Evaluación de la actividad antifúngica del extracto de tomillo (thymus vulgaris) contra botrys cinerea, fusarium oxysporum y sclerotinia sclerotiorum

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO DE TOMILLO (Thymus vulgaris) CONTRA

Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum

MARIA CAROLINA LIZCANO GONZALEZ

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

MICROBIÓLOGA AGRÍCOLA Y VETERINARIA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA BOGOTA D.C.

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NOTA DE ADVERTENCIA

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANIFÚNGICA DEL EXTRACTO DE TOMILLO (Thymus vulgaris) CONTRA

Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum

MARIA CAROLINA LIZCANO GONZALEZ

APROBADO

--- --- Dr JAIRO CUERVO A. MARIA XIMENA RODRIGUEZ Ph. D DIRECTOR ASESOR

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO DE TOMILLO (Thymus vulgaris) contra

Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum

MARIA CAROLINA LIZCANO GONZALEZ

APROBADO

--- Dra. ANGELA UMAÑA

Decana Académica Facultad de Ciencias

--- Dra. JANETH ARIAS

Directora de Carrera

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DEDICATORIA

A Dios que siempre ha estado presente en mi vida.

A los que ya no están y siempre me acompañan.

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AGRADECIMIENTOS

A mis padres Edgar y Ligia que siempre estuvieron presentes en este largo camino y que me mostraron las cosas importantes de la vida.

A mis hermanitos Andrés, Camilo y Laura por su buena energía y compañía.

A Alejandrito que en los momentos difíciles siempre estuvo dándome ánimo y haciendo parte de los felices.

A todas aquellas personas que siempre confiaron en mí, Sonia y Gabriel.

Al Doctor Jairo Leonardo Cuervo por su apoyo y paciencia para la realización de este trabajo.

A Maria Ximena Rodríguez por su comprensión, colaboración y tiempo.

A Carolina Parra por su amistad, apoyo, ayuda incondicional y desinteresada.

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TABLA DE CONTENIDO

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN 11

2. MARCO TEÓRICO 13

2.1 Fungicidas Biológicos 13

2.2 Generalidades del Cultivo de Tomillo (Thymus vulgaris) 15 2.3 Generalidades del Cultivo de Albahaca (Ocimun basilicum 17 2.4 Control contra Hongos Fitopatógenos en Plantas Aromáticas 18 2.5 Hongos Fitopatógenos de Plantas Aromáticas 19

2.5.1 Generalidades de Botrytis cinerea 23

2.5.1.1 Descripción básica 23

2.5.1.2 Huéspedes y Especialización 23

2.5.1.3 Enfermedad 23

2.5.1.4 Epidemiología 24

2.5.1.5 Control 24

2.5.2 Generalidades de Fusarium oxysporum 24

2.5.2.1 Descripción básica 24

2.5.2.2 Especialización de huéspedes 24

2.5.2.3 Síntomas de enfermedad 25

2.5.2.4 Ciclo de enfermedad 25

2.5.2.5 Epidemiología y control 26

2.5.3 Generalidades de Sclerotinia sclerotiorum 27

2.5.3.1 Descripción básica 27

2.5.3.2 Huéspedes 28

2.5.3.3 Enfermedad 28

2.5.3.4 Epidemiología 28

2.5.3.5 Control 29

2.6 Extracción de Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) 30

2.6.1 Métodos de extracción 31

3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 35

3.1 Formulación del Problema 35

3.2 Justificación 35 4. OBJETIVOS 37

4.1 Objetivo General 37

4.2 Objetivos Específicos 37

5. MATERIALES Y MÉTODOS 38

5.1 Diseño de la investigación 38

5.1.1 Obtención del Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) 38 5.1.1.1 Obtención del Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) 38

5.1.2 Pruebas In Vitro 39

5.1.2.1 Técnica de Crecimiento Radial 39

6.1.2 Prueba de Invernadero 40

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 43

6.1 Prueba In Vitro 43

6.1.1 Técnica de Crecimiento Radial 43

6.2 Prueba de Invernadero 51

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RESUMEN

Los extractos vegetales forman una parte muy importante en la agroecología, ya que estos benefician al medio ambiente, combatiendo organismos fitopatógenos, sin recurrir a agentes químicos.

El objetivo principal de este estudio es el de evaluar la actividad antifúngica del extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) sobre los hongos fitopatógenos Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum causantes de enfermedades en Albahaca (Ocimum basilicum), haciendo que cultivos enteros se pierdan debido a la baja calidad y a la muerte total de las plantas.

El estudio se desarrollo en los laboratorios y en los invernaderos de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia. En esta investigación, se evaluó el extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) a concentraciones de 150, 250 y 500g/L con dos tiempos de tratamiento térmico (15 y 30 min). Las pruebas realizadas fueron In vitro; se obtuvo un medio de cultivo con los extractos y se evaluó la tasa de crecimiento radial de los hongos, El tratamiento de 500 g/L y 30 minutos fue el que obtuvo mejores resultados, se le adicionó a plantas de albahaca inoculadas con Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum.

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ABSTRACT

The vegetal extracts makes a very important role in the Agro-ecology, they benefit to the environment and to the entire ecosystem around, fighting Infectious diseases in plants caused by Phyto-pathogens organisms, without using any kind chemical agents.

The intention of this analysis is to estimate the fungicide action of the Thyme

(Thymus vulgaris) extract in the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum and Sclerotinia sclerotiorum, this fungus are able to cause diseases in the Basil (Ocimum basilicum), which can cause serious damage in this herb, resulting in loss of yield and thus profit.

The entire investigation was developed in the greenhouses and laboratories of the Department of Agronomy of the Universidad Nacional de Colombia.

In this investigation was evaluate the Thyme (Thymus vulgaris) extract in concentrations of 150, 250 y 500g/L in different times of boiling (15 and 30 minutes). The related examinations were made In vitro; using this extracts, there was obtained a Growth medium, at the same time, the radial grown rate of the fungus was evaluated, later, the treatment with better results was added to the sick Basil (Ocimum basilicum), previously inoculated with Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum and Sclerotinia sclerotiorum.

During the tests was seen the reactions and activities of the Thyme (Thymus vulgaris) extract, in a preventive, curative, control and healthy way for the Basil (Ocimum basilicum); the percentage of incidence and severity was measured.

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1. INTRODUCCIÓN

La agricultura ecológica, orgánica o biológica enmarca todos los sistemas agrícolas que promueven la producción sana y segura de fibras y alimentos, desde el punto de vista ambiental, social y económico. Está basada en un sistema de producción sostenible, en el cual no se hace uso de fertilizantes, herbicidas o pesticidas químicos, u otras sustancias toxicas que pueden llegar a causar algún daño a la salud humana, animal y al medio ambiente. Dicho de otra forma, la agricultura ecológica trabaja bajo el concepto de producción sostenible y competitividad, sin deterioro de los recursos naturales, con un fin muy claro, el crecimiento económico y del mejoramiento de la calidad de vida de la población.

La agricultura ecológica aboga por una producción más limpia, libre de sustancias perjudiciales tanto para las personas como para el medio ambiente, y puede en algunos casos representar una mejora en la ganancia del productor.

En la actualidad se han ido desarrollando diferentes formas de contribuir a la conservación del medio ambiente en el área agrícola con productos biológicos, estos productos evitan o excluyen insumos externos de síntesis químicas que empobrecen el suelo contrarrestando la acción de las poblaciones de organismos benéficos, disminuyendo los nutrientes para las plantas y contaminando fuentes de agua.

El Manejo Integrado de Plagas es un método para combatir poblaciones no deseadas siendo responsable con el medio ambiente. Existen productos biológicos que pueden llegar a ser muy efectivos para el control de plagas. Se conocen sustancias extraídas de plantas que tiene un efecto antifúngico contra la población dañina y sin contaminación del recurso suelo y agua.

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perdidas hasta de un 100% de la producción de este cultivo por su agresividad al atacar.

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2. MARCO TEORICO

2.1 FUNGICIDAS BIOLÓGICOS

Los Hongos constituyen el grupo más importante entre los agentes causales de tipo infectivo que provocan enfermedades de las plantas. El número exacto de hongos fitopatógenos se desconoce, pero se estiman en un número superior a las diez mil especies, pertenecientes a diversas categorías taxonómicas (Asocolflores, 1995).

El uso de Productos Naturales es tan antiguo como la humanidad. Los productos naturales son de naturaleza muy variada, desde sustancias biológicamente activas de origen marino, exudados de raíz y los más explorados, aquellos provenientes de plantas. La química orgánica estudia la estructura, transformación y efectos biológicos de los metabolitos secundarios presentes en diferentes organismos. Debido a sus propiedades y principios activos se están aplicando en medicina moderna, cosmetología, farmacéutica, biotecnología y últimamente con contribución muy prometedora en la agricultura ecológica (Fonnegra y Jiménez 2006).

En la naturaleza existen de 250.000 a 500.000 especies vegetales, de las cuales se estima que al menos el 10% han sido estudiados en sus aspectos químicos y propiedades biológicas. Como se mencionó anteriormente, esta temática no es nueva, se había dejado en el olvido por un largo periodo de tiempo y recientemente, el interés ha sido renovado valorando la diversidad de estructuras químicas en la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos (Piñol, 2001).

Los productos de origen vegetal han sido, en las últimas dos décadas, mayormente estudiados en su parte química, con énfasis en los metabolitos secundarios, los cuales están implicados en el control biológico contra patógenos o plagas, y en ciertos casos, activando procesos de defensa en la planta, brindando una protección preventiva (Kagale et al. 2004).

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dar lugar a la formación de los metabolitos secundarios, haciéndose evidente la interconexión entre productos del metabolismo primario con el secundario (Gil, 2002).

Los compuestos fenólicos sencillos (hidroxibenzoicos o hidroxicinámicos), son metabolitos secundarios comunes en las plantas con propiedades fungicidas. Las cumarinas clasificadas como antifúngicas y antibacteriana. Los conjugados de fenilpropanoides con aminas, se incorporan a la pared celular vegetal para aumentar su rigidez e impedir la entrada de los patógenos. En cuanto a las fitoalexinas, estas son sintetizadas por las plantas, después de la infección y en actividad inhibitoria de microorganismos patógenos, se han identificado un grupo importante, por ejemplo, la pisatina, la cual es un flavonoide sintetizado por el guisante, Pisum sativum, como reacción a la infección por hongos, siendo esta la primera fitoalexina aislada y caracterizada (Gil, 2002).

Por otro lado, aquellas que hacen parte de la respuesta hipersensible, como es el caso de algunos compuestos pertenecientes a los grupos de los alcaloides, los terpenoides y los fenilpropanoides, participan activamente eliminando directamente al microorganismo patógeno y/o restringiendo su invasión al resto de la planta. Al mismo tiempo, otros metabolitos secundarios contribuyen a destruir las especies reactivas de oxígeno que son tóxicas para la misma célula vegetal, las cuales se sintetizan durante las etapas tempranas de la respuesta de defensa. Es así, como algunos metabolitos secundarios constituyen una parte importante de la respuesta de la defensa de las plantas sometidas al ataque por patógenos (Sepúlveda et al. 2003).

Existen varios reportes en la literatura en donde registran plantas con actividad fungicida, como es el caso de Allium sativum, la cual contiene como compuesto activo aliína un aminoácido sulfurado; el aceite esencial de hojas de orégano mexicano (Lipp iagraveolens), presenta fenoles timol y carvacol que son los principales componentes que le confieren poder antibacteriano y antifúngico (Kagale et al. 2004). El aceite esencial obtenido desde hojas de limón (Cymbopogon citratus), que es rico en citral, myrceno, dipenteno, methylheptenona, ciertos alcoholes, y ácidos volátiles, presento actividad antifúngica, contra Mycosphaerella fijiensis en bioensayos realizados in vitro

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En Colombia evaluaron el efecto biofungicida de Momordica charantia, Awinglea glutinosa, Salvia officinalis, Carica papaya, Azadirachta indica y Jatropha sp. Utilizando como adherente natural el aceite de Ricinus comunis, los autores encontraron que hubo respuesta de sensibilidad del hongo a los tratamientos, sin embargo el químico presentó los mejores resultados en todas las variables (Marín et al. 2006).

En el caso del patosistema pepino-Podosphera xanthii, causante del mildeo polvoso, al ser tratado con un inductor exógeno, proveniente de las hojas de malsana (Reynoutria sachalinensis), se observó rápidamente la síntesis de una fitoalexina, C-glycosdsil conocida como cucumarina, la cual se acumula en el sitio de penetración del hongo, jugando un papel importante en el bloqueo, colonización y supervivencia del patógeno. Se reporto la lignificación de la pared celular y el aumento en actividad de las enzimas quitinasas, peroxidasas y β-1,3 glucanasas (Fofana et al. 2005).

Los efectos fungicidas in vitro de los Aceites esenciales de plantas aromáticas contra Fusarium sp ha sido determinados por la capacidad inhibitoria en el crecimiento del fitopatógeno con estos productos (Fernández y Vega 1990).

Los extractos provenientes del cedro blanco (Hiba arborvitae) inhiben la germinación de esporas de Botrytis cinerea (Hernández y Bautista 2007); y el crecimiento micelial Sclerotinia sclerotiorum aplicados a diferentes concentraciones (Zapata et al. 2003).

2.2 GENERALIDADES DEL CULTIVO DE TOMILLO (Thymus vulgaris)

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rojizo; la corola, un poco mas larga que el cáliz, con el labio superior erguido y el inferior trilobulado y de color blanquecino o rosado; los cuatro estambres sobresalen de la corola. El fruto es un tetraquenio, lampiño, de color marrón (Gil, 2002).

Es una especie muy variable, tanto en su fenología como en la composición química de su aceite, en la que ya se han detectado siete quimotipos. Debido a esto ha dado lugar a confusiones taxonómicas en este género, en el que se han considerado como especies distintas, a sus variedades o ecotipos (Fonnegra y Jiménez 2006).

Su hábitat son países de cuenca mediterránea occidental, sobre suelos secos y soleados. Es abundante en el este, centro y sur de la península y en Baleares. Crece sobre suelos calizos, arcillosos y menos frecuentes en silicios. La latitud es de 0 a 1.800 m. El clima más favorable para su cultivo es templado, templado-calido y de montaña. Resiste bien a las heladas y sequías, pero no el encharcamiento ni exceso de humedad ambiente. Aunque prefiere los suelos ricos y calcáreos, se adapta a los arcillosos, ligeros y silicios. Prefiere la exposición a medio día. Su reproducción puede hacerse por semillas o vegetativamente, por división de pies o por esquejes (Latorre,1999).

Las enfermedades que puede atacar el cultivo, se destaca sobre la parte aérea, a veces, un amarillamiento de hojas, de algunas ramas, de la parte superior, debido a un ataque de nematodos fitófagos, a nivel de las raíces. Una invasión generalizada conduce a la desaparición de la totalidad de los pies atacados. El responsable principal es Meloidogyne hapla. La única lucha posible es la desinfección de suelos y mediante la multiplicación vegetativa, recurrir a los pies sanos. No se debe implantar el cultivo de tomillo en parcelas donde se ha detectado presencia de nematodos. La defoliación y el amarilleo confirmado después de la floración, son fenómenos naturales, que no deben confundirse con enfermedades (Gutierrez, 1996)

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españolas, apenas contienen timol) en porcentaje del 20 al 70%, según las razas; también contiene p-cimeno, terpinenos, linalol, borneol y sus esteres acéticos, cíñelo, geraniol, cariofileno. En Francia se han encontrado hasta la fecha, siete quimiotipos diferentes de Thymus vulgaris (Fonnegra y Jiménez 2006).

La mayoría del aceite comercial de tomillo es extraído de Thymus zygis. Los principales componentes del aceite de tomillo son mostrados en la TABLA Nº 1. Los aceites ricos en timol son producidos en grandes cantidades y son valorados por su aroma. Se observan las variaciones en la composición del aceite debido a diferentes quimiotipos reconocidos. Se reportan rendimientos de aceite entre 0.5 – 1.5%.

TABLA Nº 1 .Contenido (%) de algunos de los principales componentes de

diferentes quimiotipos de Thymus zygis.

COMPUESTO

QUIMIOTIPO QUIMOL

QUIMIOTIPO CARVACROL

QUIMIOTIPO LINALOL

Y - terpineno 9.9 11.9 0.2

P – cimeno 18.9 20.8 1.5

Linalol 3.2 4.1 79.0

Timol 49.8 0.8 0.9

Carvacrol 2.0 43.9 1.1

Fuente: Proyecto Hierbas Aromáticas. UNAL

2.3 Generalidades del Cultivo de Albahaca (

Ocimum basilicum

)

.

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Es originaria Persia y Asia menor, se ha extendido su cultivo por las regiones templadas, sobre todo los países de la cuenca mediterránea.

Su multiplicación puede ser por semilla o por siembra directa durante 15 días a una temperatura de 20 a 25ºC (Jarvis, 1981).

En plena floración de la planta cuando se estima a obtener su aceite se recolecta se corta a unos 15cm del suelo con el fin de preservar las yemas basales de los tallos. La albahaca produce aceite esencial, de color amarillo rico en linalol, metil chavicol y eugenol, con rendimientos aproximados de 0.6%(en peso fresco) y 1.2 % (en peso seco) (Espitia, 2004).

2.4 Control contra hongos fitopatógenos en plantas aromáticas

El método tradicional para el control de hongos en plantas aromáticas, ha sido las prácticas culturales, dirigida a reducir la fuente de inóculo del patógeno y

forma parte de un programa de manejo integrado de la enfermedad. En este sentido, el establecimiento de un buen sistema de drenaje, la remoción de las hojas viejas en el suelo junto con la poda sanitaria, se han utilizado durante años como estrategias para reducir la densidad del inóculo, sin dejar de lado, un adecuado programa de fertilización. Se ha propuesto el establecimiento de altas densidades de siembra, con el fin de generar un micro y mesoclima al interior de la plantación, creando condiciones desfavorables para el patógeno (Rosales et al. 2002).

El método de control químico, es el más ampliamente utilizado, se establece

dentro de un programa normal de rotación entre fungicidas, sistémicos y protectantes, a lo largo del ciclo del cultivo. De acuerdo a Marín y Romero (1998), los fungicidas para el control de esta enfermedad se pueden agrupar en tres categorías, con base en su modo de acción: fungicidas de contacto o protectantes, de acción sistémica local y fungicidas sistémicos. En cuanto a los fungicidas protestantes, estos son utilizados de forma alternada con fungicidas sistémicos, estos últimos, son aplicados con aceites o emulsiones como adherente (Romero, 2006).

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tendiente a reducir el inóculo de la enfermedad, utilizando microorganismos, que en buena medida actuarían como antagonistas o en competencia contra los hongos fitopatógenos (Patiño et al. 2006; Gutiérrez, 1996). A pesar de los avances, el empleo de estos microorganismos y el como hacerlos eficientes para uso masivo, esta aún poco desarrollado, máxime que una de las limitantes en su aplicación es la efectividad disminuida causada por el efecto negativo de factores ambientales, los cuales pueden alterar la supervivencia, actividad y vida útil de estos en la superficie de la hoja.

La importancia de los metabolitos secundarios en control, se ve claramente en los trabajos con extractos de plantas, en donde se han evidenciado como potentes productos antifúngicos, antibacterianos, estimuladores del desarrollo fisiológico de la planta o activando los mecanismo de defensa contra plagas y

enfermedades (Kagale, 2004).

2.5 Hongos fitopatógenos de plantas Aromáticas

En Estragón (Artemisa dracunculus) la principal enfermedad es la roya del estragón, Puccinia dracunculina, que hace su aparición en los meses donde hay elevadas temperaturas y la es humedad imperante (Gómez, 2004).

En la Albahaca sólo dos enfermedades de origen biótico de importancia han sido descritas para esta especie, ambas causadas por patógenos que representan un amplio rango de hospederos afectando otros cultivos (Goto, 1990).

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para esta enfermedad en otros cultivos son válidas para albahaca. Así es importante la eliminación de hojas o cualquier tejido muerto o senescente y evitar exceso de fertilización nitrogenada (Gil, 2002).

Pudriciones radicales y de corona, causadas por hongos de los géneros Pythium

spp., Rhizoctonia spp. Phytophthora spp. y Fusarium sp., los que producen necrosis y podredumbre del sistema radical y corona, asociado a clorosis y marchites de las plantas. Las raíces pierden su color blanco característico, adquiriendo una coloración marrón. La principal vía de llegada de estos patógenos al cultivo es a través de sustrato, bandejas, agua, solución nutritiva, tanques y cañerías contaminados. De aquí, que una medida de control fundamental la constituya el asegurar la limpieza de todas estas posibles fuentes de inóculo del hongo. De igual manera se debe evitar la contaminación con suelo de todos los componentes del sistema o recipientes que se vayan a utilizar (Gómez, 2004).

En la Menta a existencia de enfermedades afecta el estado sanitario de los cultivos y por lo tanto reducen la producción de materia verde y aceite esencial. La enfermedad de mayor importancia en la Argentina para las mentas es la roya (Puccinia menthae Pers) que, ataca a hojas y tallo, se caracteriza por la aparición de pústulas amarillas que luego oscurece a tonos marrones (Goto, 1990).

Cuando el ataque es muy intenso puede provocar la caída de las hojas. El control de esta enfermedad es difícil, en general se recomienda adelantar la cosecha cuando se prevé un ataque severo (Latorre, 1999).

El marchitamiento es, una enfermedad producida por el hongo (Verticillum sp), que se caracteriza porque las hojas se toman amarillas, la planta crece con dificultad y termina por morir en poco tiempo, especialmente si el clima es seco (Goto, 1990).

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jóvenes, que pueden extenderse a, los brotes, provocando la caída de las primeras y la muertes de los segundos (Gutiérrez, 1996).

En Orégano (Pelcthranthus amboinicus), el ataque del tizón foliar (Alternaria alternata) que si bien no se manifiesta severamente, es la enfermedad que reviste mayor importancia, ya que causa el deterioro del producto. Se manifiesta desde, el ápice hacia la base de la planta en forma de manchas foliares que se localizan principalmente en las hojas superiores. En ataques severos se produce la muerte de la planta. La predisponen la sucesión de días lluviosos, elevada humedad y temperatura (Gil, 2002).

Dentro de la enfermedades fúngicas se nombra Phythophthora cryptogea que produce necrosis a nivel del cuello de la raíz se caracteriza por un importante deterioro de las plantas, ramas secas y las hojas presentan manchas amarillas, marrones y negras, este hongo , se presenta en primavera en especial en suelos húmedos y compactados (Gómez, 2004).

El orégano puede ser atacado por una podredumbre debido al desarrollo de

Botrytis cinerea y por Puccinia rubsaameni. Para el caso de la mejorana se menciona a su vez el ataque de Puccinia menthae, así como Septoria origanicola var. Mejorana ambas afectan al sistema fotosintético de las plantas (Gómez, 2004).

Una de las más importantes enfermedades del orégano es debida a

Colletotrichum spp causante de necrosis foliares que deprecian la calidad de la producción en verde. Los síntomas que se observan primero son unas pequeñas manchas pardas sobre las hojas y los tallos. Al extenderse progresivamente por la lámina foliar, las áreas necróticas coalescentes producen el total marchitamiento de las hojas, que caen finalmente. Dos han sido las especies de

Colletotrichum aisladas del orégano: Colletotrichum dematium y Colletotrichum gloeosporioides, ambos fueron aislados y cultivados en PDA (Patata-Dextrosa-Agar) dando dos tipos diferentes de colonias (Latorre, 1999).

De igual forma se ha descrito un hongo perteneciente a la familia de la

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y salvia, que provoca unas necrosis a nivel del cuello y de las raíces. El marchitamiento del pie de las plantas afectadas se caracteriza por la presencia de ramas secas y de hojas con manchas amarillas, pardas y negras. El hongo está presente en los suelos húmedos y compactos, propensos a los encharcamientos (Gutiérrez, 1996).

También se ha podido observar sobre cultivos de orégano un oidio causado por

Erysiphe galeopsidis el cual provoca unas manchas blancas sobre los tallos y las hojas de las plantas enfermas (Gómez, 2004).

Otros agentes causantes de enfermedades de origen fúngico en el orégano son

Botrytis cinerea y una roya, Puccinia rubsaameni. Ambos parasitan al orégano y le causan podredumbres (Goto, 1990).

El Damping-off en Salvia (Pluchea odorata) causado por Pythium debaryanum y Pellicularia filamentosa. En los semilleros, donde las plantas están bastante apiñadas y bajo muchas condiciones algunos de los plantones muertos pueden ser la consecuencia de la acción de alguno de estos hongos. El control que se puede realizar hoy por hoy es difícil pero se recomienda la solarización de los suelos como prevención (Apablaza, 1999).

Manchas en las hojas es causado por Cercospora salviicola y Ramularia salviicola. Arrancar y destruir las primeras hojas manchadas frecuentemente es utilizado como método de control preventivo (Gamboa, 1998).

Muchas especies de royas atacan principalmente a especies silvestres de Salvia. Algunas de las más comunes son Puccinia caulicola, P. farinacea, y P.salviicola.

Raramente se aplican métodos de control (Apablaza, 1999).

2.5.1 Generalidades de Botrytis cinerea 2.5.1.1 Descripción básica

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de diámetro; para que se produzcan apotecios se necesita un periodo de almacenamiento en frío; los tallos de los apotecios llegan a 3 cm de longitud y a 1-2 mm de grueso; los discos son cóncavos , pardo amarillentos y de hasta 8mm de diámetro. Las ascas son cilíndricas, las ascosporas elipsoidales a fusiformes, y uninucleadas. Los conidióforos son mas o menos rectos, ramificados, pardos, pero mas pálidos cerca del ápice; las ramas terminales producen conidias lisas, unicelulares, obobales o elipsoidales, hialinas a pardo claro o, en masa, pardo grisáceo (Elad y Volpin, 1999).

2.5.1.2 Hospedero y especialización

Es un parasito inespecífico que ataca un amplio numero de especies vegetales (hortícola, ornamentales, cultivos extensivos, frutales) especialmente anuales; también ataca a plántulas de árboles forestales. Puede comportarse como patógeno y como saprofito. Aunque entre los aislados existen variaciones notables de morfología cultural y de agresividad, no se ha encontrado especialización respecto al huésped (Smith 2002).

2.5.1.3 Enfermedad

Produce una podredumbre blanda (podredumbre gris), marchitez súbita o lesiones pardas. El hongo infecta a las plantas casi exclusivamente a partir de tejidos colonizados muertos o senescentes o a través de heridas; puede causar muerte de plántulas en pre y post emergencia (ornamentales, hortícolas, árboles forestales); en tallos y pecíolos aparecen lesiones pardas que se extienden lentamente por los tejidos del tallo. Sobre las hojas se desarrollan lesiones pardas, a veces hidrópicas, que se extienden con rapidez, especialmente en condiciones húmedas (Avila, 1993).

2.5.1.4 Epidemiología

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saprofitito importante que se adhiere a las superficies mojadas de las plantas (Bayona, 1996).

2.5.1.5 Control

Los problemas de resistencia a fungicidas y en este caso, la falta de especificidad del huésped, la enfermedad puede extenderse fácilmente de un cultivo a otro (Doss, 1995).

2.5.2 Generalidades de Fusarium oxysporum

2.5.2.1 Descripción básica

Esta especie, la mas importante del género Fusarium, en PDA las colonias tiene un aspecto variable que depende de la cepa; en general el micelio aéreo ye el medio cambia de color a distintos tonos desde violeta a morado oscuro; si abundan los esporodoquios las colonias puede aparecer crema o naranja. Las microconidias, siempre presentes, son oval-elipsoides, mono o bicelulares, y se forman en fialidas cortas no ramificadas, nunca en cadena, pero agrupadas en falsos capítulos. Las macroconidias, normalmente 3-5 septadas, son fusoides, ligeramente curvadas y a menudo tienen una célula basal pedicelada; se forman al principio en fialidas individuales, luego en esporodoquios. Las clamidosporas son solitarias o están en cadenas cortas (Agrios, 1998).

2.5.2.2 Especialización de hospedero

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2.5.2.3 Síntomas de la enfermedad

Los síntomas de la marchitez fusárica varían según el huésped, el patotipo y las condiciones de infección; en general las hojas mas viejas muestran al principio un aclarado vascular leve, clorosis de la lamina o marchitez, y estos síntomas progresan posteriormente a las hojas jóvenes, a menudo iniciándose unilateralmente en algunas en correspondencia con una infección localizada en parte del sistema vascular de raíz y tallo; las partes afectadas de la planta empardecen. En el tallo aparecen estrías longitudinales necróticas que se extienden hacia el ápice; los síntomas internos pueden verse a simple vista en secciones de raíz, tallo y pecíolo. El empardecimiento comienza en el tejido vascular y se extiende al córtex en las fases tardías de la infección. La marchitez se desarrolla con especial rapidez en la floración o fructificación. En los cultivos aparecen en focos que se extienden gradualmente, causando la muerte prematura de las plantas afectadas. Debido a la consecuencia respecto al control y a la posibilidad de conjunción con otras enfermedades es importante comprobar los síntomas de las marchiteces debidas a Fusarium (Mazzanti, 1994).

2.5.2.4 Ciclo de la enfermedad

Las marchiteces debidas a Fusarium son enfermedades típicas del suelo, y en el la principal fuente del inóculo son los restos vegetales infectado; las clamidosporas pueden resistir de forma inactiva durante varios años y germinar al disponer de nutrientes, por ejemplo la proximidad de partes jóvenes de raíces. La clamidospora germinada da lugar a inóculo al gormar hifas, conidias y clamidosporas; en este aspecto las cepas del patógeno se comportan igual que otras especies de Fusarium (Agrios, 1998).

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mediante crecimiento miceliar y formación de microconidias que se transportan en la corriente transpiratoria (Latorre, 1999).

En estadíos posteriores puede extenderse al tejido adyacente causando necrosis visibles exteriormente. La patogénesis esta relacionada con el bloqueo de los vasos y la formación de enzimas y toxinas. Los Fusarium causantes de marchitez pueden también invadir y colonizar plantas que no son huéspedes, en las que causan síntomas leves; estos portadores asintomáticos contribuyen al transporte y multiplicación del inóculo (Smith, 2002).

2.5.2.5 Epidemiología y control

Los Fusarium patogénicos causantes de marchiteces, que tiene una importancia primordial en muchos cultivos (excepto cereales), puede dispersarse en el suelo, polvo, agua de riego o por plantas infectadas (pero rara vez por semilla); los agentes mas importantes en la practica son el suelo y el material de multiplicación vegetativa, que deben someterse a controles fitosanitarios para impedir la dispersión. Aunque las clamidosporas son muy resistentes es posible utilizar termoterapia en bulbos y tratamientos desinfectantes en el suelo que, sin embargo, tiene a ser mas bien ineficaces en suelo in situ, dado que incluso pequeñas cantidades de inóculo residual pueden ser acusa de ataques importantes y que el inóculo que permanece en zonas profundas colonizará de nuevo con rapidez la zona desinfectada, en la que existe un vació microbiológico (Smith, 2002).

En los sistemas intensivo de cultivo las raíces se desarrollan en un volumen limitado de sustrato, que puede mantenerse en un principio libre de F. oxysporum, sin embargo debe evitarse la re-infestación con plantas, polvo o agua de riego. Algunos suelos son supresivos para las marchiteces debidas a

Fusarium, debido a que un alto nivel de competencia con otros microorganismos

impide que las formas especiales ataquen a las plantas cultivadas en ellos; este efecto supresito puede incluso trasferirse a otros suelos y establecerse allí, lo que abre perspectivas a un control microbiológico (Agrios, 1998).

(27)

marchiteces por Fusarium son las temperaturas elevadas, el crecimiento rápido y la transpiración intensa, pero no son fáciles de alterar sin afectar directamente la producción. El éxito inicial del control con fungicidas sistémicos (benzimidazoles) fue de corta duración al aparecer con rapidez cepas resistentes de F. oxysporum. Las principales perspectivas para el control residen de hechos en la mejora de cultivares resistentes, de los que se dispone comercialmente para la amatoria de huéspedes importantes; tales cultivares pueden ser muy resistentes solo a algunas razas o ser ampliamente tolerantes a distintas razas, en algunos casos pueden dar buen resultado injertar sobre patrones con un buen nivel de resistencia de base amplia (Polanco, 2004).

2.5.3 Generalidades de Sclerotinia sclerotiorum

2.5.3.1 Descripción básica

(28)

2.5.3.2 Hospederos

S. sclerotiorum es uno de los patógenos con una gama de huéspedes más amplia, se señala como huéspedes a 225 géneros de 64 familias de plantas superiores, principalmente angiospermas. Es especialmente frecuente el parasitismo a las Solanaceae, Cruciferae, Umbeliferae, Compositae,

Curcubitaceae y Leguminoseae. En raras ocasiones ataca a plantas leñosas, a gramíneas y a cereales. Se ha demostrado que son capaces de atacar una amplia gama de huéspedes (Agrios, 1998).

2.5.3.3 Enfermedad

S. sclerotiorum causa en una amplia gama de huéspedes una podredumbre blanda progresiva de tejidos no lignificados; los daños son especialmente frecuentes en tallos de plantas herbáceas y en órganos de almacenamiento de hortícola; también causa lesiones de hojas, pero solo si las condiciones para su extensión son muy favorables. En distintos cultivos se dan nombre distintos a la enfermedad, siendo generalizado el del mal del esclerocio. Son rasgos característicos la formación de lesiones extensas blandas, normalmente de color claro y el crecimiento de un tapiz miceliar blanco algodonoso sobre la superficie y en el interior de las cavidades del huésped; posteriormente se forma en las cavidades medulares de los tallos y de los pecíolos esclerocios negros prominentes cuya aparición es un carácter diagnostico fiable. El primer síntoma notable en plantas infectadas en el eje principal cerca del nivel del suelo suele ser un marchitamiento, al que sigue rápidamente un colapso total y el encamado (Purdy, 1999).

2.5.3.4 Epidemiología

(29)

Una condición para la germinación carpogénica es que haya habido un periodo de helada que rompa la dormicíon y a continuación temperaturas mayores y humedades altas; en las altitudes templadas los apotecios maduran típicamente; los estipes de los apotecios se alargan en respuesta a la luz y las ascosporas se dispersan por el viento; al aterrizar sobre huéspedes potenciales necesitan durante 16-24 horas agua para germinar; pueden germinar en un intervalo de temperatura desde 0-25º C, con un óptimo a 15-20 ºC (Smith, 2002).

También parece que para la infección se necesita una base exógena de nutrientes. Los tejidos heridos, muertos o senescentes se colonizan con facilidad y sirven como una base nutritiva, desde la que puede tener lugar la infección de tejidos sanos (Adams, 1999).

Las ascosporas germinales producen apresorios que pueden variar desde formas lobuladas simples a cojinetes ramificados complejos; la penetración normalmente es directa a través de la cutícula, ayudada por una importante disolución pectolítica y celulolítica de la estructura de la estructura celular del huésped. Al descomponerse el huésped los esclerocios vuelven al suelo o pueden distribuirse por las operaciones culturales, la recolección el pastoreo, etc. (Agrios, 1998).

En la mayoría de las regiones la ausencia de un estadio conídico y las limitaciones ambientales para la formación de apotecios reducen a un ciclo único anual de infección (Smith, 2002).

2.5.3.5 Control

El control químico se ha dirigido tanto a inhibir el desarrollo de los esclerocios como a proteger las plantas contra la infección por ascosporas; lo primero se ha intentado con distintos esterilizantes de suelo y con fungicidas de amplio espectro (Smith, 2002).

(30)

cultivos tiene un valor limitado, dado la amplia gama de huéspedes (Adams, 1999).

2.6 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS

Las plantas poseen una variedad de mezclas de compuestos bioactivos tales como lípidos, grasas, fotoquímicos, fragancias, pigmentos y sabores que son ampliamente utilizados en la agroindustria alimentaría y no alimentaría, en la industria Farmacéutica y en la industria cosmética. Para separar estos compuestos (solutos) de la fase sólida, ésta se pone en contacto con una fase líquida, ambas fases entran en contacto íntimo y el (los) soluto(s) se difunde(n) desde el sólido a la fase líquida, lo que permite una separación de los componentes de su estructura natural original.

Este proceso se conoce como lixiviación y para realizarlo existen varios métodos. Un proceso importante es la lixiviación de azúcar de las remolachas con agua caliente. Otros procesos muy utilizados consisten en la extracción de aceites vegetales, en los cuales se emplean disolventes orgánicos como hexano, acetona y éter, para extraer aceites de maní, soja, semillas de lino, ricino, girasol o algodón (Geankoplis, 1999).

Los métodos tradicionales de extracción requieren altos tiempos de residencia y grandes cantidades de solvente. Estos métodos se basan en la selección del solvente asociado con el uso de calor y/o agitación e incluyen el soxhlet, la hidrodestilación y maceración mezclada con agua, alcohol o grasa caliente. El soxhlet es una técnica estándar y la principal referencia para evaluar el rendimiento de otros métodos de extracción sólido – líquido (Luque de Castro y García-Ayuso, 1998).

(31)

disminuir el consumo de solvente, aumentar el rendimiento de extracción y mejorar la calidad del extracto.

Se empezará describiendo los métodos de extracción con soxhlet y con fluidos supercríticos, también se citaran algunos resultados comparativos entre estos dos métodos y finalmente se mostrarán algunas de las aplicaciones agroindustriales con fluidos supercríticos FSC, con el objeto de continuar la divulgación que ya se viene haciendo de éste método y de sus bondades entre los académicos e industriales de nuestros países latinoamericanos.

2.6.1 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN

2.6.1.1 EXTRACCION CON SOXHLET

Para la extracción con soxhlet se deben tener en cuenta: la selección del solvente, la matriz sólida y las condiciones de operación.

2.6.1.1.1 Selección del solvente

Debe seleccionarse un solvente conveniente de tal forma que ofrezca el mejor balance de varias características deseables: alto límite de saturación y selectividad respecto al soluto por extraer, capacidad para producir el material extraído con una calidad no alterada por el disolvente, estabilidad química en las condiciones del proceso, baja viscosidad, baja presión de vapor, baja toxicidad e inflamabilidad, baja densidad, baja tensión superficial, facilidad y economía de recuperación de la corriente de extracto y bajo costo (Dahlstrom et al., 1999).

(32)

El uso de solventes alternativos tales como: isopropanol, etanol, hidrocarburos, e incluso el agua, se ha incrementado debido a asuntos del medioambiente, la salud, y a preocupaciones de seguridad. Se usó d-cineno y hexano en la extracción de aceite a partir del salvado de arroz y se observó que el d-cineno extrajo una cantidad significativamente superior de aceite que el hexano bajo cualquier serie dada de condiciones (Mamidipally y Liu, 2004). También se ha utilizado agua para extraer el aceite del salvado de arroz a un valor del pH de 12. El aceite extraído con agua tuvo un volumen más bajo de ácido graso libre y un color más claro que el obtenido con hexano (Hanmoungjai et al., 2000).

Sin embargo, los solventes alternativos producen a menudo menos recuperación debido a una afinidad molecular disminuida entre el solvente y el soluto. Los costos de los solventes alternativos pueden ser superiores. A veces se agrega un co-solvente para aumentar la polaridad de la fase líquida. Además, se han reportado extracciones de mezclas de isopropanol y el hexano para aumentar el rendimiento y la cinética de extracción (Li et al., 2004).

2.6.1.1.2 Características de la matriz

La extracción con Soxhlet depende fuertemente de las características de la matriz y de las dimensiones de las partículas puesto que la difusión interna puede ser el paso limitante durante la extracción. Para la extracción total de las grasas de las semillas oleaginosas, se realizó una extracción de 2-h obteniendo un rendimiento del 99% cuando la dimensión de las partículas era 0.4 mm, mientras que fue necesaria una extracción de 12-h para obtener una eficacia similar si la dimensión de las partículas era 2.0 mm (Luque-Garcia y Luque de Castro, 2004).

2.6.1.1.3 Condiciones de operación:

(33)

pueden disminuirse usando evaporación flash o separación por membrana para recuperar el solvente (Mamidipally y Liu, 2004).

2.6.1.1.4 Comparación Soxhlet y CO2 SC

La extracción con Soxhlet es una técnica bien establecida. Entre sus ventajas, por encima de otros nuevos métodos como la extracción ayudada con ultrasonido, la ayudada con microondas y la extracción con fluidos supercríticos está la de tener bastantes aplicaciones industriales, buena reproduci-bilidad y eficacia, y menor manipulación del extracto. Sin embargo, comparada con CO2SC, el método Soxhlet es una técnica anticuada y consumidora de tiempo y de solvente. En la extracción de aceites de rosa silvestre (Rosa canina L), utilizando n-hexano con soxhlet se consumieron 180 minutos para extraer 48.5 g/kg, mientras que con CO2SC a 35 ºC y 250 bar, se consumieron 35 minutos para extraer 57.2 g/kg, cuando se le agrego propano (cosolvente) al CO2SC a 28O ºC y 100 bar se consumieron 35 minutos para obtener 66.8 g/kg (Szentmihalyi et al., 2002).

Algunos solventes usados con el Soxhlet convencional se han cuestionado recientemente debido a su toxicidad (n-hexano). El uso de solventes no tóxicos como el CO2 supercrítico y el agua están en el orden del día.

2.6.1.2 EXTRACCION CON FSC

Un fluido supercrítico es cualquier sustancia a una temperatura y presión por encima de su punto crítico termodinámico. Tiene la propiedad de difundirse a través de los sólidos como un gas, y de disolver los materiales como un líquido. Adicionalmente, puede cambiar rápidamente la densidad con pequeños cambios en la temperatura o presión. Estas propiedades lo hacen conveniente como un sustituto de los solventes orgánicos en los procesos de extracción.

Los fluidos supercríticos (FSC) tienen la capacidad de extraer ciertos compuestos químicos con el uso de determinados solventes específicos bajo la combinación de temperatura y presión (Brunner, 2005; Rozzi y Singh, 2002).

(34)

residuos, sus condiciones críticas son relativamente fáciles de alcanzar y se consigue con diferentes grados de pureza, se puede trabajar a baja temperatura y por tanto, se pueden separar compuestos termolábiles, se puede obtener a partir de procesos de fermentación alcohólica y ayuda a prevenir la degradación térmica de ciertos componentes químicos del alimento cuando son extraídos (Brunner, 2005; Hurtado, 2002; Rosa y Meireles, 2005).

Las ventajas de los fluidos supercríticos son: (Bruner, 2005; Hurtado, 2002; Sánchez et al., 2005; Tonthubthimthong et al., 2001; Zkal et al., 2005).

(35)

3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

Existe una gran incidencia de hongos fitopatógenos como Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum en los cultivos de Albahaca (Ocimum basilicum) tipo exportación, en los invernaderos de la Facultad de Agronomía de la Universidad nacional de Colombia, sede Bogotá.

La enfermedades producidas por estos hongos fitopatógenos han ocasionado pérdidas en la producción hasta de un 60%, debido a una considerable baja de la calidad del producto, la disminución de la productividad del cultivo y llegando incluso la pérdida total de las plantas.

Para evitar el control químico de estos hongos se propone un manejo natural integrado del extracto acuoso de Tomillo (Thymus vulgaris), que es conocido por tener propiedades antifúngicas, pero no ha sido evaluado sobre estos hongos de gran importancia en el cultivo de la Albahaca.

3.2 JUSTIFICACIÓN

El control de patógenos con aceites esenciales y extractos de plantas aromáticas es un campo poco explorado en nuestro país, aunque por muchos años haya habido evidencia del conocimiento de las propiedades de las plantas aromáticas y sus múltiples usos. El empleo de estas plantas y sus componentes han sido de una forma artesanal.

Aprovechando la problemática generada en cultivos de Albahaca (Ocimum basilicum) tipo exportación, por hongos fitopatógenos como Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum en los invernaderos de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá; nos lleva a pensar que esta problemática también afecta a los productores de plantas aromáticas en nuestro país.

(36)

productores y comercializadores, ya que se daría a conocer un método para combatir los agentes causales de las enfermedades de la Albahaca (Ocimum basilicum), y esto a su vez contribuiría al estudio del manejo biológico de las enfermedades fitopatológicas

(37)

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo General

Evaluar la actividad antifúngica del extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) sobre los hongos fitopatógenos Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum causantes de enfermedades en Albahaca (Ocimum basilicum).

5.2 Objetivos Específicos

• Obtener extractos acuosos de Tomillo (Thymus vulgaris).

• Probar las propiedades antifúngicas del extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) sobre los hongos fitopatógenos Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum in vitro aislados de albahaca (Ocimum basilicum).

• Evaluar la actividad antifúngica del extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) sobre plantas de Albahaca (Ocimum basilicum) inoculadas con

Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea y Fusarium oxysporum en pruebas de invernadero.

(38)

5. MATERIALES Y METODOS 5.1 Diseño de la investigación

El proyecto se realizó dentro de las instalaciones de los Laboratorios de Biología del Suelo y en los Invernaderos de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá.

Este procedimiento se realizó con extracto de Menta (Mentha spicata) pero no hubo ninguna inhibición de crecimiento para los hongos, por eso se realizó con tomillo, ya que no todos las plantas tienen los mismos principios activos.

Los extractos acuosos se realizaron con concentraciones de 150, 250 y 500 g/L de extracto Tomillo en agua, el tratamiento térmico se realizó con tiempos de 15 y 30 min de ebullición respectivamente, ya que en los tiempos 0, 45 y 60 min no se observó inhibición de ningún tipo. La tasa de crecimiento se midió los días 2, 5 y 7.

5.1.1 Obtención de Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris)

Se recolectaron plantas de Tomillo (Thymus vulgaris) de 10 semanas de edad

del Invernadero Nº 2 de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, las cuales se cortaron con tijeras de podar, dejando ramas de 2 centímetros sobre el eje principal de la planta. Posteriormente se pesaron y se procesaron en una picadora de cocina marca Oster.

(39)

5.1.2 Prueba in vitro

Las cepas de los hongos fitopatógenos Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y

Sclerotinia sclerotiorum; fueron aisladas anteriormente de plantas de Albahaca (Ocimum basilicum) enfermas en el Laboratorio de Biología del Suelo de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. Las cepas se conservaron en Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ®).

5.1.2.1 Evaluación de la Inhibición del Crecimiento Radial

La evaluación de la actividad del extracto, contra hongos se hizo por medio de la medición del halo del crecimiento del hongo respecto al control negativo. Se preparó Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ®) como indica el fabricante, 39 gramos en 1000 mL de agua destilada estéril, se dispuso a esterilización en autoclave de marca All American a 121 ºC por 15 minutos y luego se dispuso en cajas de Petri estériles 50% de Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ®) y 50% de las diferentes concentraciones del extracto con los diferentes tiempos de ebullición, se dejó solidificar y se llevaron a refrigeración a 4 ºC hasta su posterior utilización (Ramírez 1998).

Para la siembra se usaron rodajas de 3 mm de diámetro de colonias de los hongos fitopatógenos de ocho días de edad que se cortaron con un sacabocados. Para colocar la rodaja con el micelio en contacto con el medio de cultivo en el centro de la caja se utilizaron palillos de madera de 10 centímetros de largo y 2 milímetros de grosor puntiagudos esterilizados con calor seco. Las cajas se sellaron y etiquetaron y se incubaron a 26 ºC.

Para la evaluación de los hongos fitopatógenos se utilizó el procedimiento de crecimiento radial midiendo el diámetro de la colonia a los dos, cinco y siete días después de la inoculación (Martínez 1999).

(40)

Para todas las concentraciones y los tiempos al igual que para los controles se hizo 4 repeticiones para obtener datos representativos estadísticamente.

Se midió el diámetro en milímetros de la zona de crecimiento del hongo en cuatro direcciones a intervalos de dos días tomando como resultado el valor promedio de estas mediciones. Este ensayo se realizó cuatro veces por duplicado determinándose el porcentaje de crecimiento y el porcentaje de inhibición del crecimiento del hongo para el extracto acuoso:

Diámetro del crecimiento del hongo En el extracto X 100

% de crecimiento = ---

Diámetro del control negativo

% de inhibición = 100-% de crecimiento

Los resultados obtenidos se evaluaron considerándose activo los extractos que presentaron un porcentaje de crecimiento menor o igual al 80 y un porcentaje de inhibición mayor o igual al 20 (Márquez et al. 2007).

5.1.3 Prueba de Invernadero

Se sembraron en un banco de propagación en los invernaderos de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá; 200 semillas de plantas de Albahaca (Ocimum basilicum), las semillas se obtuvieron en Semicol Ltda. Estas semillas se dispusieron en bandejas plásticas con turba estéril sin nutrientes, se les proporcionó riego con aspersor cada dos días y al paso de 30 días se realizaron los dos ensayos simultáneos:

(41)

inóculo) en cámara de Neubauer antes de iniciar el proceso para obtener una concentración inicial, este inóculo se mezcló con 500 ml de agua destilada estéril y se llevó a una concentración de 1 x 107 esporas / ml. Para inocular la turba con

Fusarium oxysporum, se tomó 1000 gramos de turba estéril en empaques individuales y flexibles en polietileno con cierre hermético y se incubó durante 7 días a 26ºC, se realizaron 4 repeticiones (Rodríguez 2004).

El inóculo de Sclerotinia sclerotiorum y Botrytis cinerea, se realizó tomando esclerocios de los hongoscon 10 días de edad en medio PDA, se dispusieron 50 esclerocios en dos porciones de 1000 gramos de turba estéril en empaques flexibles en polietileno con cierre hermético y se incubó durante 7 días a 26ºC. Se realizaron 4 repeticiones (Rodríguez 2004).

Se tomó 2000 gramos adicionales de turba estéril para los controles, sin patógenos.

Al cabo de 7 días de la inoculación de la turba, las plantas de Albahaca (Ocimum basilicum) de 30 días de edad se transplantaron a recipientes de poliestireno expandible de 4 onzas.

Se le proporcionó 100 gramos de turba inoculada con los tres hongos fitopatógenos respectivamente a cada recipiente, y la turba estéril se dispuso 4 recipientes para el control positivo y 4 para el negativo.

A las plantas se les dispuso una bolsa de plástico para crear un micro ambiente húmedo por 72 horas. Después de la siembra se regaron con aspersor cada dos días por 15 días. Cuando se evidenció crecimiento micelial sobre la turba, se les proporcionó a cada planta por aspersión 20 mL de las diferentes concentraciones utilizadas en el ensayo in vitro tendrían efecto antifúngico, cada dos días por 15 días más.

(42)

Se midió el porcentaje de la planta afectada. Como referencia se usó una tabla de incidencia y severidad de la enfermedad. Como control se tomaron plantas sin aplicación de los extractos. Se tomó por cada tratamiento 4 repeticiones.

(43)

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 PRUEBA IN VITRO

6.1.2 EVALUACIÓN DE LA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO RADIAL

Muchas plantas han sido aceptadas para su uso antifúngico porque en su

análisis químico y evaluación farmacológica han demostrado que contienen un

principio especial, (Zapata et al., 2003) la búsqueda es muy intensa en casi todo el mundo y se basa en explorar el parentesco sistemático con plantas curativas

ya reconocidas que han servido para hallar otras nuevas; o bien se han

descubierto por casualidad o por validación sistémica de la flora de una región

(Romero et al., 2006).

Las concentraciones a las cuales se produjo la inhibición son altas con respecto

a otros estudios hechos con diferentes tipos de plantas; sin embargo, se debe

tener en cuenta que se está trabajando con extractos crudos que contienen otros

metabolitos o impurezas sin actividad antifúngica.

Dada la extensa variedad de la flora y los numerosos principios activos que en

ella se encuentran, es muy probable que de esta fuente puedan aislarse

moléculas novedosas y eficaces para ser usadas como antimicóticos; dado que

en la literatura revisada no se encontraron reportes de estudios fitoquímicos que

aislaran o implicaran una sustancia química en particular con efectos

antifúngicos, no es posible, por el momento, definir la naturaleza química de los

compuestos bioactivos de esta especie. A partir de tomillo frescose han aislado

Carvacrol (2-hidroxi -p. cimeno) y P- cimenol (Isopropil-tolueno) a las cuales se

les ha encontrado actividad antifúngicas (Espitia, 2004).

En nuestra población existe una amplia tradición en el uso empírico de plantas

con fines medicinales (Marín et al., 2006); es por tanto, muy importante validar a través de la experimentación, la eficacia y seguridad de las múltiples especies

(44)

Los extractos acuosos de tomillo en las concentraciones empleadas tienen

efecto inhibitorio sobre las tres cepas evaluadas. Mediante la prueba de comparar el comportamiento en conjunto de todos los tratamientos se encuentran diferencias significativas entre todos los tratamientos.

Según lo descrito por Vokou et al. (1993) y Daferera et al. (2003), tomillos de diferentes orígenes geográficos mostraron que los componentes mayoritarios son el carvacrol, en la mayoría de las muestras estudiadas, el timol, en un número menor de casos, o una sumatoria de estos dos compuestos fenólicos conformando entre el 50 y 90% del total. Como componentes secundarios están descriptos en estos trabajos, el p-cimeno y al terpineno en todas las muestras analizadas.

La capacidad antifúngica podría ser atribuida a la presencia de los compuestos monoterpénicos fenólicos, principalmente timol y carvacrol. Se ha informado la reactividad de los grupos hidroxilofenólicos, formando enlaces puentes de hidrógenos con sitios activos de ciertas enzimas (Farag et al., 1989). Además estos compuestos atacan la membrana citoplasmática del microorganismo destruyendo la capacidad selectiva y permitiendo el escape de componentes intracelulares (Nychas, 1995) lo que sumado a su capacidad de inactivar enzimas, explicaría la actividad contra el desarrollo fúngico.

Un ejemplo de este comportamiento son los datos obtenidos de la administración del extracto acuoso de tomillo, en estos ensayos, donde se encontró correlación

entre los días de administración y la acción inhibitoria

.

(45)

Porcentaje de Crecim iento según concentración 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

2 5 7

Día

%

Conc. 150 Conc. 250 Conc. 500 Desv. Std.

FIG.1. Porcentaje de Crecimiento según concentración

En la Figura 1 se observa que la concentración de extracto acuoso de 500g/L fuel el que obtuvo menor crecimiento (60%) en los días de evaluación, en los días 5 y 7 se mantuvo el porcentaje de crecimiento de los hongos, esto comparado con la concentración de 150 g/L que obtuvo un crecimiento del 90% en el día 5.

Porcentaje de Crecimiento según Tiempo

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

2 5 7

Día

%

15 min. 30 min. Desv. Std.

FIG.2.Porcentaje de crecimiento según tiempo.

(46)

Porcentaje de Crecimiento según Especie

0 20 40 60 80 100 120

2 5 7

Día

%

Fusarium oxysporum Botrytis cinerea Sclerotinia sclerotiorum Desv. Std.

FIG.3. Porcentaje de Crecimiento según especie.

B. cinerea tuvo un mayor crecimiento en los tres días evaluados, F. oxysporum

en el día 5, tuvo un porcentaje de crecimiento del 52%, mientras que B. cinerea

tuvo uno de 107%, S. sclerotiorum tuvo un porcentaje de 46%. El día 7 se obtuvo una disminución del porcentaje de crecimiento de F. oxysporum (27%) y B. cinerea (81%), mientras S. sclerotiorum tuvo aumento en el porcentaje de crecimiento de 35% (Figura 3)

Porcentaje de inhibición según concentración

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

2 5 7

Día

%

Conc. 150 Conc. 250 Conc. 500 Desv. Std.

(47)

El porcentaje de inhibición de la concentración de 500g/L fue el que obtuvo un mayor valor (48%) en el día 5 y en el día 7 fue 44%, esta concentración fue la que alcanzo un menor porcentaje de crecimiento y un mayor porcentaje de inhibición de los tres hongos (Figura 4)

Por el valor del porcentaje de inhibición de los días 5 y 7 en la concentración 500g/L se presume que la acción antifúngica del extracto permanece durante estos días; ya que su poder de inhibición disminuye en un 2% durante estos dos días, el porcentaje de inhibición del extracto de 250g/L, aunque es menor el comparado con el de la contracción de 500g/L, en el día 5 fue de 41% y aumento en un 3% el día 7. El porcentaje de inhibición de la concentración 150g/L fue la menor, aumento un 4% del día 5 al 7 (Figura 4).

Porcentaje de inhibición según tiem po

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

2 5 7

Día

%

15 min. 30 min. Desv. Std.

FIG.5.Porcentaje de inhibición según tiempo.

(48)

Porcentaje de Inhibición según especie

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

2 5 7

Día

%

Fusarium oxysporum Botrytis cinerea Sclerotinia sclerotiorum Desv. Std.

FIG. 6. Porcentaje de Inhibición según especie.

F. oxysporum tuvo un porcentaje de inhibición el día 5 de 46% y el día 7 la inhibición aumento en un 28%. Mientras que S. sclerotiorum el día 5 obtuvo una inhibición de 53% y fue disminuyendo hasta llegar a 15 %. B. cinerea el día 5 alcanzo un porcentaje de inhibición del 19 y aumento el día 7 a 22% (Figura 6).

Teniendo en cuenta que el porcentaje de inhibición mayor al 20% es positivo para evidenciar la inhibición del crecimiento de los hongos (Márquez et al. 2007), la concentración del extracto acuoso con una concentración de 500g/L y un tratamiento térmico de 30 min, es el que obtiene la propiedad antifúngica capaz de disminuir el crecimiento de los hongos (Figura 6).

(49)

Fusarium oxysporum

Día 7

150g/L 150g/L

Control

250g/L 250g/L

500g/L

500g/L

15 min 30 min

FIG. 7. Crecimiento F. oxysporum en extracto Albahaca día 7

B. cinerea tuvo un comportamiento en el crecimiento similar al de F. oxysporum

en el control; con la adición al medio de cultivo del extracto acuoso de tomillo se observa una inhibición del crecimiento con los tratamientos utilizados (Figura 8).

Botrytis cinerea

Día 7

Control 15 min

150g/L

250g/L

500g/L

150g/L

250g/L

500g/L 30 min

(50)

En la figura 9 se observa que S. sclerotiorum tuvo un menor crecimiento en el medio con el extracto en todas las concentraciones y con los tratamientos térmicos comparados con el control.

Sclerotinia sclerotiorum

Día 7

150g/L 150g/L

Control

250g/L 250g/L

500g/L 500g/L

15 min 30 min

FIG. 9. Crecimiento S. sclerotiorum en extracto Albahaca día 7.

En las figuras anteriores (Figura 7, 8 y 9) se observa que el extracto de tomillo logra inhibir el crecimiento normal de los hongos patógenos, los controles que no están adicionados con el extracto confirma el comportamiento normal en el crecimiento de los hongos patógenos.

6.2 PRUEBA DE INVERNADERO

(51)

ESCALA DE SEVERIDAD

NIVEL PORCENTAJE SÍNTOMAS

0 0 Planta sana

1 0 - 10 Leves

2 10 - 50 Severos

3 50 -75 Muy severos

4 ≥ 75 Planta muerta

TABLA Nº 2. Escala de Severidad (Agrios, 1998)

FIG. 10. Escala de Severidad (Agrios, 1998)

6.2.1 FUNCIÓN CURATIVA

La dosis del extracto se le aplicó a las plantas cuando se observó el crecimiento micelial por encima de la turba. En las figuras 11 y 12 se puede observar que S. slcrerotiorum presenta un mayor porcentaje de incidencia de enfermedad con un valor de 44%, y un porcentaje de severidad de 71.5%, este es uno de los hongos fitopatógenos con alto grado de agresividad en el cultivo de albahaca, se demuestra que tiene la capacidad de causar graves daños a los cultivos y tiene una incidencia alta por encima de los otros hongos fitopatógenos utilizados para este estudio.

% INCIDENCIA Nivel Curativo

32 39 44 14 23 0 10 20 30 40 50 60 70 80 HONGOS FITOPATOGENOS % F. oxysporum Sclerotinia sclerotiorum B. Cinerea C+

(52)

% SEVERIDAD Nivel Curativo

10

71,5

26,9

1

6

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

HONGOS FITOPATOGENOS

%

F. oxysporum

Sclerotinia

sclerotiorum

B. Cinerea

C+

C-FIG. 12. Porcentaje de Severidad de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto de tomillo a nivel Curativo.

6.2.2 FUNCIÓN PREVENTIVA

El extracto acuoso de tomillo con tratamiento térmico se aplicó antes de la inoculación durante 10 días. Al observar las figuras 13 y 14 se puede establecer que S. sclerotiorum, presenta un porcentaje de incidencia y de severidad más alto que los otros hongos (25% de incidencia y 18 % de severidad). Aunque estos porcentajes comparados con los valores del función curativa de extracto sean más bajos S. sclerotiorum sigue siendo la mayor amenaza en el cultivo de albahaca.

(53)

Siendo F. oxysporum uno de lo hongos más agresivos sobre muchos cultivos, fue el que menor porcentaje de incidencia y severidad tuvo con la función curativa y preventiva del extracto (Figuras 13 y 14).

% INCIDENCIA Prevención

16 25 21 5 9 0 10 20 30 40 50 60 70 80 HONGOS FITOPATOGENOS % F. oxysporum Sclerotinia sclerotiorum B. Cinerea C+

C-FIG. 13. Porcentaje de Incidencia de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto de tomillo a nivel Preventivo.

% SEVERIDAD Prevención

6 18 17 1 2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 HONGOS FITOPATOGENOS % F. oxysporum Sclerotinia sclerotiorum B. Cinerea C+

C-FIG.14. Porcentaje de Severidad de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto de tomillo a nivel Preventivo.

El carvacrol y el timol son los monoterpenos que caracterizan a algunas de las especies de la familia Lamiaceae, principalmente en los oréganos (Origanum

(54)

componentes son encontrados presentan una importante variabilidad debido a numerosos parámetros significativos que afectan la composición química de esta planta, principalmente la localización geográfica y las condiciones climáticas y ambientales (Vokou et al., 1993).

La evaluación de extractos vegetales sobre organismos patógenos se realiza usualmente in vitro, esto hace que no sean reconocidas las ventajas que estos tienen sobre los productos químicos y a su vez sea complicado su utilización en campo.

(55)

7. CONCLUSIONES

De los resultados de la presente investigación se puede concluir:

• El extracto de tomillo (Thymus vulgaris) acuoso con tratamiento térmico de 30 min inhibió 42% el día 5 y 44% en el día 7 el crecimiento de los hongos fitopatógenos.

• Se observó un mayor porcentaje de inhibición de crecimiento en el extracto de 500g/L con tratamiento térmico en los hongos patógenos utilizados.

• El extracto de tomillo (Thymus vulgaris) inhibe el crecimiento en mayor

proporción a Fusarium oxysporumin vitro con un porcentaje de inhibición en el día 7 de 74%.

• Se puede observó en la prueba de invernadero que S. slcrerotiorum

presenta un mayor porcentaje de incidencia de enfermedad en la función curativa con un valor de 44%, y un porcentaje de severidad de 71.5%, y en la función preventiva presenta un porcentaje de incidencia y de severidad más alto que los otros hongos, 25% de incidencia y 18 % de severidad.

• Siendo F. oxysporum uno de lo hongos más agresivos sobre muchos cultivos, fue el que menor porcentaje de incidencia y severidad tuvo en la función curativa y preventiva del extracto.

(56)

8. RECOMENDACIONES

• Es necesario llevar el extracto de tomillo (Thymus vulgaris) a un análisis cromatográfico y de espectrometría de masas para conocer la totalidad de sus componentes y su concentración individual con el fin de conocer cual es el componente con mayor proporción que posee la característica antifúngica.

• Determinar el mecanismo de inhibición de las sustancias en los hongos.

Figure

TABLA DE CONTENIDO

TABLA DE

CONTENIDO p.7
TABLA Nº 1 .Contenido (%) de algunos de los principales componentes de

TABLA Nº

1 .Contenido (%) de algunos de los principales componentes de p.17
FIG.1. Porcentaje de Crecimiento según concentración
FIG.1. Porcentaje de Crecimiento según concentración p.45
FIG.2.Porcentaje de crecimiento según tiempo.
FIG.2.Porcentaje de crecimiento según tiempo. p.45
FIG.3. Porcentaje de Crecimiento según especie.
FIG.3. Porcentaje de Crecimiento según especie. p.46
FIG.4. Porcentaje de Inhibición según concentración.
FIG.4. Porcentaje de Inhibición según concentración. p.46
FIG.5.Porcentaje de inhibición según tiempo.
FIG.5.Porcentaje de inhibición según tiempo. p.47
FIG. 6. Porcentaje de Inhibición según especie.
FIG. 6. Porcentaje de Inhibición según especie. p.48
FIG. 7. Crecimiento F. oxysporum  en extracto Albahaca día 7
FIG. 7. Crecimiento F. oxysporum en extracto Albahaca día 7 p.49
FIG. 8. Crecimiento B. cinerea  en extracto Albahaca día 7.
FIG. 8. Crecimiento B. cinerea en extracto Albahaca día 7. p.49
FIG. 9. Crecimiento S. sclerotiorum  en extracto Albahaca día 7.
FIG. 9. Crecimiento S. sclerotiorum en extracto Albahaca día 7. p.50
FIG. 11. Porcentaje de Incidencia de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto
FIG. 11. Porcentaje de Incidencia de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto p.51
FIG. 10. Escala de Severidad (Agrios, 1998)
FIG. 10. Escala de Severidad (Agrios, 1998) p.51
FIG. 12. Porcentaje de Severidad de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto
FIG. 12. Porcentaje de Severidad de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto p.52
FIG. 13. Porcentaje de Incidencia de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto de tomillo a nivel  Preventivo
FIG. 13. Porcentaje de Incidencia de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto de tomillo a nivel Preventivo p.53
FIG. 13. Porcentaje de Incidencia de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto
FIG. 13. Porcentaje de Incidencia de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto p.53

Referencias

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