión de la callasa en ovarios de

trigo y maíz.

, -. Eliminar la formación de callosa en las megaesporas de maíz y trigo mediante la inducción

del gene de la callasa.

Analizar la expresión de la callasa (0-1,3-glucanasa) y su efecto en los ovarios de maíz y trigo en comparación con sus contrapartes no manipuladas.

Describir la formación de callosa durante el desarrollo de ovarios de maíz y trigo sexuales y

(21)

MATERIALES Y MÉTODOS

Construcciones genéticas

Se construyeron plásmidos quiméricos que contienen el promotor del gene de la proteína DMCl (Klimyuk and Jones, 1997) que está asociada a la meiosis así como el gen reportero Green Flourescent Protein (GFP) de Aequorea victoria

(Chalfie, M. et a/., 1992), que codifica para una proteína con fluorescencia natural. La GFP se utiliza como control positivo.

Se construyó un plásmido que contiene la región promotora del gen DMCI y el gen de t3-1,3-Glucanasa (BGL). El fragmento de la región promotora de DMCI se obtuvo del plásmido p4905; El gen de BGL se obtuvo del plásmido pABGL. Se utilizó el vector pGem -32 para subclonar el gen de BGL.

Construcción del plásmido DMCl -GFP

Se utilizaron los plásmidos p4905 que contiene el gen de DMCI, y pGreen Lantern con el gen de la proteína de la fluorescencia verde (GFP).

El plásmido p4905 se construyó a partir del plásmido pBIN19, por el Molecular Biology Research Laboratory, Research School of Biological Sciences, The Australian National University. Fue proporcionado al Dr J. Antonio Serratos, científico adjunto, del Centro de Biotecnología Aplicada, CIMMYT.

':' El proceso de construcción del plásmido se llevó a cabo con la siguiente metodología:

1. La región del gen de DMCI y el plásmido pGreen Lantern fueron cortados con las enzimas de restricción Pstl y Smal

(22)

Construcción del plásmido DMCl(promotor)-GFP

Esta construcción constituye una versión diferente de la anterior, ya que contiene sólo la región promotora del gen DMCI; su construcción se llevo a cabo de la siguiente manera:

La región del promotor de DMCl y el plásmido pGreen Lantern fueron cortados en los sitios de restricción para las enzimas Pstl y EcoRl

La región del promotor de DMCI fue clonada en el vector pGreen Lantern

El procedimiento de clonación se hizo de acuerdo a la metodología propuesta por Brown T. (1995) y modificada por Lee J .Y. (comunicacion personal)

Digestion de plásmidos con enzimas de restricción Pstl y Smal (cantidades en PI).

CONSTRUCCION DMCI-GFP

PLASMID0

1 Pstl+l Smal

4 React 4 l o x GIBCO BRL 10

PGREEN

1 Pstl+l Smal

4 React 4 l o x GIBCO BRL 10 p4905 ENZIMA BUFFER ADN LANTERN

.-• Digestión de plásmidos con enzimas de restricción Pstl y EcoRl (cantidades en

PI). c ”

CONSTRUCCION DMCl(promotor)-GFP

PLASMID0

1 Pstl+l EcoRl

4 React 1 l o x GIBCO BRL 10 p4905 ENZIMA BUFFER ADN PGREEN LANTERN

1 Pstl+l EcoRl

4 React 1 l o x GIBCO BRL 10

AGUA

24

(23)

Las mezclas de reacción se incubaron a 37' C en baño maría durante 1 hora para ambas digestiones

Las bandas de interés se cortaron y fueron aisladas con el kit de purificación de ADN de Amersham Pharmacia Biotech Inc.

Ligación de los fragmentos DMCl y pGreen Lantern

Los fragmentos de las bandas correspondientes al gen de DMCI y el vector pGreen Lantern se ligaron con ligasa T4 (GIBCO BRL) y la mezcla de reacción se llevo a cabo a 16' C en baño maria durante toda la noche. Esta se hizo con una relación vector/inserto de 1 :2

Reacción de ligación (cantidades en

~ l )

Buffer de Reacción 5X

2 Inserto

1

Vector

1

T4 DNA ligasa (1 unidad)

2

Volumen total 10

ddHzO 4

Construcción del plásmido DMCl(promotor)-BGL

Para la construcción de este plásmido se utilizó la siguiente estrategia:

: 1. Se cortó el fragmento BGL-NOS a partir del plásmido pABGL en los sitios de restricción para BarnHl y Pstl. Asimismo se digirió al plásmido pGEM -32 con las mismas enzimas.

+ -- 2. Se clonó el fragmento de BGL-NOS en el vector pGEM -32

3. Se cortó la construcción anterior (BGL-NOS)-pGEM

-32

con la enzima EcoRl,

obteniéndose el fragmento BGI-NOS con los extremos para EcoRl

4. Se cortó el plásmido p4905 con EcoRl y se obtuvo el fragmento grande (vector). Este fragmento se purificó y defosforiló con fosfatasa alcalina de ternera (CIP) para evitar el religamiento del fragmento.

(24)

Digestión de los plasmidos pABGL y pGEM-3Z.

Se utilizaron las enzimas BarnHl y Pstl para la reacción de doble digestión para los plásmidos pABGL y pGEm -32; para p4905 se utilizó EcoRI.

Las condiciones de reacción se muestran a continuación (las cantidades se dan en PI):

Plásmido

51

8 H (Boehringer Mannheim) 1 EcoRl

20

p4905

50

8 React 1 (GIBCO BRL) 1 BamHl + I Pstl

20

PABGL

H20 Buffer

Enzima ADN

PGEM -32 5 1 BamHI+I Pstl 2 React 1 (GIBCO BRL) I 1

Las mezclas de reacción se incubaron a 37' C baño maría durante 1 hora para ambas digestiones

Defosforilación del fragmento de p4905 digerido

con

EcoRl

La defosforilación se llevó a cabo de la siguiente manera:

(25)

Clonación del gen BGL en el vector p4905

Una vez que se obtuvieron tanto el gen de BGL como el vector defosforilado de p4905, se procedió a ligar los fragmentos, para así obtener la construcción DMCI (promotor)-BGL

Las relaciones vector/inserto que se utilizaron para la ligación,fueron:

I 1:l

II 1 :3 111 3: 1

Las condiciones de reacción se especifican en la siguiente tabla(en PI):

I I1 111

DMC 1 3 3 5 Agua 1 1 1 Ligasa 2 2 2 Buffer 5X 1 3 1 BGL 1 1 1

Electroforesis en gel de agarosa

Preparación del gel de agarosa para la electroforesis.

Para el corrimiento de muestras de ADN en electroforesis se utilizó normalmente un gel de agarosa al 0.8 % El volumen total de agarosa preparada depende siempre del tamaño de la cámara de electroforesis utilizada y de la cantidad de muestras a examinar.

Para preparar el gel se utilizó gel buffer 1OX TAE: 400 mM Tris, 50 mM NaOAc, 7.7 mM EDTA (Hoisington, et a/. 1994):

STOCK

MW=380.20 Na4EDTA

4.10 g NaOAc (MW=82.03)

1 LITRO

, -

48.40 g Tris Base (MW)=121.10

(26)

Después de la electroforesis, se cortaron las bandas correspondientes a los fragmentos de interés , visualizadas con luz ultravioleta.

Transformación Bacteriana.

Para la transformación bacteriana se utlizaron células competentes de E. coli, cepa XL1 blue. Para la reacción de transformación se usaron 5 pI de la reacción

de ligación. El marcador de selección fue Ampicilina (50 pl/L) para las construcciones DMCI-GFP, DMCl (promotor)-GFP; kanamicina (50 pI/L) para DMCI (promotor)-BGL.

El protocolo de transformación es el siguiente:

1.Tomar las células competentes en congelación a -80

'

C y colocarlas en hielo por 10 minutos.

6. b a n d o una pipeta estéril, transferir 50 pI de células competentes a tubos eppendorff y mantenerlos en el hielo

7. Adicionar 3 pI de ADN a las células competentes y agitar los tubos suavemente

con la punta de los dedos. Mantener los tubos en hielo por 30 minutos.

8. Colocar los tubos a 42' C en baño maría por 90 segundos (choque térmico).

9. Trasferir nuevamente los tubos al baño de hielo durante 1-2 minutos.

10.Adicionar 800 pI de medio SOC o LB a cada tubo . Transferirlos a un incubador con agitación (200 ciclos/minuto) a 37

'

C. Incubar durante 45 minutos.

..I

11. Transferir un volumen apropiado (200 yl por placa) de células competentes transformadas sobre placas de medio LB-agar (con ampicilina)

, "

12. Dejar secar las placas hasta que el líquido sea absorbido. Invertir las placas e incubar a 37

'

C

Extracción de ADN de plásmidos

(27)

Producción de un lisado aclarado

1.

Centrifugar 2 mi de cultivo bacteriano por 5 min a 10000 rpm

2. Resuspender suavemente cada muestra con 250

pI

de solución de resuspención celular

3. Adicionar 250 pl de solución de lísis celular a cada muestra e invertir los tubos 4 veces durante 4 minutos

4. Adicionar 10 pI de Solución de proteasa alcalina e invertir los tubos 4 veces. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.

5. Adicionar 350 pI de solución de neutralización e invertir 4 veces 6. Centrifugar a 14 O000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente

Obtención del ADN de plásmido

1.

Insertar la columna del filtro dentro del tubo de colecta 2. Transferir el lisado aclarado a la columna preparada

3. Centrifugar a 14000 rpm por 1 minuto a temperatura ambiente. Descartar el ,4 líquido del tubo y reinsertar la columna.

’.

Lavado.

4. Adicionar 750 yl de solución de lavado conteniendo etanol. Centrifugar a 14000 rpm por 1 minuto . Descartar el líquido y reinsertar la columna en el tubo de colección

(28)

Elución

7. Transferir la columna a un tubo eppendorf esteril de 1.5 ml

8. Adicionar 100 pl de agua libre de nucleasas a la columna para eluir el ADN. Centrifugar a 14000 rpm por 1 minuto

9. Después de eluir el ADN, remover la columna del tubo y descartarla 1

O.

Almacenar el ADN a -2OOC

Composición de Buffers y soluciones

1OX TE Buffer

100 mM Tris-HCI (pH 7.5) 10 mM EDTA

Medio LB

1

O

g de caseína-peptona 5 g de extracto de levadura

5 g de NaCl

.-•

15

g de agar (sólo para placas)

Disolver en 1L de agua destilada. Autoclavar y enfriar antes de adicionar el antibiotico (<45'C)

' -.

Solución de

lisis

celular Wizard@ Plus SV

0.2 M NaOH

(29)

Solución de resuspensión celular Wizard@ Plus SV

50 mM Tris-HCI (pH 7.5) 10 mM EDTA

100 pg RNAsa A

Solución de neutralización Wizard@ Plus SV

4.09 M hidrocloruro de guanidina 0.759 M de acetato de potasio 2.12 M de ácido acético glacial pH final aproximado de 4.2

Solución de lavado Wizard@ Plus SV

162.8 mM de acetato de potasio 27.1 mM de Tris-HCL (pH 7.5)

Adicionar etanol 95% . Las concentraciones finales deben ser aproximadamente 60% de etanol 60 mM de acetato de sodio, 60 mM de acetato de potasio y 10 mM de Tris-HCI

.-+ '

Una vez terminada la extracción de ADN de plásmidos se procedió a hacer una cuantificación a traves de fluorornetria (TKO 100 Mini-Fluorometer, Hoefer

+ -- Scientific Instruments. CA, E.U.)

Se hizo un ensayo de digestión con las enzimas Pstl y Smal para verificar la presencia del inserto de DMCI en la construcción

(30)

Buffers GIBCO BRL 1X

-*

' "

React 1 Buffer

5 mM MgCI2 10 mM MqCl2

10 mM MgCI2 10 mM MgC12

20 mM Tris-HCI pH 7.4 50 mM Tris-HCI pH 8.0

50 mM Tris-HCI pH 8.0 50 mM Tris-HCI pH 8.0

React 4 Buffer React 3 Buffer

React 2 Buffer

I

50 mM NaCl 100 mM NaCl 50 mM KC1

Buffers Boehringer Mannheim I X (mmol/L)

A H

Tris-Acetato 10 Mg-Acetato 50 Tris-HCI 33

MgC12 10

K-Acetato

7.5 1

7.9 p H a 37 OC

2-Mercaptoetanol

0.5 Ditiotreitol (DTT)

1 Ditioeritritol (DTE)

1 O0 NaCl

(31)

Transformación Vegetal

Material Vegetal

Se utilizaron dos variedades de trigo para la trasformación genética: Baviacora y Baviacora 504 que fueron proporcionadas por el Laboratorio de Ingenieria

Genética Aplicada (AGEL) del Centro de Biotecnología Aplicada (ABC) de

CIMMYT. En el caso de Maíz se utilizó la variedad 216x72 procedente del mismo laboratorio.

Trigo

I

Baviacora 504

Maíz

I

216x72

Se utilizaron

los

embriones de maíz y trigo previamente preparados por el Laboratorio de Ingenieria Genética Aplicada.

Obtención de embriones (Bohorova et al., 1999).

Las semillas son cosechadas de 15 a 20 días después de la autopolinización. Los granos en desarrollo son esterilizados superficialmente con una solución de cloro 20%-30%, lavados en agua doble destilada por cinco minutos. Una vez hecho esto ,:* se hace la excisión de los embriones. Se colocan de manera circular en cajas petri conteniendo medio MS+15% maltosa para utilizarse en

la

trasformación por bombardeo de partículas.

, ..

Preparación de la muestra

Se colocan en el sonicador 60 pI (1 .O pm) de partículas de

oro

en etanol

loo%,

hasta mezclar perfectamente. Centrifugar a 14000 g por 1 minuto. Descartar el

(32)

Las construcciones utilizadas para la trasformación vegetal fueron:

DMCI-GFP

DMCl (promotor)-GFP DMCl(promotor)-BGL

El plásmido de selección contiene el gen bar (gen de Fosfinotricina

acetiltransferasa), bajo control del promotor de ubiquitina, que confiere resistencia el herbicida fosfinotricina (PPT)

Procedimiento de bombardeo.

Se utilizó el aparato de biolística PDS-IOOO/He, de Biorad. Se utilizó la técnica de bombardeo de acuerdo a Pellegrineschi et al. (1 999).

Para cada bombardeo se utilizaron 10 pI de microparticulas-DNA colocadas en el macroacarreador (porta membrana). Los bombardeos se hicieron a una distancia de 5 cm de la placa de retención de membrana usando la pistola de genes PDS 1000/He (Bio-Rad) con 900 pulgadas/cm2 de acuerdo al procedimiento descrito por Pellegrineschi et al. (1 999)

Condiciones de cultivo y selección de plantas transformadas

Después de ocho horas del bombardeo, se colocaron

los

embriones en medio MS (Murashigie T. and Skoog F.1962) conteniendo 2.5 mg/l de ácido 2,4-

diclorofenoxiacetico (2,4-D), 20 g/l de sacarosa y 9 g de Bacto Agar para inducir el crecimiento del embrión. Después de 20 días, se evaluaron a los embriones en crecimiento y se transfirieron a medio MS con 5 mg/l de PPT. Después de 15 dias, las plántulas que sobrevivieron al tratamiento con PPT y que desarrollaron raíces, se cambiaron nuevamente al mismo medio hasta que desarrollaron un tamaño apropiado de raíz y se transplantaron entonces a suelo.

Las plantas se colocaron en una cámara de crecimiento en condiciones

semicontroladas, con temperatura de día de 24-28 'C, y temperatura de noche de 15 y 18 'C.

(33)

RESULTADOS

- Construcciones geneticas.

Se logró la construcción de diferentes plásmidos que se denominaron DMCI-GFP, DMCl (promotor)-GFP y DMCl Cpromotor)-BGL. Los plásmidos DMCI-GFP y DMCl(promotor)-GFP contienen ambos al gen de-la proteína de la fluorescencia verde (GFP). El primero contiene al gen completo de DMCI (con intrón), mientras que el segundo, contiene

sólo

la región promotora del DMCI. La tercera construcción genética, DMCI (promotor)-BGL, contiene la región promotora del gen DMCl y el gen de 13-glucanasa (BGL). A continación se detallan

los

resultados obtenidos por etapas de las diferentes construcciones genéticas.

DMCI-GFP. Seleccion de la construcción.

(34)

La siguiente figura muestra un mapa del plásmido DMCI-GFP, construido a partir del gen DMCI con intrón y el vector que contiene al gen de la proteína de fluorescencia verde (GFP). El plásmido completo tiene aproximadamente 8000 pb. RB y LB se refieren a los extremos derecho e izquierdo del vector, respectivamente

..*

(35)

Identificación de la construcción genética DMCl (promotor)-GFP

Para la identificación de la construcción DMCl(promotor)-GFP se hizo una digestión de los plásmidos obtenidos a partir del cultivo de bacterias

transformadas con esta construcción. Se utilizaron las enzimas Pstl y EcoRI.

Se muestran los fragmentos obtenidos a partir de la digestión de DMCl(promotor)- GFP con las enzimas Pstl+Smal. El fragmento de aproximadamente 1300 pb (carriles 1 y 5) corresponde a la región promotora de DMCl y la banda de aproximadamente 5000 pb al vector pGreen Lantern.

5000 pb 1300 pb No. M 1 2 3 4 5 6 7 a Plásmido

Marcador 1 kpb (3ul)

DMCl (promotor)-GFP

DMCI (promotor)-GFP

DMCl (promotor)-GFP

DMCI (promotor)-GFP

Enzima (S)

Pstl+Smal Pstl Smal Pstl+Smal Pstl Smal

(36)

La figura muestra el mapa de la construcción DMCl(promotor)-GFP. Este plásmido contiene la región promotora del gen DMCI y el gen de la proteína de la fluorescencia verde (GFP)

DMCl(promotor)-GFP

€ E

5 ;

ii

S

I

Identificación de la construcción DMCl(promotor)-BGL

(37)

En la fotografia se pueden observar 13 muestras de plásmidos de la construcción pGEM-BGL, digeridos con las enzimas BamHl y Pstl (carriles numerados). A

excepción de las muestras 1 y 7 , todas las demás resultaron positivas. También se pueden observar las muestras de p4905 digeridas con la enzima EcoRl

defosforilado por 10 minutos, que fueron utilizadas en la siguiente etapa de la construcción (muestras A, B y

C).

3100

1636

31 O0

(38)

La digestión de las muestras de plásmidos con la construcción DMCl(promotor)-

- BGL con la enzima EcoRl dió corno resultado un fragmento grande (vector) de

aproximadamente 11 kpb y uno pequeño de alrededor de 2.2 kpb, que corresponde al gen de BGL clonado previamente en pGEM-3Z. El tamaño original del gen BGL deberia ser de aprox 1.5 kpb.

En la fotografía siguiente se observan 8 muestras de ADN de plásmidos de la construcción DMCl(promotor)-BGL. Las muestras de la primera parte del gel

están digeridas con la enzima EcoRI. Se observa una banda de aproximadamente 2200 pb en los carriles 5, 7 y 8. Estas bandas corresponden al gen de BGL. En la segunda parte del gel se observan las muestras digeridas con las enzimas BarnHl y Pstl. Las bandas de las muestras 5,7 y 8 corresponden a:

Tamaño

4072 p4905 (promotor DMCI)

1636 Fragmento DMCI-BGL-NOS (BarnHI)

(39)

4500 pb

2000 pb

(40)

La figura siguiente muestra el mapa de la construcción DMCI (promotor)-BGL:

- e

E

5 3

5

(41)

Transformación vegetal

La transformación vegetal se llevó a cabo como se describió en material y métodos, utilizando el sistema de biolística de Bio-Rad PDS-lOOO/He, del cual se muestra a continuación una fotografía (figura 1)

(42)

El primer paso en la transformación del trigo y maíz consistió en la preparación de los embriones a partir de los granos de éstas especies. En el caso del trigo se muestra a continuación

un

grano donde se puede observar el embrión y el pericarpio (figura 2). Una vez que el pericarpio es removido se hace la excisión del embrión inmaduro (0.5-1 .O mm). l o s embriones se colocaron en un medio osmótico (MS

+

maltosa 15%) y se dispusieron en el centro de la caja Petri, que corresponde al área que fue bombardeada

(43)

En las partículas de oro se colocaron tanto el gen de interés como el marcador de

selección que en este caso es el Patch25 que confiere resistencia al herbicida PPT. Los embriones se colocaron en la cámara de vacío de la pistola de genes. El gas Helio es cargado y después liberado disparando a las partículas de oro cargadas con el ADN sobre los embriones (figura 4).

Válvula vacío

(44)

Los embriones bombardeados permanecieron en el medio o lsmótico y fueron transferid al día siguiente a medio MS hasta la formación de callo embriogénico, durante un tier apróximado de dos semanas (este tiempo varia dependiendo del genotipo usad Después de esto, fueron transferidos al medio MS con PPT (medio de selección) por periódo de aproximadamente 4 semanas.

Los embriones bombardeados de trigo (fig 5) y de maíz (figura 6), después de 4 seman de crecimiento en medio de selección

os

'PO

0).

un

(45)

(46)

(

(47)

Una vez que transferidas a humedad, luz

las plántulas desarrollaron raíces

lo

suelo y aclimatadas en la cámara de

(48)

(49)

Se bombardearon un total de 161 6 embriones de trigo (variedades Baviacora y Baviacora 504); mientras que de maíz se bombardearon 291 embriones. Las fechas de transformaci6n, genotipos y plásmidos utilizados se muestran en las siguientes tablas:

Trigo

Fecha de transformación

21 6x72 26 mayo

Bombardeados Control Plásmido

Genotipo

1 o1 11

DMCl(promotor)-GFP 21 6x72

9 junio

94 9 DMCI-GFP

21 6x72 26 mayo

96 11

DMCl(promotor)-GFP

Tntal 291

(50)

El número de plantas que sobrevivieron a la selección con P l T fue para el caso de trigo de 265, que representa aproximadamente el 16% del total de embriones bombardeados; el el caso del maíz hubo una sobrevivencia de 16 plantas , que constituye aproximadamente el 5.5%

Sobreviviencia a PPT de las plantas transformadas

Especie Genotipo Control Bombardeados Sobrevivencia a selección (PPT)

Trigo Baviacora 95

24 291

31

21 6x72 Maíz

265 1616 180

Total

79

334 54

Baviacora 504

186 1282

Sobrevivencia a medio de selección (PPT) de acuerdo al genotipo

Especie Trigo Maíz Genotipo Baviacora Baviacora 504 21 6x72

Plásmido Número de Sobrevivencia Sobrevivencia % de

embriones a PPT (Total) por ganotipo sobrevivencia

por genotipo

DMCl -GFP 1037

265

I

112

1

42.26

I

DMCl (PROMOTOR)- 245

G FP

DMCl -GFP 162 153 57.63

DMCl (PROMOTOR)- 1 72

GFP

DMC1-GFP 94 24 11 _45.83

DMCl(PROMOT0R)- 197 13 54.1 6

(51)

Sobrevivencia en medio de selección (PPT) de acuerdo al plásmido utilizado

Especie

Trigo

Maíz

Plásmido Genotipo Número de embriones

DMC1-GFP Baviacora 1199

Baviacora 504

Baviacora 504

DMCl -GFP 21 6x72 94

DMCl promotor) 197

-GFP

~

Sobrevivencia a seleccion con PPT

265

24

39.62

60.37

(52)

Discusión

El promotor es el principal determinante del patrón de expresión en una planta transgénica. Los promotores constitutivos dirigen la expresión en todos o en casi todos los tejidos, independientemente de las señales de desarrollo o ambientales . En este caso se utilizó un promotor tejido específico, el DMCI involucrado en el proceso de meiosis (Klimyuk and Jones, 1997). Se ha reportado que cuando se compara este promotor con promotores const-itutivos ampliamente conocidos como el CAMV 35s o los promotores ubiquitina 1 de maíz y actina 1 del arroz presenta elevados niveles de expresión en

monocotiledóneas (Battraw and Hall, 1992; Potrykus and Spangenberg, 1995), que han sido utilizados con el intrón del gen para transformación en

monocotiledóneas.

En el caso de promotores tejido específico, como su nombre

lo

indica, promoveran la expresión del gen en respuesta a factores propios de cada tipo de tejido. Algunos ejemplos de promotores tejido-específicos son los de glutenina, faseolina y b-ordeína, que se expresan respectivamente en endospermo, cotiledones y endospermo (Pizarro, G. y Equenique V. 1999). Sin . .* I embargo, el gen utilizado en el presente trabajo, el DMCI, con expresión

durante la meiosis, se espera que tenga un nivel de expresión mucho mayor que los anteriormente reportados (Serratos, A. Comunicación personal). Por esta razón se utilizó como promotor en las construcciones genéticas que se

realizaron en este trabajo.

’.

La capacidad de expresión de un promotor puede variar manipulándolo de

distintas maneras: eliminando la región del intrón, adicionandole un intrón, o

(53)

Tanto la primera construcción que utilizó el gen completo de DMCl (DMCI- GFP), como la segunda (DMCl(promotor)-GFP) con sólo la región promotora, fueron utilizadas al mismo tiempo para la transformación de maíz y trigo.

El plásmido DMCI-GFP fue relativamente fácil de elaborar y no presentó problemas durante la clonación en el plásmido pGreen Lantern. En el caso del plásmido DMCl(promotor)-GFP, se tuvo más cuidado al hacer los cortes para obtener

los

fragmentos correspondientes a la región promotora y descartar el intrón del gen. De esta manera, utilizando los mapas de restricción respectivos de cada plásmido y las herramientas de clonación (Brown, T. 1990; Promega, 1996; Draper et al., 1988) se obtuvo la construcción deseada de una manera precisa.

En el caso del plásmido DMCl(promotor)-BGL, la estrategia fué más compleja y no exenta de algunas difucultades. Como se reportó en materiales y métodos fué preciso hacer una subclonación en el plásmido pGEM-3Z, para hacer viable su clonación posterior y definitiva en el plásmido p4905, con la región promotora de DMCl únicamente. Esta construcción presentó problemas tales como una baja eficiencia de transformación en las bacterias y algunos tamaños de bandas ligeramente diferentes a los esperados en las electroforesis que se hicieron para

..* ,

-. comprobar el inserto. Por esta razón, será necesario hacer una verificación posterior de esta construcción antes de proceder a la transformación de maíz y

trigo por la técnica de biolística.

La transformación de maíz y trigo se llevó a cabo como se mencionó en

(54)

genotipo, se observa que ésta fue ligeramente superior para Baviacora 504, en el caso del trigo (57.63% contra 42.26% de Baviacora). Para maíz no fue posible hacer esta comparación pues solo se utilizó una variedad (216x72).

En el caso del trigo se tuvo un porcentaje de sobrevivencia a PPT de 60.37 cuando se utilizó la construcción DMCl(promotor)-GFP, mientras que para la construcción DMCI-GFP, éste porcentaje fué de 36.37. Para el maíz transformado estos porcentajes fueron respectivamente 66.66 y 33.33.

Estos resultados preliminares nos indican que se tuvo una mayor eficiencia de transformación al utilizar la versión corta del gen DMCI , es decir, cuando se utilizó sólo la región correspondiente al promotor.

El

estado de desarrollo de las plantas transformadas al momento de terminar el presente trabajo, no permitieron realizar los análisis moleculares correspondientes para determinar la expresión del gen de la proteína de la fluorescencia verde GFP. Tales estudios comprenden: extracción de ADN a partir de tejido de las plantas transgénicas, PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de ADN genómico, análisis de la progenie para verificar la expresión trasciente. Una técnica adicional que se utiliza para este tipo de análisis

.* '

* -_ molecular es la de Southern Blot para hibridizar el ADN de la planta

(55)

Conclusión

En el presente estudio se logró la construcción de varios plásmidos quiméricos conteniendo el promotor DMCl

.

La obtención de plantas transgénicas de maíz y trigo obtenidas permitirán la evaluación de la expresión tejido-específico tanto del gen reportero GFP como de la proteína de la 8-glucanasa, as en estas especies de fundamental importancia agrícola.

(56)

Referencias

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