ESTUDIO MICROBIOLÓGICO AMBIENTAL DEL HUMEDAL GUARANAO PARAGUANÁ ESTADO FALCÓN Autor

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1 0UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL

“FRANCISCO DE MIRANDA”

ÁREA DE TECNOLOGÍA

NÚCLEO LOS PEROZO

PROGRAMA DE CIENCIAS AMBIENTALES

ESTUDIO MICROBIOLÓGICO AMBIENTAL DEL HUMEDAL GUARANAO PARAGUANÁ ESTADO FALCÓN

Autor

Jordán M. Milagro D.

Rojas. Yarubith T.

Tutor:

Prof. José Araujo

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2 Tabla de Contenido

1. Introducción ... 6

2. Objetivos ... 8

2.1. Objetivo General ... 8

2.2. Objetivo especifico ... 9

3. Antecedentes ... 9

4. Marco Teórico ... 10

4.1. La Microbiología como Ciencia ... 10

4.2. Microbiología Ambiental ... 11

4.3. Los microorganismos y su papel en el ambiente ... 12

4.4. Aspectos Microbiológicos de la Calidad del Aire ... 14

4.4.1. Bacterias ... 15

4.4.2. Hongos ... 16

4.5. Métodos en Microbiología Ambiental. ... 17

4.5.1. Morfología ... 17

4.5.2. Las Bacterias ... 17

(3)

3

4.5.4. Espiroqueta:... 20

4.5.5. Los vibrios: ... 20

4.5.6. Bacterias con apéndice ... 21

4.5.7. Los Hongos ... 21

4.5.8. Las esporas: ... 21

4.5.9. Microalgas (Fitoplancton) ... 22

4.6. Cultivo y Aislamiento de Microorganismos ... 22

Cultivo ... ¡Error! Marcador no definido. 4.7. Medios de Cultivo ... 23

4.7.1. Medios de cultivo para Hongos ... 23

4.8.2. Medio de Cultivo para Bacterias ... 24

4.8. Aislamiento de Hongos en Cámara Húmeda (Métodos de Microcultivo de Riddell) ... 24

4.9. Aislamiento de bacterias por selección de colonias ... 25

4.10. Cultivo y Asilamiento de Microorganismos del agua... 25

4.11. Cultivo y Aislamiento de Microorganismos del suelo ... 26

4.12. Cultivo y Aislamiento de Microorganismos del aire ... 26

(4)

4

4.14. Método de Muestreo: ... 27

4.15. Determinación de la Biomasa microbiana ... 28

4.16. Método de UFC y NMP ... 29

4.17. Método de Cámara de Neubauer ... 30

4.18. Identificación de microorganismos... 30

4.18.1. Macroscópica ... 30

4.19. Microscópica ... 31

4.19.1. Microscopía Óptica ... 31

4.20. Preparación de Muestra ... 31

4.20.1. Preparación húmeda: ... 31

4.20.2. Preparación fijada:... 32

4.21. Tinción ... 32

4.21.1. Tinción Simple (Azul de metileno) ... 32

4.21.2. Tinción Diferencial (Método de Gram) ... 33

5. MARCO METODOLÓGICO ... 34

5.1. Área de Estudio ... 34

(5)

5

5.3. Puntos de Muestreo ... 35

5.4. Recuperación y Promoción del Crecimiento ... 37

5.4.1. Aire: ... 37

5.4.2. Suelo: ... 37

5.4.3. Agua: ... 37

5.5. Calculo del UFC: Este realizará aplicando para los métodos propuestos en microbiología ambiental en el aire, suelo y agua por Kolwzan, (2006). ... 38

5.6. Caracterización e Identificcaión ... 38

6. Resultados Esperados ... 39

7. Bibliografía ... 41

8. Cronograma de Actividades ... 44

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6 1. Introducción

Los Humedales Costeros constituyen áreas de gran importancia biológica, con condiciones ambientales particulares derivadas de su condición de ecotonos entre el mar y la zona continental. Estos ecosistemas particulares están definidos

mayormente por una compleja interacción en donde se producen amplias fluctuaciones de la salinidad y de la temperatura, producto de la mezcla de los

aportes marinos y fluviales, la escasa profundidad de sus aguas, una elevada evaporación y altas tasas de descomposición. (López H, 2008)

Una de las definiciones muy conocidas y aceptadas es la Convención de Ramsar o Convención Relativa a los Humedales de Importancia Internacional,

especialmente como Hábitat de Aves Acuáticas, donde es expuesta como: “extensiones de marismas, pantanos, turberas y aguas de régimen natural o

artificial, permanentes o temporales, estancadas o corrientes, dulces, salobres o saladas, incluyendo las extensiones de agua marina cuya profundidad en marea baja no exceda de 6 m”; especificando que los humedales podrán

comprender/incorporar zonas costeras y ribereñas adyacentes a humedales, así como las islas o extensiones de agua marina de una profundidad no superior a los

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7 La Laguna de Guaranao es un Humedal Costero localizado en la Península de Paraguaná Municipio Carirubana del Estado Falcón, que cuenta con una

extensión de 140 hectáreas, en el cual se haya presente el ecosistema manglar, este cumple funciones tanto de carácter geomorfológico y ecológico, al

proporcionarle refugio a variedades de especies de animales como peces, y aves. De igual manera constituye zona de apareamiento cría y alimentación para gran

número de peces e invertebrados marinos (MARN 1983).

En 1991 a través del Decreto Nacional 1.848 fue decretado Parque Metropolitano Guaranao, con una poligonal cerrada que abarca una superficie

mayor a 200 ha que se distribuye desde la inter-comunal Ali Primera Punto Fijo –

Los Taques hasta la salida al mar en el puerto internacional, atravesando los sectores Blanquita de Pérez, Bloques de BTV, La Rosa, Los Caciques, Santa

Irene, Josefa Camejo, Bolívar e Industrial.

Su principal atractivo radica en el hecho de ser el único curso natural

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8 pero han sido secados progresivamente por degradación del bosque del cerro por los pobladores o por sus animales (chivos)

La contaminación de sistemas acuáticos naturales por el vertido de aguas residuales doméstica y urbana representa una de las principales causas de

pérdida de calidad ambiental de los ríos, estuarios y las aguas costeras en general. La gestión correcta de éste y otros problemas sólo puede abordarse tras

el conocimiento de la identidad e importancia de las fuentes contaminantes descargadas en el sistema receptor. Las aguas residuales domésticas pueden contener gran diversidad de agentes contaminantes de naturaleza química,

capaces de provocar cambios importantes en los ecosistemas locales, así como numerosos microorganismos patógenos (bacterias, virus), de efectos indeseables

sobre la salud. Por lo tanto, evaluar la calidad de las aguas y su grado de contaminación por materia fecal es una labor de importancia por razones de tipo

ecológico, sanitario y estético (Mayelys G, et al 2009).

2. Objetivos

2.1. Objetivo General

Evaluar la Microbiología Ambiental de la Laguna Guaranao en sus

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9 2.2. Objetivo especifico

 Establecer la ubicación de las estaciones de muestreo

 Recuperar y promover (hongos, bacterias y protozoarios) en los

componente aire, agua y suelo

 Aislar los diversos microorganismos recuperados.

 Caracterizar los hongos, bacterias y protozoarios aislados

 Identificar los hongos, bacterias y protozoarios

 Determinar el índice de calidad por UFC y NMP

3. Antecedentes

En esta parte es pertinente citar algunos antecedentes encontrados sobre el

tema de estudio. El primero a citar fue el realizado por López Y. (2007), donde permitieron emprender este estudio con el fin de realizar el rescate y

conservación de la Laguna de Guaranao mediante un plan de acción participativo establecido por la integración de la escuela- comunidad a través del método de Investigación Acción Participativa (IAP) y siguiendo lo establecido en el Currículo

Básico Nacional de Educación (CBN, ob, cit), donde plantea el fortalecimiento de los valores ambientales, éticos y estéticos y la participación organizada de la

(10)

10 4. Marco Teórico

4.1. La Microbiología como Ciencia

La Microbiología (del griego μῑκρος, Mikros, "pequeño"; βίος, bios, " vida, yλογία,logia) es el estudio de los microorganismos, un heterogéneo grupo de

organismos microscópicos unicelulares, como las bacterias, los hongos, protozoos, que también incluyen el estudio de los virus, las células microbianas

son distintas a las células animales o vegetales, que son incapaces de vivir aisladas en la naturaleza y solo pueden existir como partes de los organismos pluricelulares. Una célula microbiana puede por sí misma llevar a cabo sus

procesos vitales de crecimiento, generación de energía y reproducción independiente de otras células, de la misma o diferente clase. En este estudio se

emplearan técnicas no destructivas:

Metrología, Radiografía Industrial, metalografía de Réplica, ensayo de dureza Vickers, Microscopía Electrónica de barrido (MEB), análisis dispersivo en Energía de rayos X (EDS), micro sonda electrónica, Corrientes Inducidas, Fluorescencia de

Rayos X, Microscopía óptica para análisis de fibras con tinciones .Puede ser dividida en diversas ramas como:

(11)

11 Ecología Microbiana, Microbiología de Aguas, Aeromicrobiología, Epidemiología Microbiana y Microbiología Ambiental (Madigan y Martinko, 2006).

4.2. Microbiología Ambiental

Microbiología ambiental, en general se refiere al estudio de la composición,

fisiología, diversidad microbiana, la interacción, la asociación y los procesos de los entornos de cada uno con un conjunto definido de factores ambientales. Sin

embargo, con el desarrollo de la comprensión del medio ambiente y el papel de los microbios en el mismo, el ámbito de la microbiología ambiental se ha ampliado enormemente en los últimos años por lo que la microbiología ambiental es

aplicada en el suelo, agua, aire y sedimentos que cubren el planeta y también puede incluir a los animales y plantas que habitan en estas áreas. Microbiología

ambiental también incluye el estudio de los microorganismos que existen en ambientes artificiales como biorreactores (Pradipta, 2008).

La microbiología ambiental establece la función para el mantenimiento del equilibrio ambiental, así como también su uso para la valoración de la calidad

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12 también ser agentes capaces de ser usados para beneficio de la restauración ambiental (Keya, 2011).

4.3. Los microorganismos y su papel en el ambiente

La ecosfera donde viven los organismos se divide en los ambientes de la atmosfera (aire), de la hidrosfera (agua), y de la litosfera (suelo). No se considera que la atmosfera alberge poblaciones microbianas autóctonas, pero sirve como

medio para la dispersión rápida y de manera global de diversos tipos de microorganismos, que al ser transportados son sometidos a diversos efectos de

stress como temperatura, radiación y desecación. En comparación con la atmosfera, la hidrosfera es mucho más adecuada para el crecimiento microbiano de hecho se cree que la vida en nuestro planeta tiene su origen en un medio

acuoso, en ella se pueden encontrar poblaciones autóctonas la mayoría de las cuales presentan motilidad y crecen con bajas concentraciones de nutrientes.

En el neuston, es decir la interface entre el aire-agua, se encuentran grandes poblaciones microbianas. Los microorganismos fotosintéticos son los más

destacados del neuston y de la columna de agua subyacente donde penetra la luz. Las algas y las bacterias se distribuyen por lo general cercanas a la superficie.

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13 fotosintéticos se encuentra también en los sedimentos del litoral, donde la luz penetra hasta el fondo, mientras que aguas más profundas domina la actividad descomponedora por debajo de la profundidad de compensación que la

profundidad donde la productividad fotosintética y la descomposición respiratoria se igualan (Atlas, 2005).

Los microorganismos son los principales productores, y descomponedores

de los océanos y los mares de todo el mundo. En el hábitat marino los microorganismos planctónicos poseen una función casi exclusiva en la producción

primaria. Mientras que las plantas superiores y macroalgas bentónicas contribuyen significativamente a la producción primaria sólo en los estuarios y en las zonas litorales. En los estuarios es característico la una producción fotosintética mayor a

la del mar, y en las marismas templadas o los bosques de manglares en los estuarios tropicales, las bacterias descomponedoras y las poblaciones fúngicas

son muy importantes en estos estuarios costeros, cuyas condiciones ambientales se ven influenciadas por la influencia de las mareas (Atlas, 2005).

En los ambientes marinos hay una zona litoral otra intermareal, una zona nerítica o costera que se extiende sobre la plataforma continental, y una zona

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14 hay zonas epipelágicas de mar abierto y hábitat bénticos algunos de los cuales se dan en fosas a gran profundidad. Cada uno de estos hábitats acoge poblaciones microbianas marinas características. La mayoría de las bacterias marinas son

Gram negativas y móviles. En la zona pelágica toda la producción primaria es generada por bacterias y algas microscópicas donde la disponibilidad de nutriente

se convierte en el factor limitante para el aumento de la biomasa, donde las cianobacterias y la algas constituyen un suministro de carbono para el ecosistema

marino aunque la mayoría de las bacterias heterótrofas se encuentran en escases de nutrientes y de allí que la mayoría de las bacterias autóctonas puedan crecer a muy bajas concentraciones de nutrientes (Atlas, 2005).

4.4. Aspectos Microbiológicos de la Calidad del Aire

La cantidad de microorganismos de la atmosfera varía según la altura (101

-104 UFC / m3), y los valores más altos son los que se encuentran junto al suelo, y

en especial los dos metros inferiores, que es considerado el microclima del hombre, y disminuyen hasta los 200 metros y luego se hacen más escasos a los 5000 metros, y su presencia es rara en el límite de la troposfera y no se

encuentran en la estratosfera. El número de microorganismos en el aire es mayor en lugares poblados al compararlos de lugares abiertos sin población, por otro

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15 número de microorganismos es mayor en las zonas pobladas y después en el mar, cerca de las costas (De la Rosa, 2002).

El tiempo que permanecen los microorganismos en el aire depende de la

forma, tamaño y peso del microorganismo y de la existencia y potencia de las corrientes aéreas que los sostengan y los eleven. (Mohr, 1997)

Los índices Internacionales propuestos por la OMS para el Estudio de la Calidad de Aire se muestran a continuación:

4.4.1. Bacterias

Según Organización Mundial de la Salud (OMS) Según el documento de edición de 1993, por la comisión de las Comunidades Europeas (Cost Project 63

Report n°12)

Cuadro 1 Niveles de UFC/m3 de Bacterias en Aire

Nivel de Contaminación Concentración de Bacterias UFC/ m3 en el aire

Muy Baja < 50

(16)

16

Intermedia 100-500

Alta 500-2000

Muy Alta >2000

4.4.2. Hongos

Según Organización Mundial de la Salud (OMS) Según el documento de edición de 993, por la comisión de las Comunidades Europeas (Cost Project 63

Report n° 12)

Cuadro 2 UFC / m3 de Hongos en Aire

Nivel de Contaminación Concentración de Bacterias UFC/ m3 en el aire

Muy Baja < 25

Baja 25-100

Intermedia 100-500

Alta 500-2000

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17 4.5. Métodos en Microbiología Ambiental.

4.5.1. Morfología

Los Microorganismos pueden ser identificados por su morfología tanto las bacterias como los hongos quienes son identificados por la estructura de sus hifas y cuerpos fructíferos (Madigan y Martinko, 2006)

.

4.5.2. Las Bacterias

Son microorganismos microscópicos procariotas pertenecientes al dominio bacteria su tamaño se mide en micras (1 µm = 10-6 m) y oscila entre 0,2 µm de algunos cocos y las 5-8 µm de largo por 1,5 µm de ancho de los bacilos. Las

bacterias pueden adoptar diversas formas como, cocos, bacilos, espirilos, vibrio, cuadrados, estrellas, amorfas o con apéndices. A su vez estas pueden estar

agrupadas, solas, a pares, tétradas, octadas, cadenas, paquetes (Madigan y Martinko, 2006).

4.5.2.1. Coco:

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18 4.5.2.2. Diplococos:

Formado por dos cocos asociados de forma tal que siempre forma parejas.

Algunos diplococos poseen capsula como el Streptococcus pneumoniae (llamado

antes Diplococcus pneumoniae) es un diplococo encapsulado de bordes

adyacentes redondeados y extremos puntiagudos que le proporcionan una forma

lanceolada.. (Madigan y Martinko, 2006).

4.5.2.3. Streptococos:

Son bacterias en forma de cadena pertenecientes al filo Firmicutes producto

de una división celular sucesiva en un solo eje, del Griego στρεπτος streptos, significa que se doble o retuerce con factibilidad, como una cadena.

4.5.2.4. Stafilococos:

Son cocos, de 0,8 a 1 micras, inmóviles en forma de racimo de uvas

producto de un crecimiento celular sucesivo en varias direcciones o ejes de crecimiento, del Griego σταφυλή, staphylē, "racimo de uvas" y κόκκος, kókkos,

"gránula" aunque al ser aislados se pueden ver en diplo o cadenas.. (Madigan y

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19 4.5.2.5. Cocobacilo:

Bacilo muy corto de forma oval, podría decirse que es una bacteria que incluye la forma de bacilo (bastón) como la de coco (oval).

4.5.2.6. Bacilo:

La palabra bacilo (plural bacilos) se usa para describir cualquier bacteria con forma de barra o vara, y pueden encontrarse en muchos grupos taxonómicos

diferentes de bacterias. Sin embargo el nombre Bacillus, se refiere a un género específico de bacteria. Los bacilos son bacterias que se encuentran en diferentes

ambientes y solo se pueden observar con un microscopio (Madigan y Martinko, 2006).

Los bacilos se suelen dividir en:

4.5.6.1. Bacilos Gram positivos:

Fijan el violeta de genciana (tinción de Gram) en la pared celular porque

carecen de capa de lipopolisacárido.

4.5.6.2. Bacilos Gram negativos:

No fijan el violeta de genciana porque poseen la capa de lipopolisacárido

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20 4.5.6.3. Diplobacilos:

Corresponde a dos bacilos unidos como pareja y originado por la división en un único plano perpendicular al eje longitudinal del bacilo

4.5.3. Espirilo:

Son bacterias flageladas con forma helicoidal y espiralada, del latín sprillu

esta forma estructural hace que su movimiento sea conforme a su forma contorneada en forma de hélice, lo que les permite atravesar las mucosas y la

sangre. (Madigan y Martinko, 2006).

4.5.4. Espiroqueta:

Son bacterias Gram negativas pertenecientes al filo spirochaetes, su estructura es una célula alargada con un genoma lineal de forma helicoidal con

longitud de 5-500 micras y un diámetro de 0,1-0,6 micras (µm). Poseen una membrana externa formada por varias x capas llamada "envoltura celular" o "vaina externa" que rodea completamente el protoplasma cilíndrico. (Madigan y Martinko,

2006).

4.5.5. Los vibrios:

Son bacilos Gram negativos que presentan una sola incubación en forma

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21 permite una elevada movilidad. No forman esporas, varias especies marinas son bioluminiscentes, tanto de vida independiente como simbiótica o parasitaria. (Madigan y Martinko, 2006).

4.5.6. Bacterias con apéndice

Filamentos: filamentos ramificados que se asemejan en cierta forma a los micelios de los no relacionados fungi, entre los cuales fueron clasificados

originalmente con el antiguo nombre de Actinomycetes. (Atlas, 2005).

4.5.7. Los Hongos

Los hongos son un reino dentro del dominio eukarya, desde el punto vista morfológico son un grupo heterogéneo. Unos son unicelulares y están constituidos

por células, redondeadas o ovales con tamaños entre 3-10 micra de diámetro denominadas levaduras (Atlas, 2005).

4.5.8. Las esporas:

Son estructuras unicelulares de resistencia que contienen toda la

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22 conidiófora. Se forman por estrangulamiento del extremo de las hifas. Los conidióforos son hifas especializadas que presentan gran diversidad de forma, color, tamaño, tipo de septación, etc. (Madigan y Martinko, 2006).

4.5.9. Microalgas (Fitoplancton)

Las microalgas son microorganismos que contienen clorofila, un pigmento verde que sirve como molécula captadora de luz que hace posible que las algas

realicen fototrofía, la mayoría de las microalgas se encuentran en ambientes acuáticos sin embargo también es posible encontrarlas en el suelo. Casi las tres

cuartas partes del planeta están cubiertas por agua, solo el 0.8% corresponde al agua dulce, como lagos lagunas y ríos. (Madigan y Martinko, 2006).

4.6. Cultivo y Aislamiento de Microorganismos

Cultivo de células viables: Este método es útil para el contaje de células

vivas, se define como célula viable aquella que es capaz de dividirse para dar lugar a la descendencia, la forma habitual se hace contando a un número de células capaces de generar colonias sobre la superficie de un medio sólido.

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23 4.7. Medios de Cultivo

Para el cultivo de los microorganismos se usan diversos medios de cultivo que pueden variar según su composición química como definida o simple e indefinida o

compleja, según su naturaleza, puede ser liquida, semisólida o sólida según la cantidad del agente solidificante en este caso el agar (Schlegel, 1997).

4.7.1. Medios de cultivo para Hongos

4.7.1.1 Agar Sabouraud

El principal uso del agar Dextrosa Sabouraud es para el cultivo de hongos y levaduras. Este agar fue desarrollado como una modificación de la fórmula

original del Agar de Dextrosa, por Raymand Sabouraud (Sabouraud R, 1892).

4.7.1.2. Czapek Dox Agar

Este medio es propicio para el crecimiento de hongos, levaduras y especies

filamentosas, que pueden ser encontradas en la naturaleza. El Czapek Dox Agar es un medio semi sintético, usado en especial para los hongos contiene nitrato de sodio y nitrógeno que provee una fuente energética para el crecimiento fúngico.

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24 4.8.2. Medio de Cultivo para Bacterias

4.8.2.1. Agar Nutritivo

El Agar Nutritivo es un medio de cultivo utilizado para una amplia variedad de microorganismos. Su formulación fue sugerida por la APHA (American Public Health Association) a principios de 1900, como un medio de cultivo estándar para

el análisis de agua (APHA, 1917; APHA 1923). Este medio de cultivo se encuentra descrito en los Métodos Estándar de la APHA y de la AOAC

(Association of Oficial Analytical Chemists) como un medio útil para el análisis de agua, alimentos y otros materiales (AOAC, 1995). (Marshall RT, 1993).

4.8. Aislamiento de Hongos en Cámara Húmeda (Métodos de Microcultivo de Riddell)

El método de microcultivo desarrollado por Riddell este método crea un ambiente propicio para generar la esporulación de especies fúngicas el cual consiste en inocular con aguja de inoculación estéril pequeños cubos de medio

agar con aproximadamente 1 cm3 dispuestos sobre láminas portaobjetos, la cual

estará sobre una base en forma de U realizado con una barrilla de vidrio o pipeta

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25 de una capsula de Petrí estéril la cual será incubada a temperatura ambiente y en condiciones de luz natural durante un lapso de 10-15 días. (Casas Rincón, 2006).

4.9. Aislamiento de bacterias por selección de colonias

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayoría de los casos, mediante la producción de colonias aisladas en cultivos sólidos. El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran número

de ellas a partir de una única célula inicial de forma que, tras un periodo de incubación en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia

observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano). Sin (Schlegel, 1997).

4.10. Cultivo y Asilamiento de Microorganismos del agua

En Venezuela hasta los momentos las Normas COVENIN establecen

métodos desarrollados para el análisis de muestras de agua con fines de consumo, mientras que no se estableces procedimientos normados para el análisis de aguas con fines recreacionales, por otro lado algunos investigadores y

laboratorios de análisis adoptan el uso de la metodología estándar desarrollada por el ISO, la cual puede ser usada con diversos niveles de sensibilidad según, el

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26 usadas para el cálculo del NMP este tipo de estudio hace más confiable los resultados. (APHA, 1992).

4.11. Cultivo y Aislamiento de Microorganismos del suelo

Las muestras de suelo deben ser tomadas a una profundidad determinada

para evitar interferencia con posibles contaminantes del aire, para este procedimiento se utiliza una pala estéril y un cubo o una bolsa plástica nueva, en

donde se colocan entre 200g a 1Kg colectados a 20 o 30 cm del suelo, esta técnica permite recuperar la gran abundancia de microorganismos presentes en el suelo.

4.12. Cultivo y Aislamiento de Microorganismos del aire

Cada vez somos más consientes de que el aíre es vehículo transmisor de agentes biológicos, entre lo que se incluyen hongos, bacterias, protozoos, y sus subproductos, además de polen y otros elementos presentes, estos

microorganismos son trasladados y pueden cambiar las condiciones de los ambientes donde se posan o logran colonizar de allí la importancia de reconocer y

(27)

27 4.13. Sedimentación pasiva

El Método más utilizado es el conocido como Sedimentación pasiva. El cual se basa en dejar placas abiertas que contienen medio de cultivo de agar, durante

varios minutos y esperar que las corrientes de aíre lleven a los microorganismos suspendidos en el aíre choquen y se pongan en contacto con ellas (Kolwzan, 2006

Microkit, 1999; Buttner y Col, 1997).

4.14. Método de Muestreo:

Uno de los métodos de muestreo más usados es el muestreo por

sedimentación pasiva en el que se dejan abiertas placas de Petri por un periodo de tiempo de 10 a 20 minutos y esperar que sedimenten los microorganismos de la columna de aíre. Es un método claramente cualitativo y semi cuantitativo,

algunos autores recomiendan no utilizar el estándar de UFC/m3 mientras que otros

sugieren el cálculo de las UFC/Placa multiplicada por 10 para obtener resultados

en UFC/m3, Temperaturas de Incubación: en general en el aire intramural hay dos

tipos de poblaciones microbianas a parte de de los actinomicetos de cierto tipo de aire como el de las tenerías, fabricas, silos, textiles entre otros que incluye la flora

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28 4.15. Determinación de la Biomasa microbiana

Existen varios métodos para medir el crecimiento microbiano:

• Métodos directos. Son aquellos en los que se cuenta el nº total de células en un

volumen conocido y así se estima el nº total en la población. Entre ellos:

a. Recuento directo del nº de células al microscopio. Se utilizan portas especialmente diseñados para el recuento celular y denominados cámaras de

recuento.

b. Contadores electrónicos. Las células son suspendidas en un fluido conductor que pasa lentamente a través de una abertura fina por la que pasa una corriente

eléctrica.

c. Recuento de células viables. Haciendo diluciones apropiadas seguidas de

siembra sobre placas Petri podemos obtener crecimiento de colonias aisladas procedentes cada una de una única célula.

d. Métodos indirectos. Son aquellos que utilizan parámetros distintos del nº de

células, pero que pueden relacionarse de forma directa con éste (masa celular, actividad metabólica.

Entre los métodos indirectos se encuentran:

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29 b. Determinación del nitrógeno celular. Medir el contenido proteico del cultivo. c. Determinación del DNA.

d. Determinación de una actividad metabólica según el tipo de microorganismo: consumo de oxígeno (en aerobios), liberación de CO2 u otro producto de

fermentación, aumento de la concentración de alguna enzima constitutiva, incorporación en la célula de algún material radiactivo, etc.

e. Medida de la turbidez del cultivo (Madigan y Martinko, 2006).

4.16. Método de UFC y NMP

Una ventaja especial de los medios de las pruebas en agar es que proporcionan números - unidades formadoras de colonias (UFC). Para el análisis

de UFC se debe utilizar las herramientas estadísticas diseñadas para la distribución de Poisson (Ilstrup 1990) o bien convertir los datos para aproximar la

distribución normal. Esta conversión de datos se puede hacer mediante el uso de sus valores en log10 o tomando la raíz cuadrada de (n +1) (Ilstrup 1990).

El método del Número Más Probable consiste en la enumeración de los

microorganismos y es el método más comúnmente utilizado en el laboratorio (USP 2003b) o en otras situaciones en que la muestra no se puede poner en una

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30 4.17. Método de Cámara de Neubauer

La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al

de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una

depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado

con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área

sombreada y marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma

que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 micro litro (INE, 1982).

4.18. Identificación de microorganismos

4.18.1. Macroscópica

Las bacterias y los hongos pueden ser estudiados de forma macroscópica al ser cultivados en placa de Petri este tipo diverso de formas es útil para la

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31 identificación de las colonias que crecen en el medio cultivo, identificando tres elementos de interés. 1) La Forma: puede ser puntiforme, circular y ovalada, filamentosa, irregular, rizoide, fusiforme. 2) La Elevación: plana, elevada, convexa,

pulvinada, umbonada, montañosa, crateriforme. 3) El Margen: entero, ondulado, lobulado, erosionado, filamentoso, rizado (Rossi, 1936).

4.19. Microscópica

4.19.1. Microscopía Óptica

El microscopio es un instrumento que permite la observación de organismos que no pueden ser apreciados en detalle a simple vista, es decir de los

microorganismos. (Rossi, 1936).

4.20. Preparación de Muestra

4.20.1. Preparación húmeda:

Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos

(32)

32 4.20.2. Preparación fijada:

Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una gota de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes

químicos) y después se tiñen mediante diferentes técnicas. (Rossi, 1936).

4.21. Tinción

Las tinciones son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas

sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante. (Rossi, 1936).

4.21.1. Tinción Simple (Azul de metileno)

Azul de metileno (Tinción positiva). Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si

(33)

33 4.21.2. Tinción Diferencial (Método de Gram)

La tinción de Gram es un método empírico para diferenciar especies de bacterias en dos grandes grupos (Gram-positivas y Gram-negativas), basado en

(34)

34 5. MARCO METODOLÓGICO

5.1. Área de Estudio

La Quebrada de Guaranao se encuentra ubicada en el Sector Suroeste de la Península de Paraguana, Estado Falcón. En su curso bajo, atraviesa la ciudad

de Punto Fijo, para desembocar finalmente en el Golfo de Venezuela, al Norte del Puerto de Guaranao.

Desde el punto de vista urbano la Quebrada en sus últimos 7,5 kilómetros de recorrido forma parte del área definida por MINDUR como ´´ Área Metropolitana

Punto Fijo- Los Taques, según Gaceta Nº 3034 de Fecha 18/ 10/1982. Según la División Político Administrativo Vigente, pertenece a los Municipios Autónomos

Carirubana (Capital de Punto Fijo).

5.2. Zona de Estudio

Ubicación de las estaciones de muestreo: Se realizará un estudio cartográfico para puntualizar las estaciones de muestreo según los siguientes criterios.

 Actividad Antrópica

 Entrada de o salida de cuerpos de agua (dulce o salobre)

(35)

35  Posibles lugares de pesca

 Lugares de esparcimiento

 Vertido de desechos sólidos

Esto se realizará aplicando una encuesta (anexo 1) y organizando los datos en una matriz compilada en una tabla descriptiva. Una vez determinadas las áreas en las zonas de estudio según los datos obtenidos las estaciones de muestreo

serán ubicadas según el método de cuadricula estableciendo una escala adecuada.

5.3. Puntos de Muestreo

Se establecieron 5 estaciones de muestreo tomando como criterio, el posible efecto de la actividad antrópica la entrada y salida del cuerpo de agua, y lugares con vertido de desechos sólidos como se muestra a continuación

Tabla N° 1 Estaciones para la toma de muestra en la zona de estudio de la Laguna del Parque Metropolitano Guaranao

Estación Coordenadas

E1 11°40'28.36"N;

70°12'34.74"O

(36)

36 70°12'32.84"O

E3 11°40'39.68"N;

70°12'22.17"O

E4 11°41'6.88"N;

70°11'24.49"O

E5 11°41'27.24"N;

70°11'0.15"O

Fuente: Google Earth Rojas y Jordan, 2012.

(37)

37 5.4. Recuperación y Promoción del Crecimiento

Los grupos de los microorganismos serán recuperados y examinados en los diversos componentes según los siguientes métodos:

5.4.1. Aire: Sedimentación Pasiva medido en UFC/m3 para hongos en medios de agar PDA y bacterias Agar Nutritivo crecidos a temperatura para microorganismos mesofilos.

5.4.2. Suelo: Crecimiento por dilución en Placa de 10.-1 a 10.5 medidos en UFC/g. El método de dilución en placa determinando el NMP/g, aplicando para

ambos métodos el crecimiento de hongos en agar Saboraud y de bacterias en agar nutritivo, a temperatura propicia para la promoción de la flora mesófila (37°C).

Observación por microscopía óptica en cámara de Neubauer y lámina de contacto para la cualificación y cuantificación de microalgas medidas en cel/ml.

5.4.3. Agua: Crecimiento por dilución en tubos múltiples y placa medido en UFC/ ml, en agar PDA para hongos y agar nutritivo para bacterias. El método de dilución

(38)

38 microorganismos termoresistentes) en medio presuntivo de caldo lauril triptosa fosfato triple concentrado y medio confirmativo de bilis verde brillante, con crecimiento a temperatura de microorganismos mesófilos a 37°C. Morfotaxonomía

microscópica de microalgas en cámara de Neubauer medidas en cel/ml.

5.5. Calculo del UFC: Este realizará aplicando para los métodos propuestos

en microbiología ambiental en el aire, suelo y agua por Kolwzan, (2006).

5.6. Caracterización e Identificcaión

Las diversas UFC recuperadas en el aire (UFC/m3), suelo (UFC/g) y agua

(UFC/ml), serán agrupadas para la comparación de características

macromorfológicas y micromorfológicas de las bacterias y hongos. Las

macro-características culturales de las colonias bacterianas serán registradas según la morfología colonial propuesta por Thomas Kerr 1989, y las características micromorfológicas serán establecidas por la naturaleza morfológica y afinidad a la

tinción diferencial de Gram observable por microscopía óptica.

La comparación de las características macro y micromorfológicas permitirán establecer las diferentes cepas recuperadas que serán nombradas colocando el

(39)

39 hongos (H), bacterias (B). Si la cepa corresponde a la misma placa serán enumeradas con letras en minúsculas.

6. Resultados Esperados

Culminada la toma de muestras se procederá a la aplicación de la metodología planteada, y se espera obtener una demostración de la diversidad

microbiana existente en el agua, aire y suelo del humedal Guaranao, a fin de generar un registro de hongos, bacterias y protozoarios en los componentes mencionados del ecosistema.

Con la obtención apropiada del registro microbiológico ambiental y los análisis

físico-químicos aportados, se podrá evaluar las condiciones físico-naturales del agua, aire y suelo del humedal Guaranao

 En el caso particular de la evaluación del humedal Guaranao, se espera

aportar las condiciones sanitarias del cuerpo de agua, así mismo, dar una

clasificación para el uso de este recurso y proponer posibles tratamientos considerando el estado del ecosistema y las necesidades de la población

(40)

40  Para el sustrato suelo, se plantea caracterizar los microorganismos

presentes y la proporción de los mismos, para comparar con estudios similares.

 En el aire, establecer la calidad de la atmósfera presente. Generalmente en

condiciones naturales y de bajas perturbaciones, el aire como medio de estudio posee menor diversidad de microorganismos que en el sustrato agua y suelo tal como manifiesta la literatura recabada.

 Comparar los resultados obtenidos de los componentes agua, suelo y aire

(41)

41 7. Bibliografía

Atlas M Ronal, Bartha Richard, Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental,

Cuarta edición, Pearson, Madrid, 2005.

APHA, AWWA, WPCF. Métodos estándar para la evaluación de aguas potables y aguas residuales .USA. pp.2.1- 289;3. 1-3.138;4.1-4.235; 5.1- 5.62; 6.158- 6.198;

7.1-7.70. 1992.

Beveridge, TJ y Graham LL. Capas de la superficie de las bacterias. Microbiol Rev. 55 (4) :684-705, 1991.

Kolwzan, Barbara. Waldemar AdamiaK, Kazimierz Grabas, Adam awelczyk, Introdution to Envronmental Microbiology,Wydawnicza Politechniki Wroclawskiej,

Wroclaw, 2006.

CASAS R. (1994). Micología General Segunda Edición Caracas – Venezuela.

(42)

42 DECRETO N° 883, Normas para la clasificación y el control de la calidad de los cuerpos de agua y vertidos o efluentes líquidos 11 de Octubre de 1995.

DE LA ROSA, (2002). El aire: hábitat y medio de transmisión de microorganismos. ObservatorioMedioambiental Vol. 5 pp 375-402

Instituto Nacional de Ecología, (INE) Manual de técnicas de Muestreo y Análisis de plancton y Perifiton, México, 3ra edición, pp228, 1982.

Keya Sen and Nicholas J Ashbolt, Environmental Microbiology Current Tecnology and Water Applications, Ed Caister Academic Press, 317pp, 2011.

Microkit, S.L. Proyecto Microkit para la optimizar la sensibilidad de los parámetros

del muestreo microbiológico del aire, 1999.

Madigan M, Martinko J (editores) Brock Biología de los Microorganismos (11ª ed.)

Prentice Hall, 2006.

Mohr, A. J. Fate and transport of microorganisms in air. En: Hurst, C. J. et al. (ed). Manual of environmental microbiology. Ed. American Society for Microbiology,

Washington, 1997.

López, H. 2008. Estudio Preliminar del estado actual de las pesquerías del Parque

(43)

43 Pradipta K. Mohapatra, Environmental microbiology, Ed I.K. International, 533pp, 2008.

Rossi, G., S. Ricardo, G. Gesue, M Stanganelli, y T.K. Wang. Direct microscopic and bacteriological investigations of the sed. Soil Sciencie 41:53-66, 1936.

Schlegel, Hans G Microbiología General, Ediciones Omega, Barcelona 650pp 1997.

Raymand Sabouraud (Sabouraud R, 1892). Sabouraud. R. XXXXXXX Ann. Dermatol. 3:1061, 1892.

Riddell, Roland W, Permanent Stained Mycological Preparations Obtained by Slide

Culture, Mycologia, 42, (2): 265-270, 1950.

Secretaría de la Convención de Ramsar, 2010. Uso racional de los humedales:

Conceptos y enfoques para el uso racional de los humedales. Manuales Ramsar para el uso racional de los humedales, 4ª edición, vol. 1. Secretaría de la

Convención de Ramsar, Gland (Suiza).

López Y, Piñero M. 2007. Investigación y acción participativa como herramienta epistemica en la integración escuela- comunidad para el rescate y conservación

(44)

44

8. Cronograma de Actividades

Mes M1 M2 M3

M4

M5

M6

Revisión Bibliográfica

x x x

x

Toma de Muestra

x

Procedimiento x x

x

Objetivo 1 x

Objetivo 2

x

Análisis de Resultado

x

x

Escritura

x

x

(45)

45 9. Presupuesto

Cantidad Materials Precios Precio total 50 Envases estériles para la toma de

muestra

5 Bs f C/U 250 Bs f

2 Cajas de Guantes 70 Bs f C/U 140 Bs f

2 Frascos Antibactrial 75 Bs f C/U 150 Bs f

1 Caja de tapa boca 30 Bs f C/U 30 Bs f

1 Botella de alcohol 130 Bs f C/U 130 Bs f

2 Caja de algodón 45 Bs f C/U 90 Bs f

2 Rollo de papel adsorbente 30 Bs f C/U 60 Bs f

1 Rollo de papel aluminio 30 Bs f C/U 30 Bs f

Medios de Cultivo

1 1

Saburaud Agar Nutritivo

1800 C/U 1800 C/U

1800 Bs f

(46)

46 Reactivos

2 2

azul metileno Safranina

40 Bs f C/U 30 Bs f C/U

80 Bs f 60 Bs f

2 Frascos de Lugol 30 Bs f C/U 60 Bs f

Implementos de Limpieza e higiene

2 Jabón liquido 24 Bs f C/U 48 Bs f

2 Toallitas Desinfectante 50 Bs f C/U 100 Bs f

1 Gerdex 300 Bs f C/U 300 Bs f

2 Pañitos 15 Bs f C/U 30 Bs f

Materiales de Vidrio

4 pipetas 30 Bs f C/U 120 Bs f

4 Propipetas 100 Bs f C/U 400 Bs f

4 Vasos de Precipitado 50 Bs f C/U 200 Bs f

1

Tubos de ensayos(caja)

100 Bs f C/U 100 Bs f

(47)

47

2 Picetas 30 Bs f C/U 60 Bs f

100 Capsulas de Petri 5 Bs f C/U 500 Bs f

2 Cajas de Cubre objeto 50 Bs f C/U 100 Bs f

2 Cajas de Porta objeto 20 Bs f C/U 40 Bs f

Total 6.778 BS F

Figure

Figura 1 Cámara de Neubauer

Figura 1

Cámara de Neubauer p.30
Tabla  N°  1  Estaciones  para  la  toma  de  muestra  en  la  zona  de  estudio  de  la  Laguna del Parque Metropolitano Guaranao

Tabla N°

1 Estaciones para la toma de muestra en la zona de estudio de la Laguna del Parque Metropolitano Guaranao p.35
Figura  N°  2  Mapa  de  las  estaciones  de  muestreo  en  la  laguna  del  Parque  Metropolitano Guaranao

Figura N°

2 Mapa de las estaciones de muestreo en la laguna del Parque Metropolitano Guaranao p.36

Referencias

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