Efecto genotoxico de la t 514 obtenida de karwinskia humboldiana sobre linfocitos humanos in vitro

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

FACULTAD DE MEDICINA

EFECTO GENOTOXICO DE LA T-514 OBTENIDA DE Karuñnskia humbcfldtiarw SOBRE

LINFOCITOS H U M A N O S in vitro

POR

MA. DEL ROBLE VELAZCO CAMPOS

Como requisito parcial para obtener el Grado de DOCTOR EN CIENCIAS con Especialidad

en Farmacología y Toxicología

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

FACULTAD DE MEDICINA

E F E C T O GENOTOXICO DE LA T - 5 1 4 OBTENIDA

D E Karwinskia humboldtiana S O B R E

LINFOCITOS HUMANOS

in vitro

P o r

MA. DEL ROBLE VELAZCO CAMPOS

C o m o r e q u i s i t o p a r c i a l p a r a o b t e n e r e l G r a d o d e

DOCTOR EN CIENCIAS c o n E s p e c i a l i d a d

e n F a r m a c o l o g í a y T o x i c o l o g í a

o

A

FONDO

"EFECTO GENOTOXICO DE LA T - 5 1 4 OBTENIDA DE Karwinskia humboldtiana SOBRE LINFOCITOS H U M A N O S in vitro"

Aprobación de la Tesis:

DRA. PATRICIA OSTfìOSKY W E G M A N ' o c a l

DO PINEYRO LOPEZ 2 d o . V o c a l

^cJL

DR. JULIO SEFjULVEDA S A A V E D R A 3er. V o c a l

DR. ROBERT

V

A D O LONGORIA ctor

Asesores:

Dr. Med Oscar Torres Alanís

asesor principal

Dra. Patricia Ostrosky Wegman

asesor e x t e r n o

AGRADECIMIENTOS

A ICONACYT]

C O N S E J O NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA

por la beca o t o r g a d a con No. de Registro 5 3 0 4 7

Area; Ciencias Biomédicas

G r a d o : Doctorado

A los m i e m b r o s del J u r a d o Examinador, Dra. Garza Ocañas, al Dr. Torres

Alanís, al Dr. Sepúlveda, por s u s valiosos c o m e n t a r i o s y s u g e r e n c i a s e n la

revisión d e este t r a b a j o .

Al Dr. Alfredo Piñeyro por b r i n d a r m e s u apoyo y confianza p a r a la realización

de mí tesis.

A la Dra. L a u r a Martínez de Villarreai por s u apoyo y motivación a seguir

a p r e n d i e n d o ,

A Regina por las experiencias Inolvidables q u e p a s a m o s d e n t r o y f u e r a del

laboratorio.

A Ana Ma., Marlcha, Paty Ramírez,

Montserrat, A u r o r a Castillo, Alejandra,

del laboratorio u n sitio en d o n d e se

Emilio, Luís Alonso, Luis S e r r a n o ,

D e y a n i r a y E r n e s t o Torres por hacer

Con especial cariño y admiración a la Dra. Patricia Ostrosky Wegman. Gracias por creer en mí y darme !a oportunidad de aprender tus enseñanzas, por tu

DEDICATORIA:

A mis padres, Ma. Elena y Marcelo, testigos amorosos y solidarios de mi vida; a mi hermana Alejandra,

a Manuel con todo mi amor

TABLA DE CONTENIDO

C a p í t u l o Página 1 INTRODUCCION

1.1 Generalidades . . . 1

1.2 Carcinogénesis Q u í m i c a . . . 4

1.3 P r o d u c t o s Naturales en el Tratamiento del C á n c e r . . . 6

DERIVADOS ANTRAQ U ÍNONIC OS Y ANTRACENONICOS 2.1 Generalidades . . . 10

2.1.1 N o m e n c l a t u r a y E s t r u c t u r a Q u í m i c a . . . 11

2.1.2 Metabolismo . . . 11

2 . 2 Mutagenicldad . . . 14

2.3 Carcinogenicidad. . . . 17

2.4 Actividad Citostàtica . . . 17

2.4 Kdnulnskia humboldtíuna . . . . 18

EL CULTIVO DE L1NFOCITOS HUMANOS 3.1 Generalidades . . . . 22

3 . 2 El Ciclo Celular . 2 4 3 . 3 Aberraciones Cromosómicas 26 3 . 4 Intercambio de C r o m á t i d a s H e r m a n a s 27 3 . 5 Cinética de Proliferación Celular e Indice Mitótico. 30 3 . 6 Activación Metabòlica . . . . 32

5 MATERIAL Y METODO

5.1 Llnfocitos H u m a n o s . . . - . . 3 7 5.1.1 D o n a d o r e s . . . . . 37

5 . 1 . 2 Cultivo de Llnfocitos 37 5 . 1 . 3 Preparación de Lamniniiias . . . . 3 8

5 . 1 . 4 Tinción . . . . . 39

5 . 1 . 5 Análisis Microscópico. . . . 4 0 5.1.5.1 Indice Mitótico . . . 4 0 5.1.5.2 Cinética d e Proliferación Celular . 41

5.1.5.3 I n t e r c a m b i o s d e C r o m á t i d a s H e r m a n a s 41 5.1.5.4 Aberraciones Cromosómicas . . 41

5 . 1 . 6 Activación Metabóllca 42

5 . 1 . 7 T r a t a m i e n t o s 42 5 . 1 . 8 Análisis E s t a d í s t i c o 44

5 . 1 . 9 Citometría d e Flujo . . . 4 5 5.1.9.1 Obtención de Células M o n o n u c l e a d a s . 46

5 . 1 . 9 . 2 Tinción 47 5.2 Salmone/fa typhlmuiium

(Prueba de Ames) , . . . . . 4 8

6 RESULTADOS

6.1 Cultivo d e Llnfocitos

6.1.1 Aberraciones Cromosómicas . , . . 5 0

6.1.1.1 Sin Activación Metabòlica . . 5 0 6.1.1.2 Con Activación M e t a b o l i c a . . . 5 3

6.1.2 Intercambios de C r o m á t i d a s H e r m a n a s

6.1.2.1 Sin Activación Metabòlica . . . 5 6 6.1.2.2 Con Activación Metabòlica . . . 5 7 6 . 1 . 3 Cinética d e Proliferación Celular

e Indice Mitótico

6.1.3.1 Sin Activación Metabòlica . . 5 8 6.1.3.2 Con Activación Metabòlica . . . 6 2

6.1.4 Citometría de Flujo 66 6.2 Salmonera íyphimurium . . . . . 6 8

7 DISCUSION

7.1 Cultivo de Linfocltos 71 7.1.1 Aberraciones Cromosómicas . . . 7 1

7.1.3 Cinética de Proliferación Celular

e Índice Mitótico 73 7 . 1 . 4 Citometría de Flujo 77 7.2 S a l m o n e r a typhUnu.riu.rn . . . . . 7 8

8 CONCLUSIONES , RECOMENDACIONES

Y CONTRIBUCIONES 80

LISTA DE TABLAS

Tabla Página

1 F r e c u e n c i a de Aberraciones C r o m o s ó m i c a s

E s t r u c t u r a l e s en Linfocitos . . . . . 5 1

2 Frecuencia de Aberraciones C r o m o s ó m i c a s E s t r u c t u r a l e s

en Lintocitos con Activación Metabòlica . . . 5 4

3 Efecto de la T-514 sobre la Cinética de

Proliferación C e l u l a r . . . 5 9

4 Efecto de la T-514 sobre la Cinética de Proliferación

Celular con activación metabòlica . . . 6 3

5 Efecto de la T - 5 1 4 sobre la Cinética de Proliferación

Celular por 2 h r s s i n activación metabolica . . . 6 5

6 Efecto de la T-514 sobre la Cepa TA1537 de

Saímoneíia typhlmurium . . . . 6 9

7 Efecto de la T - 5 1 4 sobre l a s C e p a s TA98 y TA 100

LISTA DE FIGURAS

Figuras Página

1 Clasificación de los C a m b i o s Moleculares en el DNA

que Aparecen como R e s u l t a d o de la Mutación . . . 4 2 Diferentes E s t r u c t u r a s Q u í m i c a s d e los Derivados

A n t r a q u l n ó n l c o s . . . 12 3 D i a g r a m a E s q u e m á t i c o del Metabolismo de los

Glucósidos y Agliconas A n t r a q u l n ó n l c a s . . . . 1 3 4 E s t r u c t u r a s Q u í m i c a s de Algunos C o m p u e s t o s

A n t r a c e n ó n i c o s y A n t r a q u l n ó n l c o s . . . . . 1 8

5 E s t r u c t u r a Q u í m i c a de la T-514 2 0 6 D i a g r a m a del Ciclo Celular que M u e s t r a las Proporciones _{O c u p a d a s p a r a c a d a Fase . . . . 2 5}

7 Representación E s q u e m á t i c a de u n Modelo p a r a el

Mecanismo d e ICH E s p o n t á n e o e Inducido por M u t á g e n o s . 29 8 Incorporación de BrdU p a r a el Análisis de la Cinética de

Proliferación Celular . . . . 3 2

9 E s q u e m a del Cultivo de Linfocltos . . . . . 3 9

1 0 E s q u e m a de los Intercambios y s u Valor . . . . 4 1

11 I n t e n s i d a d de Fluorescencia Relativa. . . . 4 5 1 2 E s q u e m a del Procedimiento p a r a la Detección de

M u t á g e n o s en Salmonella typhlmurtum . . . 4 8 1 3 Efecto de la T - 5 1 4 s o b r e el Número de Rompimientos

Totales 52

1 4 Efecto de la T-514 s o b r e el N ú m e r o de Células con

1 5 Electo d e la T - 5 1 4 s o b r e el N u m e r o d e Rompimientos

Totales en Presencia de Activación Metabòlica . . . 5 5 16 Efecto de la T - 5 1 4 s o b r e el N ú m e r o d e Células con

Aberraciones en Presencia de Activación Metabòlica . . 56

1 7 Efecto de la T - 5 1 4 s o b r e la F r e c u e n c i a de I n t e r c a m b i o s

de C r o m á t l d a s H e r m a n a s . . . 5 7

1 8 Efecto d e la T - 5 1 4 s o b r e la F r e c u e n c i a de I n t e r c a m b i o s d e C r o m á t l d a s H e r m a n a s e n Presencia de

Activación Metabòlica . . . . 5 8 1 9 C o m p a r a c i ó n del Efecto de la T - 5 1 4 y la MM-C sobre la

Cinética de Proliferación Celular 60

20 Comparación del Efecto de la T - 5 1 4 y l a MM-C s o b r e el

Indice d e Replicación . . . . 0 1 2 1 C o m p a r a c i ó n del Efecto de la T-514 y la MM-C s o b r e la

Inhibición del Indice Mltótlco . . . . . 6 2 2 2 Efecto d e la T - 5 1 4 s o b r e la Cinética de Proliferación

Celular en Presencia de Activación Metabòlica . . . 6 3 2 3 Efecto d e la T - 5 1 4 s o b r e la Inhibición del Indice Mitótico

y el Indice de Replicación en Presencia d e Activación

Metabòlica 64

2 4 Efecto de la T - 5 1 4 s o b r e la Cinética de Proliferación

Celular por 2 h r s de Exposición . . . . . 6 5 2 5 Efecto de la T - 5 1 4 s o b r e la Inhibición del Indice Mitótico

y el Indice de Replicación por 2 h r s de Exposición . . 66

2 6 P o r c e n t a j e s de las F a s e s del Ciclo Celular en Cultivos de 2 4

AC Ac.PC 9-AAC 2-AA BrdU Cone. CP CPC DNA hrs ICH IM m mM MM-C NADPH P PHA rpm S9

NOMENCLATURA

Aberraciones C r o m o s ó m l c a s

Acido Plcrolónico

9-Aiiiinoacridina

2 - Amin oari traceno

Bromodesoxiuridlna

Concentración

Ciclofosfamida

Cinética de Proliferación Celular

Acido Desoxirribonucléico

Horas

Intercambio de C r o m á t i d a s H e r m a n a s

Indice Mitótico

Indice de ReplicacLón

micro Molar

mili Molar

Mitomicina-C

Nicotlnamlda Adenina Dinucleótido Reducido

probabilidad

Fltohemaglutinina

Revoluciones por Minuto

R E S U M E N

Ma. del Roble Velazco C a m p o s

Universidad Autónoma de Nuevo León

Facultad de Medicina

Título del Estudio:

Número de páginas: 91

Area d e E s t u d i o : ToxicoJogía G e n é t i c a

F e c h a de g r a d u a c i ó n : E n e r o 1 9 9 9

Candidato p a r a el g r a d o d e Doctor e n Ciencias con Especialidad e n Farmacología y

Toxlcología

EFECTO GENOTOXICO DE LA T - 5 1 4 OBTENIDA DE Karwinskia humboldtlana

SOBRE LINFOCITOS HUMANOS in uiíro

P r o p ó s i t o y M é t o d o d e l Estudio: La toxicidad de la Karwinskia humboldtiana, p l a n t a p e r t e n e c i e n t e a la familia R a m n a c e a e . s e h a evaluado en n u m e r o s o s e s t u d i o s . De e s t a p l a ñ í a s e h a n aislado c u a t r o a n t r a c e n o n a s diméricas, n o m b r a d a s T-496, T- 514, T - 5 1 6 y T - 5 4 4 de a c u e r d o a s u p e s o molecular. La T-514 e n particular h a m o s t r a d o s e r tóxica e n hígado y pulmón a s í como en líneas celulares t u m o r a l e s , en especial p a r a l a s células de h e p a t o m a . Por e s t a razón, s e h a s u g e r i d o q u e la toxina p u d i e r a ser utilizada como u n a g e n t e antineoplásico. El p r e s e n t e estudio se realizó con el fin de caracterizar la actividad biológica de la T-514 como u n potencial agente citostàtico y genotóxico. Linfocitos de s a n g r e periférica en cultivo s e utilizaron como u n s i s t e m a de p r u e b a , d o n d e se evaluaron los siguientes p a r á m e t r o s d e genotoxicldad: a b e r r a c i o n e s cromosómicas e intercambios de c r o m á t i d a s h e r m a n a s ; y c o m o p a r á m e t r o s de c a p a c i d a d citotóxica y citostàtica, s e evaluó e\ índice mitótico y la cinética de proliferación celular. Con el fin de evaluar mutaciones g é n i c a s , s e utilizaron las c e p a s TA98, TA 100 y TA1537 d e Salmo ne ila typhimurium.

CAPITULO 1

I N T R O D U C C I O N

1.1. Generalidades

El c a m p o de ía Toxicología a b o r d a los efectos de los a g e n t e s químicos y físicos sobre s i s t e m a s vivos, con el propósito de definir los efectos s o b r e la s a l u d , p a r a lo c u a l se a p o y a especialmente e n d a t o s y metodología de varias ciencias básicas, tales como la fisiología, farmacología, genética, embriología, química y bioestadística.

Desde h a c e 3 0 a ñ o s , la Toxicología h a proporcionado l a f u e n t e p r i m a r i a de d a t o s a c e r c a de los efectos sobre la s a l u d de p r o d u c t o s químicos existentes o nuevos. Sin e s t a información, m u c h o s c o m p u e s t o s q u í m i c o s potencialmente peligrosos solo podrían h a b e r s e identificado mediante la exposición h u m a n a . De hecho esto h a ocurrido con a l g u n o s agentes, como el accidente con el metilisocianato en Bhopal, India en 1984, y el u s o de a r m a s químicas.

e m b a r g o , e s el d e d e t e c t a r y a n a l i z a r el d a ñ o potencial de aquéllos a g e n t e s q u e interacclonan d i r e c t a o i n d i r e c t a m e n t e con los ácidos nucléicos y q u e p r o d u c e n alteraciones e n e l e m e n t o s genéticos a c o n c e n t r a c i o n e s s u b t ó x l c a s modificando las c a r a c t e r í s t i c a s h e r e d i t a r i a s o inactivando al DNA, a g e n t e s a ios que se les d e n o m i n a g e n o t ó x i c o s .

El s u r g i m i e n t o de e s t a disciplina s e r e m o n t a a 1 9 2 7 c u a n d o s e d e m o s t r ó que la radiación a u m e n t a b a la f r e c u e n c i a de m u t a c i o n e s e s p o n t á n e a s (Müller, 1927); veinte a ñ o s d e s p u é s se d e m o s t r ó el m i s m o hallazgo con a g e n t e s químicos utilizando especies n o m a m í f e r a s . C a t t a n a c h (1966) sugirió por p r i m e r a vez q u e a l g u n a s e n f e r m e d a d e s

hereditarias podrían t e n e r u n origen a m b i e n t a l .

Con el d e s c u b r i m i e n t o de l a e s t r u c t u r a del ácido desoxtrribonucléico (DNA) en los a ñ o s 5 0 por Watson y CricK s e a b r i e r o n n u e v o s horizontes p a r a el e s t u d i o d e la m u t a g é n e s i s . E n 1969 la Toxicología Genética f u e reconocida como disciplina aJ f u n d a r s e la Sociedad de Mutagénesis Ambiental bajo el liderazgo del Dr. Alexander Hollaender e n E s t a d o s Unidos. El concepto de carcinógenos m u t a g é n i c o s f u e revitallzado seguido d e la introducción de la activación de procarcinógenos e m p l e a n d o la mediación de h o s p e d e r o s o de los s i s t e m a s de activación m e d i a n t e m i c r o s o m a s tn uitro.

Los cambios en la composición d e los p a r e s d e b a s e s de u n codón de u n gen p u e d e n d a r c o m o r e s u l t a d o u n p r o d u c t o génlco q u e n o f u n c i o n a r á . E s t o p u e d e e v e n t u a l m e n t e e x p r e s a r s e como m u e r t e celular o m u e r t e del organismo, o en u n a f o r m a a l t e r a d a d e la célula u organismo. E s t o s c a m b i o s s o n l l a m a d o s mutaciones. T a n t o la duplicación como la reparación del DNA no s o n perfectas, d e m a n e r a q u e ocurren alteraciones e s p o n t á n e a s las c u a l e s c o n f o r m a n la f r e c u e n c i a b a s a l de m u t a c i o n e s . Los c a m b i o s e s p o n t á n e o s e n el DNA o c u r r e n a nivel nucleótido y cromosómlco. Algunas m u t a c i o n e s p u e d e n s e r n e u t r a l e s o a ú n benéficas, s i n e m b a r g o , la m a y o r í a d e l a s m u t a c i o n e s son d a ñ i n a s p a r a las células y n o r m a l m e n t e se p i e r d e n con rapidez de la población celular, bajo p r e s i o n e s d e selección a m b i e n t a l e s a p r o p i a d a s . Algunas células m u t a n t e s sobreviven, y en c a s o d e s e r c é l u l a s s o m á t i c a s se p u e d e n d u p l i c a r y í ó r m a r c l o n a s q u e e v e n t u a l m e n t e p u e d e n originar t u m o r e s ; si s o n células germinales, é s t a s p u e d e n ocasionar a b o r t o s o el n a c i m i e n t o de u n p r o d u c t o con malformaciones.

El d a ñ o al DNA se a g r u p a en d o s a m p l i a s categorías: los efectos visibles detectables m e d i a n t e el análisis cltológico de los c r o m o s o m a s

(macrolesiones) y los c a m b i o s no visibles, los c u a l e s o c u r r e n a nivel de nucleótido y s e d e n o m i n a n microlesiones (Brusick, 1987) (Figura 1).

P a r a detectar a g e n t e s genotóxlcos, la Enuironmental Protection Agency y o t r a s a g e n c i a s r e c o m i e n d a n q u e se u s e n varias p r u e b a s in

i n d u c c i ó n de rearreglos o i n t e r c a m b i o s en el DNA, a l t e r a c i o n e s en la segregación y en la integridad de los c r o m o s o m a s (Brusick, 1987).

Mutaciones por substitución de pares de bases

Mutaciones por corrimiento de

bases

Cambios numéricos en

ios cromosomas

CMutilaos estructurales en los cromosomas: -delecioaes

-rearreglos -rompimientos

Figura 1. Clasificación de los cambios moleculares en el DNA q u e a p a r e c e n como resultado de la mutación. (Brusick. 1987).

1.2. Caxci n o g é n e s i s q u í m i c a

La producción experimental de c á n c e r con s u b s t a n c i a s q u í m i c a s d a t a de 1915, c u a n d o los investigadores j a p o n e s e s provocaron c á n c e r de piel por medio d e a l q u i t r á n d e h u l l a en conejos. Desde entonces, la lista de carcinógenos orgánicos e inorgánicos h a crecido en f o r m a exponencial.

m a y o r í a de los carcinógenos químicos r e q u e r í a n activación metabòlica p a r a que p u d i e r a n r e a c c i o n a r con los c o n s t i t u y e n t e s celulares.

De a c u e r d o con e s t a s observaciones y teniendo e n c u e n t a la í n t i m a relación e n t r e m u t a g e n i c i d a d y carcinogenicldad, u n a d é c a d a d e s p u é s s e desarrolló u n a p r u e b a in vitro p a r a identificar s u b s t a n c i a s c a n c e r í g e n a s , la p r u e b a d e Ames, l l a m a d a a s í por el bacteriólogo genetista que la desarrolló (Rubin y Farber, 1990).

Los carcinógenos se clasifican e n d o s a m p l i a s categorías: los d e acción directa y los de acción indirecta; e s t o s ú l t i m o s r e q u i e r e n activación metabòlica. Los carcinógenos d e acción directa, de los c u a l e s h a y u n o s c u a n t o s , s o n c o m p u e s t o s electrofíilcos reactivos (seleccionan y reaccionan con c e n t r o s cargados negativamente de o t r a s moléculas). La activación metabolica d e los carcinógenos s e lleva a c a b o por e n z i m a s q u e e s t á n p r e s e n t e s en el organismo. Los m a m í f e r o s poseen e s t a s e n z i m a s en s u s tejidos, especialmente en el hígado y f o r m a n p a r t e del s i s t e m a de destoxificaclón.

1.3. P r o d u c t o s Naturales e n el T r a t a m i e n t o <lel Cáncer

Desde la a n t i g ü e d a d , la f a r m a c o p e a del México indígena f i n c a b a la m a y o r p a r t e de s u experiencia e n la herbolaria. S e h a n escrito varios t r a t a d o s s o b r e l a s h i e r b a s medicinales e m p l e a d a s por los indios del siglo XVI, e n d o n d e se m e n c i o n a n v a r i a s p l a n t a s y a r b u s t o s c u y a s h o j a s s e u s a b a n p a r a d e t e n e r los "crecimientos anormales".

B h a k u n l e n 1972, realizó Investigaciones p a r a e n c o n t r a r principios activos vegetales con actividad a n t l t u m o r a l , y o b t u v o r e s u l t a d o s positivos con 14 extractos, e n t r e los q u e figuran los de

Cassia obtusa, que inhibieron significativamente la leucemia Unfocítica P - 3 8 8 e n r a t o n e s ; y el de Digitalis purpurea var. alba q u e posee glucósidos q u e m o s t r a r o n cito toxicidad t u m o r a l en r a t o n e s ( B h a k u n i ,

1974).

A c t u a l m e n t e entre las p l a n t a s e m p l e a d a s como a n t l t u m o r a l e s e s t á la m a n d r à g o r a (Podophyllum peltatum), de la c u a l s e e x t r a j o la podoñlotoxina, utilizada por los indios del Perú c o m o remedio p o p u l a r por s u s efectos eméticos, c a t á r t i c o s y antihelmínticos. Los derivados del

Podophyllum s o n el etopósido y tenipósldo. glucósidos semlsintétlcos que a c t ú a n principalmente e n las f a s e s S y G2 del ciclo celular. A diferencia de la podoñlotoxina, n o d e t i e n e n las células en mitosis, s i n o que f o r m a n u n complejo t e r n a r i o con u n a t o p o l s o m e r a s a D y el DNA (Goodman y Gilman. 1996).

granulocltopenia y depresión de la m é d u l a ó s e a en r a t a s , d a t o s q u e los c o n d u j e r o n a purificar u n alcaloide activo. Investigaciones ulteriores de J o h n s o n y cois. (1963) d e m o s t r a r o n la actividad de a l g u n a s fracciones alcaloides c o n t r a u n a neoplasla linfocítica a g u d a en r a t o n e s . Los efectos de la vinblastina y vincristina s o n específicos de c a d a f a s e del ciclo celular, bloquean a las células q u e e s t á n en mltosis; s o n c a p a c e s de ligarse específicamente a la t u b u l i n a y b l o q u e a r la f a c u l t a d de d i c h a proteína p a r a polimerizarse en m i c r o t ú b u l o s (Goodman y Gllman,

1996).

La actlnomicina A fue el primer antibiótico cristalino aislado del medio de cultivo de u n a especie de Sfcreptomyces ( W a k s m a n y Woodruff, 1940). Más t a r d e se obtuvieron m u c h o s antibióticos similares, incluida la actlnomicina D (dactlnomicina). La d a c t i n o m i c i n a posee beneficios en el t r a t a m i e n t o de diversos t u m o r e s , e n p a r t i c u l a r a l g u n a s n e o p l a s i a s de niños, y el coriocarcinoma. La c a p a c i d a d de las a c t i n o m i c i n a s p a r a ligarse con el DNA de doble hélice es el p u n t o de p a r t i d a de s u actividad biológica y s u citotoxicidad (Sobell, 1973)

Los antibióticos antraciclínlcos, d a u n o r r u b i c i n a , d o x o r r u b i c i n a e i d a r r u b i c i n a y s u s derivados, s e c u e n t a n e n t r e los a g e n t e s a n t l t u m o r a l e s m á s i m p o r t a n t e s . S o n p r o d u c i d o s por el hongo

Streptocvccus peucetíus var. caes tus. La i d a r r u b i c i n a e s u n derivado sintético. La utilidad clínica de e s t o s agentes q u e d a limitada por la r a r a aparición de cardiomiopatía.

a m l n o a n t r a c e n o d i o n a (Arlln y cois, 1990; F e l d m a n y cois., 1993). E s t o s c o m p u e s t o s se intercalan en el DNA y por consiguiente i n h i b e n la s í n t e s i s de DNA y RNA. Se p r o d u c e n r o t u r a s e n filamentos solos o dobles, c o m o o c u r r e en el i n t e r c a m b i o de c r o m á t i d a s hijas. Por tanto, las a n t r a c i c l i n a s s o n m u t a g é n i c a s y c a r c i n o g é n a s . S e cree q u e el r o m p i m i e n t o del DNA es m e d i a d o por la acción de la t o p o i s o m e r a s a II o por la generación d e radicales libres (Tewey y cois.. 1984).

Las bleomicinas f u e r o n d e s c u b i e r t a s como p r o d u c t o de la fermentación de Streptomyces verticillus (Umezawa, 1973J. El m e d i c a m e n t o utilizado en s e r e s h u m a n o s es u n a mezcla de d o s péptidos q u e l a n t e s de cobre, bleomicinas Aj y B2- S u acción citotóxica es c o n s e c u e n c i a de s u facultad d e f r a g m e n t a r el DNA. Los e s t u d i o s In vitro indican q u e c a u s a n a c u m u l a c i ó n de células en la fase G2 del ciclo, y m u c h a s de é s t a s m u e s t r a n a b e r r a c i o n e s c r o m o s ó m i c a s q u e Incluyen r o m p i m i e n t o s cromatídicos, b r e c h a s y fragmentos, a s í como t r a n s l o c a c l o n e s (Twentyman. 1983).

En 1992 s e aprobó el u s o del taxol (Placlitaxel) p a r a el t r a t a m i e n t o del c á n c e r ovárico r e f r a c t a r i o a clsplatino. E s t e c o m p u e s t o s e aisló originalmente de la corteza del fresno (T a x u s brevlfoliu) e n 1971. El m e c a n i s m o de acción del taxol es el de e s t i m u l a r la formación d e m i c o t ú b u l o s , los estabiliza e impide s u despoliraerizaclón c o n la s u b s e c u e n t e interrupción del ciclo celular en mituslB (Schlff y Horwltz.,

1979).

CAPITULO 2

DERIVADOS ANTRAQUINONICOS Y ANTRACENONICOS

2 . 1 . Generalidades

Las a n t r a q u i n o n a s (AQ's) forman u n g r u p o de c o m p u e s t o s químicos f u n c i o n a l m e n t e diversos u s a d o s en el c a m p o i n d u s t r i a l y médico. Las AQ's n a t u r a l e s así c o m o las s i n t é t i c a s s o n utilizadas c o m o c o l o r a n t e s en la i n d u s t r i a de los alimentos, m e d i c a m e n t o s , cosméticos, t i n t e s p a r a el cabello y de textiles. El d e p a r t a m e n t o de la D e f e n s a de E.U. utiliza estos agentes en c o r t i n a s de h u m o en el c a m p o d e batalla. E n el á r e a clínica, las AQ's s o n utilizadas como p r e p a r a c i o n e s p u r g a n t e s y c o m o agente antimicrobial y a n t i t u m o r a l (Traganos, 1983; S e n d e l b a c h . 19891. Las h i d r o x i a n t r a q u i n o n a s (HAQ's) son los principios activos de m u c h o s f á r m a c o s fltoterapéuticos, e n t r e ellos, los l a x a n t e s derivados d e p l a n t a s como aloe, s e n n a , f r á n g u l a y r h e u m . Adlcionalmente. algunos e x t r a c t o s de plantéis son u s a d o s p a r a el t r a t a m i e n t o de cálculos en el riñon y vejiga (Rubia ttnctotorium) y c o m o s e d a n t e m o d e r a d o (H y p e r i c u m ) (Westendorf 1990).

Hyperlcaceae iHypericum), Poligonaceae (Rehum, Rumex, Polygonum),

R h a m n a c e a e (¿?harnrms] y Rublcaceae (Rubia, Morlnda, Gaífum). E n las monocotiledóneas, solo la familia Liliaceae (Aloe) contiene e s t a clase d e c o m p u e s t o s . Cerca del 90% de é s t o s c o m p u e s t o s a p a r e c e n c o m o derivados del c o m p u e s t o 9 , 1 0 - a n t r a c e n o d i o n a con a l g u n o s g r u p o s f u n c i o n a l e s hidroxilo, como los g r u p o s metilo, hldroximetilo y carboxilo ( W e s t e n d o r f y cois., 1 9 9 0 ) .

2 . 1 . 1 . N o m e n c l a t u r a y estructura q u í m i c a

La figura 2 Ilustra la n o m e n c l a t u r a y las e s t r u c t u r a s q u í m i c a s d e los derivados a n t r a q u i n ó n i c o s . El n o m b r e ' A n t r a q u l n o n a " f u e p r o p u e s t o inicialmente por Graebe y Lieberman en 1868, q u i e n e s d e m o s t r a r o n la m i s m a relación e s t r u c t u r a l del a n t r a c e n o y la AQ en la c u a l el g r u p o b e n c e n o e s s u s t i t u i d o por u n a b e n z o q u i n o n a (Phillips M. citado e n S e n d e l b a c h . 1989). Las posiciones 1, 4, 5 y 8 s o n referidas f r e c u e n t e m e n t e como a : las posiciones 2, 3, 6 y 7 son referidas c o m o jj. Las AQ's n a t u r a l e s son c o m p u e s t o s glucuronizados en la molécula de glucosa por u n enlace a.-glucosídíco m i e n t r a s que las AQ's sintéticas, c o m o la alizarina y la lucidina, no contienen glucosa u n i d a .

2 . 1 . 2 . Metabolismo

Antraquinona

Substituidas por gnipo amino

o NH2

Substituidas por grupo nitro O NOi

Substituidas por grupo fenol OH O OH

Figura 2. Diferentes estructuras químicas de los derivados antraquinónicos (Sendeltwch, 1969).

La porción del a z ú c a r le confiere c a r a c t e r í s t i c a s hldrofílicas al glucósido a n t r a q u i n ó n i c o lo q u e le impide s e r a b s o r b i d o por las células epiteliales del intestino (Figura 3). El enlace a-glucosídlco no es hidrolizado por el ácido del estómago o por las a - g l u c o s i d a s a s del intestino delgado. Por lo tanto, el metabolismo de los glucósidos a n t r a q u i n ó n i c o s t o m a lugar en el colon en d o n d e el enlace a-glucosídico s e hldroliza por la flora intestinal liberando a la glucosa y d e j a n d o la AQ

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Figura 3. Dragraí/ia esquemático del metabolismo de los glucósidos y agliconas antraquinónicas. (Sendelhach, 1989).

Una vez s e p a r a d a , el metabolismo de la aglicona a n t r a q u i n ó n l c a no es claro. S e h a d e m o s t r a d o la reducción bacterial de las agUconas lo que h a llevado a p e n s a r que la actividad catártica p u e d e no ser por la AQ sino por las a n t r o n a s o a n t r a n o l e s f o r m a d o s . Por lo q u e a los glucósidos a n t r a q u i n ó n i c o s s e les h a c o n s i d e r a d o c o m o pro-fármacos, en los que el g r u p o a z ú c a r tiene u n a función de t r a n s p o r t a d o r .

d e s p u é s de la a d m i n i s t r a c i ó n oral. La lípofilicidad d e las agliconas a n t r a q u l n ó n l c a s facilita la absorción a t r a v é s del intestino delgado, d o n d e son t r a n s p o r t a d a s al hígado y glu cu ron izadas. Los c o m p u e s t o s g l u c u r o n i z a d o s son excretados p a r c i a l m e n t e en la orina y r e t o m a n al Intestino a través de la bilis.

Así como la r u t a del glucósido a n t r a q u l n ó n i c o , la AQ g l u c u r o n l z a d a q u e es soluble en a g u a . es t r a n s p o r t a d a h a c i a el colon d o n d e las e n z i m a s b a c t e r i a n a s de la flora s e p a r a n a la AQ libre (Brown. 1980 y B r u g e m a n 1984). Por lo q u e la habilidad de las AQ's libres p a r a s e r a b s o r b i d a s a través del i n t e s t i n o delgado parece d e t e r m i n a r el potencial tóxico de estos c o m p u e s t o s , en c o n t r a s t e con los glucósidos a n t r a q u i n ó n i c o s los c u a l e s p a s a n libremente a la recirculación e n t e r o h e p á t i c a [Sendelbach 1989).

2 . 2 . Mutagenicidad

Los c o m p u e s t o s a n t r a c e n ó n i c o s s e h a n reconocido como tóxicos y se s o s p e c h a q u e los derivados a n t r a q u i n ó n i c o s t a m b i é n lo s e a n debido a s u similiud e s t r u c t u r a l . S w a n b e c k (1906) reportó la interacción e n t r e el DNA y a l g u n o s derivados a n trace nónicos y a n t r a q u i n ó n i c o s . E n s u t r a b a j o s e ñ a l ó q u e los c o m p u e s t o s con g r u p o s hldroxllo en las posiciones 1 y 8 y con u n oxígeno o u n g r u p o hidroxilo en la posición 9, f o r m a r o n complejos con el DNA, d e t e c t a d o s por espectroscopia e n el rango visible.

relacionados en s i s t e m a s procariónticos. Brown y Dietrich ( 1979) r e p o r t a r o n que n u m e r o s o s derivados a n t r a c é n i c o s s o n m u t a g é n i c o s en la p r u e b a de Salmo ríe lia typhimurium c o n activación metabòlica, con u n a p a r t i c u l a r sensibilidad a la cepa TA1537. E n la m i s m a p r u e b a , Liberman y cois. (1982), r e p o r t a r o n q u e los derivados a n t r a q u i n ó n i c o s p r o b a d o s f u e r o n m u t a g é n i c o s p a r a la c e p a TA1537 y n i n g u n o d e los c o m p u e s t o s a n t a c e n ó n i c o s exhibieron actividad m u t a g é n i c a .

Con b a s e e n s u s experimentos, T i k k a n e n y M a t s u s h i m a (1983), sugirieron q u e las HAQ's q u e t i e n e n de u n o a t r e s g r u p o s hidroxilo s o n m u t a g é n i c a s , m i e n t r a s que los c o m p u e s t o s con m á s de t r e s g r u p o s hidroxilo carecen de e s t a actividad.

Krivobok y cois. (1992) e s t u d i a r o n la m u t a g e n l c l d a d de las HAQ's y m e t i i a n t r a q u i n o n a s , así como los c o m p u e s t o s diméricos skirina, r u g u l o s i n a y r u g u l i n a en varias c e p a s de S. typhimurium, y s u s r e s u l t a d o s s o b r e las relaciones actividad m u t a g é n i c a - e s t r u c t u r a sugieren que el g r u p o 6-metilo j u e g a u n papel I m p o r t a n t e en d i c h a actividad d e s p u é s de la activación metabòlica.

B r u g g e m a n y v a n d e r Hoeven, 1984), y requiere de la t r a n s f o r m a c i ó n microsoma] p a r a producir s u me tabuli tu activo, la 2 - h i d r o x l e m o d i n a (Masuda y cois., 1984: M a s u d a y cois., 1985). S e d e m o s t r ó q u e no t e n í a interacción covalente con el DNA de Salmonella, ni en hígado de r a t a (Bosch y cois., 1987). Sin embargo, a n t e r i o r m e n t e s e h a b í a d e m o s t r a d o por medición e s p e c t r o s c o p i a q u e la e m o d i n a y el ditranol, 1,8,9-trlhidroxiantraceno, f o r m a n complejos con el DNA (Swanbeck, 1966).

La e m o d i n a ha m o s t r a d o r e s u l t a d o s negativos en el e n s a y o de m u t a g e n i c i d a d con la p r u e b a del locus hprt (hipoxantlna-fosforribosil-t r a n s f e r a s a ) en células de cobayo V79, así c o m o (hipoxantlna-fosforribosil-t a m b i é n p a r a i n d u c i r ICH (Bruggeman y v a n d e r Hoeven, 1984). Sin embargo, se d e m o s t r ó q u e este c o m p u e s t o f u é m u t a g é n i c o en células d e c a r c i n o m a m a m a r i o de r a t ó n y la 1 , 4 - h i d r o x l a n t r a q u i n o n a m o s t r ó u n a débil inducción d e ICH en células V79 (Bruggeman y van der Hoeven, 1984). Finalmente, n o i n d u j o reparación n o p r o g r a m a d a (UDS) en hepatocitos p r i m a r i o s de r a t a ( W e s t e n d o r f y cois., 1990)

La luteoskirina, u n a h i d r o x i a n t r a q u i n o n a dimérica t u m o r i g é n i c a y hepatotóxica, producida por el g é n e r o Penlclllium s p p , m o s t r ó u n efecto citostàtico a b a j a s c o n c e n t r a c i o n e s s o b r e las células t u m o r a l e s d e ascitis de Ehrlich en cultivo (Figura 4). A d e m á s e n c o n t r a r o n los a u t o r e s u n i n c r e m e n t o en la frecuencia de células m u l t i n u c l e a d a s . En células r e s i s t e n t e s a la luteoskirina a i s l a d a s como u n a s u b l í n e a , se o b s e r v a r o n a b e r r a c i o n e s cromosómicas y c r o m o s o m a s de m a y o r longitud ( S e h a c h t s c h a b e l y cois., 1969). Por otro lado. Akuzawa y cois.(1992) d e m o s t r a r o n que la luteoskirina i n c r e m e n t ó el nivel de r e s i d u o s 8 -hidroxidesoxíguanina en el DNA de células de h e p a t o m a H4-11-E. y

2 . 3 . Carcinogenicidad

EL d a n t r o n , 1,8-dihidroxiantraquinona, a c t ú a c o m o promotor t u m o r a l en fibroblastos de r a t ó n C3H y e s t i m u l a la s í n t e s i s de DNA en hepatocitos de r a t a de cultivo primario, y s u g i e r e n q u e las h i d r o x i a n t r a q u i n o n a s con g r u p o s hidroxi en posiciones 1,8 p u e d e n t e n e r actividad promotora (Wolfle y cois,, 1990). La lucldina, 1,3-dihidroxi-2-hidroximetllantraquinona, f u e c a p a z de f o r m a r a d u c t o s en el DNA en hepatocitos primarios de r a t a con activación metabòlica in

ultro, por lo q u e los a u t o r e s sugieren q u e los efectos genotóxicos de este c o m p u e s t o observados en p r u e b a s In vitro s o n el r e s u l t a d o de u n a interacción covalente con el DNA celular, i n d i c a n d o u n a potencial actividad carcinogénica de e s t o s c o m p u e s t o s (Poginsky y cois., 1991).

2 . 4 . Actividad C i t o s t à t i c a

Emodlne

Lúteos kjrina Fleonwcr«

Figura 4 . Estructuras químicas de algunos c o m p u e s t o s autracenóuicos y antraqulnónicos.

2 . 5 . K a r m i n s k i a humboldtiana

C u a n d o a c c i d e n t a l m e n t e s e ingieren los frutos se p r o d u c e u n a intoxicación c a r a c t e r i z a d a por u n a parálisis similar al s í n d r o m e de Guillian-Barre. El c u a d r o clínico se d e s a r r o l l a a los 15 días a p r o x i m a d a m e n t e d e s p u é s de la ingestión, con u n a n e u r o p a t í a progresiva, con u n a parálisis a s c e n d e n t e , la c u a l p u e d e t e r m i n a r en m u e r t e por p a r o respiratorio; si los p a c i e n t e s sobreviven, la recuperación es lenta, pero completa (Escobar y Nieto, 1965; Dewan y cois., 1965).

Desde 1981 en el D e p a r t a m e n t o de Farmacología y Toxicología de la F a c u l t a d de Medicina de la U.A.N.L. s e inició u n a línea de investigación con el fin de e s t u d i a r las p r o p i e d a d e s q u í m i c a s y biológicas de e s t a p l a n t a . S e inició c o n el aislamiento de los p r o d u c t o s biológicamente activos del fruto de K. humboldtiana (Guerrero y cois., 1987), posteriormente se realizaron estudios s o b r e la intoxicación a g u d a experimental en animales, c o n f r u t o m a d u r o o con las t o x i n a s purificadas. Los r e s u l t a d o s revelaron q u e la T-544 c a u s a b a el d a ñ o neurológico y la T-514 (Figura 5) e r a c a p a z de afectar el p u l m ó n y el h í g a d o (Bermúdez y cois., 1986): a d e m á s la Ingestión del f r u t o m a d u r o (0.70% de T - 5 4 4 y 0.29% de T-514) p r o d u c í a lesiones e n hígado y pulmones, las c u a l e s c a u s a b a n la m u e r t e de los a n i m a l e s (Bermúdez y cois. 1992).

E s t a toxicidad se h a correlacionado con los hallazgos en cultivos primarios de hígado y piel de r a t a , en los c u a l e s se observó q u e los hepatocitos m o s t r a r o n mayor senslblidad a a m b a s toxinas T - 5 1 4 y T-5 4 4 que los queratinocltos, siendo la T - T-5 1 4 m á s hepatotóxlca In vltro

HO Me

Figura 5. Estructura química de la T-S14.

El efecto in vltro de la toxina T - 5 1 4 s e analizó en líneas celulares b e n i g n a s y neoplásicas de hígado, p u l m ó n y colon, de origen h u m a n o , y s e c o m p a r ó c o n m e d i c a m e n t o s a n t i - n e o p l á s i c o s conocidos; la toxina m o s t r ó toxicidad selectiva hacia las células t u m o r a l e s , de m a n e r a similar al 5-Fluoruracilo, la Epidoxorrublclna y la Mitomlclna-C; por lo q u e con b a s e e n estos resultados, se p r o p u s o q u e la T - 5 1 4 podría t e n e r actividad anti-neoplásica (Piñeyro y cois., 1994).

los modelos de t u m o r de colon y de s i s t e m a nervioso c e n t r a l en los c u a l e s mostró moderada actividad a n t i t u m o r a l .

Estudios bioquímicos y de u l t r a e s t r u c t u r a h a n s e ñ a l a d o q u e la toxina T-514 produce a dosis s u b i e t a l e s (0,5, 1 y 2 tig/ml) , u n d a ñ o selectivo e irreversible sobre los peroxisomas de l e v a d u r a in vivo.

(Sepúlveda y cois., 1992). Por lo que recientemente se le h a d e n o m i n a d o "peroxisomicina At" (Moreno-Sepúlveda y cois. (1995). Los m i s m o s a u t o r e s reportaron el efecto inhibitorio de la T - 5 1 4 y o t r a s a n t r a c e n o n a s relacionadas sobre la actividad de la c a t a l a s a h e p á t i c a in vitro, e n z i m a de origen exclusivamente peroxisomal. E n c o n t r a s t e con e s t e reporte, s e d e m o s t r ó que la T-514 no inhibe la actividad d e la c a t a l a s a t i s u l a r por lo q u e concluyeron que la c a t a l a s a in siíu e in vivo p u d i e r a e s t a r protegida por algún factor desconocido c o n t r a el efecto Inhibitorio d e la peroxisomicina A! (Moreno-Sepúlveda y cois. 1997). T a m b i é n s e observó u n incremento en la actividad específica de la NADPH-citocromo-P-450 r e d u c t a s a en hígados de r a t a s t r a t a d a s c o n u n a dosis a g u d a de T-514, r e s u l t a d o s que indican que la T-514 p u e d e a c t u a r como u n i n d u c t o r enzimàtico microsomal (Guerrero-Olazarán y Viader-Salvadó, 1996).

Se h a n aislado tres a n t r a c e n o n a s d l m é r i c a s de o t r a s especies del género Kcmuinsícla: l a T - 5 1 6 , el isómero de l a T - 5 1 4 (peroxisomicina A,}), el Isómero de posición de la toxina 5 1 4 (peroxisomicina D3) (Rivas y cois., 1990) y el diasteroisómero d e n o m i n a d o peroxisomicina A2 obtenido de K. parvi/olia (Waksman y Ramírez. 1992).

CAPITULO 3

EL CULTIVO DE LINFOCITOS HUMANOS

3 . 1 Generalidades

La s a n g r e es u n o de los tejidos m á s accesibles del h u m a n o y el crecimiento potencial e s excelente d e s p u é s de la estimulación por u n mitógeno. T a m b i é n es u n o de los m á s fáciles de e s t u d i a r debido a que las células tienen u n ciclo celular bien caracterizado. La s a n g r e contiene diferentes tipos celulares. Las c é l u l a s b l a n c a s (leucocitos] s o n células n u c l e a d a s . de m a n e r a q u e poseen DNA y si se i n d u c e n a dividirse, proporcionan figuras mitóticas. Los tipos de células b l a n c a s p r e s e n t e s en la s a n g r e periférica son: granulocltos. monocitos y linfocitos; existen s u b t i p o s de linfocitos. E s t o s tipos diferentes n o p u e d e n identificarse morfológicamente, pero con el u s o de m a r c a d o r e s de superficie se p u e d e n reconocer.

La proliferación llnfocitaria i n d u c i d a por los a n t í g e n o s tiene l u g a r n o r m a l m e n t e f u e r a de la s a n g r e y del c o n d u c t o torácico, y p u e d e visualizarse (n uitro al cultivar células linfoides j u n t o con a n t í g e n o s específicos. Las lectinas m i t ó g e n a s (proteínas que s e u n e f o r m a n d o e n l a c e s c r u z a d o s e n los r e s i d u o s h l d r o c a r b o n a d o s específicos d e la superficie celular) e s t i m u l a n pollclonalmente a l a s células linfoides. E s t a s lectinas mitógenas (mitógenos) se derivan de varías p l a n t a s y bacterias. S u empleo In vltro h a d e m o s t r a d o que la activación de las c é l u l a s T y B da lugar a la producción de citoclnas, c o m o interleuciñas, a s í como a la expresión de receptores p a r a citocinas; ello c o n d u c e a las células hacia el ciclo celular (proliferación) y. finalmente, h a c i a la f u n c i ó n efectora (maduración).

La activación linfocitaria, y a s e a por antígenos o mitógenos, d a l u g a r a modificaciones i n t r a c e l u l a r e s y al desarrollo ulterior en el sentido de u n linfoblasto. Se cree q u e la estimulación por mitógenos de los linfocJtos ín vitro imita la serie de h e c h o s q u e tienen lugar in viuo

t r a s s u estimulación por los antígenos específicos.

Las células T y B s e activan por mitógenos diferentes. Así, la fitohemaglutlnina (PHA] y la concavallna A (Con-A) e s t i m u l a n a l a s células T h u m a n a s y m u r i n a s . Los lipopolisacáridos (LPS) e s t i m u l a n las células B m u r i n a s . El mitógeno de fitolaca a m e r i c a n a e s t i m u l a t a n t o las células T como las B h u m a n a s (Roitt y cois., 1991).

El cultivo de linfocltos h u m a n o s h a sido a m p l i a m e n t e utilizado como s i s t e m a de p r u e b a p a r a e v a l u a r la actividad m u t a g é n i c a de s u s t a n c i a s q u í m i c a s y radiaciones (Obe y cois., 1975; Ostrosky-Wegman y cola.. 1988), a d e m á s se p u e d e n e v a l u a r los efectos de las s u s t a n c i a s sobre la proliferación celular ( G e b h a r t . 1 9 8 1 ; Ostrosky-Wegman y cois.,

s u b p o b l a c I o n e s y se h a d e t e r m i n a d o el t i e m p o del ciclo celular el c u a l p u e d e variar en función d e las condiciones de cultivo (Mutchinick y cois., 1980: G o n s e b a t t y Mutchinick.,1990), la e d a d de los d o n a d o r e s (Schneider y cois.. 1982), el e s t a d o de s a l u d (Ortlz y B e t a n c o u r t , 1990) y c u a n d o s e agregan ciertos agentes químicos (Morimoto y Wolff, 1980).

3 . 2 . El Ciclo Celular

El proceso de la formación de n u e v a s células d e p e n d e del paso d e c a d a u n a de ellas a través de tres procesos: crecimiento, duplicación del DNA y división celular, los c u a l e s i n t e g r a n lo q u e c o m ú n m e n t e se define c o m o ciclo celular. Las f a s e s del ciclo celular f u e r o n p r o p u e s t a s originalmente por Howard y Pele en 1953, estos a u t o r e s c o n s i d e r a r o n q u e u n ciclo comienza c u a n d o u n a célula t e r m i n a la mitosis y finaliza con la siguiente división: así al tiempo e n t r e la división celular y el comienzo de la s í n t e s i s del DNA se le llamó G j (del inglés gap). Al período de duplicación del DNA s e le llamó f a s e S (de síntesis), al l a p s o c o m p r e n d i d o e n t r e la síntesis y la mitosis s u b s e c u e n t e se le d e n o m i n ó G2y por último al periodo de división celular lase M.

de la segregación de los c r o m o s o m a s . Las p a u s a s en los p u n t o s d e restricción permiten corregir y r e p a r a r la información genética c o n el fin de q u e c a d a célula hija reciba u n c o m p l e m e n t o completo de información genética idéntica de la célula m a d r e ( M u r a k a m i y cois., 1995].

Figura 6. Diagrama del ciclo celular que muestra las proporciones ocupadas para cada fase. (Dean y Dauford, 19841.

S e h a n descrito varias clases de clcllnas en G, y s u s c i n a s a s d e p e n d i e n t e s de ciclinas (cdks), l a s c u a l e s s o n c o n s i d e r a d a s l n t e g r a d o r e s de las señales que m e d i a n a los factores de crecimiento del ciclo celular. Los factores de crecimiento a c t ú a n en la fase G[ del ciclo celular al u n i r s e a receptores específicos de la superficie d e la célula, los c u a l e s inician la c a s c a d a de s e ñ a l e s que finalmente gobiernan la transcripción de g e n e s de r e s p u e s t a t e m p r a n a i n m e d i a t a y r e t a r d a d a .

cic linas, cdks, s u s c i n a s a s r e g u l a d o r a s y í o s í á t a s a s , con lo cual s e a s e g u r a el compromiso de las células p a r a e n t r a r a la fase S. U n a vez que s e h a t o m a d o la decisión p a r a replicar el DNA cromosómico, s i n embargo, las células s e vuelven r e f r a c t a r i a s a las s e ñ a l e s q u e I n d u c e n los factores de crecimiento y en cambio, d e p e n d e n del f u n c i o n a m i e n t o Intrínseco del reloj del ciclo celular p a r a r e g u l a r la progresión h a c i a la mitosIs o fase M (Sherr, 1993).

Los c r o m o s o m a s son d e s c o n d e n s a d o s d u r a n t e G,, S y G2 y posteriormente empiezan a c o n d e n s a r s e d u r a n t e la profese. Solo d u r a n t e la m e t a f a s e se vuelven visibles c o m o c u e r p o s discretos. B a j o condiciones favorables, el tiempo del ciclo celular es c a s i c o n s t a n t e . Sin embargo, la p r e s e n c i a de agentes tóxicos p u e d e n prolongar i m p o r t a n t e m e n t e G, o provocar q u e l a s células e n t r e n a G0 t e m p o r a l m e n t e y por lo tanto, extender la d u r a c i ó n del ciclo celular (Dean y Danford, 1984),

3 . 3 . Aberraciones C r o m o s ó m i c a s

Las Aberraciones C r o m o s ó m i c a s (AC) I n d u c i d a s por a g e n t e s químicos o físicos p u e d e n e s t u d i a r s e en c u a l q u i e r población celular e n ciclo o, si no e s t á en ciclo, que p u e d a s e r e s t i m u l a d a por u n a g e n t e mitogénico. P a r a e s t u d i o s de AC e n h u m a n o s sólo se d i s p o n e d e d o s tipos de células a las que se puede t e n e r acceso de u n a m a n e r a práctica. E s t a s son las células de m é d u l a ósea, las c u a l e s son u n a población e n ciclo; y los linfocitos de s a n g r e periférica, los c u a l e s n o r m a l m e n t e n o se, e s t á n dividiendo pero cuya división p u e d e ser e s t i m u l a d a ín vitro

Desde la observación de Moorhead de que los llnfocltos podían e s t i m u l a r s e con u n mltógeno como la PHA y p o d e r observarlos e n m e t a f a s e (Moorhead y cois., 1960) s e h a obtenido u n a g r a n c a n t i d a d de d a t o s sobre la inducción de alteraciones por r a d i a c i o n e s y a g e n t e s químicos utilizando este s i s t e m a (Preston y cois.. 1981).

El d a ñ o al DNA inducido por a g e n t e s q u í m i c o s en llnfocltos n o ciclantes n o se convertirá en a b e r r a c i o n e s h a s t a q u e las células s e a n e s t i m u l a d a s p a r a e n t r a r en ciclo y e m p e z a r la duplicación del DNA. D a d o q u e el d a ñ o al DNA p u e d e ser r e p a r a d o en las células en la fase G0, a s í c o m o en G¡. la frecuencia de a b e r r a c i o n e s no s e r á n e c e s a r i a m e n t e proporcional a la c a n t i d a d del d a ñ o i n d u c i d o al DNA s i n o m á s bien a la c a n t i d a d de d a ñ o q u e s e m a n t i e n e en el m o m e n t o de la duplicación (WHO, 1985). Además el grado de reparación del DNA e s t á influenciado por la fase del ciclo celular d u r a n t e el t i e m p o de exposición al agente químico (Parshad y col., 1982), y a q u e el d a ñ o p u e d e ocurrir en cualquier fase y d e p e n d e r á de q u e s e r e p a r e o no, el q u e p e r m a n e z c a .

3 . 4 . Intercambios d e Cromátidas Hermanas

E s t o s f u e r o n observados por p r i m e r a vez utilizando timidina tritiada (Taylor y cois.. 1957)

Los e s t u d i o s reailzados por n u m e r o s o s g r u p o s m o s t r a r o n q u e varios clastógenos f u e r t e s e r a n c a p a c e s de i n d u c i r u n i n c r e m e n t o en la frecuencia de ICH, por lo q u e e s t a técnica s e empezó a utilizar en la detección de m u t á g e n o s t a n t o in vivo c o m o in uitro. El S í n d r o m e d e Bluom, e n t i d a d a u t o s ó m i c a recesiva, con predisposición al c á n c e r y con fragilidad cromosómica, p r e s e n t a u n a f r e c u e n c i a de i n t e r c a m b i o s de 15 a 2 0 veces mayor q u e la c o n s i d e r a d a normal, lo c u a l c o n s t i t u y e u n nexo p a r t i c u l a r e n t r e las m u t a c i o n e s génlcas, el f e n ó m e n o d e t r a n s f o r m a c i ó n n e o p l á s i c a y el c o m p o r t a m i e n t o cromosómico ( S a l a m a n c a , 1990).

P e n y y Wolf (1974) m e j o r a r o n e s t a metodología con el u s o de bromodesoxiuridina (BrdU), u n análogo no radiactivo de la timina. El m e c a n i s m o de formación m á s a c e p t a d o h a s t a ei m o m e n t o e s t á explicado en la hipótesis p r o p u e s t a por Palnter (1980). E s t e modelo se b a s a en la posibilidad de q u e los rompimientos de la doble h e b r a de DNA o c u r r a n f r e c u e n t e m e n t e en la conexiones de z o n a s de duplicación o replicones a d y a c e n t e s d u r a n t e la duplicación. Este principio se a p o y a en la evidencia d e q u e ciertas enzimas, las t o p o í s o m e r a s a s , en células de mamíferos, i n d u c e n y r e ú n e n los rompimientos. Ocasionalmemte, en lugar de u n a r e u n i ó n normal, el r o m p i m i e n t o e s sellado por la r e u n i ó n de h e b r a s h i j a s de u n a molécula d u p l i c a d a a la molécula n o d u p l i c a d a .

superhélice —

la topoisomerasa rompe en la superhélice

eliminación de la tensión por la torsión

" m o j

la topoisomerasa une los extremos

o

si la topoisomerasa se equivoca

O

ICH espontáneo

Figura 7. Representación esquemática de un modelo para el mecanismo de ICH espontáneo (A) e inducido por mutágenos (B). (Holden y cois., 1989)

La t o p o i s o m e r a s a r o m p e la doble hélice en la superhélice, y permite q u e l a s h e b r a s s e desenrollen y s e elimine la tensión por la

superhélice

la topoisomerasa rompe en la superhélice

eliminación de la tensión por la torsión

uniones inadecuadas de la topoisomerasa

torsión. La s e g u n d a función de la t o p o i s o m e r a s a e s la d e r e u n i r l a s d o s h e b r a s p a t e r n a s del DNA. por ejemplo, h e b r a o b s c u r a c o n o b s c u r a y h e b r a clara con clara. Ocasionalmente, p u e d e la t o p o i s o m e r a s a equivocarse y entonces unir u n a h e b r a o b s c u r a con u n a clara, y u n a h e b r a clara con u n a o b s c u r a y d a r como r e s u l t a d o u n ICH que p u e d e observarse en la s u b s e c u e n t e mitosis (se a s u m e que l a s h e b r a s h a n sido m a r c a d a s con BrdU),

E n la presencia de u n m u t á g e n o , o c u r r i r á n u n n ú m e r o de perturbaciones a lo largo del DNA. E s t a s p e r t u r b a c i o n e s p u e d e n ser productos de alquilación, u n i o n e s covalentes, d í m e r o s de t i m i d i n a o eutrecruzamientos. La síntesis de DNA s e lleva a c a b o n o r m a l m e n t e h a s t a el p u n t o en que la t o p o i s o m e r a s a r e ú n e los e x t r e m o s libres. Aquí se pierde la precisión del reconocimiento de la h e b r a p a t e r n a y se Incrementa la frecuencia de uniones erróneas. Se o b s e r v a r á e n t o n c e s u n elevado n ú m e r o de ICH en la s u b s e c u e n t e mitosis (Figura 7B) (Holden y cois., 1989).

3 . 5 . Cinética d e Proliferación Celular e I n d i c e M i t ó t i c o .

En m u c h o s c a s o s la capacidad p a r a interferir con la proliferación celular se ha estudiado de m a n e r a paralela a la b ú s q u e d a de actividad genotóxica. Los m e d i c a m e n t o s antineoplásicos q u e afectan la e s t r u c t u r a del DNA, también son capaces de r e t r a s a r la Cinética d e Proliferación Celular (CPC).

efecto, rio tienen n e c e s a r i a m e n t e q u e i n t e r a c t u a r con el DNA. s i n o q u e t a m b i é n p u e d e n afectar proteínas a s o c i a d a s con la regulación del ciclo celular, o bien, con el a p a r a t o mitótico.

Si las células s e cultivan en p r e s e n c i a de BrdU d u r a n t e el p r i m e r ciclo celular, c a d a c a d e n a d e la doble hélice del DNA sintetiza s u c a d e n a c o m p l e m e n t a r l a incorporando e s t a base. D u r a n t e la mltosis, las c r o m á t i d a s h e r m a n a s n o s e d i s t i n g u e n e n t r e sí por t e n e r la m i s m a composición química, e s decir, u n filamento original y otro q u e contiene BrdU.

D e s p u é s del s e g u n d o ciclo celular, y por lo t a n t o de u n a s e g u n d a s í n t e s i s de DNA, c a d a c a d e n a del DNA de u n c r o m o s o m a servirá a s u vez de molde a copiar con lo q u e s e o b t e n d r á n d o s tipos de c r o m á t i d a s , en u n a existirán d o s c a d e n a s q u í m i c a m e n t e d i s t i n t a s , m i e n t r a s q u e en la o t r a a m b a s c a d e n a s t e n d r á n BrdU en l u g a r de timina. E n e s t a metafaae, las c r o m á t i d a s del c r o m o s o m a s e r á n q u í m i c a m e n t e diferentes, lo que s e p u e d e poner de manifiesto por la tinción q u e d a n c u a n d o s e agrega el colorante 3 3 2 5 8 de Hoechst, c o m p u e s t o derivado del benzimldazol que tifie al DNA n o r m a l pero no a q u e l c u y a s d o s c a d e n a s h a n sido s u s t i t u i d a s por BrdU. Los c r o m o s o m a s m u e s t r a n u n a c r o m á t i d a con fluorescencia m á s i n t e n s a y o t r a o p a c a (Figura 8).

Figura 8. Incorporación de BrdU p a r a el análisis de la Cinética de Proliferación Celular (CPC). Mctafases en primera (MI), s e g u n d a (M2) y t e r c e r a (M3) divisiones.

3 . 6 A c t i v a c i ó n m e t a b ò l i c a

Muchos c o m p u e s t o s químicos a d q u i e r e n la c a p a c i d a d de s e r m u t a g é n í c o s solamente d e s p u é s de q u e in vivo s o n activados metabòlicamente en el hígado y en a l g u n o s c a s o s d u r a n t e el p a s o por el tracto digestivo. Con el fin de relacionar los efectos in vitro e in uiuo, F r a n t z y Mailing en 1975 desarrollaron u n a f o r m a de activación metabòlica in vitro utilizando extracto de m l c r o s o m a s del hígado de r a t a j u n t o con u n s i s t e m a g e n e r a d o r de fosfato dinucleótido a d e n i n nicotinamida reducido (NADPH). Bruce Ames a d o p t ó este método en s u s p r u e b a s c o n bacterias, específicamente c o n S, typhlmurlum a lo q u e d e b e el nombre de P r u e b a de Ames, y d e s d e e n t o n c e s los s i s t e m a s de activación b a s a d o s en mlcrosomas s e h a n i n c o r p o r a d o e n m u c h a s p r u e b a s de mutagenicidad in vitro (Ames y cois.,1975),

CAPITULO 4

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Uno de los esfuerzos m á s i m p o r t a n t e s del t r a t a m i e n t o c o n t r a el c á n c e r es el desarrollar nuevos agentes con actividad antineoplásica. El I n s t i t u t o Nacional del Cáncer de E.U. (NCI) r e p o r t a q u e e n t r e 1990 y 1992, se probaron cerca de 2 7 , 0 0 0 c o m p u e s t o s químicos definidos y miles de extractos c r u d o s de p r o d u c t o s n a t u r a l e s , m á s i m p o r t a n t e s , con base en los r e s u l t a d o s ín uitro, a p r o x i m a d a m e n t e cerca del 4 % de e s t a s s u b s t a n c i a s s e h a n referido p a r a s u posterior ensayo. De estos, cerca de 1000 c o n t i n u a r o n la s e g u n d a evaluación ín vltro e In vivo.

(Greever y cois. 1992)

«

E n el D e p a r t a m e n t o de Farmacologóla y Toxicología d e la Facultad de Medicina de la U.A.N.L., e s t á n en desarrollo u n a serie de p r u e b a s dirigidas a Investigar la potencial acción a n t i n e o p l á s i c a de la T-514. Ya q u e en México es necesario Importar p r o d u c t o s útiles en el t r a t a m i e n t o c o n t r a el c á n c e r y el costo de los m i s m o s es m u y elevado. el desarrollo de c o m p u e s t o s antineoplásicos a bajo costo h a a d q u i r i d o alta prioridad en n u e s t r o país.

Impiden la duplicación de las células c a n c e r o s a s .

S e h a planteado que la T - 5 1 4 p u d i e r a e m p l e a r s e como u n a g e n t e antineopláslco con b a s e en los a n t e c e d e n t e s q u e se h a n descrito en relación a s u acción sobre líneas celulares, sin e m b a r g o es de p a r t i c u l a r Importancia el analizar s u g e n o t o x i c i d a d a s í c o m o s u s efectos sobre la proliferación celular q u e p u e d a n revelar si la actividad citostàtica de dicho c o m p u e s t o sigue el m i s m o p a t r ó n d e los a g e n t e s quimlote rapé uticos que i n t e r a c t ú a n c o n el DNA.

Por o t r a parte, los d a t o s e n la l i t e r a t u r a a c e r c a de la m u t a g e n l c l d a d y genotoxicidad de los derivados a n t r a c e n ó n i c o s y a n t r a q u i n ó n i c o s , s e reportan principalmente en bacterias; los d a t o s en s i s t e m a s de mamíferos son escasos. La investigación q u e se realizó en linfocitos h u m a n o s in vitro sobre e9te derivado a n t r a c e n ó n i c o , la T - 5 1 4 , c o n f o r m a y a u n o de los d o c u m e n t o s pioneros p a r a este g r u p o de

c o m p u e s t o s n a t u r a l e s .

4 . 1 H i p ó t e s i s d e Trabajo

4 . 2 . Objetivo General d e Trabajo

Evaluar el potencial genotóxico de la T - 5 1 4 s o b r e linfocitos h u m a n o s in vitro y en el s i s t e m a de Ames.

4 . 2 . 1 . Objetivos E s p e c í f i c o s

1) Analizar los efectos de la toxina T - 5 1 4 e n cultivos de linfocitos h u m a n o s e v a l u a n d o los siguientes p a r á m e t r o s :

-El DNA, d e t e r m i n a n d o la f r e c u e n c i a de a b e r r a c i o n e s c r o m o s ó m i c a s e s t r u c t u r a l e s y de i n t e r c a m b i o s de c r o m á t i d a s h e r m a n a s

-La proliferación celular, evaluando la c a p a c i d a d de proliferación con b a s e en la cinética de proliferación celular, la proporción de células en m e t a f a s e (índice mitótico) y s o b r e l a s o t r a s f a s e s del ciclo celular m e d i a n t e la cltometría de flujo.

2) Investigar la capacidad de La toxina p a r a producir m u t a c i o n e s en Saímoneiia typhlmurium .

CAPITULO 5

MATERIAL Y MÉTODOS

5 . 1 . L i n f o c i t o s H u m a n o s

5 . 1 . 1 . D o n a d o r e s

S e obtuvo s a n g r e periférica h e p a r i n i z a d a por venopunción de ocho d o n a d o r e s s a n o s , con u n a edad promedio de 3 0 . 7 a ñ o s con los siguientes criterios de inclusión: s u j e t o s mayores de 18 años, de a m b o s sexos y de condición saludable. Los criterios de exclusión f u e r o n : a n t e c e d e n t e s de exposición reciente y directa a plaguicidas, s u b s t a n c i a s q u í m i c a s u h o r m o n a s ; e s t a r bajo t r a t a m i e n t o médico; s e r f u m a d o r y h a b e r e s t a d o expuesto a rayos X en el m e s «interior a la t o m a de la m u e s t r a .

5 . 1 . 2 . Cultivo de l i n f o c i t o s

t r a t a m i e n t o s fueon agregados a los cultivos a l a s 4 8 h r s de incubación. Las concentraciones se eligieron de a c u e r d o a lo establecido por D e a n y Danford (1984): 1) que la concentración m á s alta d e m o s t r a r a evidencia de inhibición mitótica y 2) q u e los intervalos de las c o n c e n t r a c i o n e s f u e r a n la mitad del logaritmo de las m i s m a s .

Los cultivos se mantuvieron a 37°C e n u n a a t m ó s f e r a de 5% d e COa. A las 7 0 h r s de incubación s e agregó a c a d a cultivo 0.2 mi d e colccmida (I0|ig/ml; Microlab) y la i n c u b a c i ó n c o n t i n u ó por 2 h r s m á s . Los cultivos se centrifugaron a 1,200 rpra por 10 min, se eliminó el s o b r e n a d a n t e y se r e s u s p e n d i ó el precipitado e n 10 mi de KCL 0 . 0 7 5 M y s e m a n t u v i e r o n a 37°C d u r a n t e 2 0 min , e n s e g u i d a s e c e n t r i f u g a r o n a 1,200 r p m d u r a n t e 10 min, se eliminó el s o b r e n a d a n t e y las c é l u l a s f u e r o n fijadas r e s u s p e n d i e n d o con solución de Carnoy (metanol-ácido acético 3:1). El lavado con solución fijadora se repitió h a s t a q u e se obtuvo u n p a q u e t e celular blanco, el cual s e r e s u s p e n d i ó en solución fijadora y se g u a r d ó a 4°C.

5 . 1 . 3 . Preparación d e laminillas

6.0 mi 0.2 mi 0 3 mi 0 J mi

RPMI 1640 PHA BrdU

sangre Tratamiento Col cernida

KC10.075M 20 min

Solución Camoy

4 8 hrs

<=>

c=C>

O

1

!

!

f

V

<=> o ^ —

Figura 9. E s q u e m a del cultivo de llnfocitos.

5 . 1 . 4 . T i n c i ó n

Las laminillas se sumergieron en u n a solución de Hoechst 3 3 2 5 8 (1 m g / m l ) en a g u a destilada por 3 0 min en a u s e n c i a de luz. se lavaron en a g u a corriente y se secaron. Posteriormente s e cubrieron c o n solución a m o r t i g u a d o r a de fosfatos ( N a ^ P O * 6 6 mM. KH2P04 6 6 mM. pH 6.8) y se expusieron a luz negra por 1:30 h r s . Las laminillas f u e r o n lavadas en la m i s m a solución a m o r t i g u a d o r a y se s u m e r g i e r o n en u n a solución de G i e m s a (Merck) al 4% en solución a m o r t i g u a d o r a de fosfatos por 3 min, se lavaron en a g u a corriente y se secaron (Perry y Wolff, 1974).

5 . 1 . 5 . A n á l i s i s m i c r o s c ó p i c o

Indice Mitótico y Cinética de Proliferación Celular. Los p a r á m e t r o s p a r a e v a l u a r el efecto genotóxico f u e r o n : Intercambios d e C r o m á t l d a s H e r m a n a s y Aberraciones Cromosómicas.

5 . 1 . 5 . 1 . Indice Mitótico. Las p r e p a r a c i o n e s se observaron al microscopio óptico a 2 0 aumentos recorriéndolas en zlg-zag, c o m e n z a n d o de la parte central de la laminilla p a r a c o n t a r u n t o t a l de d o s mil núcleos y de ellos determinar c u á n t o s e s t a b a n en división (metafase). Se registraron como núcleos aquéllos q u e podían ser reconocidos por s u morfología, de forma a p r o x i m a d a m e n t e esférica, d e tinción clara y de t a m a ñ o relativamente g r a n d e . Como m e t a f a s e se s e ñ a l a r o n a las agrupaciones de c r o m o s o m a s bien definidas con u n n ú m e r o mayor de 3 0 cromosomas:

Número total de m e t a f a s e s IM = Número total de células e v a l u a d a s

La inhibición del índice mitótico (IIM) producido por la toxina se calculó como:

1M del t r a t a m i e n t o x 100 IIM = 100 - IM del control

1( # MI ) + 2 ( # M2) + 3 ( # M3) IR = Número de m e t a f a s e s o b s e r v a d a s

5 . 1 . 5 . 3 . I n t e r c a m b i o s d e C r o m á t i d a s H e r m a n a s . E s t o s fueron establecidos por el análisis de 2 5 m e t a f a s e s en s e g u n d a división. La f r e c u e n c i a por célula se obtuvo por la s u m a de los i n t e r c a m b i o s p r e s e n t e s en c a d a cromosoma de la m e t a f a s e con 4 4 - 4 6 c r o m o s o m a s . Para c a d a cromosoma se s u m a r o n los i n t e r c a m b i o s terminales, aquellos q u e se localizaron en los extremos con valor de uno. y los i n t e r c a m b i o s intersticiales, s i t u a d o s en la zona intermedia, con valor de 2 debido a q u e s u formación requiere el doble de eventos q u e los terminales (Figura

10) (Latt. 1981).

Figura 10. Esquema de los intercambios y su valor.

5 . 1 . 5 . 4 . A b e r r a c i o n e s C r o m o s ó m i c a s .

El análisis de aberraciones c r o m o s ó m i c a s se realizó en 100 m e t a f a s e s consecutivas de primera división (MI). T o d a s con 4 5 o m á s centrómeros. El d a ñ o cromosómico (Ostrosky. 1991) se clasificó como: b r e c h a s (discontinuidades de DNA cuya d i s t a n c i a es m e n o r al a n c h o de la cromátida.) cromatídicas o cromosómicas.

i n t e r c a m b i o s (rearreglos a n o r m a l e s e n t r e los brazos d e u n o o m á s cromosomas) cromatídicos: como c u a d r i r r a d i a l e s o trirradiales o cromosómicos (diccntricos, anillos, translocaciones).

5 . 1 . 6 . A c t i v a c i ó n m e t a b ó l i c a

El homogenado hepático que contiene las e n z i m a s mlcrosomales o fracción "S9" (sobrenadante p r o d u c t o de la centrifugación a 9 0 0 0 g) s e obtuvo de la c a s a Moltox Inc. (USA) y c u m p l í a con las siguientes características: especie: rata; cepa: Sprague-Dawley; sexo: m a c h o ; buffer: KC1 0.15 M volumen: 2.1 mi, pH 7.4; agente inductor: Aroclor

1254. C u a n d o la fracción "S9" se c o m b i n a con los s i g u i e n t e s cofactorea y soluciones se forma la m e z c l a 8 9 , la cual s e preparó i n m e d i a t a m e n t e a n t e s de c a d a experimento: 20% de la fracción S9, MgCl2 8 mM, nicotin-ndenina-difosfato (NADP) 4 mM, glucosa-6-fosfato (G-6-P) 5 mM y de solución a m o r t i g u a d o r a de fosfato de sodio 100 mM, pH 7.4 . La solución de los cofactores s e filtró utilizando u n a u n i d a d swinex (Millipore Corp.) e q u i p a d a con u n a m e m b r a n a de 0.2 m p de poro y por último s e le agregó la fracción S 9 (White y Hesketh, 1980).

5 . 1 . 7 . T r a t a m i e n t o s