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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUILLO
ESCUELA DE POSTGRADO
SECCIÓN DOCTORADO
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS
TESIS DOCTORAL:
EFECTO DE LA RECOLONIZACIÓN VAGINAL POR
Lactobacillus sp. PROBIÓTICO POTENCIAL EN MUJERES
CON VAGINOSIS BACTERIANA
AUTOR : MsC. STEVE TONY HURTADO ESCAMILO
ASESOR : Dr. SANTIAGO BENITES CASTILLO
Trujillo (Perú) – 2011
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PRESENTACIÓN
Señores Miembros del Jurado:
En cumplimiento con el Reglamento de Grados de la Escuela de Post-Grado de la Universidad Nacional de Trujillo, para obtener el grado de Doctor en Ciencias Biomédicas, presento a vuestra consideración y criterio el presente trabajo de tesis:
Efecto de la recolonización vaginal por Lactobacillus sp. probiótico potencial en mujeres con vaginosis bacteriana
Trujillo, Diciembre del 2014
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MIEMBROS DEL JURADO
Dr. Oscar Panta Guardado
Presidente del Jurado.
Dr. Santiago Moisés Benites Castillo
Secretario
Dra. Elva Mejía Delgado
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DEDICATORIA
A mis padres José y Sabina,
Por el amor, apoyo y guía espiritual,
Siempre y por siempre.
A mi esposa Merly, por su sacrificio,
amor incondicional y cuidados.
A mis hijos, motor de mi vida.
Diana, la inteligencia y ternura,
Gabriel, la inteligencia y fuerza
A mis hermanos, sobrinos y amigos,
Quienes apoyaron mi proyecto,
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AGRADECIMIENTOS
A mi asesor de tesis Doctoral, Dr. Santiago Benites Castillo, por su apoyo decidido en la realización, desde la elaboración del proyecto hasta la publicación del presente estudio.
Agradezco sinceramente al Dr. Carlos Napoleón Rivera Espinola, Médico Ginecólogo Obstetra del Hospital II Chocope – EsSalud, quien participó activamente desde el estudio piloto hasta la evaluación del efecto del tratamiento, en las toma de muestras y revisión del estudio.
v
ÍNDICE
Pág.
Presentación i
Miembros del Jurado ii
Dedicatoria iii
Agradecimientos iv
Índice v
Índice de cuadros, tablas e ilustraciones vi
Resumen vii
Abstract viii
I. Introducción 1
Objetivos 4
Problema 4
Hipótesis 5
Marco conceptual teórico- filosófico 5
II. Material y Métodos 8
Objeto de Estudio 8
Métodos y Técnicas 8
1. Obtención del LBP probiótico potencial 8
Aislamiento, Identificación y Selección 8
Actividad antagónica de LBP BMP9 contra S. aureus 9
2. Evaluación del LBP BMP9 como probiótico vaginal en VB 10
Grupo Tratamiento 10
Obtención de biomasa de LB H2O2 Positivo (BMP9) para tratamiento 10
Presentación del inóculo para tratamiento 10
Medición del efecto de recolonización vaginal por LB H2O2 Positivo BMP9 11
Análisis estadístico 11
Aspectos éticos 11
III. Resultados 12
IV. Discusión 23
V. Conclusiones 28
VI. Propuesta 30
VII. Referencias Bibliográficas 31
Anexos Anexo 1. Test de Nugent 37
Anexo 2. Criterios de inclusión y exclusión 38
Anexo 3. Tabla 5. Cultivos puros pre-seleccionados de Lactobacillus sp. vaginales aislados de donantes con cero puntos según Nugent. 39
Anexo 4. Tabla 6. Características de los aislamientos pre-seleccionados de Lactobacillus sp. aislados. 40
vi
Anexo 6. Prueba de hipótesis para comparar los promedios de recolonización vaginal en mujeres con vaginosis
bacteriana en pre y post tratamiento con LBP BMP9 43
ÍNDICE DE CUADROS, TABLAS E ILUSTRACIONES Pág. a) ÍNDICE DE CUADROS O TABLAS III-1. Características de cultivos puros de LBP potencial para uso vaginal en mujeres con Vaginosis Bacteriana. Hospital II Chocope – EsSalud, La Libertad, 2010. 14
III-2. Valores de frecuencias observadas según edad, grupos bacterianos y valores de los test de Nugent al momento del diagnóstico y días post-tratamiento vaginal con Lactobacillus sp. BMP9, en mujeres atendidas en el Hospital de Chocope II- EsSalud, 2010 15
III-3. Valores promedio de las edades y puntajes Nugent de mujeres al momento del diagnóstico y días post-tratamiento vaginal con Lactobacillus sp. BMP9, según puntaje Nugent normalizado (≤3). 16
III-4. Efecto de la recolonización vaginal por Lactobacillus sp. BMP9 en mujeres Normales y con Vaginosis Bacteriana, según criterio de Nugent al día 30 post-tratamiento. 17
b) INDICE DE ILUSTRACIONES Figura 3-1. Colonias de Lactobacillus sp probiótico potencial MBP9. 18
Figura 3-2. Dosaje de H2O2 según el Test Peróxidos – Merckoquant de Merck®. 19
Figura 3-3. Fotomicrografía de células de la cepa de Lactobacillus sp. BMP9 20
Figura 3-4A. Turbidímetro de Siemens® 21
Figura 3-4B. Placa de Agar MRS - inoculación de LBP en botón 21
Figura 3-4C. Método de Lewus y detección de catalasa 21
Figura 3-4D. Cultivo testigo de la cepa salvaje indicadora en Agar Müeller Hinton 21
Figura 3-4E. Inóculo de la cepa BMP9 y jeringa de 1 mL para la administración. 21
vii
BMP9. en mujeres con Vaginosis Bacteriana (VB) y Normales según criterio de Nugent al día 30 de
control post-tratamiento. 22
RESUMEN
Efecto de la recolonización vaginal por Lactobacillus sp. probiótico potencial en mujeres con vaginosis bacteriana
La microflora vaginal en mujeres sanas está dominada por especies de lactobacilos, que previenen el sobre crecimiento e invasión de bacterias patógenas y su disminución está asociada con un aumento en la incidencia de infecciones vaginales.
Objetivo: Evaluar el efecto de la recolonización vaginal por una cepa de lactobacilo probiótico potencial, Lactobacillus sp. BMP9, en mujeres con vaginosis bacteriana.
Métodos: Las mujeres categorizadas según criterio de Nugent: 16 con vaginosis bacteriana (VB) (Nugent: 7-10 puntos) y 4 normales (Nugent: 3 puntos) recibieron vaginalmente una suspensión de 109 UFC/mL de LBP
BMP9, durante 7 noches consecutivas. Los hisopados vaginales controles fueron realizados los días 1, 7, 15 y 30 post-tratamiento para la categorización según Nugent.
Resultados: El 81,25% (13/16) de mujeres con VB mostraron curación (Nugent: <7 puntos), el 68.8% (11/16) se normalizaron (Nugent: ≤ 3 puntos) y en el 100% (4/4) de las mujeres Normales no se observó efectos negativos, al día 30 de control post-tratamiento (t= 7.384, p <0.01) y OR 1,44.
viii
Palabras clave: Vaginosis Bacteriana, probiótico vaginal, Lactobacillus
probiótico.
ABSTRACT
Effect of vaginal re-colonization by potential probiotic Lactobacillus
sp. in women with bacterial vaginosis
The vaginal microflora of healthy women is dominated by Lactobacillus
species, which prevent the growth and invasion of pathogenic bacteria and their decrease is associated with increased incidence of vaginal infections. Objective: To evaluate the effect of vaginal re-colonization by a potential probiotic Lactobacillus strain, Lactobacillus sp. BMP9, in women with bacterial vaginosis (BV).
Methods: Women categorized by Nugent criteria: 16 with bacterial vaginosis (Nugent: 7-10 points) and 4 normal (Nugent: 3 points) vaginally received a suspension of 109 CFU / mL of LBP BMP9 for 7 consecutive
nights. Vaginal swabs controls were performed on days 1, 7, 15 and 30 post-treatment for categorization according to Nugent.
Results: Women with BV showed cure of 81.25% (13/16) (Nugent <7 points), 68.8% (11/16) were normalized (Nugent: ≤ 3 points), and in the normal women group it wasn’t observe negative effects 100% (4/4) at day 30 post-treatment control (t= 7.384, p <0.01) and OR 1.44.
Conclusion: Vaginal re-colonization with Lactobacillus sp. BMP9 in women with BV restores the normality of vaginal ecosystem.
1
I. INTRODUCCIÓN
La microbiota vaginal humana puede cambiar en composición rápidamente, entre más de 50 especies, por razones no totalmente claras1
y se forma mayormente por el ascenso de microbios, a lo largo del periné, del recto a la vagina2. Las cantidades y tipos de microbios fluctúan con los
niveles hormonales, contacto sexual, duchas vaginales y dieta; sin embargo, la composición básica es relativamente simple, con lactobacilos dominantes en mujeres saludables3.
Las infecciones del tracto urogenital de origen bacteriano tienen una alta incidencia entre la población femenina mundial en edad reproductiva. Una gran proporción de estas enfermedades, como la vaginosis bacteriana (VB) son causados a menudo por múltiples agentes patógenos, tales como Gardnerella vaginalis, Mobiluncus sp., Bacteroides
sp., Peptococcus sp., Peptoestreptococcus sp., Propionibacterium spp.,
Prevotella, Mycoplasma hominis4,5,6.
El género Lactobacillus consiste en bacilos Gram-positivos, no esporulados, catalasa y oxidasa negativo, no reducen nitrato, no producen indol ni H2S, no licua la gelatina. La mayoría son homofermentativas, es
decir forman ácido láctico a partir de glucosa como producto final de fermentación, están ampliamente distribuidos en la naturaleza y en los humanos habitan como componente importante de la flora autóctona: en la vagina, tracto gastrointestinal y orofaringe. El término “Bacilo de Döderlein” incluye a cepas vaginales humanas de L. acidophilus, L. casei,
L. fermenti, L. celobiosus y Leuconostoc mesenteroides7.
En mujeres sanas, la microflora vaginal está dominada por especies de lactobacilos, con un nivel de 107 - 108 UFC g-1 de líquido, que
ejercen una influencia significativa sobre la microbiología del ecosistema8.
2
bacterias patógenas9,10, por una combinación de exclusión competitiva, la
competencia por nutrientes y la liberación de sustancias antimicrobianas, tales como el peróxido de hidrógeno, ácidos orgánicos, bacteriocinas, y biosurfactantes2.
En consecuencia, una disminución de los lactobacilos vaginales ha sido directamente asociada con un aumento en la incidencia de infecciones vaginales. Un ecosistema vaginal saludable ha venido mostrando ser protector inclusive contra la adquisición del VIH y gonorrea11.
Los probióticos se definen como microorganismos vivos que administrados en la cantidad adecuada, brindan un beneficio de salud al huésped12 y son considerados seguros13; el uso de Lactobacillus
probióticos vaginales, al menos en ratones hembras no produjeron efectos adversos ni modificaciones estructurales o ultra estructurales en la vagina14.
Actualmente, hay un creciente interés en la utilización de los lactobacilos como probióticos humanos para restaurar y mantener una flora vaginal normal y prevenir la recurrencia de las enfermedades como una barrera biológica contra la colonización de bacterias patógenas15,16.
Los lactobacilos, administrados como agentes probióticos serían una alternativa eficaz al tratamiento convencional con antimicrobianos sobre los cuales muchos microorganismos patógenos ya han desarrollado resistencia16,17, teniendo además la ventaja de poder administrarlo
durante el embarazo sin ningún riesgo haciendo de esta terapia de reemplazo bacteriano la mejor alternativa en beneficio de las mayorías15.
El tratamiento de infecciones vaginales con muchas especies de
3
mostrado cierta eficacia clínica18. En gestantes con VB en el primer
trimestre de embarazo se observó una reducción del 81% del riesgo de infección genital10.
El ácido láctico producido por los Lactobacillus spp. ha sido ampliamente considerado como el factor que permite dominar el ecosistema vaginal; sin embargo, datos recientes sugieren que puede ser la producción de H2O219. Mujeres colonizadas con lactobacilos
productores de H2O2 son más propensas a mantener una flora vaginal
normal que las mujeres con lactobacilos no productores de H2O220. Las
especies de Lactobacillus facultativas producen grandes cantidades de peróxido de hidrógeno, mientras que las anaerobias no producen6.
La producción de H2O2 está fuertemente ligada con las especies y
es un predictor para la colonización sostenida a largo plazo de la vagina. Así por ejemplo, de 101 mujeres monitoreadas durante 8 meses, el 96% de mujeres quienes mantuvieron colonización por especies similares de
Lactobacillus fueron colonizadas por cepas productoras de H2O2 de
Lactobacillus crispatus o L. jensenii. En contraste, solo 1 de 21 mujeres permaneció colonizada por cepas de lactobacilos no productoras de H2O2
en similar período21.
Lactobacillus paracasei LCR 1289 es una cepa seleccionada de vagina humana por su potencial probiótico capaz de inhibir a
Staphylococcus aureus, in vitro, debido al H2O2 producido22, por su
adherencia a las células epiteliales vaginales y la competencia para receptores específicos de la exclusión16.
4
subsecuentemente al tratamiento antibiótico de la vaginitis y VB en mujeres25,26.
Con la visión de desarrollar una formulación de probióticos para el tratamiento y la prevención no sólo de la VB sino también otras infecciones del tracto urogenital, la presente investigación pretendió obtener una cepa vaginal de Lactobacillus sp. productor de H2O2 para el
tratamiento de la vaginosis bacteriana, para luego analizarle algunas otras características probióticas y tecnológicas.
Objetivos
General: Evaluar el efecto de la recolonización vaginal por Lactobacillus
sp. probiótico potencial en mujeres con vaginosis bacteriana.
Específicos:
1. Obtener cepas vaginales a partir de mujeres saludables y cero puntos según Nugent, de Lactobacillus sp. productor de H2O2 y otras
características probióticas
2. Realizar test de antibiosis de la cepa de Lactobacillus sp. seleccionada frente a Staphylococcus aureus.
3. Determinar el puntaje Nugent antes y después de la recolonización vaginal por Lactobacillus sp. probiótico potencial LBP BMP9, en mujeres con vaginosis bacteriana.
Problema
5
Hipótesis
Ho: La recolonización vaginal por Lactobacillus sp. probiótico potencial
LBP BMP9 no restablece la normalidad del ecosistema vaginal en mujeres con vaginosis bacteriana
Ha: La recolonización vaginal por Lactobacillus sp. probiótico potencial
LBP BMP9 restablece la normalidad del ecosistema vaginal en mujeres con vaginosis bacteriana
MARCO CONCEPTUAL TEÓRICO- FILOSÓFICO
La disminución de la concentración de los lactobacilos vaginales protectores, en mujeres en edad fértil, tiene relación directa con la anormalidad de la microflora del ecosistema vaginal y el padecimiento de síndrome de flujo vaginal, siendo la vaginosis bacteriana (VB) más frecuente5.
Usualmente el tratamiento de la VB se realiza con antibióticos como el metronidazol, aunque actualmente se están probando probióticos. Estos últimos nos ofrecen más ventajas con respecto a los antibióticos, como evitar el incremento de la resistencia antimicrobiana y no tener efectos colaterales principalmente15,16,17.
Surge entonces la necesidad de realizar más investigaciones para obtener un producto probiótico efectivo, para tratar la VB y probablemente otras infecciones del tracto genitourinario y así mejorar la calidad de vida de las mujeres.
6
precisamente el presente estudio pretende obtener un producto probiótico, para tratar la VB, sobre todo con cepas de nuestra población, de ahí que se orienta en el marco del positivismo empírico, descrito por primera vez por el filósofo Augusto Comte, sin embargo la tesis principal es verificacionista, la cual sostiene que una proporción es significativa si y solo si puede ser verificada empíricamente27,28.
La verificación del efecto protector fue realizada en mujeres, a quienes se les realizó el test de Nugent para valoración de la flora vaginal y el diagnóstico de VB. Luego de la categorización de las mujeres según el test de Nugent se las trató con un inóculo estandarizado de
Lactobacillus sp., por lo tanto el estudio es coherente con la categoría filosófica de la causalidad, que denota la conexión necesaria de los fenómenos, uno de los cuales (denominado causa) condiciona a otro (denominado efecto). La causa absoluta es el conjunto de todas las circunstancias cuya presencia determina necesariamente el efecto, siendo la causa absoluta el Lactobacillus sp. en una concentración de 109 ufc/mL,
administrado vaginalmente durante 7 noches. La causa específica, el conjunto de circunstancias que existen ya en la situación dada, antes que se produzca el efecto.
Así mismo, la presente tesis doctoral corresponde a una investigación de tipo cuantitativa29. Se trabajó con pacientes, cuyas
características fueron lo más homogéneas posible, a excepción de la edad. Un grupo con VB que tenía puntaje Nugent de 7 a 10 y otro con flora normal, puntaje Nugent de 3). Al ser tratadas con el inóculo de
7
El paradigma cuantitativo es a su vez deductivo según el filósofo Whewell (1986), porque los datos recolectados sirven para evaluar modelos, hipótesis preconcebidas, controlando situaciones intervinientes para finalmente establecer una observación estable, objetiva y repetible; es decir, la validez de los resultados está en función de que puedan ser verificados27. Las evaluaciones realizadas en el estudio sobre el efecto,
fueron repetidas y verificadas inmediatamente terminada las dosis de tratamiento hasta los 30 días post-tratamiento, siendo la última evaluación el criterio final como efecto para estimar los cálculos y la significancia estadística. De esta manera se confirmó la hipótesis, deduciendo que el inóculo de Lactobacillus sp. probiótico potencial tiene efecto protector o normalizador del micro ecosistema vaginal, en la dosis indicada. A mayor recolonización vaginal por el Lactobacillus sp. probiótico potencial, mayor normalidad según el test de Nugent, es decir menor puntaje Nugent.
8
II. MATERIAL Y MÉTODOS
El presente trabajo se organizó en dos fases: 1) La obtención de una cepa de Lactobacillus sp. probiótico potencial (LBP) principalmente en función de sus mayores niveles de producción de H2O2
y 2) Evaluación del efecto de la recolonización vaginal con dicha cepa de LBP en pacientes con Vaginosis Bacteriana (VB), atendidas por consulta externa en Ginecología del Hospital II Chocope – EsSalud, La Libertad, entre Noviembre del 2009 - Diciembre del 2010.
OBJETO DE ESTUDIO
La cepa de LBP denominada como Lactobacillus sp. BMP9.
La secreción vaginal de mujeres categorizadas según criterio de Nugent30
(Anexo 1) que cumplieron criterios de inclusión y exclusión (Anexo 2): Para la obtención de la cepa de LBP, 8 mujeres categorizadas como NORMAL de 18 - 38 años de edad, con cero puntos; y para la evaluación del efecto de la recolonización vaginal por Lactobacillus sp. BMP9, 16 mujeres de 23 - 40 años de edad con VB (7 – 10 puntos) y 4 de 23 – 39 años con 3 puntos.
MÉTODOS Y TÉCNICAS
1. Obtención del LBP probiótico potencial
Aislamiento, Identificación y Selección.
La cepa de LB probiótico potencial BMP9 se seleccionó a partir de la secreción vaginal de entre 8 mujeres saludables (Nugent: 0 puntos) que se enriquecieron en caldo Man Rogosa Sharpe (MRS) durante 24 horas y luego se sub-cultivaron en Agar MRS entre 35 a 37°C por 24 - 48 horas en 5 a 7% de CO2. Se aislaron 10 - 20 cultivos
9
crecimiento de hongos, enterobacterias ni cocos Gram-positivos.
Lactobacillus sp. se identificó en función de sus características morfológicas, tintoriales y pruebas bioquímicas confrontándolo con las características de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356.
Las cepas con producción >20 mg/L de H2O2 en caldo MRS a
37°C / 24 – 48 h según Test Peróxidos - Merckoquant-Merck®,
crecimiento óptimo en 24 – 48 h. y supervivencia en agar MRS por ≥ 7días, fueron pre-seleccionadas. Finalmente se eligieron aquellas que además mostraron la mayor adhesión a las células epiteliales en la muestra original, producción estable de H2O2 tras subcultivos en caldo
MRS a 35 – 37°C cada 72 horas y lograron una mayor acidez final (pH: 4.5).
El cultivo puro también se conservó en refrigeración entre 4 a 5°C31, en alícuotas para su posterior utilización.
Actividad antagónica de LBP BMP9 contra Staphylococcus aureus.
Se utilizó el método del botón32 y un cultivo salvaje indicador de
S. aureus identificado por el sistema automatizado MicroScan-Siemens®. La prueba se realizó en agar MRS, anaeróbicamente a 35 –
37°C. En placa de Petri de 100x15 mm con 10 mL de agar MRS, secada a temperatura ambiente, se colocó 2 µL de una suspensión con densidad óptica (DO) 1.70 de LBP BMP9 cultivada en agar MRS a 35 – 37°C por 18 horas y luego se incubó durante 8 horas. Posteriormente se vertieron 9 mL adicionales de Agar Müeller Hinton conteniendo 50
µL de la suspensión salina del cultivo indicador, joven, con DO 0.06. La placa se incubó en 5 - 7% de CO2 por 18 h. El efecto antibacteriano se
10
En 3 mL de sobrenadante, obtenido tras la centrifugación a 5000 r.p.m. durante 5 minutos del cultivo de Lactobacillus sp. BMP9 crecido en caldo MRS a 35 – 37°C, 5 - 7% de CO2 por 24 – 48 horas, DO final
0.20, pH final 4,5 y 25 mg/L de H2O2, se observó la inhibición del
crecimiento del cultivo indicador, para lo cual se inocularon sendos cultivos de la cepa indicadora equivalentes a DO iniciales: 0,01 y 0,06. Los sistemas se incubaron a 35 – 37°C y durante cada hora durante 24 h se midió la DO.
2. Evaluación del LBP BMP9 como probiótico vaginal en mujeres con VB
Grupo Tratamiento:
Las 20 pacientes que recibieron vaginalmente al acostarse durante 7 noches consecutivas, una suspensión de 109 Lactobacillus
sp. BMP9, productor de peróxido de hidrógeno (LB H2O2 positivo)
viables16,33, en 1mL de SSF estéril utilizando una jeringa N° 25 (de
tuberculina) nueva. De las cuales 16 tuvieron VB y 4 fueron Normales según criterio de Nugent.
Obtención de biomasa de LB H2O2 Positivo (BMP9) para
tratamiento:
La obtención de biomasa del LB H2O2 Positivo seleccionado se
realizó en agar MRS, a partir de subcultivos en caldo MRS, entre 35 - 37°C por 18 – 24 horas y 5 - 7% de CO2. El cultivo puro de
Lactobacillus sp BMP9 se suspendió en SSF estéril hasta la DO deseada (Figura 4E).
Presentación del inóculo para tratamiento:
11
MicroScan TurbidityMeter – Siemens® (Figura 4A), equivalente a 109
UFC/mL determinado en placa por recuento de diluciones decimales seriadas (Figura 4 F).
Medición del efecto de recolonización vaginal por LB H2O2 Positivo BMP9.
Los controles se realizaron los días: 1, 7, 15 y 30 post-tratamiento26. Se realizaron sendas calificaciones de la secreción
vaginal mediante el Criterio de Nugent 30.
Las muestras se colectaron con la ayuda de espéculos sin lubricación e hisopos estériles, los cuales se rotaron sobre la pared lateral vaginal para obtener la secreción. Un primer hisopo conteniendo la muestra de secreción vaginal se colocó dentro de un tubo conteniendo 10 mL de caldo MRS. El segundo hisopado se extendió sobre una lámina portaobjeto para la tinción Gram7 y test de Nugent,
luego se introdujo en un tubo conteniendo 0.5 mL de SSF estéril para la calificación de la muestra.
Análisis estadístico
Los resultados sobre el efecto de la recolonización vaginal por
Lactobacillus sp. BMP9 en mujeres con vaginosis bacteriana mostrados se analizaron, aplicándose el software SPSS v.19.0 la prueba de Student T, con una significancia estadística del 95% y 99%.
Aspectos éticos
12
III. RESULTADOS
Se aislaron 320 cultivos de Lactobacillus sp, probióticos potenciales, de la secreción vaginal de 8 mujeres con score cero puntos según criterio de Nugent (Anexos: 3 y 4) y los niveles de peróxido de hidrógeno producidos por los LBP incubados a 35 - 37°C, 5 - 7% de CO2
por 24 – 48 horas en caldo MRS se determinó mediante el método enzimático Test Peróxidos – Merckoquant (Merck®) (Anexo 5).
En general las colonias de LBP seleccionadas presentaron forma circular, ligeramente convexa y borde entero en agar MRS (Figura 1), no hemolíticas. Los bacilos fueron Gram-positivos, no esporulados, rectos y algunos ligeramente curvados, catalasa negativa, ácido sulfúrico negativo. Se pre-seleccionaron 13 cultivos puros (Tabla 1) y de los 4 productores de 25 mg/L de H2O2 (Figura 2) finalmente se seleccionó la denominada cepa
Lactobacillus sp. BMP9 (LBP BMP9)(Figura 3) para la evaluar su potencial como probiótico vaginal.
LBP BMP9 demostró tener actividad antagónica contra una cepa salvaje de Staphylococcus aureus, evaluado mediante el método de Lewus y por la inhibición del crecimiento del sobrenadante de caldo MRS donde creció. El efecto se evidenció por la formación de halos de inhibición de crecimiento y la no variación de las DO iniciales, respectivamente; en cambio, en caldo MRS la cepa indicadora logró DO finales equivalentes a 0,18 y 0,31 a partir de 0,01 y 0,06 respectivamente (Figura 4).
13
El grupo VB inicia con puntaje Nugent Promedio = 8.44 y DS= 1.263, y al día 30 de control post-tratamiento el puntaje Nugent Promedio = 3.25 y DS= 2.352. El éxito llegó al 68.8% (11/16) de normalización (Nugent final ≤ 3 puntos) (Tabla 3), mostrándose una colonización gradual por parte de los lactobacilos. En tanto que el 31.2% (5/16) a partir de la segunda semana de control muestran una disminución del morfotipo LB. La edad no influyó en los resultados obtenidos (R2= 8.2%)
14
Tabla 1. Características de cultivos puros de LBP para uso vaginal en mujeres con Vaginosis Bacteriana. Hospital II Chocope – EsSalud, La Libertad, 2010.
CEPA AISLAMIENTO
TIEMPO DE CRECIMIENTO
OPTIMO
SUPERVIVENCIA EN AMRS > 7
DIAS
ADHESIÓN A CEL EPIT
PRODUCCION ESTABLE DE H2O2 mg/L
ACIDEZ (pH FINAL)
BMP1 14 24-48 H + A 12 5.0
BMP2 63 24-48 H + A 15 5.0
BMP3 71 24-48 H + A 12 5.0
BMP4 173 24-48 H + A 21 5.0
BMP5 174 24-48 H + A 24 4.5
BMP6 208 24-48 H + A 20 4.5
BMP7 209 24-48 H + A 21 4.5
BMP8 266 24-48 H + A 20 4.5
BMP9 268* 24-48 H + A 25 4.5
BMP10 300 24-48 H + A 25 5.0
BMP11 305* 24-48 H + A 25 4.5
BMP12 311* 24-48 H + A 25 4.5
BMP13 317* 24-48 H + A 25 4.5
Leyenda:
LBP : Lactobacillus sp. probiótico potencial
(*): LBP seleccionado.
CEL EPIT: Células Epiteliales
15
Tabla 2. Valores de frecuencias observadas según edad y valores de los test de Nugent al momento del diagnóstico y días post-tratamiento vaginal con Lactobacillus sp. BMP9, en mujeres atendidas en el Hospital de Chocope II-EsSalud, 2010.
n° Edad N-0 N-1 N-2 N-3 N-4
1 23 3 4 3 4 0
2 39 3 3 4 2 2
3 30 3 3 4 3 2
4 28 3 2 2 5 3
5 35 7 4 3 3 2
6 23 7 4 3 4 0
7 28 10 3 2 3 3
8 24 9 3 4 3 1
9 23 8 4 4 3 1
10 25 10 4 3 4 2
11 32 10 4 2 4 2
12 28 7 5 5 3 3
13 30 9 6 5 5 2
14 39 9 4 3 2 2
15 33 9 5 4 2 3
16 40 7 4 2 3 4
17 33 10 6 6 5 5
18 23 9 6 7 8 8
19 33 7 5 3 3 7
20 38 7 5 6 7 7
16
Tabla 3. Valores promedio de las edades y puntajes Nugent de mujeres al momento del diagnóstico y días post-tratamiento vaginal con
Lactobacillus sp. BMP9, según puntaje Nugent normalizado (≤3).
Edad promedio
n (%)
TEST DE NUGENT R2
N-0 N-1 N-2 N-3 N-4
29.1 11 (68.8) 8.64 4.18 3.45 3.27 1.91
0.082 33.4 5 (31.2) 8.00 5.20 4.80 5.20 6.20
Leyenda: n: número de pacientes.
N-0, score Nugent el día de diagnóstico; N-1, score Nugent el día 1 post- tratamiento; N-2, score Nugent el día 7 post-tratamiento; N-3, score Nugent el día 15 post- tratamiento; N-4, score Nugent el día 30 post- tratamiento.
17
Tabla 4. Efecto de la recolonización vaginal por Lactobacillus sp. BMP9 en mujeres Normales y con Vaginosis Bacteriana, según criterio de Nugent al día 30 post-tratamiento.
GRUPO Puntaje Nugent
Número de mujeres
(%) Conclusión t OR
N-0 N-1 N-2 N-3 N-4
Normal
0 - 3 p 4
(100%) 3 (75%) 2 (50%) 2 (50%) 4 (100%) No efectos negativos 1,44 4 - 6 p nulo 1
(25%)
2 (50%)
2
(50%) 0
7 - 10
p
nulo 0 0 0 0
VB
0 - 3 p nulo 2 (12.50%) 8 (50%) 9 (56.25%) 11
(68.75%) Exito (81.25%)
7.384 4 - 6 p nulo 14
(87.5%) 7 (43.75%) 5 (31.25%) 2 (12.50%)
7 - 10 p 16
(100%) 0
1 (6.25%) 2 (12.50%) 3 (18.75%) Fracaso (18.75%) Leyenda:
VB: Vaginosis Bacteriana
18
Figura 1. Colonias de Lactobacillus sp probiótico potencial MBP9 (flecha). A: en agar MRS tras incubación a 35 – 37 °C y 5 – 7 % CO2
durante 48 horas. B: observación de una colonia de la Fig. 2A, a 100X.
A
19
Figura 2. Dosaje de H2O2 según el Test Peróxidos – Merckoquant de
Merck®. Se midió los niveles de H2O2 alcanzados por
20
21
Figura 4. A) Turbidímetro de Siemens®, durante la medición de la D.O. de un cultivo de Lactobacillus sp. B) Placa de Agar MRS - inoculación de LBP en botón.
C) Método de Lewus y detección de catalasa: Observación de la inhibición del crecimiento de una cepa salvaje de Staphylococcus aureus por la cepa BMP9. D) Cultivo testigo de la cepa salvaje indicadora en Agar Müeller Hinton. E) Inóculo de la cepa BMP9 y jeringa de 1 mL para la administración y F) Presentación del producto: Lactobacillus sp. BMP9 de tratamiento (3 mL. D.O. 1.70 y 109 UFC/mL).
A B
A
C D
22
Figura 5. Efecto del tratamiento vaginal por Lactobacillus sp. BMP9. en mujeres con Vaginosis Bacteriana (VB) y Normales según criterio de Nugent al día 30 de control post-tratamiento.
(t: 7.384; α = 0,01; p=0.000).
13
3 3
1 0
2 4 6 8 10 12 14
SI NO
VB
NORMAL
81.25%18.75% 75 %
25 % N° de
mujeres
23
IV. DISCUSIÓN
El diagnóstico de la VB puede realizarse mediante el criterio de Amsel, de Nugent y por métodos inmunocromatográficos6,30. Para este
estudio se decidió emplear el de Nugent, ya que no sólo es cualitativo sino también cuantitativo, pues refleja la carga bacteriana según el morfotipo presente en la muestra vaginal de la paciente, de forma objetiva30 y económica. Además permite demostrarle a la paciente en
tiempo real, el progreso de la normalización de su flora vaginal.
Los resultados obtenidos sugieren que la normalización del ecosistema vaginal en mujeres con VB puede ser significativamente mejorada por la aplicación vaginal de lactobacilos viables con características probióticas.
Las nuevas cepas de Lactobacillus spp. aisladas de vagina de mujeres saludables han demostrado de que podrían ser candidatas prometedoras para uso en la preparación de productos probióticos35.
Estudios previos han informado de que los lactobacilos adhesivos puede inhibir in vitro la adhesión de patógenos tales como Escherichia coli, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa,
Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae 16.
En la Tabla 1, se muestra las cepas de Lactobacillus sp. probiótico potencial MBP finalmente pre-seleccionadas de entre 8 mujeres saludables, con cero puntos, según criterio de Nugent, muestreadas durante el transcurso de un mes. La identificación de la cepa Lactobacillus
sp. se hizo en base a características fenotípicas36, sin embargo en la
actualidad la identificación de Lactobacillus acidophilus puede hacerse mediante técnicas de biología molecular37. Estas podría permitirnos hacer
24
se mantiene regulando el micro-ecosistema vaginal en las pacientes normalizadas o curadas y también para confirmar su ausencia en las pacientes cuyos resultados no fueron los esperados.
Aunque preliminarmente, para seleccionar e identificar un lactobacilo probiótico potencial contra infecciones del tracto urogenital en humanos, puede ser considerado la habilidad de coagregación con bacterias38 y la habilidad de adhesión a células cérvicovaginales39, el
criterio principal de selección aplicado en el presente estudio fue la producción de H2O2, considerando el antecedente de que la normalidad,
según criterio de Nugent, en mujeres no gestantes y en edad fértil esta mejor asociado a la presencia de lactobacilos productores de altos niveles de H2O2 en la vagina19. La estabilidad en la producción de H2O2 y de
acidez final además de otras características como: tiempo óptimo de crecimiento, de supervivencia, adhesión a las células epiteliales, en gestantes se ha asociado con un reducido riesgo de VB en las 20 semanas de gestación40 y reducción de vulvovaginitis recurrente41.
Las pruebas para selección fueron excluyentes y sólo las que calificaron fueron probadas. De los 320 cultivos o aislamientos primarios de LBP, 107 produjeron H2O2 mayor de 10 mg/L en 24 – 48 horas de
crecimiento, de estos 41 se mantuvieron viables en agar MRS a 35 - 37 °C por más de 7 días, de los cuales 36 mostraron alta adhesión a las células epiteliales vaginales observadas en la muestra original, de estas 15 mantuvieron estable su producción de H2O2; este criterio
probablemente tiene relación con la colonización vaginal sostenida a largo plazo por este tipo de cepas encontradas en otras investigaciones21 y
finalmente 8 cultivos produjeron una acidez final de 4,5 del caldo MRS cuyo pH inicial fue 6,5.
25
antibiótica42 y al nonoxinol-9 43 debido a que este último in vitro inhibe a
muchos de los lactobacilos en concentraciones de 0.1% a 1% y no tiene efecto sobre el crecimiento de Escherichia coli44. Estas y otros
características constituyen motivos de investigaciones futuras a considerar y evaluar en la cepa BMP9.
La cepa BMP9 mostró una buena actividad antibacteriana contra S. aureus, bacteria indicadora productora de catalasa, mediante la técnica del botón de Lewus, la cual es muy adecuada para la medición del efecto antagónico de bacterias acido lácticas en anaerobiosis45. El efecto puede
deberse no sólo a bacteriocinas, sino también al ácido láctico y otros metabolitos46.
En el sobrenadante del caldo MRS donde creció la cepa BMP9, el efecto principal fue debido a H2O2 producido (25mg/L ó 0.735 mmol/L).
Estos niveles son mayores en comparación a los 15.5 mg/L encontrados por otros investigadores35. Es necesario decir que, en el afán de comparar
nuestra cepa con la cepa Lactobacillus casei v. rhamnosus contenido en las cápsulas vaginales Tropivag®, esta no mostró niveles detectables de H2O2, con el método empleado, aunque su velocidad de crecimiento fue
mayor.
Los niveles de pH 4,5 probablemente no fue un factor inhibitorio para el crecimiento de S. aureus, pues es viable en ámbitos de pH amplios47, sin embargo el bajo pH vaginal inhibe el crecimiento de muchos
patógenos. La acidez está en relación directa con el nivel de estrógenos que favorece la colonización vaginal con lactobacilos, los cuales metabolizan el glicógeno para producir ácido láctico33, por lo tanto se
26
De las mujeres del grupo con VB, cinco no se consideraron en el estudio, por los criterios de eliminación citados en el Anexo 2. El restablecimiento de la flora vaginal normal podría no lograrse hasta en el 65% tras el tratamiento con metronidazol33 por lo que el tratamiento
exógeno con lactobacilos probióticos es una alternativa.
En la tabla 2, se muestra las frecuencias observadas según edad, grupos bacterianos y valores de los test de Nugent al momento del diagnóstico y días post-tratamiento vaginal con Lactobacillus sp. BMP9 de 16 pacientes con VB que iniciaron con puntajes entre 7 a 10 y 4 mujeres normales con 3 puntos. El efecto de la recolonización vaginal por
Lactobacillus sp. BMP9. en mujeres Normales y con Vaginosis Bacteriana, según criterio de Nugent al día 30 post-tratamiento es favorable y no depende del valor de Nugent al momento del diagnóstico (Anexo 6).
Los valores de los puntajes Nugent al momento del diagnóstico (N-0) son mayores y que al final, al día 30 de control post-tratamiento (N-4), es decir la recolonización vaginal en las pacientes con VB por LBP BMP9 es gradual a lo largo del periodo de estudio y el micro-ecosistema vaginal tiende a normalizarse, lo cual es estadísticamente altamente significativo (t= 7,384; α = 0,01; p=0.000) (Anexo 6).
Cuando analizamos más al detalle podemos apreciar que las edades promedio de las pacientes sometidas al tratamiento son independientes de los valores de los test de Nugent al momento del diagnóstico (N-0) y 30 días post-tratamiento vaginal con Lactobacillus sp. BMP9 (R2=0.082)
(Anexo 6).
El tratamiento de infecciones vaginales con muchas especies de
27
infección genital10. En el presente estudio se utilizó una sola cepa de
Lactobacillus excelente productora de H2O2 (25 mg/L). Es probable que la
producción de H2O2 por los LB sea uno de los más importantes, pero no el
elemento primario necesario para curar la VB; bajas concentraciones de LB productores de H2O2 fueron tóxicos para G. vaginalis, pero solo
cuando se combinó con mieloperoxidasa y Cl- que se encuentran en el
mucus cervical5.
El factor protector de este producto como probiótico vaginal (Figura 1) al término de la evaluación se puede notar aún en 2 de las 5 pacientes que no lograron un puntaje Nugent final ≤3 (normalización del micro-ecosistema vaginal). Sin embargo lograron puntajes de 4 y 5 que corresponde a una flora intermedia o susceptible de VB. Con la cepa LBP BMP9 se ha logrado un éxito del 68.8% de Normalidad y curación (puntaje Nugent <7) de un 81.25%, si incluimos además a las de flora Intermedia.
El fracaso en curación de VB, mantener puntaje Nugent ≥7, fue del 10% en una similar investigación48 en tanto que la presente mostró un
18.75% (3/16). Probablemente se deba a algunas bajas dosis aplicadas o la inadecuada conservación del producto, esto deducido de las entrevistas post-tratamiento a las pacientes y la observación del remanente del producto que devolvían; para que los lactobacilos ejerzan su función protectora podría ser necesario que se constituyan como biopelícula o biofilm y para que esto ocurra es importante la concentración para constituirla49 y asegurar la protección continua46. Otra razón podría ser
debido a que en el primer caso se utilizaron 2 cepas diferentes de
28
Al término del segundo control (7° días post-tratamiento) puede apreciarse una disminución significativa del puntaje Nugent en todas las pacientes tratadas, luego al tercer control (15° día post-tratamiento) en el grupo considerado como no curación se vuelve a incrementar el puntaje. Los LB disminuyeron, lo cual se favoreció finalmente con la menstruación y la flora de VB se incrementó. Aquí surge una propuesta, la de determinar si es que el tratamiento por una semana más, podría llegar a normalizar el micro-ecosistema vaginal de estas pacientes.
El uso de Lactobacillus LBP BMP9 no produce efectos adversos durante la terapia vaginal de recolonización, como en otro estudio donde se utilizó tabletas con Lactobacillus con bajas dosis de estrógenos23. La
cepa BMP9 no afectó negativamente cuando se administró en 4 pacientes normales con 3 puntos según Nugent y el efecto favorable con incremento de LB fue más probable en las mujeres con VB que en las normales (Odds ratio 1,44); sin embargo, aun cuando el efecto muy significativo (t= 7,384; α= 0,01; p=0.000) podría llegar al 100% de éxito, sería conveniente realizar más réplicas para obtener mayor fiabilidad de los resultados. El valor del Odds ratio = 1.44, nos dice que el 44% más de las mujeres con VB muestran efectos favorables con incremento de la microflora de LB, que las Normales, cuando reciben vaginalmente un tratamiento con
29
V. CONCLUSIONES
En las condiciones de trabajo expuestas, podemos concluir lo siguiente:
1. Se obtienen cultivos vaginales de Lactobacillus sp. productores de 25 mg/L de H2O2 para el tratamiento de la vaginosis bacteriana (VB).
2. Se demuestra, in vitro, la actividad antagónica de Lactobacillus sp. BMP9 contra Staphylococcus aureus, inhibiendo su crecimiento.
30
VI. PROPUESTA
Considerando que la recolonización vaginal exógenamente por lactobacilos probióticos (LBP) es favorable para restablecer la normalidad del micro ecosistema vaginal, además por las ventajas de su uso, pues es inocua y la posibilidad de reemplazar o reforzar la terapia antibiótica de elección para curar la vaginosis bacteriana y otras infecciones del tracto génito-urinario, a las luces de la presente experiencia se propone lo siguiente:
31
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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37 ANEXO 1
TEST DE NUGENT30 PARA EL DIAGNOSTICO DE VAGINOSIS
BACTERIANA
El frotis de secreción vaginal, coloreado con la técnica de Gram se observa con objetivo de inmersión (100X) para la identificación de los morfotipos bacterianos.
El número de organismos (células bacterianas) vistos se cuantificará en una escala de 0+ a 4+, tal como se indica:
0+ = no se observan células. 1+ = < 01 células por campo. 2+ = 01 – 04 células por campo. 3+ = 05 – 30 células por campo. 4+ = > 30 células por campo.
El cálculo del Puntaje Total se realiza sumando los puntajes individuales alcanzados por cada escala y morfotipo observados, según la siguiente tabla:
MORFOTIPOS (Cél x C)
Puntaje BGP largos:
Lactobacillus
BGv pequeños: Gardnerella y
BGN pequeños: Bacteroides
BGN curvos: Mobiluncus
> 30 0 0 0
5 – 30 < 1 < 1 - 4 1
1 – 04 1 – 4 5 – >30 2
< 1 5 – 30 3
0 > 30 4
Leyenda:
Cél: N° de células bacterianas observadas en promedio. C: Campo microscópico a 1000X.
BGP: Bacilo Gram-positivo BGv: Bacilo Gram-variable. BGN: Bacilo Gram-negativo.
VALORACION DEL PUNTAJE TOTAL: (Categorías Clínicas)
0 – 3 = NORMAL (Flora endógena).
38 ANEXO 2
CRITERIOS DE INCLUSIÓN, EXCLUSIÓN Y ELIMINACION DE MUJERES PARA EL ESTUDIO.
Criterios de Inclusión:
Mujer sexualmente activa, entre 18 y 40 años
Mujer Normal / Sintomática de Vaginosis Bacteriana. Mujer que acepta voluntariamente adherirse al estudio
Criterios de Exclusión:
Mujer con secreción vaginal positiva a hongos y parásitos.
Mujer con presencia de diplococos gramnegativos con morfotipo de Neisseria.
Mujer cuya secreción vaginal tiene índice de Leucocitos/Células epiteliales mayor que 1.
Mujer con tratamiento antibiótico en los 3 días anteriores al examen. Mujer en estado menstruación
Mujer que se aplicó ducha vaginal previa al examen. Mujer que tuvo relación sexual previa al examen.
Mujer con infección uterina, cervicitis y/o displasia vaginal.
Criterios de Eliminación:
Mujer que no cumplió con el esquema de tratamiento propuesto.
Mujer que adicionó algún tratamiento antibiótico o de estrógenos durante el período de estudio.
39 ANEXO 3
Tabla 5. Cultivos puros pre-seleccionados de Lactobacillus sp. vaginales aislados de donantes con cero puntos según Nugent, elegidos para evaluación de la producción de peróxido de hidrógeno.
N° de MUESTRA
N° de
DONANTE FECHA EDAD
CRECIMIENTO EN N° de
Cultivos MRS BHI AS MC ASb
1 1 nov-09 25 + + - - - 10
2 1 nov-09 25 + + - - - 10
3 1 nov-09 25 + + + - -
4 1 nov-09 25 + + - - - 10
5 2 nov-09 32 + + + - +
6 2 nov-09 32 + + + + +
7 2 nov-09 32 + + - - - 10
8 2 nov-09 32 + + - - - 10
9 3 nov-09 28 + + - - - 10
10 3 nov-09 28 + + - - - 10
11 3 nov-09 28 + + - - - 10
12 3 nov-09 28 + + - - - 10
13 4 dic-09 38 + + + + -
14 4 dic-09 38 + + - - - 10
15 4 dic-09 38 + + - - - 10
16 4 dic-09 38 + + + + -
17 5 dic-09 27 + + - - - 10
18 5 dic-09 27 + + - - - 10
19 5 dic-09 27 + + + - -
20 5 dic-09 27 + + - - - 10
21 6 ene-10 23 + + - - - 20
22 6 ene-10 23 + + - - - 20
23 6 ene-10 23 + + + - -
24 6 ene-10 23 + + - - - 20
25 7 ene-10 20 + + - - - 20
26 7 ene-10 20 + + + - -
27 7 ene-10 20 + + - - - 20
28 7 ene-10 20 + + - - - 20
29 8 mar-10 18 + + - - - 20
30 8 mar-10 18 + + + - -
31 8 mar-10 18 + + - - - 20
32 8 mar-10 18 + + - - - 20
Leyenda:
40 ANEXO 4
Tabla 6. Características de los aislamientos pre-seleccionados de Lactobacillus sp. aislados de pacientes sanas (Nugent: cero puntos). Hospital II Chocope – EsSalud, La Libertad, 2010.
n AISLAMIENTO DONANTE H2O2
mg/L
TIEMPO DE CRECIMIENTO OPTIMO
SUPERVIVENCIA EN
AMRS > 7 DIAS
ADHESIÓN A CEL. EPITELIALES
PRODUCCION ESTABLE DE H2O2
1 2 1 12 24-48 H + A -
2 14 1 12 24-48 H + A +
3 30 1 12 24-48 H + A -
4 59 3 12 24-48 H + A -
5 63 3 15 24-48 H + A +
6 71 3 12 24-48 H + A +
7 103 4 18 24-48 H + M -
8 108 4 15 24-48 H + M +
9 112 5 15 24-48 H + M +
10 120 5 12 24-48 H + M -
11 133 5 12 24-48 H + M -
12 160 6 12 24-48 H + A -
13 161 6 12 24-48 H + A -
14 167 6 18 24-48 H + A -
15 169 6 20 24-48 H + A -
16 171 6 21 24-48 H + A -
17 173 6 21 24-48 H + A +
18 174 6 24 24-48 H + A +
19 175 6 18 24-48 H + A -
20 206 7 20 24-48 H + A -
21 208 7 20 24-48 H + A +
22 209 7 21 24-48 H + A +
23 234 7 15 24-48 H + A -
24 244 7 15 24-48 H + A -
25 247 7 18 24-48 H + A -
26 248 7 20 24-48 H + A -
27 251 7 20 24-48 H + A -
28 266 8 20 24-48 H + A +
29 267 8 20 24-48 H + A -
30 268 8 25 24-48 H + A +
31 269 8 25 24-48 H + A -
32 273 8 20 24-48 H + A -
33 288 8 20 24-48 H + A -
34 298 8 15 24-48 H + A -
35 300 8 25 24-48 H + A +
36 304 8 20 24-48 H + A -
37 305 8 25 24-48 H + A +
38 309 8 25 24-48 H + A -
39 311 8 25 24-48 H + A +
40 317 8 25 24-48 H + A +
41 320 8 20 24-48 H + A -
41 ANEXO 5
METODO PARA DETERMINACION DE H2O2 - Test Peróxidos Merckoquant®.
1. Método.
La peroxidasa transfiere el oxígeno del peróxido a un indicador redox orgánico. Entonces se forma un producto de oxidación azul. La concentración de peróxidos se determina semicuantitativamente por comparación visual de la zona de reacción de la tira de ensayo con las zonas de una escala colorimétrica.
2. Intervalo de medida y número de determinaciones
3. Campo de aplicaciones
El test determina peróxidos inorgánicos en soluciones acuosas y disolventes orgánicos. Los peróxidos poliméricos no se determinan o sólo incompletamente. Material de las muestras:
Éteres sencillos Leche UHT
Baños de decapado y de eliminación de cobre
Decolorantes y oxidantes (fabricación de papel y tejidos)
Soluciones desinfectantes y de lavado (p. ej. tecnología de alimentos, lavanderías)
Agua de piscinas
4. Influencia de sustancias extrañas
Ésta se comprobó en soluciones con concentraciones de peróxido de hidrógeno cerca del valor central del respectivo intervalo de medida y con 0 mg/l de H2O2. La determinación todavía es interferida por las concentraciones de sustancias extrañas indicadas en la tabla.
5. Reactivos y Auxiliares
Las tiras de ensayo son utilizables hasta la fecha indicada en el envase si se conservan cerradas entre +2 y +8 °C.
Contenido del envase:
Caja con 100 tiras de ensayo (art. 1.10011.0001 y 1.10081.0001) Otros reactivos:
42
6. Preparación
Las muestras con más de 25 mg/l de H2O2 (art. 110011) o 100 mg/l de H2O2 (art. 110081) deben diluirse con agua destilada o éter exento de peróxidos. El valor del pH de la muestra acuosa debe encontrarse en el intervalo 2 - 12. Si es necesario, amortiguar la muestra con acetato sódico o ajustar el pH con ácido clorhídrico.
7. Técnica
Determinación en soluciones acuosas:
Introducir la zona de reacción de la tira de ensayo durante 1 segundo en la muestra preparada (15 - 30 °C). Dejar que se escurra el exceso de líquido por el borde longitudinal de la tira sobre un pañuelo de papel absorbente y, después de 15 segundos (art. 110011) o después de 5 segundos (art. 110081), clasificar el color de la zona de reacción de la mejor manera posible de acuerdo con una zona de color de la etiqueta.
Leer el correspondiente valor de medición en mg/l de H2O2 o estimar un valor intermedio.
Notas sobre la medición:
• Toda coloración azul dentro de 3 minutos puede interpretarse todavía como hallazgo positivo.
• Si el color de la zona de reacción corresponde a la tonalidad más oscura de la escala colorimétrica o es más intenso o aparece otra coloración, debe repetirse la medición con nuevas muestras a su vez diluidas con agua destilada o resp. éter exento de peróxidos, hasta que se obtenga un valor inferior a 25 mg/l de H2O2 (art. 110011) o 100 mg/l de H2O2 (art. 110081).
Resultado del análisis = valor de medición x factor de dilución 8. Control del procedimiento
Comprobación de las tiras de ensayo y de la manipulación:
Completar 5,0 ml de Perhydrol® (H2O2 30 % ~ 333 000 mg/l de H2O2) con agua destilada a 500 ml y mezclar. Tomar 1,5 ml de esta solución, completar con agua destilada a 500 ml y mezclar. Seguidamente analizar inmediatamente (la solución no es estable) tal como se describe en el apartado 7. El contenido de H2O2 determinado debe ser de 10 mg/l.
9. Nota
Cerrar de nuevo inmediatamente la caja tras la toma de la tira de ensayo.
43 ANEXO 6
Prueba de hipótesis para comparar los promedios de recolonización vaginal en mujeres con vaginosis bacteriana en pre y post tratamiento con LBP BMP9
1. Hipótesis estadísticas
Ho: di 0 o Ho: 1 2
Ha: di 0 o Ho: 1 2
Donde: :
i
d El promedio de puntaje Nugent en mujeres con vaginosis bacteriana antes de la recolonización vaginal por
Lactobacillus sp. probiótico potencial LBP BMP9 es mayor
al promedio de puntaje Nugent después de la recolonización vaginal por Lactobacillus sp. probiótico potencial LBP BMP9.
:
1
Promedio de puntaje Nugent antes de la aplicación del cultivo probiótico potencial de Lactobacillus sp. LBP BMP9 en mujeres con vaginosis bacteriana
:
2
Promedio de puntaje de Nugent después de la aplicación del cultivo probiótico potencial de Lactobacillus sp. LBP BMP9 en mujeres con vaginosis bacteriana
Es decir:
Ho: No existe diferencia en el promedio del puntaje Nugent antes y después de la recolonización vaginal por Lactobacillus sp. probiótico potencial LBP BMP9 en mujeres con vaginosis bacteriana.
o
La recolonización vaginal por Lactobacillus sp. probiótico potencial LBP BMP9 no restablece la normalidad del ecosistema vaginal en mujeres con vaginosis bacteriana Ha: El promedio del puntaje Nugent antes de la recolonización vaginal
por Lactobacillus sp. LBP BMP9 en mujeres con vaginosis
bacteriana es mayor al promedio del puntaje Nugent después de la recolonización vaginal por Lactobacillus sp. LBP BMP9.
o
