Los códigos de barra de ADN como herramienta en la identificación de las especies del género Micropholis (Griseb ) Pierre (SAPOTACEAE)

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(1)LOS CÓDIGOS DE BARRA DE ADN COMO HERRAMIENTA EN LA IDENTIFICACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO Micropholis (Griseb.) Pierre (SAPOTACEAE).. MAESTRÍA EN MANEJO, USO Y CONSERVACIÓN DEL BOSQUE. UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES. SHIRLEY DAYANA SÁNCHEZ CALLEJAS. ROCIO CORTÉS BALLÉN Ph.D. JAMES RICHARDSON Ph.D.. 2016.. 1.

(2) NOTA DE ACEPTACIÓN. ___________________________________________. ____________________________________________. ____________________________________________. _____________________________________________. __________________________________ Director __________________________________ Jurado __________________________________ Jurado. BOGOTÁ D.C. Día ____ Mes ______ Año____. 2.

(3) DEDICATORIA. Dedico este proyecto de investigación a mis padres quienes han sido motor y ejemplo de vida para salir adelante, y a mis hermanos por su gran apoyo y compañía permanente. A mi directora de tesis Rocio Cortés por sus aportes, recomendaciones, consejos y enseñanzas a lo largo de todo el proceso de formación profesional y personal. A James por sus contribuciones y por el apoyo constante durante el proceso de la investigación. A la Universidad Distrital Francisco José de Caldas por brindarme la oportunidad de pertenecer a ella, y en general a todas aquellas personas que de manera directa o indirecta hicieron parte de este gran logro.. 3.

(4) TABLA DE CONTENIDO. RESUMEN.......................................................................................................................................... 6 ABSTRACT ........................................................................................................................................ 7 INTRODUCCIÓN GENERAL ........................................................................................................... 9 LOS CÓDIGOS DE BARRA DE ADN COMO HERRAMIENTA EN LA IDENTIFICACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO Micropholis (Griseb.) Pierre (SAPOTACEAE). ............... 13 RESUMEN ................................................................................................................................ 13 ABSTRACT .............................................................................................................................. 14 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 14 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................. 17 Muestreo ................................................................................................................................ 17 Extracción y amplificación de ADN ..................................................................................... 18 Análisis de datos.................................................................................................................... 19 RESULTADOS ......................................................................................................................... 20 Muestreo ................................................................................................................................ 20 Extracción y amplificación.................................................................................................... 20 Análisis de Neighbor-Joining................................................................................................ 21 Análisis de máxima parsimonia ............................................................................................ 21 Análisis bayesiano ................................................................................................................. 23 Análisis de “barcoding gap”................................................................................................. 23 DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 24 Utilidad de los códigos de barra de ADN en Micropholis .................................................... 24 Especies de Micropholis polifiléticas .................................................................................... 27 El “barcoding gap” en Micropholis...................................................................................... 28 CONCLUSIONES .................................................................................................................... 29 4.

(5) AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................ 29 CONCLUSIONES GENERALES .................................................................................................... 30 RECOMENDACIONES ................................................................................................................... 32 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................................. 33. 5.

(6) RESUMEN. El género Micropholis de la familia Sapotaceae es diverso y ecológicamente importante en los bosques húmedos de tierras bajas. En general, las especies son difíciles de identificar en ausencia de caracteres reproductivos y en estados juveniles. Por consiguiente, se podría subestimar la biodiversidad de los bosques donde crecen estas especies al desconocer con certeza su identidad, lo que a su vez impide tomar decisiones con precisión en cuanto al manejo, uso y conservación de dichos bosques. Actualmente, existen técnicas que permiten identificar las especies con base en caracteres moleculares mediante el uso de los códigos de barra de ADN. El proyecto evaluó la capacidad de los marcadores moleculares matK, ITS y rbcL en la diferenciación de las especies del género Micropholis. Aunque la extracción de ADN de material fresco no presentó dificultades, la extracción con base en material de herbario sí, por lo que se aumentó el esfuerzo de trabajo en el laboratorio para la obtención de ADN. Los análisis de Neighbor-Joining, máxima parsimonia e inferencia bayesiana evidenciaron el éxito de ITS2 como código de barras de ADN para la identificación de las especies de Micropholis, logrando discriminar cerca del 70% de las especies utilizadas en el estudio. Adicionalmente, la combinación de los marcadores moleculares del cloroplasto con ITS2 logró identificar con la misma eficiencia las especies de Micropholis. Teniendo en cuenta la riqueza de la flora del país, y además que la generación de datos moleculares es cada vez menos costosa, se evidencia la necesidad de implementar técnicas como los códigos de barra de ADN en la identificación de especies, lo que impactaría en áreas tales como los estudios de evaluación de la biodiversidad, la identificación de especies de valor económico, o el control de comercio ilegal, entre otros.. 6.

(7) ABSTRACT. The genus Micropholis (Sapotaceae) is diverse and ecologically important in lowland tropical wet forests. In general, species are difficult to identify in the absence of reproductive traits and in juvenile stages. As a result we may underestimate the biodiversity of the forests where these species grow that is an impediment to forest management and conservation decision making. Alternative techniques to identify species are based on molecular characters using DNA barcoding. This study assessed the ability of molecular markers ITS2, matK and rbcL in differentiating species of the genus Micropholis. Although DNA extraction of fresh material has not presented difficulties, extraction based on herbarium material itself, which has increased work effort in the laboratory to obtain DNA. Maximum parsimony analysis, Neighbor-Joining and Bayesian inference showed the success of ITS2 as barcode DNA to identify species Micropholis, achieving discriminating about 70% of the species used in the study. Additionally, the combination of molecular markers chloroplast with ITS2 successfully identified with the same efficiency Micropholis species. Given the richness of the flora of the country, and also the generation of molecular data is becoming less expensive, it is evident the need to implement techniques such as barcodes DNA species identification, which would impact areas such as studies of biodiversity assessment, identification of species of economic value or control illegal trade, among others.. 7.

(8) LISTA DE FIGURAS Figura 1. Árbol construido por el método de Neighbor-Joining, utilizando las distancias de Kimura 2-parámetros con el marcador molecular ITS2. Los rectángulos verdes representan las especies identificadas y los valores de bootstrap se presentan sobre las ramas. ............................................. 49 Figura 2. Porción del alineamiento múltiple de secuencias de M. guyanensis con el marcador molecular ITS2. Los óvalos indican las posiciones variables informativas dentro de los individuos de la especie en estudio. .................................................................................................................... 50 Figura 3. Porción del alineamiento múltiple de secuencias de algunas especies del género Micropholis con el marcador molecular ITS2. Los óvalos indican las posiciones variables informativas para el estudio. ............................................................................................................. 50 Figura 4. Análisis filogenético basado en el método de máxima parsimonia utilizando el marcador molecular ITS2. Los cuadrados verdes indican los clados resueltos. Los puntos blancos indican las homoplasias y los puntos negros indican las sinapomorfías. Las flechas indican los nodos que colapsaron en el árbol de consenso estricto. Los valores de bootstrap se presentan sobre las ramas. ........................................................................................................................................................... 51 Figura 5. Análisis filogenético basado en el método de máxima parsimonia utilizando 20 secuencias de nueve especies de Micropholis con los marcadores moleculares ITS2 (a), matK (b), rbcL (c) y las combinaciones de los marcadores ITS2+matK (d), ITS2+rbcL (e), matK+rbcL (f) e ITS2+matK+rbcL. Los puntos blancos indican las homoplasias y los puntos negros indican las sinapomorfías. Los valores de bootstrap se presentan sobre las ramas. ............................................ 52 Figura 6. Árbol de máxima credibilidad (MCC) del análisis de inferencia bayesiana de la región ribosomal nuclear ITS2. Los rectángulos verdes representan las especies identificadas. Los valores de probabilidad posterior se muestran sobre las ramas. .................................................................... 53 Figura 7. Divergencia intraespecífica e interespecífica para el conjunto de datos estudiados con el marcador molecular ITS2 (a), matK (b) y rbcL (c). .......................................................................... 54. LISTA DE TABLAS Tabla 1. Marcadores moleculares, primers y programas utilizados en la amplificación de ADN de Micropholis ....................................................................................................................................... 44 Tabla 2. Números de acceso de GenBank para las secuencias analizadas. *Especimen botánico estéril. **Especimen botánico fértil. (COAH), espécimen botánico del Herbario Amazónico Colombiano. ...................................................................................................................................... 44 Tabla 3. Resumen de la variabilidad de las secuencias en el análisis de máxima parsimonia para las especies de Micropholis. ................................................................................................................... 48. 8.

(9) INTRODUCCIÓN GENERAL. La identificación tradicional de especies ha sido realizada con base en caracteres morfológicos tales como tamaño, forma, color, consistencia, cantidad y tipos, tanto de hojas como de flores, frutos, corteza y semillas, entre otros. Sin embargo, la identificación basada en este tipo de caracteres aunque es de gran utilidad, presenta cuatro limitaciones significativas que se deben considerar: la plasticidad fenotípica y la variabilidad genética de los caracteres empleados para la identificación de las especies, la existencia de taxones crípticos, la poca utilidad de las claves morfológicas en algunos de los estados de desarrollo del individuo (e.g. plántulas) y la falta de especialistas en cada uno de los grupos de interés (Hebert et al., 2003a; Palacio-López & Rodriguez-López, 2007; Chase & Fay, 2009; Paz et al., 2011). En primera instancia, se presenta una limitación en cuanto a la plasticidad fenotípica y la variabilidad genética en los caracteres empleados para la identificación de especies (Paz et al., 2011), es decir, los genotipos tienen la habilidad de producir diferentes fenotipos en respuesta a las diversas condiciones ambientales que se presenten. La plasticidad fenotípica es uno de los medios por los cuales las plantas pueden ajustar o modificar su morfología y fisiología con el fin de adaptarse a la heterogeneidad ambiental (Palacio-López & Rodriguez-López, 2007). Por consiguiente, estos tipos de variabilidad pueden llevar a identificaciones incorrectas. Por otro lado, se pasa por alto los taxones morfológicamente crípticos que son comunes en muchos grupos (Hebert et al., 2003a). Estos taxones, al ser inconspicuos o “invisibles” quedan por fuera en los inventarios biológicos, generando subestimaciones en la biodiversidad. En tercer lugar, las claves morfológicas establecidas son eficaces tan sólo para un estado especifico de la vida o desarrollo del individuo, es decir, algunos caracteres morfológicos se presentan en el individuo en determinado estado de desarrollo por lo que una clave sería tan solo útil para ese momento de. 9.

(10) crecimiento. Finalmente el uso de las claves requiere de un alto nivel de conocimientos con el fin último de no incurrir en diagnósticos erróneos (Chase & Fay, 2009). De acuerdo a lo anteriormente mencionado y haciendo énfasis en que uno de los objetivos de las ciencias biológicas, y en particular de la sistemática, ha sido la clasificación de los organismos con base en caracteres morfológicos (Paiz-Medina & Huete-Pérez, 2008), y conociendo sus limitaciones, se ha logrado avanzar en metodologías y herramientas que permitan una identificación más precisa y donde se haga posible el establecimiento de diagnósticos confiables. Por consiguiente, se tomarán decisiones adecuadas en cuanto a tráfico ilegal de especies protegidas o en peligro de extinción, identificación de especies de gran valor económico, estudios de evaluación de la biodiversidad y control de comercio ilegal, entre otros. Por su parte, el género Micropholis de la familia Sapotaceae es de gran importancia económica por presentar madera adecuada para ebanistería, pisos y artesanías, además de presentar látex utilizado en la industria para la producción de goma de mascar (Vivas et al., 2014). Sin embargo, desde los inicios de su clasificación ha sido objeto de discusión debido a que las especies presentan caracteres morfológicos muy similares y a que no siempre se cuenta con caracteres reproductivos, hechos que dificultan su identificación, así como la caracterización de usos potenciales (Pennington, 1990; Vivas et al., 2014). Por consiguiente, se justifica la necesidad de implementar herramientas que permitan realizar una identificación mucho más precisa de las especies del género Micropholis. Los códigos de barra de ADN son secuencias cortas y estandarizadas que permiten la identificación de las especies conocidas y a la vez el descubrimiento de especies desconocidas (Baker et al., 1996; Hebert et al., 2003b; CBOL Plant Working Group, 2009; Gernandt, 2011). El gen cox1 resultó ser un código de barras capaz de diferenciar especies en varios grupos de animales (Hebert et al., 2003a; Smith et al., 2005). Por el contrario, en plantas no se ha encontrado un único marcador que permita identificar las especies, por lo que se han generado debates en cuanto a que región o regiones sirven para actuar como códigos de barra específicos en plantas ( Kress & Erickson, 2007; 10.

(11) Sass et al., 2007; CBOL Plant Working Group, 2009 ). Actualmente, se ha discutido acerca de qué tanto es más difícil establecer códigos de barra en plantas en comparación con otros grupos taxonómicos, por lo que se han desarrollado varios intentos por establecer los marcadores moleculares que sirvan como códigos de barra de ADN en plantas. Por ejemplo, Kress et al (2005), comprobaron que los marcadores moleculares ITS y trnH-psbA comprendían la mejor región de ADN para utilizarse como códigos de barra, ya que se caracterizaron por tener una buena longitud, una alta variación intraespecífica, permitían la utilización de iniciadores universales y eran fáciles de amplificar. Del mismo modo, Lahaye et al (2008), evaluaron ocho regiones potenciales como códigos de barras de ADN en angiospermas, donde se estableció nuevamente que trnH-psbA era la región de ADN que permitía observar una mayor variación interespecífica seguida de matK, esto permitió proponer a estas dos regiones como códigos de barra de ADN universales en plantas. En este mismo sentido, Newmaster et al (2008), determinaron seis regiones codificantes y una no codificante de ADN de cloroplasto para la obtención de códigos de barra para Compsoneura (Myristicaceae), donde se demostró nuevamente que las regiones matK y trnH-psbA ofrecían una alta resolución entre todas las especies de estudio. Con base en las experiencias anteriormente mencionadas, el CBOL Plant Working Group, recomendaron el uso de las regiones de ADN del cloroplasto matK y rbcL (CBOL Plant Working Group, 2009). Sin embargo, el código de barras de ADN no ha sido útil para diferenciar las especies dentro de diferentes grupos de gimnospermas, por ejemplo, Nicolalde-Morejón et al (2010), examinaron el desempeño de cuatro regiones codificantes del cloroplasto como son matK, rbcL, rpoC1 y rpoB y tres regiones no codificantes atpF-atpH, psbK-psbl y trnH-psbA y la región nuclear ITS para tres géneros de cícadas, donde encontraron que rbcL tuvo gran éxito en la amplificación pero a su vez mostró una baja variación dentro de los géneros de estudio, por su lado matK se descartó debido a la dificultad en la amplificación; en cuanto a psbK-psbl resultó exitoso en la amplificación y con buenos niveles de variación, sin embargo no funcionó en todos los grupos analizados. Por consiguiente, recientemente se han propuesto marcadores moleculares alternativos como por ejemplo ITS ya que ha demostrado ser 11.

(12) capaz de discriminar entre especies en varios grupos de plantas (Group China.Plant.BOL et al., 2011). La implementación de códigos de barras de ADN ha desarrollado grandes expectativas ya que facilita el levantamiento de la biodiversidad, determina especies crípticas y ha sido de gran utilidad en estudios ecológicos, donde la identificación de material biológico en estados juveniles es un impedimento en cuanto a la caracterización y composición florística del bosque de estudio (González, 2009; Kress et al., 2010). Por otro lado, el uso de la técnica de códigos de barra de ADN es de gran utilidad para la identificación de especies pertenecientes a taxones difícilmente diagnosticables sobre la base de morfología, como también para grupos de organismos cuyos problemas taxonómicos fundamentales han sido resueltos convenientemente por los especialistas (Coissac et al., 2016; Divakar et al., 2016; Moon et al., 2016). Se estima que esta técnica contribuirá a actualizar las colecciones biológicas y acelerará el inventario de la biodiversidad, siempre de manera precisa y en menor tiempo (Newmaster et al., 2006; Lanteri, 2007). De acuerdo a la dificultad en la identificación de las especies del género Micropholis y en general de toda la familia Sapotaceae y teniendo en cuenta la utilidad de los códigos de barra de ADN como herramienta para la identificación de taxones con morfologías muy similares, en el capítulo I se podrá encontrar un artículo que hace referencia a la evaluación de la capacidad de los tres marcadores moleculares propuestos como códigos de barra en plantas, para la discriminación de las especies del género Micropholis.. 12.

(13) LOS CÓDIGOS DE BARRA DE ADN COMO HERRAMIENTA EN LA IDENTIFICACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO Micropholis (Griseb.) Pierre (SAPOTACEAE). Dayana Sánchez-C. 1 James Edward Richardson2,3 Dayron Cárdenas4 Rocio Cortés-B.5 Palabras claves: biodiversidad, distancia genética, ITS2, matK, molecular, rbcL, taxonomía Key words: biodiversity, ITS2, genetic distance, matK, molecular, rbcL, taxonomy.. RESUMEN. El género Micropholis (Sapotaceae) es diverso y ecológicamente importante en los bosques húmedos de tierras bajas del Neotrópico. En general, las especies son difíciles de identificar en ausencia de caracteres reproductivos y en estados juveniles. Por consiguiente, se podría subestimar la biodiversidad de los bosques donde crecen, lo que a su vez podría impedir tomar decisiones acertadas en cuanto al manejo, uso y conservación de estos bosques. Actualmente, existen técnicas alternativas que permiten identificar las especies con base en caracteres moleculares usando los códigos de barra de ADN. Nuestro objetivo fue evaluar la capacidad de los marcadores moleculares ITS2, matK y rbcL en la identificación de 22 especies de Micropholis que tienen una distribución pantropical. Los análisis de Neighbor-Joining, máxima parsimonia e inferencia bayesiana mostraron que el marcador molecular con mejores resultados fue ITS2, con un 70% de eficiencia, en donde 15 de las 20 especies se pudieron identificar con esta región nuclear. Los dos marcadores del cloroplasto no presentaron resultados óptimos para la determinación de las especies del género, por lo que se propone a ITS2 como potencial código de barras para la identificación de las especies de. 1. Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Bogotá, Colombia. [email protected]. Autor encargado de la correspondencia. 2. Universidad del Rosario, programa de Biología. Bogotá, Colombia. [email protected] Tropical Diversity Section Royal Botanic Garden Edinburgh. Edinburgh, UK. [email protected] 4 Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas SINCHI. Bogotá, Colombia. [email protected] 5 Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Bogotá, Colombia. [email protected] 3. 13.

(14) Micropholis. ABSTRACT. The genus Micropholis (Sapotaceae) is diverse and ecologically important in lowland tropical wet neotropical forests. In general, species are difficult to identify in the absence of reproductive traits and in juvenile stages. As a result we may underestimate the biodiversity of the forests where these species grow that is an impediment to forest management and conservation decision making. Alternative techniques to identify species are based on molecular characters using DNA barcoding. This study assessed the ability of molecular markers ITS2, matK and rbcL in differentiating species of the genus Micropholis. Neighbor-Joining analysis, maximum parsimony and Bayesian inference showed that ITS2 was the best marker for species identification with an efficiency of 70% in discriminating species, with sufficient interspecific and intraspecific divergence to identify 15 of the 20 species used in the analysis. The two additional chloroplast markers did not improve species determination. Thus, we propose ITS2 as a potential bar code marker for identifying species in Micropholis. INTRODUCCIÓN. El género Micropholis comprende 38 especies que se encuentran ampliamente distribuidas en Centroamérica, Suramérica y en las Islas del Caribe (Pennington, 1990). Sin embargo, la mayoría de las especies se encuentran en las Guayanas, en el sur y centro de Venezuela, y en la región Amazónica de Brasil, Perú y Colombia. Las especies de este género crecen en los bosques húmedos de tierras bajas, aunque algunas especies, como por ejemplo M. crotonoides, crecen en bosques montanos. En Colombia, el género se encuentra representado por 20 especies que pueden ser árboles y arbustos de hojas simples, alternas y dísticas, que presentan látex blanco tanto en la corteza como en las ramitas y peciolos (Piñeros, 2013). Muchas especies de Micropholis se. 14.

(15) diferencian fácilmente de otras Sapotaceae por presentar hojas con venación secundaria broquidódroma o eucamptodroma que se encuentran cercanas y uniformemente distribuidas y que dan a la hoja una apariencia estriada, y por la cicatriz adaxial que se extiende a lo largo de la semilla (Pennington, 1990). La identificación de las especies de Micropholis se ha realizado tradicionalmente usando caracteres morfológicos. Sin embargo, a pesar de ser indiscutiblemente útil, es una labor complicada en muchos casos debido a que no siempre se cuenta con caracteres reproductivos como flores y/o frutos que permitan realizar una identificación acertada (Vivas et al., 2014). La causa podría estar relacionada con lo encontrado por Terra-Araujo et al., (2012), quienes observaron que las flores de M. guyanensis son altamente efímeras y que persisten solo un día aproximadamente, fenómeno que podría extrapolarse a otras especies del género y de la familia. Teniendo en cuenta que con base en la identificación de las especies se estima la diversidad de los bosques, y se toman decisiones en cuanto a su manejo, uso y conservación, es necesaria la implementación de herramientas adicionales a los rasgos morfológicos, que permitan realizar identificaciones de manera precisa y consistente, tales como la técnica de códigos de barra de ADN. Desde hace aproximadamente dos décadas, los datos moleculares se han convertido en una alternativa valiosa en la identificación de especies (Baker et al., 1996; Hebert et al., 2003a; Kress et al., 2005) en la que se incluyen datos adicionales a los tradicionales morfológicos. Los códigos de barra de ADN son secuencias cortas y estandarizadas que permiten la identificación de las especies conocidas y a la vez el descubrimiento de especies desconocidas (Baker et al., 1996; Hebert et al., 2003a; CBOL Plant Working Group, 2009; Gernandt et al., 2011; Gong et al., 2015; Divakar et al., 2016). El gen cox1 resultó ser un código de barras capaz de diferenciar especies en varios grupos de animales (Hebert et al., 2003b; Smith et al., 2005). Por el contrario, en plantas ha sido difícil encontrar un único marcador que permita identificar las especies, y se han analizado diversas regiones que funcionen como códigos de barra específicos en plantas (Kress & Erickson, 2007; Sass 15.

(16) et al., 2007; CBOL Plant Working Group, 2009; Coissac et al., 2016). En el 2009, el CBOL Plant Working Group recomendó el uso de una región particular de los genes del cloroplasto matK y rbcL, terminando parcialmente con esta discusión. Sin embargo, debido a que estos dos marcadores han sido muy poco variables en algunos grupos de plantas (e.g. Orchidaceae, Asahina, 2010; Cuéllar, 2011; Euphorbiaceae-Euphorbia, Aubriot et al., 2013; Lamiaceae, Christina & Annamalai, 2014; Leguminosae-Cassia, Purushothaman et al., 2014) se propuso el espaciador transcrito interno ITS2 como una tercera región a considerar, ya que ha demostrado ser capaz de discriminar entre especies en varios grupos de plantas (Group China.Plant.BOL et al., 2011; Hollingsworth et al., 2011; Coissac et al., 2016). Son pocos los estudios realizados en códigos de barra de ADN en la familia Sapotaceae y particularmente en el género Micropholis. El primero fue realizado por González et al (2009), quienes realizaron un inventario de todos los árboles a lo largo de dos hectáreas en un bosque tropical de la Guayana Francesa, evaluando ocho marcadores moleculares (rbcLa, rpoC1, rpoB, matK, ycf5, trnL, psbA-trnH, ITS), con el fin de examinar si los códigos de barra contribuían a aumentar la calidad y minimizar los tiempos en la identificación de especies para los estudios de biodiversidad en bosques tropicales. Los resultados mostraron que ITS y matK presentaron dificultades en la secuenciación, y que ninguno de los marcadores logró una tasa de identificación en las plantas mayor al 70%, sin embargo concluyeron que ITS podría ser un código de barras útil para la identificación de especies estrechamente relacionadas en las familias Sapotaceae y Lauraceae. En el 2010 Kress et al., utilizaron datos de matK, rbcL y trnH-psbA como herramienta para la construcción de una filogenia en una comunidad de 300 árboles tropicales en Puerto Rico, donde se incluyeron algunos géneros de la familia Sapotaceae como Chrysophyllum, Manilkara y Micropholis. Los resultados mostraron que la combinación de los tres marcadores moleculares permitió la diferenciación del 95% de las especies y el 96% de las familias, evidenciando así que los códigos de barra de ADN son una herramienta útil para explorar la evolución de las diferentes. 16.

(17) comunidades. Por otro lado, Baraloto et al (2012) evaluaron la utilidad de los rasgos funcionales y las relaciones filogenéticas en la predicción de los procesos de construcción de algunas comunidades de especies arbóreas que ocurren en la selva tropical de la Guayana Francesa como es el caso de Micropholis, utilizando 17 rasgos funcionales y datos moleculares de dos marcadores del cloroplasto (matK y rbcL). Los resultados mostraron que en promedio las especies se relacionan en mayor medida por sus rasgos funcionales, es decir, confirman que los cambios en el medio ambiente son la respuesta predominante en la construcción de las comunidades ricas en especies, y no su similitud filogenética. Finalmente, en el 2014 Vivas et al., evaluaron la capacidad de los códigos de barra en la identificación de especies de Sapotaceae, quienes incluyeron ocho géneros de la familia y cuatro especies de Micropholis, demostrando que ITS resultó ser la mejor opción de código de barras para facilitar la identificación de especies en esta familia. Teniendo en cuenta que el muestreo de las especies de Micropholis ha sido muy poco representativo en los estudios mencionados anteriormente, los principales objetivos de este estudio son: 1) evaluar la capacidad de los marcadores moleculares matK, rbcL y ITS en la diferenciación de las especies del género Micropholis (Sapotaceae) y 2) conformar una base de datos con códigos de barra de ADN disponible en BOLD Systems de las especies de Micropholis estudiadas. MATERIALES Y MÉTODOS. Muestreo. Se muestrearon un total de 20 especies, en las que el número de individuos varió desde un individuo hasta 19 individuos por especie. Se usaron un total de 147 secuencias de Micropholis, de las cuales 58 son originales y 89 fueron bajadas de GenBank. El trabajo de campo se centró en algunas localidades de los Departamentos de Caquetá y Meta en Colombia. Los especímenes botánicos fueron identificados mediante el uso de las claves taxonómicas de la serie Flora Neotrópica de la. 17.

(18) familia Sapotaceae (Pennington, 1990) y a través de la comparación con los especímenes de referencia de los herbarios COAH y UDBC. Las colecciones realizadas fueron procesadas y depositadas en el Herbario Forestal UDBC. Extracción y amplificación de ADN. La extracción de ADN se realizó siguiendo cuatro protocolos y técnicas de extracción en plantas. El ADN del material de herbario se extrajo usando el protocolo de CTAB (Doyle & Doyle, 1990), con algunas modificaciones menores en la preparación del buffer de lisis celular, ya que no solo contenía CTAB2%, PVPP y 2- mercaptoetanol2%, sino que también se agregó NaCl 5M, EDTA 20 mM (PH=8) y Tris HCl 100 mM (PH=8), de acuerdo al protocolo del Laboratorio del Real Jardín Botánico de Edimburgo (Clark & Hollingsworth, 2011). Adicionalmente, se dejaron las muestras en isopropanol frío a -20 °C durante siete días para aumentar la cantidad de ADN que se precipita. La extracción de ADN de material fresco se realizó siguiendo el protocolo de sales (Maniatis et al., 1982), la técnica de Alexander (Alexander et al., 2007) y las instrucciones del fabricante del DNeasy Plant Mini Kit de Qiagen. La amplificación de las tres regiones analizadas se realizó utilizando los primers y programas que se muestran en la tabla 1. Para la amplificación de ITS2 de las muestras procedentes de material de herbario se realizaron PCR’s anidadas (Nested PCR) con el fin de incrementar la sensibilidad y calidad de la detección del ADN. El proceso consistió principalmente en dos fases de amplificación, cada una con distintos pares de primers; primero se realizó una PCR con primers externos de ITS completo (ITS8P y ITS5P) para amplificar una región de ADN más extensa, y luego se hizo una segunda PCR utilizando un par de primers para amplificar la región específica de ITS2 (ITS2-S2f y ITS4) y utilizando 1 µl de la primera PCR en vez de 1 µl de ADN.. 18.

(19) Análisis de datos. La edición de las secuencias se realizó con ayuda de BioEdit V. 7.2.5 (Hall, 1999). La alineación de las secuencias se efectuó a través de la plataforma del Instituto Bioinformático Europeo (EMBLEBI) bajo el alineamiento múltiple a través de la interfase de la herramienta Clustal Omega (McWilliam et al., 2013). En la tabla 2 se muestran los números de acceso de las secuencias en GenBank utilizadas en este estudio. Se utilizó PAUP (Swofford, 2003) para la construcción de las matrices y análisis de Neighbor-Joining utilizando el modelo de dos parámetros de Kimura (K2P) que asume que la tasa de transiciones puede no ser la misma que la tasa de transversiones, y que las frecuencias de los cuatro nucleótidos son iguales (Kimura, 1980). Se evaluó el soporte de las ramas con el método de bootstrap con un total de 1.000 réplicas. Para el análisis de máxima parsimonia se utilizó la combinación de los software WinClada (Nixon, 2002) y NONA (Goloboff, 1996), eliminando del análisis los caracteres no informativos, se realizó un análisis heurístico con 1.000 réplicas comenzando con cinco árboles por cada réplica, y con una estrategia de búsqueda de Multiple TBR + TBR (mult “max”). Los demás criterios de establecieron por defecto. Para el análisis de inferencia bayesiana, se utilizó el método bayesiano MCMC (Simulación Monte Carlo mediante cadenas de Markov), tal como se aplica en MrBayes v. 3.2.2 (Ronquist et al., 2012), con los modelos evolutivos generados para cada una de las particiones, aplicando diez millones de generaciones, cuatro cadenas paralelas y con el primer 25% de generaciones descartadas como burn-in. El modelo evolutivo que mejor se ajustó a los datos fue TIM2+G, el cual se estimó con ayuda de jModelTest v. 2 (Darriba et al., 2012), utilizando el criterio de información de Akaike (AIC). El árbol que se utilizó para el análisis correspondió al árbol de máxima credibilidad (MCC) con un burn-in del 10% con ayuda del programa TreeAnnotator (Drummond et al., 2012). Los análisis se realizaron en la plataforma CIPRES (Miller et al., 2010). Finalmente, se estimaron las. 19.

(20) distancias inter e intraespecíficas para establecer la presencia de un barcoding gap en la muestra analizada.. RESULTADOS Muestreo. Se usaron un total de 147 secuencias de Micropholis de las cuales 39,45% son originales y 60,55% fueron bajadas de GenBank. Las secuencias originales fueron obtenidas de material fresco (82,75%) o de material botánico del Herbario COAH (17,25%). Teniendo en cuenta que los resultados preliminares mostraron una baja variación en las secuencias de los marcadores moleculares del cloroplasto (rbcL y matK), y una alta variación en el Espaciador transcrito interno ITS2, se realizó un mayor esfuerzo en el laboratorio para la obtención de secuencias de este último marcador molecular. Del total de las secuencias usadas, 74 correspondieron a ITS2 e incluyeron 20 especies; 33 correspondieron a matK e incluyeron 11 especies y 40 correspondieron a rbcL e incluyeron 16 especies. Extracción y amplificación. La técnica de extracción utilizando CTAB tuvo un éxito del 85% en las muestras procedentes de material de herbario, mientras que las técnicas de sales, Alexander y el kit de Qiagen mostraron un éxito del 100% para la extracción de las muestras procedentes de material fresco. Las concentraciones obtenidas de ADN procedentes de material de herbario oscilaron entre 5 y 25 ng/µl, mientras que las concentraciones de ADN procedentes de material fresco oscilaron entre 6,8 y 37,5 ng/µl. El marcador molecular ITS2 se logró amplificar en el 100% de las muestras, esto teniendo en cuenta el uso de la PCR anidada con el fin de aumentar la detección del ADN. Por el contrario, con las regiones matK y rbcL se logró amplificar sólo un 35% de las muestras, todas procedentes de material fresco.. 20.

(21) Análisis de Neighbor-Joining Una vez calculadas las distancias genéticas entre todos los taxones del estudio, se pudo determinar el número de posiciones variables entre pares de secuencias, valores que se representaron gráficamente en un árbol de Neighbor-Joining (Figura 1). Las distancias genéticas intraespecíficas calculadas para las especies del género Micropholis utilizando el marcador molecular ITS2 oscilaron entre 0 y 0,10761, mientras que las distancias interespecíficas oscilaron entre 0 y 0,13769. Estas distancias permitieron identificar las especies: M. brochidodroma, M. casiquiarensis, M. cayennensis, M. crassipedicellata, M. crotonoides, M. gardneriana, M. gnaphaloclados, M. longipedicellata, M. macrophylla, M. melinoniana, M. obscura, M. porphyrocarpa, M. splendens y M. trunciflora, con valores de soporte de bootstrap mayores a 70%. Sin embargo, las especies: M. egensis, M. guyanensis, M. humboldtiana, M. madeirensis y M. venulosa no se lograron discriminar ya que conformaron grupos polifiléticos (Figura 2). Los árboles de Neighbor-Joining basados en los marcadores del cloroplasto presentaron muy baja resolución (árboles no mostrados). En el caso de matK, sólo se pudo identificar a M. gardneriana, mientras que utilizando el marcador molecular rbcL no se pudo discriminar ninguna de las 16 especies estudiadas. Análisis de máxima parsimonia. Los resultados del análisis de máxima parsimonia son muy similares al resultado encontrado con el análisis de Neighbor-Joining, la diferencia está en que M. humboldtiana si conformó un grupo monofilético en este análisis (Figura 4). En la figura 3 se presenta una porción del alineamiento con el marcador molecular ITS2, en la cual se pueden observar los sitios informativos para algunas especies. Este marcador molecular tiene el más alto poder de discriminación entre las especies del género Micropholis con un 50% más de 21.

(22) sitios informativos con respecto a los otros dos marcadores moleculares del cloroplasto (Tabla 3). En la figura 4 se presenta uno de los 164 árboles más parsimoniosos utilizando el marcador molecular ITS2, en donde 15 especies resultaron ser monofiléticas, las cuales corresponden a M. brochidodroma, M. casiquiarensis, M. cayennensis, M. crassipedicellata, M. crotonoides, M. gardneriana, M. gnaphaloclados, M. humboldtiana, M. longipedicellata, M. macrophylla, M. melinoniana, M. obscura, M. porphyrocarpa, M. splendens y M. trunciflora. Los árboles obtenidos con los marcadores moleculares matK y rbcL obtuvieron muy poca resolución debido al reducido número de sitios informativos (árboles no mostrados). Se puede inferir que estas regiones no funcionan como códigos de barra de ADN para diferenciar las especies del género Micropholis. Al evaluar la capacidad de cada uno de los marcadores moleculares de manera individual y en sus diferentes combinaciones (ITS2+matK, ITS2+rbcL, matK+rbcL e ITS2+matK+rbcL), se puede ver que el poder discriminatorio para la identificación de especies es más alto utilizando la región de ITS2 de manera individual, o utilizando la combinación de los marcadores moleculares ITS2+matK, ITS2+rbcL y el multilocus ITS2+marK+rbcL, logrando identificar el 55,55% de las especies. Es decir, cinco de las nueve especies utilizadas para el análisis. Los demás resultados utilizando los marcadores moleculares del cloroplasto de manera individual, o su combinación matK+rbcL, presentaron un porcentaje bajo para la discriminación de las especies de Micropholis (Figura 5). Cabe anotar que en este análisis se utilizaron solamente 20 secuencias que corresponden a nueve (9) especies (M. cayennensis, M. crassipedicellata, M. gardneriana, M. guyanensis, M. gnaphaloclados, M. madeirensis, M. sp, M. splendens y M. venulosa) debido a que coincidían en tener secuencias de los tres marcadores en las mismas muestras.. 22.

(23) Análisis bayesiano. Los resultados del análisis bayesiano utilizando el marcador molecular ITS2 presentaron resultados similares a los encontrados con el análisis de máxima parsimonia, al discriminar 15 de las 20 especies del género Micropholis. En la reconstrucción filogenética las 15 especies formaron grupos monofiléticos con probabilidades mayores al 95% (Figura 6). Al igual que con los análisis de Neighbor-Joining y máxima parsimonia, los marcadores moleculares del cloroplasto no permitieron discriminar la gran mayoría de las especies de Micropholis utilizando el análisis bayesiano (árboles no mostrados). Análisis de “barcoding gap”. Al evaluar las diferencias que existen entre las distancias genéticas intraespecíficas e interespecíficas con cada uno de los marcadores utilizados, se observó que existe una amplia superposición entre los valores de divergencia intra e interespecífica (es decir, que no existe “barcoding gap”). En el caso de ITS2, las distancias intraespecíficas oscilaron entre 0% y 10,76% mientras que la divergencia entre especies resultó entre 0% y 13,76%. Con los marcadores moleculares del cloroplasto se evidenció una mayor superposición entre los valores de divergencia intraespecífica e interespecífica en comparación con ITS2, para matK los valores de divergencia intraespecífica oscilaron entre 0% y 0,44% mientras que la divergencia entre especies resultó entre 0% y 0,959% y con rbcL la divergencia intraespecífica presentó valores entre 0% y 0,56% y valores entre 0% y 0,766% para la divergencia interespecífica (Figura 7).. 23.

(24) DISCUSIÓN. Utilidad de los códigos de barra de ADN en Micropholis. Los marcadores moleculares usados mostraron diferencias en cuanto a su utilidad para diferenciar las especies de Micropholis. El espaciador transcrito interno ITS2 presentó un poder discriminatorio mayor que los marcadores del cloroplasto ya que entre 14 y 15 especies, de las 20 analizadas, formaron grupos monofiléticos. Kress et al (2005) obtuvieron también los mejores resultados con ITS, y propusieron esta región como uno de los códigos de barra en Angiospermas, argumentando sus altos niveles de divergencia inter-específica, la posibilidad de amplificarlo en dos fragmentos más pequeños (ITS1 e ITS2), y su utilidad en muestras degradadas. Del mismo modo, Chen et al, (2010), Gao et al (2010) y Li et al (2011) confirmaron el potencial de ITS2 como código de barras universal, debido a su alta divergencia entre especies. En la familia Sapotaceae, ITS ha demostrado su utilidad en discriminar especies, tal como en el estudio realizado por González et al (2009), quienes señalan que a pesar de los problemas de amplificación, ITS podría ser útil en la identificación de Sapotaceae. Igualmente, Vivas et al (2014), quienes evaluaron la utilidad de cuatro marcadores moleculares, incluidos tres de los usados en nuestro estudio, en la identificación de 26 especies de Sapotaceae presentes en el Bosque Atlántico del Brasil, encontraron que ITS fue la mejor opción para la identificación de especies de esta familia. No sorprende que ITS resulte ser la mejor opción cuando se pretende discriminar especies cercanamente emparentadas, teniendo en cuenta que ha sido uno de los marcadores más usados en Sistemática desde los 90’s, cuando se incorporaron los datos moleculares en los análisis filogenéticos (Hillis & Dixon, 1991; Baldwin, 1992). Además de ser muy variable, y tener herencia bi-parental, ITS es fácil de amplificar debido a que existen cientos o miles de copias en el genoma, su longitud es corta (ca. de 600 pb), y se han diseñado primers universales (White el al., 1990). La alta variación inter-específica que posee ITS en general, y ITS2 en particular, es uno de los 24.

(25) requisitos para que una región funcione como código de barras; sin embargo, la naturaleza de este espaciador tiene algunos riesgos que deben ser tomados en consideración. Teniendo en cuenta que ITS2 es objeto de evolución concertada, fenómeno en el que las mutaciones que eventualmente ocurren en algunas de los cientos de copias se homogenizan por diferentes mecanismos (Hillis & Dixon, 1991; Álvarez & Wendel, 2003), es posible encontrar en el genoma de una especie varias secuencias de ITS diferentes entre sí, debido por ejemplo, a eventos de duplicación de genes en la historia evolutiva del linaje, o a la falta de una completa homogenización, por lo que no siempre las secuencias que se obtienen experimentalmente en diferentes individuos de la misma especie, o en diferentes especies, son ortólogas (Álvarez & Wendel, 2003). La clonación de los productos de PCR obtenidos bajo diferentes condiciones de amplificación permitiría conocer las posibles variantes que se presentan en un organismo, sin embargo, la clonación es una técnica que requiere tiempo y recursos adicionales, con los que no siempre se cuenta. En este sentido, Song et al. (2012) evaluaron el número de copias de ITS2 en 178 especies de plantas, evidenciando que de las 35 copias encontradas en promedio por especie, sólo tres constituyeron el 91%, las cuales permitieron inferir relaciones filogenéticas y diferenciar especies. En la práctica, una forma de detectar variantes de ITS amplificadas en la misma reacción, es la presencia de múltiples bandas al momento de visualizar los resultados de la PCR. En nuestros resultados siempre obtuvimos bandas únicas, y tuvimos como precaución usar siempre las mismas condiciones en la PCR, así como utilizar ADN a una concentración muy baja. Aunque confiamos que las secuencias obtenidas corresponden a secuencias ortólogas, consideramos que esta es una primera aproximación al uso de ITS como código de barras en Micropholis. Los marcadores moleculares del cloroplasto evaluados, matK y rbcL, mostraron un bajo poder discriminatorio, logrando identificar cuatro especies y dos especies respectivamente, del total de las especies analizadas. Aunque estas dos regiones fueron propuestas como los códigos de barra de ADN centrales para la identificación de plantas (CBOL Plant Working Group, 2009), resultados empíricos han demostrado que cuando se pretende diferenciar especies del mismo género, su éxito 25.

(26) varía de acuerdo al grupo de plantas en particular. Por ejemplo, mientras que en Helechos (Li et al., 2011), matK y rbcL resultaron ser exitosos, en Cycadales (Sass et al., 2007; Nicolalde-Morejón et al., 2010), Zingiberaceae (Shi et al., 2011) Lysimachia, Myrsinaceae (Zhang et al., 2012), Thymus, Lamiaceae (Federici et al., 2013), y Sinosenecio, Asteraceae (Gong et al., 2015) no lo fueron. La baja tasa de evolución del ADN del cloroplasto, debido principalmente a su herencia uni-parental, podría explicar parcialmente su incapacidad para discriminar especies cercanamente emparentadas. Sin embargo, es probable que cuando se examine la variabilidad de muchas más regiones del cloroplasto, en muchos más taxones, se detecten marcadores útiles para servir como códigos de barra en plantas, tal como lo observaron Dong et al. (2012) en diferentes familias de Angiospermas o Kim et al. (2015) en cultivares de Panax ginseng. Teniendo en cuenta que el número de especies de plantas con secuencias completas del genoma del cloroplasto es alto, 788 especies a la fecha, de acuerdo a la base de datos de genomas del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse), y que se estima que este número se incremente rápidamente gracias a las nuevas tecnologías de secuenciación, la posibilidad de encontrar regiones del cloroplasto hiper-variables, que adicionalmente sean fáciles de amplificar y secuenciar, es alta. En este sentido, existen varias propuestas novedosas tales como los “ultra-barcoding” (Kane et al. (2012), los “specific-barcodes” (Li et al., 2014), o los “extended barcodes” (Coissac et al., 2016) que permiten evaluar muchas regiones del genoma simultáneamente. Estos resultados ratifican el uso potencial de ITS2 como alternativa de código de barras en la familia Sapotaceae y específicamente en el género Micropholis, debido a que es un fragmento más corto y más fácil de secuenciar que ITS completo, en el que se encontraron muchos más sitios informativos en comparación con los marcadores moleculares del cloroplasto matK y rbcL.. 26.

(27) Especies de Micropholis polifiléticas Los individuos evaluados de M. egensis, M. guyanensis, M. venulosa y M. madeirensis formaron grupos polifiléticos en los tres análisis realizados. Las primeras tres especies coinciden en ser ampliamente distribuidas, tener una amplitud ecológica considerable, y por consiguiente, tener una variabilidad morfológica notoria (Pennington, 1990; Piñeros, 2013). La variabilidad morfológica se evidencia al ver el gran número de sinónimos en su historia taxonómica (Pennington, 1990), y permite entender la complejidad de su taxonomía. Si se considera adicionalmente que las flores en M. guyanensis persisten por un solo día (Terra-Araujo et al., 2012), lo que podría ocurrir en otras especies, y explicaría el bajo número de especímenes en los herbarios, los resultados obtenidos se podrían deber a problemas en la clasificación, o en la identificación de estas especies. No se puede descartar que en la historia evolutiva de Micropholis algunas especies puedan ser de origen híbrido, o que hayan sido objeto de introgresión, donde especies de origen híbrido se cruzaron de nuevo con las especies originales; o que las especies sean tan jóvenes, que no hayan divergido lo suficiente de sus especies hermanas, lo que se conoce como sorteo incompleto de linajes. Estos fenómenos podrían estar dentro de las posibles causas de las especies que aparecen en los análisis como polifiléticas, y que se han considerado limitaciones de la técnica de Códigos de Barra de ADN (Hollingsworth et al., 2011). Las especies para- o polifiléticas son más comunes de lo que se suele discutir. Por ejemplo, Funk & Omland (2003) evaluaron este aspecto en más de 2000 especies de animales, encontrando especies no monofiléticas en el 23% de los casos. Si esto ocurre en animales, donde la hibridación no es tan común, en plantas podría ser más frecuente. En efecto, se han detectado muchos casos de especies no monofiléticas en plantas (e.g. Fazekas et al., 2008; Pettengill & Neel, 2010; Arca et al., 2012). En la familia Sapotaceae hay evidencias sobre el origen híbrido de algunas especies, como en el caso de Van-royena castanosperma (Swenson et al., 2007), y de Chrysophyllum cuneifolium (Swenson et al., 2008), así como del posible origen híbrido del clado Nesoluma (Smedmark & Anderberg, 2007). Es posible que en las especies de Micropholis. 27.

(28) se presenten casos de origen híbrido o introgresión, considerando la incongruencia entre los resultados obtenidos con ITS2 y matK (Figuras 5 a, b). Aunque las especies incluidas en la Figura 5 corresponden sólo a aquellos especímenes de los que se obtuvieron secuencias de los tres marcadores, se puede ver que los cuatro especímenes de M. guyanensis conforman un grupo monofilético al usar ITS2, mientras que con matK no ocurre esto. Tampoco se podría descartar la posibilidad de la existencia de especies crípticas (Hebert et al., 2004b), ya que se puede ver cómo diferentes individuos de M. guyanensis resultaron incluidos en diferentes clados sin correlación geográfica (Figuras 1 y 4), y cómo presentan variación en las secuencias (Figura 2), variación que también ha sido observada por M. González (comunicación personal). El “barcoding gap” en Micropholis Un concepto central de los códigos de barra de ADN es el de “barcoding gap”, de acuerdo al cual el promedio de la distancia genética entre especies de un linaje debe ser mayor al promedio de la distancia genética entre individuos de la misma especie (Herbert et al., 2004a; Meyer & Palau, 2015). En animales, Herbert et al. (2004a) propusieron que la diferencia entre estas dos distancias fuera de un orden de magnitud de 10X, es decir que la distancia inter-específica debería ser 10 veces mayor que la distancia intra-especifica. Aunque en algunos grupos se encontró el barcoding gap, (Herbert et al., 2003a, 2004a; Čandek & Kuntner, 2015; Eckert et al., 2015), en muchos grupos no se detectó (e.g. Wiemers & Fiedler, 2007; Clement & Donoghue, 2012). Es más, algunos autores han considerado que la presencia del “barcoding gap” es un artefacto debido a un muestreo deficiente (Meyer & Paulay, 2005; Wiemers & Fiedler, 2007). Por ejemplo, Fazekas et al. (2009) compararon la presencia del “barcoding gap” en animales y plantas, y lo detectaron en Viburnum, aunque con base en un muestreo muy pequeño (tres especies); sin embargo, Clement & Donoghue (2012) no encontraron el “barcoding gap” en éste género al evaluar más de 100 especies. Como se puede observar en la Fig. 7, en Micropholis no se encontró una discontinuidad entre las distancias intra- e inter-específicas, por el contrario, las distancias se traslapan. La ausencia del “barcoding 28.

(29) gap” se podría esperar en grupos producto de radiaciones rápidas, en linajes muy jóvenes, con tasas de mutación muy bajas y generaciones muy largas. No tenemos evidencia de la historia evolutiva del género, ni de su edad, pero teniendo en cuenta que las especies de Micropholis son predominantemente árboles, en los que las tasas de mutación son bajas y las generaciones largas, comparados con las hierbas (Petit & Hampe, 2006; Smith & Donoghue, 2008), se puede explicar el traslape entre las distancias intra- e inter-específicas. Sin embargo, la ausencia del “barcoding gap” no implica necesariamente la ineficacia de los códigos de barra, ya que hay métodos alternativos para evaluar su utilidad, que no se basan en las distancias genéticas, como por ejemplo evaluando la monofilia, como lo discutimos anteriormente. CONCLUSIONES. Los Códigos de Barra de ADN constituyen una técnica promisoria para la identificación de especies de Micropholis. De los tres marcadores evaluados, ITS resultó ser el más útil, al lograr discriminar cerca del 70% de las especies analizadas, mientras que matK y rbcL no presentaron suficiente variación, por lo que no se deben considerar al emplear esta técnica en la práctica. De las 20 especies analizadas, cuatro no conformaron grupos monofiléticos. Es probable que procesos de hibridación o introgresión se hayan presentado en la historia evolutiva del género, aunque no se descarta la presencia de especies cripticas. No se encontró el “barcoding gap” en Micropholis, con ninguno de los marcadores evaluados. Es necesario explorar la utilidad de marcadores moleculares adicionales que permitan discriminar la totalidad de las especies de este género de árboles tropicales.. 29.

(30) AGRADECIMIENTOS. A los funcionarios del Herbario Forestal (UDBC) y del Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad Distrital por su apoyo en el procesamiento del material vegetal y en la generación de los datos moleculares. A los funcionarios del Herbario del Instituto SINCHI (COAH) por permitirnos estudiar su colección. Al Real Jardín Botánico de Edimburgo por financiar las salidas de campo, y a los funcionarios del Laboratorio de Biología Molecular por la secuenciación de las muestras. Al Centro de Investigaciones y Desarrollo Científico de la Universidad Distrital (CIDC) por el apoyo financiero para la compra de insumos y materiales indispensables para el desarrollo del proyecto. A Paola Piñeros por su ayuda en la identificación de las especies. A Diana Trujillo y Julieth Serrano por su ayuda en el laboratorio, y a los guías de campo Miguel Guerrero, Pedro Rodríguez y Antonio Rodríguez por su valiosa colaboración.. 30.

(31) CONCLUSIONES GENERALES. . La región ribosomal nuclear ITS2 presentó los mejores resultados para la identificación de las especies del género Micropholis (Sapotaceae) con un 50% más de sitios informativos en comparación con los marcadores moleculares del cloroplasto matK y rbcL.. . Los análisis de Neighbor-Joining, máxima parsimonia e inferencia bayesiana, presentaron resultados muy similares en la identificación de las especies de Micropholis, utilizando el marcador molecular ITS2.. . Existen posibles procesos de hibridación, presencia de especies crípticas o identificaciones taxonómicas erróneas en algunas especies de Micropholis, las cuales no fueron posibles de identificar utilizando la técnica de los códigos de barra de ADN.. . Los marcadores moleculares del cloroplasto matK y rbcL no resultaron ser buenos candidatos como códigos de barra de ADN en la identificación de las especies del género Micropholis de la familia Sapotaceae.. . Los análisis de divergencia intraespecífica e interespecífica deben estar combinados con análisis filogenéticos con el fin de tener mayor certeza de los resultados presentados por la existencia o no de “barcoding gap”.. 31.

(32) RECOMENDACIONES. . Conformar una base de datos con los códigos de barra de ADN de las especies de Micropholis con material procedente de especímenes tipo con el fin de tener certeza de la identidad de las especies.. . Aumentar el número de individuos de algunas especies de Micropholis, con el fin de corroborar la eficiencia de los códigos de barra de ADN en la identificación de este género.. . Realizar estudios morfológicos, ecológicos y moleculares que permitan corroborar la existencia de especies cripticas o probables procesos de hibridación, en especies como M. egensis, M. guyanensis, M. madeirensis y M. venulosa.. 32.

(33) REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. Alexander, P.J., Rajanikanth, Bacon, G. & Bailey, C. D. (2007). Recovery of plant DNA using a reciprocating saw and silica-based columns. Molecular Ecology Notes, 1, 5-9. Álvarez, I. & Wendel, J.F. (2003). Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference. Molecular Phylogenetics and Evolution, 29, 417-434. Arca, M., Hinsinger, D., Cruaud, C., Tillier, A., Bousquet, J. & Frascaria-Lacoste, N. (2012). Deciduous Trees and the Application of Universal DNA Barcodes: A Case Study on the Circumpolar Fraxinus. Plos One, 7(3): e34089. doi:10.1371/journal.pone.0034089. Asahina, H., Shinozaki, J., Mazuda, K., Morimitsu, Y. & Satake, M. (2010). Identificatioon of medicinal Dendrobium species by phylogenetic analyses using matk and rbcL sequences. Journal of Natural Medicines, 64, 133-138. Aubriot, X., Lowry, P., Cruaud, C., Couloux, A. & Haevermans, T. (2013). DNA barcoding in a biodiversity hot spot: potential value for the identification of Malagasy Euphorbia L. listed in CITES Appendices I and II. Molecular Ecology Resources, 13(1), 57-65. Baker, C. S., Cipriano, F., & Palumbi, S. R. (1996). Molecular Genetic Identification of Whale and Dolphin Products from Commercial Markets in Korea and Japan. Molecular ecology, 5, 671685. Baldwin, B.G. (1992). Phylogenetic utility of the Internal Transcribed Spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: An example from compositae. Molecular Phylogenetics and Evolution 1, 3-16. Baraloto, C., Hardy, O., Timothy, C., Dexter, K., Cruaud, C., Dunning, L., Gonzalez, M-A., Molino, J-F., Sabatier, D., Savolainen, V. & Chave, J. (2012). Using functional traits and. 33.

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