Uso de vectores lentivirales para mediar la transfección del gen de la enzima n-acetil-galactosamina -6-sulfato-sulfatasa en células en cultivo

118 

Loading.... (view fulltext now)

Loading....

Loading....

Loading....

Loading....

Texto completo

(1)

USO DE VECTORES LENTIVIRALES PARA MEDIAR LA TRANSFECCIÓN DEL GEN DE LA ENZIMA N-ACETIL-GALACTOSAMINA -6-SULFATO-SULFATASA

EN CÉLULAS EN CULTIVO

María Juliana Herrera Mejía

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

INSTITUTO DE ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO

Bogotá D.C.

(2)

USO DE VECTORES LENTIVIRALES PARA MEDIAR LA TRANSFECCIÓN DEL GEN DE LA ENZIMA N-ACETIL-GALACTOSAMINA -6-SULFATO-SULFATASA

EN CÉLULAS EN CULTIVO

María Juliana Herrera Mejía

Ingrid Schuler, PhD. Decana Académica Facultad de Ciencias

Janeth del Carmen Arias Palacios, M.Sc. M.Ed. Directora Carreras de Microbiología

(3)

USO DE VECTORES LENTIVIRALES PARA MEDIAR LA TRANSFECCIÓN DEL GEN DE LA ENZIMA N-ACETIL-GALACTOSAMINA -6-SULFATO-SULFATASA

EN CÉLULAS EN CULTIVO

María Juliana Herrera Mejía

Carlos Javier Alméciga Díaz, Q.F., PhD. Director

(4)

NOTA DE ADVERTENCIA

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien sea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”

(5)

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad por la oportunidad que me brindo para formarme como profesional y los Profesores por trasmitirme sus conocimientos.

A mi tutor Javier Alméciga por abrirme las puertas del IEIM al brindarme este trabajo de grado, por compartir conmigo cada uno de sus conocimientos, por confiar en mí y apoyarme cada minuto con esa palabra de aliento y esa alegría al llegar al laboratorio.

A todas las personas que hacen parte del IEIM por brindarme esa mano amiga y por las ayudas que siempre recibí de cada uno de ellos.

(6)

A Dios por ser mi padre y guía, por permitirme alcanzar este nuevo logro que hoy me llena de satisfacción, por mostrarme que cada obstáculo es una oportunidad de superación.

A mi hermano Santiago por ser el motor de mi vida, y ser el dueño de cada uno de mis logros, porque cada vez me llena de motivos para salir adelante.

A mis padres por crear de mi lo que soy hoy, por su amor, comprensión y por todos los consejos que hicieron de este, un proyecto posible.

A mis tías por el apoyo siempre incondicional, porque no hubo segundo que no estuvieran ahí, por vivir conmigo esta etapa tan importante de mi vida.

(7)

TABLA DE CONTENIDO

1.RESUMEN………......16

1.1 ABSTRACT………......17

2. INTRODUCCIÓN………......18

3. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA...21

4. MARCO TEÓRICO- REFERENTES CONCEPTUALES……….....23

4.1 Errores Innatos del Metabolismo………...………...23

4.2 Las Mucopolisacaridosis………...………23

4.3 Mucopolisacaridosis IVA - Morquio A………...………..26

4.3.1 Características Bioquímicas………..27

4.3.1.1 Queratán sulfato y condroitín-6-sulfato………..…………..27

4.3.1.2 Gen GALNS……….……….31

4.3.1.3 Enzima GALNS………...……….33

4.3.2 Características Clínicas………...………..37

4.3.3 Diagnóstico………...………..……….40

4.3.4 Tratamiento………...………...43

4.4 Terapia Génica………44

4.4.1 Generalidades………...………..45

4.4.2 Vectores empleados en Terapia Génica………...…..45

4.4.3 Vectores derivados de virus adenoasociados y su uso en terapia génica………..………...46

(8)

5.1 Objetivo general…….…………...……...………..56

5.2 Objetivos específicos…..………...………56

6. METODOLOGÍA………57

6.1 Producción de vectores lentivirales………...………..57

6.1.1 Elaboración Plásmido de Expresión lentiviral Topo-GALNS………57

6.1.2 Cultivo células 2λ3FT………...………..57

6.1.3 Producción Vectores Lentivirales en células 2λ3FT………...………..58

6.1.3.1 Concentración y precipitación de vectores Lentivirales con PEG 6000.59 6.1.3.2 Titulación Vectores Lentivirales……….5λ 6.2 Producción adenoasociados a partir de células HEK2λ3….……...………...60

6.2.1 Cuantificación de vectores adenoasociados...………...62

6.3 Evaluación de vectores lentivirales………...………..63

6.3.1 Cultivo células HEK2λ3 y Fibroblastos Morquio A……….………...…63

6.3.2 Transfección células HEK293 y fibroblastos humanos MPS IVA con vectores lentivirales………...………...64

6.4 Evaluación de vectores adenoasociados………...………64

6.4.1 Transfección de células HEK293 con los vectores adenoasociados....….64

6.5 Cuantificación de proteína por el método de MicroLowry……...…………...65

6.5.1 Determinación de la actividad enzimática……...………65

6.6 Análisis estadístico……….66

7. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS………...68

7.1 Producción de Vectores Lentivirales………...………68

(9)

7.1.2 Cultivo células 2λ3FT………...………..70

7.1.3 Producción Vectores Lentivirales en células 293FT………...…..71

7.1.3.1Titulación Vectores Lentivirales………..71

7.2 Producción y cuantificación de adenoasociados a partir de células HEK2λ3………..72

7.3 Evaluación de vectores lentivirales………...…..73

7.4 Evaluación de vectores adenoasociados………...……77

8. CONCLUSIONES……….86

9. RECOMENDACIONES………88

(10)

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Catabolismo del Queratán Sulfato………...…..31

Figura 2. Esquema del procesamiento y direccionamiento de una enzima lisosoma………..36

Figura 3. Estructura terciara de la enzima GALNS……….37

Figura 4. Características Clínicas. Principales características clínicas observadas en pacientes con fenotipo clásico de mucopolisacaridosis IV A………3λ Figura 5. Reacción enzimática del método de cuantificación de actividad GALN..42

Figura 6. Composición estructural de los lentivirus………..51

Figura 7. Ciclo de replicación de Lentivirus………...53

Figura 8. Genoma Lentivirus………54

Figura 9. Plásmido pLenti6/V5-D-TOPO………57

Figura 10. Secuencia de pLenti6/V5-D-TOPO………..6λ Figura 11. Peso molecular, formula y estructura de la Blasticina………..70

Figura 12. Plásmido pCMVSPORT6………..71

Figura 13. Actividad enzimática obtenida en los lisados celulares HEK293 transfectados con vectores lentivirales……….……….…75

Figura 14. Actividad enzimática obtenida en los medios de los lisados celulares HEK293 transfectados con vectores lentivirales………..76

Figura 15. Actividad enzimática obtenida en los lisados celulares HEK293 transfectados con vectores adenoasociados………7λ Figura 16. Actividad enzimática obtenida en los medios de los lisados celulares HEK293 transfectados con vectores adenoasociados………80

Figura 17. Actividad enzimática obtenida en los lisados celulares HEK293 transfectados con vectores adenoasociados AVV GALNS SUMF1………..81

(11)

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación de las Mucopolisacaridosis………...25

Tabla 2. Estructura de las diferentes cadenas de glicosaminoglicanos…………...30

Tabla 3. Características de vectores empleados en terapia génica………..46

Tabla 4. Funciones de las proteínas que componen los Lentivirus………..52

Tabla 5. Titulación vectores lentivirales……….72

(12)

ANEXOS

ANEXO A: Análisis estadísticos correspondientes a los resultados obtenidos en células transfectadas con vectores lentivirales (Realizados en SPSS)…119

Tabla 1.1 Pruebas de normalidad………..…….119

Tabla 1.2 ANOVA de un factor………..119

Tabla 1.3 Pruebas Post Hocμ Subproductos Homogéneos………..……119

Tabla 1.4 Pruebas de t-student para muestras independientes……….…….120

Tabla 1.4.1 T-student entre grupo “control” y grupo “Células Lentivirus 1 MOI”………...120

Tabla 1.4.2 T-student entre grupo “control” y grupo “Células Lentivirus 5 MOI”………...120

Tabla 1.4.3 T-student entre grupo “Células Lentivirus 1 MOI” y grupo “Células Lentivirus 5 MOI” ………121

ANEXO B: Análisis estadísticos correspondientes a los resultados obtenidos en medios de células transfectadas con vectores lentivirales (Realizados en SPSS)………122

Tabla 1.1 Pruebas de normalidad……….122

Tabla 1.2 ANOVA de un factor………..………122

Tabla 1.3 Pruebas Post Hoc: Subproductos Homogéneos……..………122

Tabla 1.4 Pruebas de t-student para muestras independientes……….………….123

Tabla 1.4.1 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células Lentivirus 1 MOI”………...…………123

Tabla 1.4.2 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células Lentivirus 5 MOI”……….………..123

(13)

ANEXO C: Análisis estadísticos correspondientes a los resultados obtenidos en células transfectadas con vectores adenoasociados (AVV-GALNS)

(Realizados en SPSS)………...…………126

Tabla 1.1 Pruebas de normalidad……….………126

Tabla 1.2 ANOVA de un factor……….……….126

Tabla 1.3 Pruebas Post Hoc: Subproductos Homogéneos………….……….126

Tabla 1.4 Pruebas de t-student para muestras independientes………..127

Tabla 1.4.1 T-student entre grupo “control” y grupo “Células AVV-GALNS 1 GV”………....127

Tabla 1.4.2 T-student entre grupo “control” y grupo “Células AVV-GALNS 5 GV”………..………..127

Tabla 1.4.3 T-student entre grupo “control” y grupo “Células AVV-GALNS 10 GV”………..………..128

Tabla 1.4.4 T-student entre grupo “Células AVV GALNS 1 GV” y grupo “Células AVV-GALNS 5 GV” ………129

Tabla 1.4.5 T-student entre grupo “Células AVV GALNS 1 GV” y grupo “Células AVV-GALNS 10 GV” ………..130

Tabla 1.4.6 T-student entre grupo “Células AVV GALNS 5 GV” y grupo “Células AVV-GALNS 10 GV”………..……….131

ANEXO D: Análisis estadísticos correspondientes a los resultados obtenidos en medios de células transfectadas con vectores adenoasociados (AVV-GALNS) (Realizados en SPSS)……….……….132

Tabla 1.1 Pruebas de normalidad………..…………..132

Tabla 1.2 ANOVA de un factor………...………..132

Tabla 1.3 Pruebas Post Hoc: Subproductos Homogéneos…………..………132

Tabla1.4 Pruebas de t-student para muestras independientes………..….133

(14)

Tabla 1.4.2 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células AVV-GALNS 5

GV”……….……134

Tabla 1.4.3 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células AVV-GALNS 10 GV”……….………..134

Tabla 1.4.4 T-student entre grupo “Células AVV GALNS 1 GV” y grupo “Medio células AVV-GALNS 5 GV” ……….………..135

Tabla 1.4.5 T-student entre grupo “Células AVV GALNS 1 GV” y grupo “Medio células AVV-GALNS 10 GV”……….……….135

Tabla 1.4.6 T-student entre grupo “Células AVV GALNS 5 GV” y grupo “Células AVV-GALNS 10 GV”……….…………..136

ANEXO E: Análisis estadísticos correspondientes a los resultados obtenidos en células transfectadas con vectores adenoasociados (AVV-GALNS SUMF1) (Realizados en SPSS)………...138

Tabla 1.1 Pruebas de normalidad………..……..138

Tabla 1.2 ANOVA de un factor……….……….138

Tabla 1.3 Pruebas Post Hoc: Subproductos Homogéneos………..138

Tabla 1.4 Pruebas de t-student para muestras independientes………..139 Tabla 1.4.1 T-student entre grupo “control” y grupo “Células AVV-GALNS SUMF1 1 GV”……….139

Tabla 1.4.2 T-student entre grupo “control” y grupo “Células AVV-GALNS SUMF1 5 GV”……….…140

Tabla 1.4.3 T-student entre grupo “control” y grupo “Células AVV-GALNS SUMF1 10 GV”……….………..140

Tabla 1.4.4 T-student entre grupo “Células AVV-GALNS SUMF1 1 GV” y grupo “Células AVV-GALNS SUMF1 5 GV”………..……….141

Tabla 1.4.5 T-student entre grupo “Células AVV-GALNS SUMF1 1 GV” y grupo “Células AVV-GALNS SUMF1 10 GV”……….142

(15)

ANEXO F: Análisis estadísticos correspondientes a los resultados obtenidos en medios de células transfectadas con vectores adenoasociados

(AVV-GALNS SUMF1) (Realizados en SPSS)………...144

Tabla 1.1 Pruebas de normalidad………..……..144

Tabla 1.2 ANOVA de un factor………..………144

Tabla 1.3 Pruebas Post Hoc: Subproductos Homogéneos………..………144

Tabla 1.4 Pruebas de t-student para muestras independientes………...145

Tabla 1.4.1 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 1 GV”………...…145

Tabla 1.4.2 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 5 GV”……….……..145

Tabla 1.4.3 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 10 GV”……….………146

Tabla 1.4.4 T-student entre grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 1 GV” y grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 5 GV”………..………..147

Tabla 1.4.5 T-student entre grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 5 GV” y grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 10 GV”………..148

(16)

16 1. RESUMEN

(17)

17

1.1 ABSTRACT

(18)

18

2. INTRODUCCIÓN

Las mucopolisacaridosis (MPS) son un grupo de enfermedades producidas por alteraciones en el metabolismo de los GAGs, también conocidos como mucopolisacáridos (1). Los GAGs están constituidos por cadenas de disacáridos secuenciales que se unen a una proteína central constituyendo proteoglicanos que forman parte de la matriz extracelular de los tejidos, lo que se explica en parte el carácter multisistémico de las MPS (2). Las MPS se producen por acumulación progresiva de GAGs en los lisosomas de las células del tejido conectivo, incluido cartílago y hueso. Esta acumulación es producida por la deficiencia de una de las enzimas lisosomales que los degradan en unidades menores dentro del lisosoma.

La MPS IV A o enfermedad de Morquio A, es una patología de tipo autosómico recesiva producida por la deficiencia en la actividad de la enzima N-acetil-galactosamina-6-sulfato-sulfatasa (GALNS), la cual se encarga de catalizar el catabolismo de los GAGs queratán sulfato (QS) y condroitín-6-sulfato (C6S) (3). El gen GALNS ha sido clonado y mapeado al cromosoma 16q24.3 (2). Los pacientes Morquio A se caracterizan por anomalías esqueléticas como talla baja, tronco corto, hiperlaxitud articular, cuello corto, opacidades corneales, facies toscas y un severo compromiso cardiaco (4,5).

(19)

19

momento, Colombia no cuenta con cifras sobre la incidencia de esta enfermedad. Sin embargo, algunos estudios apuntan a que Colombia podría ser uno de los países con mayor número de individuos afectados con esta enfermedad (6,7). Adicionalmente, se ha documentado el hallazgo de esculturas precolombinas con claros rasgos de individuos afectados con MPS IVA; lo que sugiere la presencia del desorden desde la época prehispánica (8).

(20)

20

permitido incrementar hasta 3 veces la actividad de diferentes sulfatasas, incrementando los beneficios de la terapia en aquellas enfermedades producidas por la deficiencia de una sulfatasa en las que se ha evaluado su coexpresión con SUMF1 (10,11). Para Morquio A se han evaluado vectores retrovirales (12), plasmídicos (13) y derivados de virus adenoasociados (14) (15).

(21)

21

3. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La enzima lisosomal N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa es la encargada del catabolismo de los glicosaminoglicanos QS y C6S, mediante la remoción del sulfato presente en los residuos de galactosa y N-acetilgalactosamina, respectivamente (16). La deficiencia en la actividad de GALNS produce la mucopolisacaridosis IV A. En la actualidad, la mucopolisacaridosis tipo IV A no cuenta con un tratamiento que muestre beneficios significativos para aquellos pacientes que la padecen. Sin embargo, se han realizado diversos estudios utilizando terapia de reemplazo enzimático como la más viable. Esta tiene como objetivo sustituir la enzima que se encuentra ausente o deficiente (17). No obstante, ésta terapia presenta algunas complicaciones que hacen de ella un tratamiento dispendioso puesto que se requiere que la enzima sea administrada semanalmente, lo que obliga al paciente a estar cuatro o cinco horas recibiendo dicho procedimiento, y presenta costos que pueden alcanzar los US$500.000 por paciente al año (18,19).

(22)

22

En el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo de la Pontificia Universidad Javeriana se ha trabajado durante los últimos años en la evaluación de vectores derivados de virus adenoasociados para el tratamiento de la enfermedad de Morquio A. Los ensayos in-vitro e in-vivo han mostrado la factibilidad de usar estos vectores para el tratamiento de esta enfermedad. Sin embargo, con el objetivo de incrementar los niveles de actividad enzimática es necesaria la evaluación de otros vectores virales.

En este sentido es importante reconocer que tan factible es el uso de vectores lentivirales, sustituyendo así el tratamiento de reemplazo enzimático por uno que se base en terapia génica, requiriendo con éste una sola administración de la terapia. Adicionalmente, antes de realizar la evaluación de los vectores en modelos de animales no humanos, es necesaria su evaluación en células en cultivo. En la actualidad no existen reportes del uso de vectores lentivirales para la transfección del gen GALNS.

(23)

23

4. MARCO TEÓRICO- REFERENTES CONCEPTUALES

4.1 Errores Innatos del Metabolismo

Los errores innatos del metabolismo son un grupo de enfermedades genéticas que implican alteraciones bioquímicas incluyendo mutaciones en los genes y deficiencia enzimática favoreciendo la acumulación del sustrato sobre el que actúan, generando así trastornos del metabolismo que contribuyen significativamente a la discapacidad física y psicomotriz (21-23).

Dentro de los EIM conocidos se encuentran las enfermedades de almacenamiento lisosomal, las cuales se clasifican de acuerdo al sustrato acumulado e incluyen esfingolipidosis, glicoproteinosis, mucolipidosis, mucopolisacaridosis, entre otras (24).

4.2 Las Mucopolisacaridosis

(24)

24

tejidos (25). Entre ellos se encuentran el dermatán sulfato (DS), heparán sulfato (HS), queratán sulfato (QS), condroitín 4- o 6- sulfato (C4S, C6S) y el ácido hialurónico (2).

Las MPS se producen por acumulación progresiva de GAGs en los lisosomas de las células del tejido conectivo, incluido cartílago y hueso. Son causadas por la deficiencia de las enzimas lisosomales que los degradan (26), las cuales se encargan de degradar las cadenas de polisacáridos en unidades menores dentro del lisosoma. Los fragmentos resultantes son degradados por hidrólisis secuenciales de sus terminaciones. De esta forma, su deficiencia produce depósito intralisosomal de glucosaminoglicanos degradados incompletamente, lo que altera la fisiología celular. La Tabla 1 resume el defecto enzimático y las principales manifestaciones clínicas de las 11 MPS. Con excepción de la MPS II, la cual posee una herencia ligada al cromosoma X, las MPS son desórdenes de tipo autosómico recesivos.

(25)

25

I (32,33), MPS II (31,34), MPS VI (35,36). Esta última ha demostrado beneficios para los pacientes en cuanto a calidad de vida y manifestaciones somáticas (19, 37, 38).

Tabla 1. Clasificación de las Mucopolisacaridosis (14)

Nombre OMIM Enzima

deficiente Gen locus características clínicas Principales afectados GAGs

MPS IH Enfermeda d de Hurler

607014 α-L-iduronidasa 4p16.3 Opacidad corneal, disostosis múltiple, organomegalia, enfermedad cardiaca, retardo mental, muerte

en la niñez.

Dermatán sulfato y heparán sulfato MPS IS Enfermeda d de Scheie

607015 α-L-iduronidasa 4p16.3 Opacidad corneal, articulaciones rígidas e inteligencia y expectativa

de vida normales.

Dermatán sulfato y heparán sulfato MPS IH/S Enfermeda d de

Hurler-Scheie

607016 α-L-iduronidasa 4p16.3 Fenotipo intermedio entre MPS IH y MPS IS

Dermatán sulfato y heparán sulfato MPS II Severa Enfermeda d de Hunter

309900

Iduronato-2-sulfatasa Xq28 organomegalia, retardo Disostosis múltiple, mental, muerte en la

adolescencia Dermatán sulfato y heparán sulfato MPS II moderada Enfermeda d de Hunter

309900

Iduronato-2-sulfatasa Xq28 Inteligencia normal, estatura corta, expectativa de vida

normal. Dermatán sulfato y heparán sulfato MPS IIIA Enfermeda d de Sanfilippo A

252900 Heparan N-sulfatasa (sulfamidasa)

17q25.3 Retardo mental profundo, hiperactividad, leves manifestaciones somáticas. Heparán sulfato MPS IIIB Enfermeda d de Sanfilippo B

252920 α—

N-acetilglucosamini dasa

17q21 Fenotipo similar a MPS

IIIA Heparán sulfato

MPS III C Enfermeda

d de Sanfilippo

C

252930 Acetil CoAμ α -glucosaminido N-acetil transferasa

8p11.1 Fenotipo similar a MPS

IIIA Heparán sulfato

(26)

26 Enfermeda d de Sanfilippo D acetilglucosamin a-sulfato-6-sulfatasa

IIIA sulfato

MPS IVA Enfermeda

d de Morquio A

253000

N-acetilgalactosami na-6-sulfato

sulfatasa

16q24.3 Corta estatura, displasia esquelética severa,

opacidad corneal, hipoplasia de la odontoides, laxitud de

articulaciones Queratán sulfato y condroitín sulfato MPS IVB Enfermeda d de Morquio B

253010 ß-galactosidasa 3p21.33 Fenotipo similar a MPS

IVA Queratán sulfato (QS) MPS VI Enfermeda d de Maroteaux-Lamy

253200

N-actilgalactosamin a-4-sulfatasa (arilsulfatasa B)

5q12 Disostosis múltiple, opacidad corneal, inteligencia normal,

muerte en la adolescencia

Dermatán sulfato

MPS VII Enfermeda

d de Sly

253220 ß-glucuronidasa 7q21.11 Disostosis múltiple, hepatoesplenomegalia, presentaciones fetales o

neonatales, moderado retardo mental. Heparán sulfato, dermatán sulfato, condroitín

4- y 6- sulfato MPS IX

Enfermeda d de Natowicz

601492 Hialuronidasa

3p21.3-p21.2 Estatura corta, masas en tejidos suaves periarticulares

Hialuronan

4.3 Mucopolisacaridosis IVA - Morquio A

(27)

27

La incidencia varía entre 1:45000 nacidos vivos, en Holanda y Portugal, a 1:76000 nacidos vivos, en Irlanda del Norte (5). Aunque Colombia no cuenta con cifras que muestren la incidencia de esta enfermedad, algunos estudios preliminares apuntan a que este es uno de los países con mayor número de pacientes Morquio A (6,40).

4.3.1 Características Bioquímicas

4.3.1.1 Queratán sulfato y condroitín-6-sulfato

Los GAGs son moléculas lineales de heteropolisacáridos formados por unidades repetitivas de disacáridos característicos para cada uno de ellos (Tabla 2). Estos heteropolisacáridos son modificados por N-acetilación, N- u O-sulfatación y epimerización, aumentando la diversidad molecular de cada uno de estos compuestos (2). Las cadenas de GAGs se encuentran unidas a proteínas centrales formando macromoléculas conocidas como proteoglicanos (PG), los cuales forman parte de la matriz extracelular de los tejido (41).

(28)

28

amplia distribución en el organismo, el QS se encuentra principalmente en córnea y cartílago, siendo ésta la principal razón del fenotipo característico de la enfermedad de Morquio A. La estructura química del QS es más compleja y variable que la de los otros GAGs, y heterogéneas con respecto a la carga y el tamaño (42).

Dos tipos de QS se encuentran en los mamíferos de acuerdo con la estructura de la región de ligamento (42,43). El QS tipo I se encuentra principalmente en la córnea y también está presente en pequeñas cantidades en el cartílago; mientras que el QS tipo II está presente en los proteoglicanos de cartílago (44,45). El QS I se encuentra unido mediante enlace N-glucosídico a residuos de asparagina de la proteína del núcleo (42), con una longitud que varia entre 8 a 34 residuos, y un extremo no reductor cubierto por ácido neuramínico, N-acetil-β-galactosamina o α -galactosa (46,47). Aunque en menor proporción, QS I también se encuentra en cartílago unido a las proteínas fibromodulina, proteínas ricas en prolina/arginina o leucina (PRELP) y osteoadherina, con cadenas de 8 a 9 polisacáridos y un mayor grado de sulfatación que el observado en córnea (48-52).

(29)

29

o N-acetilglucosamina (46, 50). QS II puede ser dividido así: QS II-A que está presente en el cartílago articular y disco intervertebral, contiene fucosa y ácido N-acetilneuramínico y el QS II-B presente en la tráquea y el cartílago nasal, en el cual están ausentes los residuos de fucosa y ácido N-acetilneuramínico (42, 51). Un tercer posible QS ha sido identificado en el cerebro y se caracteriza por su unión a la proteína central mediante enlace-O por intermedio de una manosa y serina o treonina (42, 46).

(30)

30

Tabla 2. Estructura de las diferentes cadenas de glicosaminoglicanos.

Las posiciones de sulfatación están señaladas en rojo ( ) (adaptada de (41)).

El segundo de los GAGs acumulados en MPS IVA es el C6S, este un heteropolisacárido conformado por unidades de N-acetilgalactosamina, con un alto grado de sulfatación, y unidades de ácido glucurónico (Tabla 2) (41). Las cadenas de C6S se encuentran unidas glicosídicamente a una serina de la proteína central, con una extensión de 100 o más repeticiones de unidades de disacáridos. A

GAG Ácido urónico Galactosa Hexosamina Estructura del

disacárido Herparán Sulfato Ácido L-idurónico (IdoA) N-acetilglucosamina (GlcNAc) Queratán Sulfato

Galactosa N-acetilglucosamina (GlcNAc)

Condroitín

Sulfato glucurónico Ácido D-(GlcA)

N-acetilgalactosamina (GalNAc)

Dermatán

Sulfato idurónico Ácido L-(IdoA)

N-acetilgalactosamina (GalNAc)

Hialuronan Ácido D-glucurónico

(GlcA)

(31)

31

diferencia del QS, el C6S se encuentra ampliamente distribuido en el organismo formando parte de la matriz extracelular del tejido conectivo, en la superficie celular y en gránulos intracelulares de ciertas células (52). La degradación de C6S esta dada por la acción secuencial de las glicosidasas glucuronidadasa y ß-hexosaminidasa y la sulfatasa GALNS, la cual remueve el motivo 6 sulfato de los residuos de N-acetilgalactosamina-6-sulfato (27).

Figura 1.Catabolismo del Queratán Sulfato

Los números en la figura corresponden a las enzimas deficientes en 1 = MPS IVA, 2 = MPS IVB, 3 = MPS IIID, 4 = Enfermedad de Sandhoff,

(32)

32 4.3.1.2 Gen GALNS

El gen humano GALNS ha sido clonado y mapeado al cromosoma 16q24.3 (2); este posee una longitud de 50 kb con 14 exones y 13 intrones. Con excepción del exón 14 (800 pb), los exones poseen un tamaño entre 67 y 175 pb, mientras que el tamaño de los intrones varía entre 380 pb (intrón 7) y 14 kb (intrón 14). La señal de poliadenilación se encuentra ubicada 33 pb corriente arriba del sitio de poliadenilación en el exón 14 (53). Un ARNm de 2,3 kb es sintetizado a partir del gen GALNS, con un marco de lectura abierto de 1,5 kb que codifican para una proteína de 522 aminoácidos (54), incluido un péptido señal de 26 residuos (55). La región reguladora 5’ posee un contenido de GC del 70%, con un número de dinucleótidos CG igual al de GC, lo cual, sumado a la ausencia de una caja TATA y la presencia de un alto número de sitios de unión para el factor de trascripción Sp1, sugieren que éste es un gen de expresión constitutiva (53).

(33)

33

no ha sido reportada en otras poblaciones (6) (56) Posteriormente, las mutaciones p.A75G y pR386C fueron identificadas en pacientes del departamento de Boyacá (Saboya y Chiquinquirá), de las cuales la primera no se identificó en otros pacientes latinoamericanos (57).

A pesar de la elevada heterogeneidad molecular de las mutaciones, se han observado algunas asociaciones genotipo-fenotipo. Así, 31 mutaciones, la mayoría de ellas puntuales, están asociadas con fenotipos atenuados, mientras que 101 se encuentran asociadas con fenotipos severos, todas éstas mutaciones sin sentido, deleciones grandes y alteraciones del sitio de corte y empalme. También se han asociado a este último fenotipo el 80% de las deleciones pequeñas y las inserciones (54).

4.3.1.3 Enzima GALNS

(34)

34

El péptido señal de 26 residuos dirige la proteína naciente al retículo endoplasmático (RE) donde es modificada mediante N-glicosilación cotraslacional (59). Esta glicosilación involucra la transferencia en bloque de un oligosacárido formado por tres glucosas, nueve manosas y 2 residuos de N-acetilglucosamina. Antes de salir del RE tres residuos de glucosa y uno de manosa son removidos del oligosacárido (Figura 2) (60).

(35)

35

otras sulfatasas por saturación del sistema, y (3) coexpresión de una sulfatasa con SUMF1 lleva a un marcado incremento en la actividad de la sulfatasa (63,64).

Después que la proteína GALNS ha sido activada, plegada y glicosilada, esta es transportada mediante vesículas desde el RE hasta el aparato de Golgi, donde recibe modificaciones adicionales necesarias para su direccionamiento al lisosoma. A diferencia de las proteínas de membrana o de la ruta secretora, en las que las cadenas de oligosacáridos son procesadas a unidades que contienen ácido siálico, las enzimas lisosomales son modificadas por la adición de residuos de fosfomanosil, el cual funciona como un componente esencial en el reconocimiento del receptor de manosa-6-fosfato en Golgi (65).

(36)

36

siendo esta la base para el desarrollo de terapias de reemplazo enzimático, génica y celular (27, 60, 65).

Figura 2. Esquema del procesamiento y direccionamiento de una enzima lisosomal

(37)

37

8 α-hélices, mientras que el dominio C-terminal consiste de una hoja ß-plegada con 4 cadenas y una α-hélice. El sitio activo (C79) se encuentra ubicado en el fondo de una cavidad rodeada principalmente por grupos de aminoácidos cargados (59).

Figura 3. Estructura terciara de la enzima GALNS. La predicción de la estructura terciara fue realizada por empleando el servidor I-tasser (http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/). La predicción de los dos posibles sitios de glicosilación, así como la generación del modelo glicosilado fueron realizados con la herramienta GlyProt (http://www.glycosciences.de/modeling/). Cortesía de Alexander Rodríguez.

4.3.2 Características Clínicas

(38)

38

opacidad corneal, enfermedad de válvulas cardiacas y hepatoesplenomegalia leve, a formas medias o atenuadas con menor compromiso óseo (Figura 4). A diferencia de otras MPS, los pacientes con MPS IVA no presentan compromiso de la esfera mental (3,5,67,68).

Los pacientes Morquio A no presentan manifestaciones clínicas al momento del nacimiento. Los primeros síntomas de la enfermedad se presentan alrededor de los dos años de vida, siendo los más comunes las deformidades óseas, la corta estatura y las anormalidades en la marcha (5). En la niñez temprana los primeros problemas ortopédicos son la cifosis en la unión torácico-lumbar y una leve prominencia del esternón, la cual evoluciona rápidamente a pectus carinatum.

(39)

39

Figura 4. Características Clínicas. Principales características clínicas observadas en pacientes con fenotipo clásico de mucopolisacaridosis IV A.

Por otro lado, la alteración en la formación del cartílago y ligamentos se manifiesta principalmente en las vértebras, debido a una maduración anormal como resultado de una incompleta osificación endocondral. Las vértebras presentan platiespondilia con bordes irregulares, discos intervertebrales mas angostos de lo normal y un canal espinal angosto (67,70). Estas alteraciones llevan a hipoplasia de la odontoides, cifosis y compresión espinal la cual puede producir alteraciones neurológicas como paraparesis, o incluso paraplejia o cuadriplejia (71,72).

(40)

40

Debido a los problemas óseos y de articulaciones que dificultan el cuidado personal, y a un esmalte delgado y frágil, los pacientes con MPS IV A desarrollan problemas de higiene oral llevando en ocasiones a gingivitis (73).

Finalmente, los problemas respiratorios en pacientes MPS IVA incluyen dificultad respiratoria por deformidades en la caja torácica, obstrucción de vías superiores durante la flexión de la cabeza, infecciones recurrentes, apnea del sueño (evidencia por ronquidos) y una tráquea angosta debido a depósitos de GAGs y deformidades en el cartílago (74,75).

4.3.3 Diagnóstico

El primer método utilizado para el diagnostico de MPS fue el análisis de GAGs en orina que en la actualidad es utilizado como prueba diagnóstica preliminar. De este modo las pruebas cualitativas incluyen la precipitación de los GAGs con albúmina ácida, bromuro de cetiltrimetilamonio o cloruro de cetilpiridinio, las cuales pueden ser utilizadas en métodos cuantitativos turbidimétricos cuando los valores son corregidos de acuerdo con la concentración de creatinina y la edad del paciente, reduciéndose el número de falsos negativos o positivos (76). Sin embargo, la cuantificación turbidimétrica con cloruro de cetilpiridinio presenta baja sensibilidad en muestras de pacientes con MPS II e IV A (77).

(41)

41

sensibilidad cercana al 100%, una especificidad alrededor del 90% y la capacidad de permitir el diagnóstico de pacientes MPS IS, III y IV, los cuales no son fácilmente diagnosticados por los otros métodos turbidimétricos (77,78).

(42)

42

Figura 5. Reacción enzimática del método de cuantificación de actividad GALNS. GAL: ß-Galactosidasa de Aspergillus oryzae.

Para el diagnóstico de pacientes Morquio A también se conoce otra estrategia que consiste en la cuantificación de la enzima GALNS en fibroblastos, plasma o sangre en papel de filtro empleando anticuerpos monoclonales específicos para la enzima (82). Basado en el hecho de que las mutaciones sobre el gen GALNS tienen un efecto directo sobre la estabilidad y plegamiento de la proteína, este método permite identificar pacientes MPS IVA con base en la disminución de la cantidad de enzima, comparada contra la encontrada en individuos no afectados.

(43)

43

espectrometría de masas en tandem (LC-MS/MS), en muestras de sangre y orina, permitió la identificación de un ligero aumento en los disacáridos derivados de QS en muestras de pacientes MPS IVA, comparado contra los valores obtenidos en individuos no afectados. Este incremento fue más marcado para HS y DS en muestras de pacientes MPS I, II y VI (83,84). Este método representa una herramienta importante para la implementación de pruebas de tamizaje neonatal en las MPS que permitan un diagnóstico y comienzo de la TRE tempranos.

4.3.4 Tratamiento

En la actualidad, la mucopolisacaridosis tipo IV A no cuenta con un tratamiento que muestre beneficios significativos para aquellos pacientes que la padecen, siendo entonces manejada exclusivamente mediante correcciones quirúrgicas y tratamiento farmacológico paliativo (5). Entre ellas se emplean antinflamatorios no esteroideos para el dolor de las articulaciones, antibióticos para las infecciones pulmonares y oxígeno para el manejo del compromiso pulmonar y la apnea obstructiva del sueño (5).

(44)

44

cirugías en la cadera, rodillas y fémur, para corregir problemas de marcha y enderezar la posición de las extremidades inferiores (5, 69, 85).

Por su parte, aunque se ha probado que el trasplante de médula ósea puede tener importantes beneficios, aunque variables, en pacientes con MPS I, II, III y VI (28), este no es una alternativa para el tratamiento de pacientes MPS IVA debido a que mediante este no se logran efectos sobre las anomalías esqueléticas y oculares, además existe la dificultad de encontrar un donante compatible (86).

MPS IV A se convierte así en una excelente candidata para un tratamiento por medio de terapia de reemplazo enzimático (TRE), terapia génica o terapia de reducción de sustrato debido a la ausencia de síntomas sobre el sistema nervioso central. La TRE se encuentra en etapas preclínicas usando una enzima recombinante producida en células CHO (87, 88). Los primeros resultados mostraron que tras la infusión de la enzima recombinante la actividad se incrementó principalmente en hígado (3 veces los valores de ratones normales), mientras que en otros tejidos como hueso, pulmón y riñón, los valores fueron significativamente menores que los observados en ratones normales. Recientemente, el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo mostró la posibilidad de producir en E. coli una enzima GALNS recombinante activa (89).

4.4 Terapia Génica

(45)

45

La terapia génica es definida como la transferencia de material genético, ADN o ARN, que se realiza con el propósito de producir algún efecto terapéutico que logré la corrección de un defecto genético o que permita la adquisición de una nueva respuesta funcional (90,91). De esta manera, la transfección puede efectuarse in-situ, en donde el material genético es administrado por inyección venosa, arterial o directamente en el órgano de interés; o ex-vivo, en donde células del individuo son extraídas, transfectadas in vitro y posteriormente reimplantadas.

Aunque inicialmente la terapia génica fue concebida para el manejo de enfermedades monogénicas, con el transcurrir del tiempo se ha enfocado fundamentalmente a la implementación de terapias para cáncer, enfermedades cardiovasculares y algunas enfermedades virales, las cuales en conjunto representan el 83% del total de los ensayos clínicos realizados hasta la fecha. En el cuarto lugar se encuentran las enfermedades monogénicas, entre las que se encuentran los errores innatos del metabolismo (92,93).

4.4.2 Vectores empleados en Terapia Génica

(46)

46

durante un periodo prolongado de tiempo (91). En este sentido, el método mas utilizado para realizar la entrega del gen es el uso de vectores derivados de virus, entre los que se encuentran los retrovirus, virus del herpes simplex, adenovirus, lentivirus y virus adenoasociados (91, 94, 95, 96,97).

Por otra parte entre los vectores no virales se encuentran los polímeros catiónicos, células encapsuladas en polímeros, liposomas, oligonucleótidos antisentido y los complejos de material genético con péptidos o polímeros (98,99). Paralelamente, se han desarrollado métodos físicos que facilitan y aumentan el ingreso del vector a la célula, como electroporación, ultrasonido, biobalistica y oclusión sanguínea (99). Las principales características de los vectores virales y no virales son resumidas en la Tabla 3.

Tabla 3. Características de vectores empleados en terapia génica (100).

Vector Ácido nucleico Integración Capacidad (Kb) Células

transducidas

Retrovirus ARN Si (al azar) 4 a 8 División

Adenovirus ADN No 4 a 35 División y

quiescentes

Adenoasociados ADN No Cercano a 4 División y

quiescentes

Lentivirus ARN Si

Al azar 4 a 8 quiescentes División y

Herpes simplex ADN No 20 Quiescentes

ADN desnudo ADN No Ilimitada División y

quiescentes

No virales ADN

ARN

No Ilimitada División y

(47)

47

4.4.3 Vectores derivados de virus adenoasociados y su uso en terapia génica

Los virus adenoasociados (AAV) son viriones no patogénicos pertenecientes a la familia Parvoviridae genero Dependovirus, de aproximadamente 20 a 25 nm de diámetro, compuestos de una mezcla de proteínas de ensamblaje que encapsidan una genoma de ADN de cadena sencilla de aproximadamente 4,7 kb (101); requieren la coinfección con un virus ayudador, tipo adenovirus o herpes simplex, para su replicación. Están constituidos por un genoma de ADN de cadena sencilla. Hasta el momento se han aislado y caracterizado nueve serotipos diferentes de AAV, cada uno de los cuales posee una afinidad por algún tejido en especial (102). En la actualidad el serotipo 8 combinado con promotores hepatoespecíficos, ha permitido el desarrollo de modelos de terapia génica para las enfermedades de Gaucher (103), Fabry (104) y Niemann-Pick (105), con lo que se ha logrado un aumento hasta de 100 veces en la expresión de las enzimas, con respecto a los valores logrados con el serotipo 2.

(48)

48

siendo en tamaño VP1>VP2>VP3 (106). Los 8 serotipos poseen una homología en la secuencia proteica de la cápside entre el 58 y 88%, siendo AAV4 y AAV5 los serotipos mas divergentes (107). Las unidades monoméricas de la cápside en los serotipos están conformadas por una estructura base de 8 cadenas ß-plegadas formando un motivo ß-barril altamente conservado, y bucles largos entre las cadenas, los cuales representan las regiones estructuralmente variables entre los diferentes serotipos (108).

(49)

49

una regulación estricta del transgén (116), (3) es posible realizar la corrección del defecto en células no transducidas por el vector gracias al mecanismo de corrección cruzada mediada por el receptor de manosa-6-fosfato (30, 38, 117), (4) ensayos preclínicos en diferentes modelos animales (ratón, rata, perro y gato) han permitido niveles enzimáticos terapéuticos hasta por 1,5 años en ratón (118) y 3 años en perros (119), con importantes correcciones bioquímicas y clínicas, y (5) en las enfermedades producidas por la deficiencia de una sulfatasa (MPS II, MPS IIIA, MPS IIID, MPS IVA, MPS VI), la coexpresión con SUMF1, in vitro e in vivo, en algunos modelos de estas enfermedades, ha permitido un incremento en la actividad de sulfatasa recombinante entre 2 y 3 veces, con un notable efecto en la distribución de la enzima, la proporción de la enzima secretada y las manifestaciones bioquímicas y clínicas de la enfermedad (10,11).

Diferentes vectores han sido empleados para realizar la transferencia génica en modelos animales de EDL, siendo los más frecuentes los lentivirus, adenovirus y virus adenoasociados (9). Para el caso de los AAV en las MPS estos han sido empleados en MPS I (120), MPS II (121), MPS IIIA (11), MPS IIIB (122), MPS VI (123) y MPS VII (124).

(50)

50

esta enfermedad. Sin embargo, con el objetivo de incrementar los niveles de actividad enzimática es necesaria la evaluación de otros vectores virales.

4.4.4 Vectores lentivirales y su uso en terapia génica

Los lentivirus son el grupo mas complejo de los Retrovirus siendo el VIH el miembro más destacado y mejor estudiado, pertenecientes a la familia Parvoviridae género Dependovirus (125) con un diámetro de 90–130 nm, una masa de ~ 2,5 x 108 Da (126-128) y una densidad de 1,16 g/ml en los gradientes de densidad de sacarosa (129). Se componen de 2 copias de ARN, una cápside nuclear (CN), una cápside (CA), una matriz asociada a la membrana (MA), proteínas de envoltura, como glicoproteínas de superficie (SU) y las proteínas transmembrana (TM), enzimas como la integrasa (EN), proteasa (PR), la transcriptasa reversa (RT) y proteínas accesorias (Figura 6) (130). Las funciones de cada una de ellas se encuentran resumidas en la tabla 4.

(51)

51

Figura 6. Composición estructural de los lentivirus.

(52)

52

Tabla 4. Funciones de las proteínas que componen los Lentivirus (130)

El ARN se transcribe inversamente y se integra en el genoma del huésped con una preferencia para la integración en las unidades activas de transcripción. Al final del ciclo de vida viral, el genoma viral de ARN de longitud completa se transporta fuera del núcleo siendo capturado por la poliproteína gag y la partícula del virus finalmente es expulsada fuera de la membrana celular. La secuencia de provirus lentiviral se transfiere posteriormente a la progenie durante la división celular (131).

Nombre de la proteína Función

Cápside (CA) Gen gag; Protege el núcleo

Integrasa (IN) Gen pol; Necesario para la integración del provirus

Matriz (MA) Gen gag; Se encuentra en la envoltura Cápside nuclear (NC) Gen gag; Protege el genoma y da forma al

núcleo

Proteasa (PR) Gen gag; Protege el genoma y da forma al núcleo

Transcriptasa Matriz (MA) (RT) Esencial para la escisión de proteínas gag durante la maduración

Proteasa (PR) Transcripción reversa del genoma RNA Glicoproteína de superficie (SU) Glicoproteína de la envoltura exterior; antígeno

principal del virus

Proteína Trans membranal (TM) Componente interno de la glicoproteína de la envoltura madura

(53)

53

Figura 7. Ciclo de replicación de Lentivirus.

(54)

54

la proteína viral R (VPR) causa la fase G2 del ciclo celular en el cual la expresión de productos virales parece ser óptimo (141).

Los lentivirus son capaces de transducir tanto células que no se encuentran en división tales como macrófagos, células T y células madre hematopoyéticas (142,143), como células quiescentes por integración en el genoma del huésped (132). Además se caracterizan por generar rápidas respuestas inmunes y tener una expresión estable y a largo plazo mediante el establecimiento de un provirus estable en las células diana (125, 141), por lo cual se están convirtiendo en los vectores de elección para la entrega de ARN de interferencia (siRNA) (144).

Figura 8. Genoma Lentivirus.

(55)

55

se pueden producir empleando proteínas de la envoltura de otros virus (pseudotipos) (132).

Sin embargo, los lentivirus presentan un problema que es explorado para la producción de vectores virales. Cuando el ADN viral se transcribe al ARN del virus pierde secuencias en el extremo 5' y 3' (la secuencia promotora y la señal del Poly A). Durante la transcripción reversa, el virus copia las secuencias sobre el extremo 3' y los coloca en el extremo 5'. El segmento U3 contiene un cebador y si este es eliminado, la supresión también se copia en el extremo 5' del ARN. Para que la replicación completa del lentivirus se lleve a cabo es necesario que el virus también tenga un promotor. El único promotor que conduce la transcripción del cDNA es el promotor interno en el plásmido del vector (130, 135-137).

Finalmente, las aplicaciones más comunes de vectores virales incluyen la restauración de los genes funcionales en estudios de terapia genética, la investigación estándar de la biología celular que involucra una amplia gama tanto in vivo como in vitro y en los diseños experimentales y la investigación oncológica

(56)

56

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo general

Evaluar el efecto producido sobre los valores de actividad enzimática de GALNS tras la transfección del gen GALNS mediada por vectores lentivirales.

5.2 Objetivos específicos

1. Producir vectores lentivirales a partir de virus derivados del VIH que porten el gen humano de la enzima N-acetil-galactosamina-6-sulfato-sulfatasa a partir del cultivo de células 293FT.

2. Producir vectores adenoasociados que porten el gen GALNS a partir de células HEK293.

3. Evaluar los vectores lentivirales y adenoasociados en células HEK293 y fibroblastos de piel.

(57)

57

6. METODOLOGÍA

6.1 Producción de vectores lentivirales.

6.1.1 Elaboración Plásmido de Expresión lentiviral Topo-GALNS.

Para la elaboración del plásmido de expresión lentiviral Topo-GALNS se empleó el plásmido TOPO-GALNS previamente construido en el IEIM. Este plásmido porta el ADNc del gen humano de GALNS insertado en el plásmido pLenti6/V5-D-TOPO (Invitrogen) (Figura 9)

Figura 9. Plásmido pLenti6/V5-D-TOPO (152)

(58)

58

Las células 293FT se cultivaron en medio medio D-MEM completo suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 mM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio y 2 mM de L-glutamina. Las células fueron incubabas a

37 C en atmosfera humedad de 5% CO2.

6.1.3 Producción Vectores Lentivirales en células 293FT (154).

Las células 293FT fueron cultivadas en placa de 15 cm de díametro hasta alcanzar una confluencia del 90-95%. Este día fue considerado como el día primero. En el segundo día el medio del cultivo se reemplazó con 10 mL de medio completo con suero sin antibióticos. Para cada muestra a transfectar se preparó un complejo ADN-lipofectamine™ 2000 complexes (Invitrogen) de la siguiente

manera: en un tubo estéril de 15 mL se diluyeron λ g de ViraPower™ Packaging Mix y 3 µg de TOPO-GALNS en 1,5 mL de medio Opti-MEM I (Invitrogen) sin suero. La mezcla se homogenizó por agitación suave.

En otro tubo de 15 mL se diluyeron 36 µl de Lipofectamine™ 2000 en 1,5 mL de medio Opti-MEM I. La mezcla se agitó y se incubó 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se realizó la mezcla de la lipofectamina con la de los ADNs y se incubó por 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación del complejo ADN-lipofectamina. A continuación, se adicionó el complejo gota a gota a la placa de cultivo y se incubó a 37°C en atmosfera humedad de 5% CO2. Al día siguiente, el medio que contenía el complejo

(59)

59

incubado a 37°C en una humedad de 5% CO2. Al cabo de 72 horas de

transfección se recolectó el sobrenadante, se centrifugó a 3000 rpm durante 15 minutos a 4°C y el pellet fue descartado. El sobrenadante se filtró por membrana de 0,45 m y se almacenó a – 20 °C para su posterior concentración.

6.1.3.1 Concentración y precipitación de vectores Lentivirales con PEG 6000

(155).

Para la concentración de los vectores se tomaron 20 mL de sobrenadante obtenidos en el punto anterior y se mezclaron con 5 ml de PEG 6000 al 50 %, 2,12 mL de NaCl 4 M y 2,27 mL de PBS 1x con el fin de tener una concentración final de PEG 6000 de 8,5 % y 0.3 M de NaCl. La mezcla se incubó durante 1,5 horas a 4°C mezclando suavemente cada media hora. Posteriormente se centrifugó a 7000 rpm durante 10 minutos a 4°C y se observó un pellet de color blanco, se decantó el sobrenadante, se adicionó 1 mL de PBS 1x y se aplicó vortex durante 30 segundos para resuspender el pellet. Alícuotas de 100 l se prepararon y se almacenaron -80°C.

6.1.3.2 Titulación Vectores Lentivirales (154).

El día antes de la transducción las células HEK293 fueron tripsinizadas y sembradas en una placa de 6 pozos, se incubaron a 37°C con una humedad del 5% de CO2. El día de la transducción se descongeló el stock de vectores

(60)

60

se removió y se adicionaron las diluciones de los vectores a la placa. Al siguiente día, el medio que contenía los vectores lentivirales se reemplazó con 2 mL de medio de cultivo completo. Para el día 4 las células se trataron de la siguiente manera: se eliminó el medio y se reemplazó con medio de cultivo completo con 5 µg/µL de blasticidina, para seleccionar las células transducidas con los vectores. Las células fueron cultivadas durante 12 días realizando cambios del medio de cultivo cada 3 días. Al cabo de los 12 días se removió el medio y las células se lavaron dos veces con PBS. Enseguida se adicionó cristal violeta y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente; se removió la solución y las células se lavaron nuevamente con PBS dos veces. Finalmente, se realizó el conteo de las colonias que presentaban coloración azul y se determinó el titulo de los vectores lentivirales. Se considera un titulo efectivo entre 1-5 x105 unidades de transducción (TU)/mL.

6.2 Producción vectores derivados de virus adenoasociados a partir de

células HEK293 (14).

(61)

61

Para la Cotransfección se empleó la mezcla de liposomas catiónicos Lipofectamine 2000® (Invitrogen). Dos horas antes de la transfección, se cambió el medio de cultivo con 15 mL de medio de crecimiento D-MEM, libre de antibióticos y suero fetal bovino.

La transfección se realizó de la siguiente manera: en un tubo de 15 mL estéril se mezcló un total de 25 g de los plásmidos pAAV-CMV-GALNS,

pAAV-EF1a-GALNS, pAAV-AAT-GALNS o pAAV-CMV-SUMF1 con los plásmidos pXX2 y pXX6-80 en una relación molar 1:1:1 que corresponde a una relación 5:5:15 en términos de g de ADN, para cada caja de 10 cm de diámetro. Todos los ADNs

plasmídicos utilizados para la transfección se purificaron empleando el kit QUIAEX-Maxi-prep (QIAGEN), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico (25 g) se diluyó en 1,5 mL de medio de cultivo libre de suero Opti-MEM® (Invitrogen) y se mezcló suavemente. En otro tubo se diluyeron 60 l de Lipofectamine 2000® con 1,5 mL de Opti-MEM®; la mezcla se agitó suavemente y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos; pasado este tiempo, se mezclaron las dos soluciones y se incubó por 20 minutos a temperatura ambiente para permitir que los liposomas formaran los complejos con el ADN; pasados los 20 minutos la solución ADN-Lipofectamine 2000® se adicionó a los cultivos de células HEK293, mezclando suavemente por rotación para permitir que los complejos se distribuyeran uniformemente en la caja de cultivo. Las células transfectadas se incubaron en una atmósfera del 5% de CO2 a 37°C; doce horas

(62)

62

y se continuó con la incubación en las mismas condiciones descritas durante 48 horas, momento en el que las células se tripsinizaron y se resuspendieron en 15 mL de solución amortiguadora de lisis (0,15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,5) y se sometieron a ciclos de congelación y descongelación, alternando los tubos entre un baño de hielo seco con etanol y un baño serológico a 37° C, mezclando con vortex después de cada ciclo. Finalmente, la suspensión se centrifugó a 3700 g durante 20 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante representaba la solución viral primaria la cual se almacenó a -80ºC para su posterior purificación y cuantificación. Bajo estas condiciones las suspensiones virales son estables por un año.

6.2.1 Cuantificación de vectores adenoasociados.

(63)

63

de NaCl al 0,9%, la cual fue tratada de igual forma que las muestras. La concentración de vg/mL se calciló empleando la siguiente ecuación:

donde MWADN corresponde al peso molecular de la secuencia flanqueada por los

ITRs para cada vector basado en el peso molecular de cada nucleótido: A = 312,2 Da, C = 288,2 Da, G = 328,2 Da y T = 303,2 Da.

6.3 Evaluación de vectores lentivirales.

6.3.1 Cultivo células HEK293 y Fibroblastos Morquio A.

La línea celular HEK293 (ATCC CRL1573), es una línea celular permanente de riñón embrionario humano transformadas con ADN del adenovirus humano tipo 5 (Ad5) (158). Esta línea celular posee una alta eficiencia de transfección, que la hace ideal para la expresión de proteínas recombinantes y la producción de vectores virales (158).

Las células HEK293 y fibroblastos de conejo se cultivaron en medio esencial mínimo Eagle’s MEM (GIBCO), suplementado con penicilina-estreptomicina (GIBCO) 100 U/mL-100 g/mL, glutamina (GIBCO) 2 mM y suero fetal bovino (SFB

- Invitrogen) al 15%, en una atmósfera al 5% de CO2 a 37°C. Los fibroblastos de

conejo fueron donados por la Dra. Martha Raquel Fontanilla del Grupo de Trabajo en ingeniería de Tejidos del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Bogotá

vg/mL =

4, 47x1019(A260- 0,59A280)

(64)

64

6.3.2 Transfección células HEK293 con vectores lentivirales (154).

El primer día de transfección se descongeló el stock lentiviral y se diluyó apropiadamente la cantidad de virus en medio completo fresco para obtener la concentración apropiada (5x104 UT/pozo y 2,5x105 UT/pozo); se mantuvo el

volumen total del medio que contenía los virus tan bajo como fue posible, con el fin de maximizar la eficiencia de la transfección. Posteriormente se removió el medio de cultivo de las células y se mezcló el medio que contenía los virus suavemente adicionándolo a ellas. El segundo día de transducción se removió el medio de cultivo y se reemplazó por medio fresco. Las células se incubaron a 37°C y 5% de CO2. Se sembraron 5x104 células/pozo las cuales fueron transfectadas con 1 y 5

MOI (Multiplicity of Infection). Un MOI corresponde a la cantidad de vectores por célula empleados para realizar la transdución, en este caso un MOI de 1 equivale a equivale 5x104 TU.

6.4 Evaluación de vectores adenoasociados.

6.4.1 Transfección de células HEK293 con los vectores adenoasociados (14).

Veinticuatro horas antes de la transfección se sembraron 1x105 células HEK293

(65)

65

se recolectó el medio de cultivo y las células se tripsinizaron y resuspendieron en 200 L de solución de lisis (acetato de sodio 25 mM, ß-glicerolfosfato 1 mM, pH 5,5, Tritón X-100 1%). El proceso de lisado se realizó mediante 3 ciclos de congelación/descongelación. La solución se clarificó por centrifugación a 2500 g por 5 minutos. El sobrenadante y el medio de cultivo se almacenaron a -20ºC para posteriores análisis.

Para la cotransfección con CMV-SUMF1, se sembraron 1,5 x105 células/pozo en placas de 12 pozos 24 horas antes de la transfección. El medio de cultivo se reemplazó por medio fresco dos horas antes y las células se transfectaron con 1:1 y 1:2 GALNS:SUMF1. Cuarenta y ocho horas después se recolectó el medio de cultivo y las células, las cuales procesardos como se describió previamente.

6.5 Cuantificación de proteína por el método de MicroLowry.

La cuantificación de proteína en los lisados celulares y en los medios se realizo por método de MicroLowry. Diez µL de muestra fueron mezclado con 100 µL de SDS y 100 µL de solución de cobre en tubo vidrio. La mezcla se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Pasado este tiempo, se le adicionó 400 µL de reactivo de Folin, se incubó 55°C durante cinco minutos y posteriormente se leyó a una absorbancia de 610 nm. La concentración de proteína fue calculada empleando una curva de calibración de albumina.

(66)

66

La determinación de la actividad enzimática se baso en el método descrito por van Diggelen et al (79). Este método emplea la acción secuencial de dos enzimas: inicialmente GALNS remueve el grupo sulfato del sustrato 4-metil-umberiferil β -D-galactopiranosido-6-sulfato y finalmente el fluorogeno 4-metilumbeliferona es liberado empleando la enzima β-galactosidasa (Figura 5). La cantidad de 4-metilumbelifarona liberada es directamente proporcional a la cantidad de GALNS presente en la muestra analizada. Para la reacción, 10 µL de muestra se mezclaron con 20 µL de sustrato 4-metil-umberiferil-β -D-galactopiranosido-6-sulfato (Toronto Research Chemicals) 2 mM en solución amortiguadora NaCl 0,1M, acetato de sodio 0,1M, pH 4,3. La mezcla se homogenizó por vortex y se incubó 18h a 37°C. Como blanco de reacción se empleó agua destilada. Trascurrida la incubación se adicionaron 2 µL de una solución 10 mg/mL de β -galactosidasa de Aspergillus oryzae (Sigma-Aldrich), se homogenizó por vortex y se incubó por 2 horas a 37°C. Finalmente, se adicionaron 1,9 mL de solución de parada (glicina 24 g/L, Na2CO3 21,2 g/L, NaOH 7,5 g/L, pH10) La fluorescencia de

la muestra se determinó en fluorometro (Turner) a ex366/ em450. Una unidad corresponde a los nanomoles nm de 4-metilumbelifarona liberados por hora. Para los lisados celulares las unidades de enzima se dividieron por los miligramos de proteína en el lisado (U/mg), mientras que para los medios de cultivo la actividad se expresó como U/mL.

(67)

67

(68)

68

7. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

7.1 Producción de Vectores Lentivirales

7.1.1 Elaboración Plásmido de Expresión lentiviral Topo-GALNS.

Para la producción de vectores lentivirales se empleó el plásmido TOPO-GALNS previamente construido en el IEIM, el cual portaba el gen humano de GALNS insertado en el plásmido pLenti6/V5-D-TOPO. Este es un vector de aproximadamente 7 kb diseñado para facilitar la expresión de TOPO® cloning rápidamente y generar altos niveles de la expresión de los productos de PCR en células de mamífero (152) usando the ViralPower™ Lentiviral Expression

(69)

69

El vector contiene el promotor de citomegalovirus humano (CMV) que produce altos niveles de expresión del gen de interés en un amplio rango de células mamíferas (162-164); C-terminal V5 epitope para la detección de la proteína recombinante de interés (165) y HIV Rev (RRE) para la exportación nuclear de mRNA viral (166,167).

Figura 10. Secuencia de pLenti6/V5-D-TOPO (152).

(70)

70

Figura 11. Peso molecular, formula y estructura de la Blasticina (154).

7.1.2 Cultivo células 293FT.

(71)

71

Figura 12. Plásmido pCMVSPORT6.

La línea celular 293FT es una línea de primaria embrionaria de riñon humano transformada con con adenovirus humano tipo 5 ADN ( 173,174). El gen adenovirus E1A es expresado en estas células y participa en la transactivación de algunos promotores virales, induciéndolas a la producir niveles mas altos de proteína. Estudios han demostrado la máxima producción de virus en células humanas 293 expresando el antígeno T de SV40 (175), haciendo de la línea celular 293FT un adecuado hospedero para la construcción de vectores lentivirales.

7.1.3 Producción Vectores Lentivirales en células 293FT.

7.1.3.1 Titulación Vectores Lentivirales.

(72)

72

blasticina. La tabla 5 resume los resultados obtenidos para el proceso de titulación de los vectores:

Tabla 5. Titulación vectores lentivirales.

Dilución evaluada Número de colonias observadas

10-2 30

10-3 27

10-4 24

10-5 22

10-6 19

Titulo viral 2,1x107 UT/mL

A partir de estos resultados se observa que el título de este stock lentiviral concentrado fue de 2,1 x 10 7 UT/mL. Aunque este título es inferior al reportado por Nair A et al. (176) y Ansorge et al. (131), los cuales estaban en el orden 1011

UT/mL y 109 UT/mL respectivamente, se prosiguió con la transfección a células HEK293 puesto que según las instrucciones del fabricante, lo ideal para llevar a cabo dicho proceso es un título superior a 1 x105 UT/mL (154).

7.2 Producción y cuantificación de adenoasociados a partir de células

HEK293.

(73)

73

solución viral purificada con títulos virales del orden de 1013 vg (genomas virales)

/mL (Tabla 5), superiores a los reportados por Zolotukhin et al. (177) y Sommer et al. (157), los cuales estaban en el orden de 1011 vg/mL, respectivamente.

Tabla 6. Cuantificación de los vectores recombinante.

Vector Tamaño A260 A280 A260/A280 gv/mL

AAV-GALNS 4674 3,512 4,000 0,878 3,58 x1013

AAV-SUMF1 4467 2,535 2,223 1,140 3,97 x1013

7.3 Evaluación de vectores lentivirales.

Las células HEK293 se cultivaron en medio D-MEM completo obteniendo un recuento total de 1,04 x106 células/mL, 5 % mas a lo obtenido por Warncke et al. (178), 1 x106células/mL, con células B las cuales serían transfectadas igualmente

con vectores lentivirales.

(74)

74

fibroblastos de conejo. Sin embargo no fue posible obtener el número suficiente de fibroblastos para realizar la evaluación de los vectores en estas células.

Figure

Tabla 1. Clasificación de las Mucopolisacaridosis (14)

Tabla 1.

Clasificaci n de las Mucopolisacaridosis 14 . View in document p.25
Tabla 2. Estructura de las diferentes cadenas de glicosaminoglicanos.

Tabla 2.

Estructura de las diferentes cadenas de glicosaminoglicanos . View in document p.30
Figura 1.Catabolismo del Queratán Sulfato

Figura 1.

Catabolismo del Querat n Sulfato . View in document p.31
Figura 2. Esquema del procesamiento y direccionamiento de una enzima lisosomal

Figura 2.

Esquema del procesamiento y direccionamiento de una enzima lisosomal . View in document p.36
Figura 3. Estructura terciara de la enzima  GALNS. La predicción de la estructura terciara fue realizada por  empleando el servidor I-tasser (http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)

Figura 3.

Estructura terciara de la enzima GALNS La predicci n de la estructura terciara fue realizada por empleando el servidor I tasser http zhanglab ccmb med umich edu I TASSER . View in document p.37
Figura 4. Características Clínicas. Principales características clínicas observadas en pacientes con fenotipo clásico de mucopolisacaridosis IV A

Figura 4.

Caracter sticas Cl nicas Principales caracter sticas cl nicas observadas en pacientes con fenotipo cl sico de mucopolisacaridosis IV A. View in document p.39
Figura 5. Reacción enzimática del método de cuantificación de actividad GALNS. ß-GAL: ß-Galactosidasa de Aspergillus oryzae

Figura 5.

Reacci n enzim tica del m todo de cuantificaci n de actividad GALNS GAL Galactosidasa de Aspergillus oryzae. View in document p.42
Tabla 3. Características de vectores empleados en terapia génica (100).

Tabla 3.

Caracter sticas de vectores empleados en terapia g nica 100 . View in document p.46
Figura 6. Composición estructural de los lentivirus.

Figura 6.

Composici n estructural de los lentivirus . View in document p.51
Tabla 4. Funciones de las proteínas que componen los Lentivirus (130)

Tabla 4.

Funciones de las prote nas que componen los Lentivirus 130 . View in document p.52
Figura 7. Ciclo de replicación de Lentivirus.

Figura 7.

Ciclo de replicaci n de Lentivirus . View in document p.53
Figura 8. Genoma Lentivirus.

Figura 8.

Genoma Lentivirus . View in document p.54
Figura 9. Plásmido pLenti6/V5-D-TOPO (152)

Figura 9.

Pl smido pLenti6 V5 D TOPO 152 . View in document p.57
Figura 10. Secuencia de pLenti6/V5-D-TOPO (152).

Figura 10.

Secuencia de pLenti6 V5 D TOPO 152 . View in document p.69
Figura 11. Peso molecular, formula y estructura de la Blasticina (154).

Figura 11.

Peso molecular formula y estructura de la Blasticina 154 . View in document p.70
Figura 12. Plásmido pCMVSPORT6.

Figura 12.

Pl smido pCMVSPORT6 . View in document p.71
Tabla 5. Titulación vectores lentivirales.

Tabla 5.

Titulaci n vectores lentivirales . View in document p.72
Tabla 6. Cuantificación de los vectores recombinante.

Tabla 6.

Cuantificaci n de los vectores recombinante . View in document p.73
Figura 13. Actividad enzimática obtenida en los lisados celulares HEK293 transfectados con vectores lentivirales (2,1x107 UT/mL)

Figura 13.

Actividad enzim tica obtenida en los lisados celulares HEK293 transfectados con vectores lentivirales 2 1x107 UT mL . View in document p.75
Figura 14. Actividad enzimática obtenida en los medios de los lisados celulares HEK293 transfectados con vectores lentivirales (2,1x107 UT/mL)

Figura 14.

Actividad enzim tica obtenida en los medios de los lisados celulares HEK293 transfectados con vectores lentivirales 2 1x107 UT mL . View in document p.76
Figura 15. Actividad enzimática obtenida en lisados celulares HEK293 transfectados con el vector AAV-GALNS (3,6x1013 gv/ml)

Figura 15.

Actividad enzim tica obtenida en lisados celulares HEK293 transfectados con el vector AAV GALNS 3 6x1013 gv ml . View in document p.79
Figura 16. Actividad enzimática obtenida en los medios de los lisados celulares HEK293

Figura 16.

Actividad enzim tica obtenida en los medios de los lisados celulares HEK293 . View in document p.80
Figura 17. Actividad enzimática obtenida en los lisados celulares HEK293 transfectados con

Figura 17.

Actividad enzim tica obtenida en los lisados celulares HEK293 transfectados con . View in document p.81
Figura 18. Actividad enzimática obtenida en los medios de los lisados celulares HEK293 transfectados con vectores adenoasociados AVV GALNS SUMF1 (3,97 x1013)

Figura 18.

Actividad enzim tica obtenida en los medios de los lisados celulares HEK293 transfectados con vectores adenoasociados AVV GALNS SUMF1 3 97 x1013 . View in document p.82