UNIVERSIDAD AUTONMA METROPOLITANA
Uaematbnpo
UNBAO
IZTAPALAPA
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cas
k , = -
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4OG'A
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CARACTERKACIOW
Y
PURlfMCIBN
BE
AL6UñOS
BACTERlOFA6OS
AISLADOS
DE
SUEROS DE
BOVINO.
REPORTE
DI1
PROYECTO DE SERVICIfl
S O W
REALIZADO POR LOS
ALUMNOS:
' A s a o z :
&&A. p r / r P € S P / d O . pL(A&*
'MANUEL ARTURO DE
LOZANNE
PREKSER
LUIS
MIGUEL FRESNEDO PEREZ
ESTE TRABAJO SE REALIZO EE: E L L?BORPTORIO DE
GENETICA DEL DEPARTANENTO DE E(ICFOBIOLOG1A
DE LA ESCUELA N?CIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS
DEL I . P . N . , BAJO LP DIRECCION DE I9 DRP.
I N D I C E
INTRODUCCION 1
MATERIALES 7
FETODOS 15
RESULTADOS 22
DISCUSION 40
CONCLUSIONES 47
RESUMEb! 49
El estudio de los efectos de bacteridfagos sobre célu-
l a s eucariontes comenzd a partir de 1965, cuando
E.
Mankie-wicz report6 que unos bacteriófagos aislados de carcinomas
-
humanos mostraban efecto citopático en células de riñdn de
-
Cercopithecus aethiops en cultivo ( 4 ) . , En el mismo año, Jo-
nes mostró evidencias del crecimiento de un bacteridfago de
Ct~ePtoCOCCUs cremoris en embriones de pollo y de su persis-
tencia en cultivos celulares ( 3 ) .
Estos descubrimientos sugirieron oue la idea tra2icio-
nal Le aue los bacteridfagos solo pueden infectar y replicaz
se en bacterias no es completamente correcta, despertando
-
así el interés de varios grupos de investigacidn por el fen5
meno.
Merril, en 1971, demostrd la introducción y expresidn
de DNA de un fago en fibroblastos galactosémicos humanos en
cultivo ( 7 ) . En este trabajo, Merril corriqió la galactose
mia de los fibrohlastos transfiriéndoles el operdn de galac-
tosa con un fago
1
transductor.reportado por Geier al año siguiecte ( 9 ) .
En trabajo semejante fué
Más tarde, Doy utilizd los fagos transductoresA y 0 8 0
como vectores en la transferencia de genes de Escherichia
-
a líneas celulares haploides de las plantas Lvcopersi-
c x esculentum y Arabidopsis thuliana (14).
Al fendmeno completo de transferencia, tranccripcibn.
riontes utilizando bacteriófagos como vectores se le denorni-
n6 trarisgenosis (14).
Por la misma época, el grupo de Petricciani reportó
-
que las vacunas virales para poliomielitis, rubeola, saram-
pión y paperas estaban contaminadas con bacteriófagos (16).
Este descubrimiento ocasionó problemas al Departamento
de Biológicos de la Administración de Alimentos y Drogas de
E . U . A . , puesto sue sus regulaciones prohiben materiales ex-
traños en las vacunas y no se conocla si los fagos podían
--
causar daños a los seres humanos, ni como eliminarlos de las
vacunas. Como solución temporal, se modificaron las regulo
ciones y se permitió la presencia de los fagos en las vacu-
nas, mientras se realizaban investigaciones más profundas.
Se conocla la presencia Be fagos como contaminantes en
los sueros bovinos fetales utilizados para enriouecer los
m s
dios de cultivo para células eucariontes (10,ll). y no tardó
en conprobarse ampliamente oue los fagoS encontrados en las
vacunas virales provenían de estos sueros (19). Aparentemeg
te, este problema se solucianaría mediante el desarrollo de
métodos para la eliminación de los fagos sin alterar las pro
piedades nutritivas de los sueros (12,18,33). Sin embargo,
en los años subsiguientes se siguió reportando la presencia
de distintos bacteriófagos en sueros bovinos (13,17,20,21,22
26,311, así como también en vacunas virales (231.
Siguiendo otra llnea de investigación, se hicieron
--
de sueros, sin encontrar evieencia alguna de oue causaran e-
fectos citopáticos, tanto en estuZios in vivo como in vitro
(15,24,27,31). Sin errbargo, es posible citar tres efectos
conocidos de bacteriófagos sobre células de mamíferos, inclg
yendo humanas. El prirr.ero de ellos es el de transgenosis,
descrito anteriormente. El segucdo efecto es indirecto:
ciertas enfermedades humanas, corro la fiebre escarlatina y
-
la difteria, son causadas por bacterias uue al ser infecta-
das por fagos producen una toxina. Una persona podría, por
ejemplo, recibir una vacuna oral de virus de poliomielitis
-
que estuviera contaminada con fagos oue infecten corinebactc
rias y sue las induzcan a producir la toxina de la difteria.
Si la flora del tracto respiratorio tiene corinebacterias
-
sensibles, dicha persona podría contraer difteria (20). Un
tercer efecto, reportado por Leavitt, indica oue ciertos fa-
gos pueden replicarse en cultivos de células de Hamsters(27).
En experimentos similares, Ando demostró la propagación de
-
colifagos de RNA en ratones (32).
Evidencias más concluyentes de oue la contaminación de
vacunas virales con fagos es dañina, podrían ser los estuoios
epidemiológicos, pero desafortunadamente, dichos estudios no
se han realizado, y probablemente no se puedan llevar a cabo.
A pesar de oue millones de personas han recibido vacunas vi-
rales, pocos países han guardado registros medicos oue pudic
ran ser examinados para determinar si l a aplicación de las
-
medades infecciosas o degenerativas (20).
Hasta aquí, oueda claro vue existe una discrepancia Ce
opiniones en torno al problema, y oue es necesario obtener
-
más información sobre las interacciones entre fagos y célu-
las para resolverlo. Por ello, en el Laboratorio de Genéti
ca Microbiana de la E.N.C.B. del I.P.N. se realizó una in'ves
tiqación en la cual se aislaron once fagos distintos de sue-
ros bovinos ( 3 0 ) . Estudios preliminares con estos fagos
-
mostraron sue algunos tienen efectos citopáticos sobre c€lu-
las humanas en cultivo (301. Sin embargo, por falta de una
cantidad adecuada de fagos altaente purificados y con títu-
los elevados, no se continuaron los experimentos.
La necesidad de tener bacteriófagos altamente purifica
dos para efectuar pruebas sobre células en cultivo es eviden
te; se debe asegurar que no haya ningún material extraño que
pueda afectar a las células y cuyo efecto se interprete como
causado por el bacteriófago.
Entre las técnicas más utilizadas actualmente para pu-
rificar bacteriófagos se pueden mencionar la ultracentrifuga
ción en gradientes de densidad, la centrifugación diferen---
cia1 y la cromatografía en columna. Debe señalarse aue pre
via a la purificacibn, la suspensión de fagos debe concen-
trarse. La concentración de un lisado fágico se puede ha-
cer mediante sedimentación por ultracentrifugación, por pre-
cipitación con polietilenglicol, o por otros medios menos u-
Para determinar el efecto de los fagos sobre las célu-
las eucarióticas se reouiere una concentración muy alta de
-
los primeros con objeto de lograr multiplicidades de infec-
ción* elevadas, enpleando volúmenes pegueños de lisado para
inocular las microplacas nue contienen el cultivo celular;
-
dado ei elevaso número de células oue forman ei cultivo y
--
oue éstas no son el huésped normal de los bacteribfagos.
El objetivo del presente trabajo fue establecer una
--
técnica cue permita obtener bacteri6fagos altamente purifics
dos y en concentraciones muy elevadas para Clue posteriormen-
te pueCan ser utilizados en nuevos experimentos oue den más
información sobre las interacciones entre bacteribfagos y cg
h l a s eucariontes. ConsiSeramos oue éste es un problema im
portante, tanto por sus inplicaciones cllnicas como biológi-
cas.
í * ) La Multiplicidad de Infection está ¿asa por la siguiente
relación: X de bacteridfagos
.
MEDIOS DE CULTIVO
1.- Medio rico sólido de Luria (L-sOli601 :
10.0 9. de Triptona o peptona de casefna purificada
5.0 g. de Extracto de Levadura
10.0 g. de NaCl
1000 ml. de agua destilada
El medio se ajusta a pH=7.0 con NaOH. Se agregan
-
15 9. de agar y se esterili.za en autoclave a 15 libras de p i g
sidn por 15 minutos. Se vacSa sobre cajas de petri estériles.
2.- Medio rico llauido de Luria (L-lSouido).- Tiene la nisma
composición aue el medio anterior excepto clue no se agrega
-
agar.
3.- Medio Mínimo 56/2 :
6.8 g. de KH2POg
1.0 g. de (NH4)2S0q
0.5 ml. de solucidn Ce i!gS04'7H20 al 20 %
0.5 ml. de solución de CaCl al 1.0 %
0.25 ml. de solución ie FeSO4'7H20 al 0.1%
1000 ml. de agua destilada.
El medio se ajusta a pH=7.0 con XOH y se esteriliza
en autoclave a 15 libras de presidn por 15 minutos.
4 . - Agar Blando.- 7.5 g. de agar por litro de agua destilada.
Se pone a ebullición, se envasa en cantidades de 3 ml. en t;
bos de hemólisis y se esteriliza en autoclave a 15 libras de
5.-Solución TE (Tris-EDTA) .-Se prepara de t a l manera Que e l
T r i s y e l EDTA queden a una concentración de 0.01M. y s e es-
t e r i l i z a a 15 l i b r a s de presión por 15 minutos.
6.-Medio l í a u i d o Manito1.- Por cada 1 0 0 0 m l . de agua d e s t i l a
da: 10.0 g. de Peptona
1.0 g. de Extracto de Carne
5.0 g. de N a C l
0.018 g. de Rojo-fen01
E l medio se e s t e r i l i z a durante 15 minutos a 15 l i b r a s
de presión. S e d e j a e n f r i a r a 45-12 y s e l e agrega Manit01
a una concentración f i n a l de 1 % . E l Manit01 debe ser este-
r i l i z a d o previamente por f i . l t r a c i 6 n en membranas M i l l i p o r e
-
de 0 . 4 5 , ~ de poro.
7.-Medio Agar T r i p l e Azúcar fierro (T.S.1.) :
3.0 g. de Extract@ de Carne
3.0 g. de Extracto de Levadura
20.0 g. de Peptona
10.0 g. de Lactosa
10.0 g. de Sacarosa
1.0 g . de Dextrosa
0.2 g. de C u l f a t o Ferroso
0.3 g. de T i o s u l f a t o de Sodio
5.0 g. de NaCl
12.0 9. de Agar
1000 ml. de agua d e s t i l a d a
8 . - Medio Agar de Hierro y L i s i n a íL.1.A.) :
5.0 g. de Peptona de G e l a t i n a 3.0
a.
e e E x t r a c t o de Levadura 1 . 0 g. de Dextrosa1 0 . 0 g. de L - l i s i n a
0.5 q. de C i t r a t o de Amonio F é r r i c o
0 . 0 4 g . de T i o s u l f a t o de Codio
0 . 0 2 g. de Púrpura de b r o s o c r e s o l
13.5 q. de Agar
1000 m l . de aqua d e s t i l a d a pH f i n a l = 6 . 7
9 . - Medio de Movilidad
-
I n d o l-
O r n i t i n a (M.1.0.) :3 . 0 g. de E x t r a c t o de Levadura 10.0 q. de Peptona de G e l a t i n a 10.0 q. de Peptona de CaseIna
5.0 q. de L - o r n i t i n a 1.0 q. de Dextrosa 2.0 q. de Agar
0 . 0 2 q. de Púrpura Se bromocresol 1000 m l . de agua d e s t i l a e a
pH f i n a l = 6 . 5
10.- R e a c t i v o de K0vaCs.- Se disuelven en 150 m l . de alcohol
11.- Soluciones de Cloruro *e Cesio íCsCl).- A la muestra
-
m e se va a centrifugar en el gradlente, se le aqrega una
--
cantidal adecuada ie solucidn TE ( según el volwen Gel tubo de centrífuga ) : se pesa esta nezcla y ee acuerio con la € 6 ~
mula inlicada por Sober ( 5 ) :
Wt(% w/w) = 137.48
-
13E.11( 1/p250c)
se calcula la cantidaC ie CsCl vue es necesario agregar para
BACTERIAS
Al Cepas de Escherichia
coli
de la colección del Laboratorio de Genética Iricrobiana Se la E.N.C.B.:W-3350 : Gal-,supresor-,SmS,F-
3000 : B1-,SmS,TIS,Bfr
C-600 : Protótrofa
KL-16 : Bl-,TsS,SmS,Hfr
JC-1176 : F- ,Thr- ,Leu-
,
Sms ,Tm-,TsSJC-1177 : F-,Thr-,LeU-,SmS,Tm-,Tl r,T4 ,T6 ,T7 r r r
Leu = Leuciria
Gal = Galactosa
B1 = Vitamina B1
SmS = Sensibilidas a estreptcaicina
T1 = Resistencia al hacteridfago T1 T q . = Resistencia al bacteridfago T4
TsS = Sensibilidad al bacteriófago T6
T7
Lac = Lactosa
F- = receptora ( herrbra I
Hfr = Alta frecuencia le recombinación. r
r
r
B) Cepas de Escherichia
&
bovinas proporcionadas por la-
Escuela de Eledicina veterinaria y Zootecnia de la U.N.A.M.:
CEPA
B-188 Col V+
B-188 Col V-
JL-9
JL-10
JL- 2 1
JL-22
JL- 2 4
JL-25 JL-26 X-249 K-273 X-442 K-832 K-992
SEROT I PO
078:KñO
078:K80
o - I ~ : K ~ o : H -
078:KBO:H-
( * )
(*I ( * I
( * )
( * )
86:B7
78:80:B
115:B
117:B(b) ( * * )
117:B(a) ( * * )
( * ) E l serotipo de estas cepas no fue proporcionado.
BACTERIOFAGOC
Se emplearon los siguientes hacteriófagos aislados en
el Laboratorio de Genetica Yicrobiana de la E.N.C.B. a par-
tir de sueros:
FAG0 0 1
0
2
0
3
0
4
0 5 0 6 0 7 0 8 0 90
10O R I G E N
Tipo de Suero
( * I
S.F.T.
Suero Ce Ternera
Suero Le Ternera
Sufro de Ternera
Suero de Ternera
Suero le Ternera
Suero de Ternera
S.F.T.
S.F.T.
S.F.T.
Marca
Gibco
D i f C O
Difco Difco Difco Difco Difco Gilico Gibco Gibco
0 11. Suero de Carnero Microbiological
Asociates
A) CONSERVACION DE LAS CEPAS.- Todas las cepas se conserva-
ron en tubos ?e tapón de rosca con medio rico Luria inclina-
do, los cuales eran sembrados e incubasos a 37OC durante 18
horas. Una vez 6esarrollaSo el cultivo, los tuhos se mantg
vieron en refrigeración. Tosas las cepas se resembraron cg
da 3 meses.
B) PRUEBAS BIOQUIM1CAS.- Para corroborar la identidar de
-
las cepas donadas por la E.M.V.Z. de la U.N.A.M., se sembró
cada una de ellas en los medios P.I.O., L.I.A., T.S.I. y Ma-
nitoi por estría y picadura, a fin de observar si su creci-
miento y su metabolismo corresponden al del género Escheri-
-
chia según la clasificación de Ewing y Edwarls ( 8 ) .C) PREPPRACIOK DE CULTIVOS DE BACTERIAS EN EASE LOGARITMICA
DE CRECIMIENTO.:
-Se hace un cultivo de toda la noche de la cepa indi
cada inoculando una asala de la cepa en 8 ml. de medio L - l l -
uIiido e incubando a 37'C sin agitación durante 18 horas apr'
xinadamente.
-Se ponen en un matraz nefelométrico estéril 10 rrl.
de medio L-llouido y 0.2 ml. del cultivo anterior. Se incu-
ba en un baño con agita.ción a 37OC hasta obtener una lectura
de 8 0 unidades Klett ( 1
-
5 x 10 cels/ml) en el fotocolorl-metro Klett-Summerson con fi.ltro rojo.
9
D) DETERMINACION DE LA SENSIBILIDPD BACTERIANA A DACTERIOFA-
el sistema fago-bacteria oue se adecúa para la propagacidn y
titulacidn del bacteridfago y para hacer una determinacidn
-
preliminar de la amplitud de huésped de los fagos.
-
Se hacen cultivos de todas las cepas bacterianas-
sue se van a probar contra los fagos.-
Se funden los tubos de agar blando y se mantienen en un baño a 45'C. A estos tUbos se adicionan 0.2 ml. delcultivo bacteriano anterior y después de una ligera agita-
ción, se vacía el contenido de los tubos sobre cajas de pe-
tri con medio ~-sdiido, distribuyendo el agar en forma homo-
génea.
-
Se deja solidificar el agar.-
Con unos capilares estériles, se toman muestras de los lisados "stock" de cada fago y se colocan pesueñas gotasde cada uno de ellos sobre las cajas con cada una de las ce-
pas bacterianas.
-
Después de 15-20 minutos de reposo, se incuban las cajas a 37'C durante 24 horas.-
Se observan las cajas y se determina la sensibili-da& de las cena- a los fagos por la presencia de zonas de 1L
sis sohre la capa de bacterias.
E) TITULACION DE LOS BACTER1OFAGOC.- Para conocer el conte-
nido le partículas fágicas en una muestra dada, se determina
su título empleando l a técnica de la doble capa de agar de &
dams (2), y usando diluciones decimales crecientes de la mues
-Se hacen las diluciones adecuaeas ee la suestra oue
contiene a los fagos en el nedio 56/2.
-A cala tuho de agar blando fundido y mantenido a
45OC, se adicionan 0 . 2 m.1. del cultivo bacteriano y 0.1 ml.
de ca6a una de las diluciones de los fagos. Se agita mo¿era
damente.
-Se vacía el contenieo de los tuh-s sobre las cajas
de petri con medio ~-sdliZo y se ¿istribuye el agar en forma
homogénea.
-Se incuba a 37'C durante 2 4 horas.
- S e cuenta el número de placas lfticas y se calcula
el título 6e fegcs.
-Todas las diluciones se siembran por luplicado.
F) IDENTIFICACION DE BPCTERIOF?GOS POR WORFOLOC-IA DE PL?CA.-
Después de leterxinar el título de un bacteridfago
-
en un medio,es conveniente corroborar su identidad observar-
io la morfología de aouellas placas líticas m e estén separa
das unas de otras. Se analizan las siguientes caracterist'
cas:
-Tamaño
-Borde y apariencia de la placa lítica.
-Presencia ?e una zona central Ce lisjs y ae un halo
de degralacidn del polisacdriro cspsrlar ( halo de
hidrdlisis )
.
-
líticas de un bacteridfago se observan placas con norfolo--
gías diferentes, significa Rue la suspensidn del fago está
-
contaminada con otro fago. Para aislar al bacteridfago de-
seado, se toma una placa de las cajas de medio 5dlido en dog
Le se haya obtenido una gran separacidn de placas y se colo-
ca en un tubo estéril con 0.1 ml. de medio L-lfouido. Se
-
homogeniza cuidadosamente y se pasa a un matraz oue contiene
10 ml. de cultivo bacteriano.
-
La mezcla se incuba a 37'C en agitacidn durante 4 horas y al cabo de este tiempo, se centrifuga el cultivo a-
5000 r.p.m. durante 15 minutos a 4OC y se colecta el sobre-
dante al que se aíiaden unas gotas de cloroformo.
-
Se realiza la titulacidn de los bacteridfagos che-cando la pureza del lisado.
H) PROPAGACION DE BACTERIOFAG0S.- Para propagar a l o s bacte
riófagos se hace un cultivo bacteriano de la cepa indicadora
de 1 x lolo cels/ml. (lectura de 100 unidades Klett).
-El cultivo se diluye 10 veces con medio L-líouido.
-Se inocula el bacteridfago a una multiplicidad de
-
infeccidn adecuada y se incuba a 37OC en un baíio con agita-
cion hasta obtener el aclaramiento del medio.
-Se agrega 0.1 ml. de cloroformo por cada 10 ml. de
lisado agitando vigorosamente.
-Se vacía a un tubo de centrífuga estéril y se cen--
-El sobrenadante se pasa a un tubo de tapón ¿e rosca
estéril y se agrega cloroforno en la misma proporción ante--
rior.
-Se titula el lisadc.
I) CONCENTRACION DE LOS BACTERIOFAG0S.- Previamente a la u& tracentrifugación en gradiente de densidad, es necesario cog
centrar los lisados fágicos a fin de aumentar su tftulo y e-
liminar algunos desechos celulares. Para este fin se empleó
la técnica de sedieentación de bacteriófagos utilizando pol&
etilen-glicol de peso molecular 6000 í PEG-6000 ) propuesta
por Yamamoto ( 6 ) :
-Se agrega al lisado fágico DNASa y RNASa pancreáti-
cas en 1 g/ml. cada una y se deja i n c m a r por 1 hora.
-Se agrega NaCl suficiente para alcanzar una concen-
tración de 0 . 5 M.
-Se centrifuga a 5000 r.p.r. durante 15 minutos a 4OC.
-Se agrega la cantidad adecuada de polietilenglicol
( PEG-6000 ) (W/V) y se disuelve por agitación vigorosa.
-Se deja reposar durante 1 hora a 4OC.
-Se vacía en un tubo de centrffuga estéril y se cen-
trifuga a 8 0 0 0 r.p.m. durante 20 minutos a 4°C.
-Se colecta el sobrenadante y se titula empleando las
diluciones adecuadas.
-Se resuspende la pastilla con medio TE y se titula
J ) PURIFICACION DE LOS BACTER1OFPGOS.- Una vez obtenico el
concentrado semipuro de cada bacteriófago, se procedió a pu-
rificarlo mediante una ultracentrifugación en gradiente de
-
densidad de CsC1.
-Primero se eligió la densida2 d? la solución de CsCl
para los fagos de acuerdo a las densitades sugeririas por RO-
mo ( 3 0 ) .
-Se hicieron las solucicnes homogéneas con los concen-
trados fdgicos y CsCl en medio TE.
-En tubos de nitrato C:e celulosa Be capacidad de 13.5
ml. se colocaron las soluciones hcmogéneas fago-CsC1 y se sg
llaron con una capa de nujol..
-se cenrrifugaron a 40,000 r.p.m~. durante 20 horas a
-
4OC en una ultracentrlfuga Beckman con un rotor 50-Ti.
-Después se colectaron los graeientes estahiecidos uti
lizando un fraccionador Gilson integratc a un espectrofotómg
trc Beckman, el cual di6 las gráficas de ahsorbancia a 260
-
nanómetros.
-Se midi6 el ín¿ice de refracción de cada fraccibn pa-
r a seterminar su densisad.
-Se titularon cada una de las fracciones de los Sra--
sientes.
-Se reunieron en un ttibo todas las fracciones CUE re--
presentaron el pico de purificacidn y se eializd contra una
*-
I-.-
R E S W L T b D O S
CARACTERIZACION BIO@UIVICA DE LAS CEPPS BACTERIANAS
A las cepas bacterianas donadas por la Escuela de Me+
cina Veterinaria y Zootecnia de la U.N.A.M. se les hicieron
varias pruebas bioauímicas para corroborar su identidad.
Los resultados, aue aparecen en la Tabla I
,
indican @ue to-das las cepas pertenecen a la familia Enterobactereacea, gé-
nero Escherichia, segdn l a clasificación de Ewing y Edwards
( 8 ) .
SENSIBILIDAD DE LAS CEPAS A LOS BACTERIOFAGOS
Se determinó la mplitud de huésped de cada bacteridfg
go, probando la susceptibilidad de todas las cepas bacteria-
nas a la infeccidn por los once bacteriófagos en estudio,
-
por meaio de la técnica de prueba de gota descrita en Méto-
dos.
Los resultados de este experimento aparecen en la Ta-
ida II. Como se puede observar, los bacteridfaqos tienen
-
una amr’litud de huésped distinta y caracterfstica de cada u-
PO, excepto los faqos 0 5 , 0 6 y 0 7 oue presentaron el mis-
no patrdn. Las cepas bovinas son resistentes a los fagos
-
0
3, 0 4 , 0 8 , 0 10 y 0 11. Las cepas de colección del la-imrSt@rio. en cambio, presentan susceptibilidad a la mayoría
de IC.? fagos, excepto al 0 1 y al 0 10. La cepa de colec-
ciOr :-3350 result6 ser sensible a todos los fagos con excep
ciór Cel 0 1, y por ello se eligió como cepa indicadora de
-
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BACTERIOFAGO
CEPA 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1
JL- 9
JL-lo + + - - - + -
-
JL- 2 1
JL- 2 2 - + - - + + + - - -
-
JL-24 + - - -
-
3L-25
JL- 2 6 + + - - -
-
X-249 + + - - -
-
K-273 + - - -
-
K-442
-
K-832 - + - - -
-
K-992 + + - - -
-
+
-- +
_
-
-
-
_
-
-
+
-- +
-
-
_
_
-
_
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B 168 C o l
v+
- - - - -
-
-
-
+
-
-
B 188 Col
v-
-
-
-
- -
-
-
-
i --
JC-1176
-
+
+
+
+
+
+
-
+
-
+
JC- 117 7
-
+
+
+
+
+
+
-
+
-
-
XL-16
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
C-600
-
+
+
+
+
+
+
-
+
-
+
3000
-
+
-
+
+
+
+
-
+
-
-
W-3350
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
( i ) = Presencia de lisis
(-1 = Ausencia de lisis
DETERLINACION DE LA NOPFOLOGIA DE PLACA
como conplemento a l experimento a n t e r i o r , se analiza-- ron l a s c a r a c t e r f s t i c a s de l a s placas l í t i c a s de cada fago
-
de acuerdo a l a t e c n i c a d e s c r i t a anteriormente. La d e s c r i p
ción morfoldgica de l o s d i f e r e n t e s fagos se presenta a c o n t i
nuacidn:
FAG0 MORFOLOGIA
0 1 Diámetro tot21 , 2
mm.
Ha1.o Be l i s i s 1
mm.
Halo de h i d r d l i s i s 1.5 Ipm.
Transparente y borde continuo.
0 2 Dián.etr-o 1-4 nm.
Turbia y borde continuo.
0 3 Diár;etro 1 Ipm.
Transparente y borde continuo.
0 4 Diámetro 1-2 mm.
Transparente y borde continuo.
0 5 Diámetro t o t a l 2-5 m.
Halo de l i s i s 1-2.5 mlr.
Halo c'e h i d r á l i s i s 1-2.5 nm.
Transparente y borde concinuo.
DiáiPetrc t o t a l 2-6 mm.
Halo c'e l i s i s 1-3 mm.
Íralo de h i d r d l i s i s 1-3 nm.
FAG0
0 7
0 8
0 9
NORFOLOGIA
üiám.etrc total 3-4 vi?.
IIalo de lisis 0.5 m..
H a l o de hidrólisis 2.5-3.5 mm.
Transparente y borde continuo.
Diámetro 1 mm.
Translúcida y borde discontinuo.
üiámet,ro total 4-7 m.
Halo d e lisis 2-5 m.
Halo de hidrólisis 2 mm.
Transparente y borde continuo.
Diámetro 0.5 rm.
Translúcida y b0rl.e liscontinuo.
D iárn.etro 2-3 m.
CONCENTRACION DE LOS BACTERIOFAGOS
Con objeto de tener los bacteriófagos obtenidos en un
voldmen peoueño necesario para poder purificarlos por ultra-
centrifugacidn en gradiente de densidad, se procedid a con-
centrarlos m.ediante su precipitacidn con polietilenglicol-
6000 según la técnica reportada por Yarramoto (6).
Tomando en cuenta los resultados de las pruebas bioló-
gicas preliminares de Romo (30), y debido a linitaciones de
material, se eligieron los fagos 0 4 , 0 6 , 0 7 y 0 9 para e- fectuar las pruebas de concentracidn y purificacidn.
Para determinar la concentracidn de polietilenglicol
-
6000 aaecuada para cada bacteriófago, se realizaron pruebas
con volúmenes de 10 ml. de lisado fágico y una concentracidn
inicial de 10% de polietilenglicol-6000. Se calculd el poy
centaje de recuperacidn de los fagos en ca<a prueba titulan-
do tanto los fagos (Tue se precipitan con el PEG-6000 cono
--
los que quedan en suspensión, y comparando con el título in'
cia1 del lisado. Cuando e.1 porcentaje de recuperacidn re-
sultaba menor al 9 0 %, se repetía la prueba con una concen-
tración menor hasta obtener ur porcentaje de recuperación ma
yor al 90%.
Los resultados de estos experimentos se presentan en la
Tabla 111. Como puede observarse, l a concentración de PEG-
6000 necesaria para ohtener una recuperacidn de bacteribfagos
PURIFICACION DE LOS BACTERIOFAGOS
Una vez concentrados los fagos se procedió a purificar
los por ultracentrifugacidn en gralientes de densidad de Cs-
C1. Las densidades de las soluciones Se CsCl para cada
fa
go aparecen en la tabla IV y se eligieron de acuerdo a l a s
-
densidades de flotación reportaeas por Romo 1301.
FAG0 % DE CsCl (w/w) DENSIDAD DE LA SOLUCION
DE CsCl I g/ml )
0
4
540 6 52
0 7 56
0 9 46
1.6625
1.6241
1.7029
1.5185
TABLA IV
.-
DENSIDAD DE LAS SOLUCIONES DE CsClUTILIZADAS PPIRA CADP BACTERIOFAGO.
La purificación se hizo de acuerdo a la técnica descri
ta en la sección de Ivétodos y los resultados obtenidos, tits
lo del bacteriófago
,
absorbancia a 260 nm. e indice de re-fraccidn de cada una de las fracciones se presentan en las
-
gráficas X 1 al # 8 . Como se puede ver en las curvas de Sg
dice de refracción í Gráficas # 2, 4, 6 y 8 ) , se formaron
-
gradientes de densidad contínuos para los cuatro fagos. Las
curvas ee ahsorbancia I Gráficas i:1. 3, 5 y 7 I y título
-
se situaron los faqos. Conociendo el índice de refraccidn
de dichas fracciones, se puede calcular la densidad de flota
ción de cada fago, de acuerdo a l a fórmula indicada por So--
ber ( 5 ) :
y,,.,
= (10.8601) ( 1 . R . )-
13.4974 (1.R.) = Indice de Refraccibn.La Tabla V muestra las densidades de flotacidn obteni-
das para los cuatro bacteribfagos y las compara con las den-
sidades reportadas por Romo ( 3 0 ) . Las diferencias oue se
-
pueden ver entre las densidades se Ciscutirán mas adelante.
FA GO DENSIDAD REPORTADA DENSIDAD OBTENIDA
( q/rl ) í q/ml )
0 4 1.6688 1.6579
0 6 1.5981 1.6242
0 7 1.6992 1.7067
0 9 1.5113 1.5721
O
O
O
5
O .5
Q
a
O
v)
Q
a:
O.
O.
I
2 3 4 5 6 7 8
1
FPACCION ?:o.
u o ,.1.400
E
\ 1 x 1 0 8 .
8
ft:
o'
v1
w
0
',
.-1.396-1.305
-1.394
-1.393
..1.392
..1.391
z \
FFPCCION NO
GRAFICA # 2
.-
INDICE DE REFRACCION (----I Y TITClLO (- )DE LAS FFFCCIONES DEL GRADIENTE DE C s C l
0.0s
0.06
0 . 0 7
0.06
5
0.055
0.04 e:O
v)
< 0 . 0 3
m
0 . 0 0
I
1 2 3 4 5 6 7 E 9
FRA.CC1ON NO.
GRAFICA # 3
.-
S R E A N C I A Ii 260 nr. DE LPS FPPCCIO?iES DELGRAFICP P 4
.-
I N D I C E DE REFPACCIOEI ( e - - ) Y T I T U L O (-)DE L A S FPACCIONES DEL GRADIENTE DE C s C l D E L FPG0'0 F.
0.2
0.15
rx
v
z
H 3.1
3
z
40.05
0.ool
1 2 3 0 -‘ 6 7 E 9
FPACCION NO.
GPAFICA It 5
.-
ABSORBANCI? ?. 2 6 0 nw. DE LPS FRACCIONES D E L8..
1x10
.i
E
\
Ol
O
2
;
5 x 1 0 ~ -z O
5x107
FPACCION NO.
.
.,1.408
'\
'..
.
--.
\
,
',
M
'.
\-.1.401
'.1.399
GRAFICA # 6
.-
INDICE DE EFFraCCION (----I Y TITLTLO (c-)DE LAS FPPCCIONES DEL GRPDIENTE DE C s C l
1 . 0 -
0.5-
0 . 4 . -
0.3'-
z
C Iz
Fa
y1
a
*
0.2- alFP?CCI:OEI NO.
5 x 1 0
1 x 1 0
3
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\
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5 x 1 0 ’2
w
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O z
1 x 1 0 1
5x10’ ..eo0 .395
z
H
F2
?
z
o m n m.390
0
*Ju
3E5
5 10 15 20
FRACCION N O .
GRAFICn # 8
.-
INDICE DE F E F F A C C I O N ( e - - + Y TITULO (-)DE U S FRACCIONES DEL GFADIEIITE DE CsCl
Para la caracterización de cada uno de los bacteriófa-
gos, se tomó en cuenta s u arnnlitul 6.e huésped, su morfología
¿e placa, su respuesta a polietilenglicol-6000 durante su
-
concentración y su cosportamiento en un gradiente isopícnico
de CsC1.
La sensibilidad le las cepas bacterianas a los fagos
está &da por la presencia de receptores específicos en la
-
superficie le la bacteria y por la presencia de los sisterras
enzimáticos
Le
restri.cción y rodjficación específicos, en lamisma,oue le permiten reconocer a u. DNA como prcpio o extra
no.
Esta sensibilical determina la aEplitu6 de huésped decada bacteriófago.
Los resultaeos ohtenidos en los experipentos de ampli-
tu6 de huésped revelarcn un patrón específico para caza fago
a excepción de los fagos 0 5,
0
6 y5
1 . Es interesanteob
servar cue las cepas Se ori.qen bovino son resistentes a la-
nayoría Ce los fagos, y las cepas de colección son sensibles
a casi todos ellos. Esto puede deberse a la ausencia de
re
ceptores específicos en las cepas hovinas, c hien, a oue son
de tipo silvestre y por ello pudieran poseer sistemas de
res
tricción aue las protegen contra infecciones fágicas; auncue
no hay que olvidar aue los fagos fueron aislados de sueros
-
de bovinos y cue se considera uue los fagos cue poseen estos
sueros pueden provenir de cepas bovinas o de cepas humanas.
La caracterjzación de los fagos por su morfología de
-
metro, apariencia, borde, tamaño y presencia de un halo de
-
h i d r b l i s i s . E l tamaño de l a s placas l í t i c a s fué muy d i v e r -
so; mientras aue algunas eran menores a 1 rm., o t r a s l l e g a -
ron a medir más de 5 mn. ( pág. 26 ) . Estas variantes se
podrían e x p l i c a r en bese a los siguientes hechos:
nano de l a p a r t f c u l a v i r a l puede i n f l u i r sobre e l tamaño de
l a p l a c a y desee 1932 s e sabe m e hay una r e l a c i ó n inversa
-
e n t r e e l tamaño de l a p a r t í c u l a y e l de l a p l a c a (1). Esto
se puede deber a nue una p a r t i c u l a peoueña d i f u n i e más rápi- a ) E l
ta
damente que una grande; b) E l tanaño s e l a s placas puede
-
s e r l i m i t a d o por mJchos f a c t o r e s ade.más de l a difusibn, cono
son: e l tamaño de estallan’iento, e l periodo l a t e n t e y l a
-
v e l o c i d a d de ?.dsorci6n, f a c t o r e s cue no s e determinaron en
-
e s t e t r a b a j o y por l o t a n t o no se puede hacer ninguna conclg
si6n a l respecto.
Dehido a l a cantidad de pruebas oue e r a necesario ha--
c e r con cada f a g o y a l a U m i t a c i ó n de materiales, se opt6
por usar para todos l o s experimentos p o s t e r i o r e s a l o s fagos
5 4,
0
6,0
7 y0
9, l o s cuales fueron seleccionados tomando en cuenta l o s resultados de l a s pruebas b i o l 6 g i c a s preliminar e s reportadas por Romo ( 3 0 ) . Segdn é s t o s , e l 0 4 no causa e f e c t o alguno sobre l a s c é l u l a s en c u l t i v o ; e l
0
6 a l t e r 6-
l o s c u l t i v o s c e l u l a r e s a l 7’ dLa después de l a infección:-
e l
0
7 l o s a l t e r 6 a l 3 O d í a ; y e l 0 9 a l 5 O d í a . Además-
e s t e ú l t i m o f a g o tuvo un aparente aumento d e l t í t u l o .
lenglicol-6000, fué necesario buscar las condiciones bajo
-
las cuales el porcentaje de recuperación fuera mayor al 9 0 % .
Inicialmente se utilizó la concentración de 10% de PEG-6000
sugerida por Yamamoto ( 6 ) . En los casos en que el porcenta je de recuperación no fue satisfactorio, se utilizaron con--
centraciones menores, debido a m e , según lo reportado por
-
Yamamoto, a concentraciones mayores del 10% hay un marcado
-
decremento en el porcentaje de recuperación.
Con referencia a la purificacidn de los fagos en gra-
dientes de CsC1, el
0
4 presentó tres picos de absorcidn a-
260 nm. ( Gráfica X 1 ) . Sin enbargo, el título de las-
-
fracciones ( Gráfica # 2 I revel6 m e la gran mayorla de los
fagos se encontraban en la Gltima fraccibn. Los picos de
-
absorbancia aue se observan en las fraciones
t
2 yt?
3 pue- den debersea
la presencia de ribosomas bacterianos.Para el 0 6 ( Gráficas I: 3 y Ii 4 ),encontramos en la
-
última fracción un pico de absorbancia muy narcado, aue co-
rresponde a la fracci6n con mayor título de fagos.
El
0
7 ( Gráficas # 5 y # 6 ) , presentó un comporta-- niento semejante al del 0 6, con sus rráximos de concentra-- ci6n y absorbancia en la pendltima fracción.En el caso del 0 9 ( Gráficas # 7 y It 8 ) , los picos
-
de absorbancia y título correspondieron a la fracción # 15
-
del gradiente.
Comparando las gráficas de absorbancia de los cuatro
-
una banda intermedia en el gradiente, mientras que los otros
tres se situaron en la zona de menor densidad. Por ello s s
gerimos aue para nuevas centrifugaciones de los fagos
0
4 ,-
0
6 y0
7 se utilicen densi.dades ligeramente menores para 10grar Que las bandas se sitúen ep zonas intermedias.
Como se puede ver en la Tabla V. las densidades de flg
tación encontradas difieren de las reportadas por Romo. Es
posible que esta diferencia se deba a que Romo utilizó gra-
dientes discontfnuos sin llegar a equilibrio, mientras que
-
en este estudio se usaron soluciones homogéneas de CsCl y se
llevaron a eouilibrio isopícnico. Consideramos oue esta
úi
tima técnica permite obtener datos mas confiables.
Es importante recordar que la finalidad del presente
-
trabajo fué desarrollar una técnica adecuada que permitiera
obtener bacteriófagos altamente purificados y en concentra--
ciones muy elevadas para oue posteriormente puedan ser utili
zados en nuevos experimentos que den más información sobre
-
las interacciones entre bacteriófagos y células eucariontes.
A continuación se sugieren algunas ideas aue podrían
-
tomarse en cuenta para abordar los estudios mencionados.
En primer lugar, es necesario hacer una caracteriza--
ción de los fagos, oue incluya la determinación del tipo de
ácido nucléico en cada fago, y el análisis de su morfología
por microscopía electrbnica. Los datos que de aquf se ob-
tengan pueden servir para clasificar a los fagos y para los
.
En segundo lugar, sería conveniente corroborar las prug
bas biológicas preliminares efectuazas por Romo, utilizando
más líneas celulares y varias multiplicidades de infección
-
para cada fago.
En los casos en Cue se observe un efecto citopático,
-
se eeberá determinar si éste es causado por la sola presen--
cia de las partículas fágicas, o bien, si se debe a un proce
so infeccioso. Esto se puede hacer infectando las células
con fagos inactivados por radiación ultravioleta, lo cual h a
ría desaparecer el efecto citopático en el caso Be oue éste
fuera causado por infección del fago. En cambio, si persig
te el efecto, se podria pensar nue es debido a la sola pre-
sencia fe1 fago.
Para obtener información sobre los mecanismos involu--
crados en cualouiera de las dos posibilidades anteriormente
mencionadas, sería recomendable xarca-r con isótopos ra2ioac-
tivos las proteinas de la cápside y el ático nucléico del fa
gc y sesuir el comportamiento cinético de ambos trazadores
-
en las células.
Los trabcjos de Nerril sugieren la posible interacción
del aaterial genético eel fago con el genoma de la célula(7).
cosa nue podría comprobarse utilizando técnicas de hibrida-
ciEn (7.283.
Es irportante conocer Cetalladamente l a s interacciones
bzctoriófago-célula eucarionte, tanto por sus iqi.icaciones
En Mgxico, no se conoce el grado de contaminación con
bacteridfagos de las vacunas de aplicacidn popular y no hay
ningún control sobre esto. Por ello es conveniente exten-
der esta investigacidn enfocándose a estiidiar la manera de
eliminar los fauos contaminantes de las vacunas y aderr&,-
determinar si las vacunas aplicadas hasta ahora tienen re-
lacidn con la aparicidn de enfermedales degenerativas o in-
1.- El empleo de un gran número de cepas indicadoras ayuda a
establecer la identidad de los fagos, al igual a d l a mor
fología de placa, ya oue ésta es una característica espe-
cSfica de cada uno.
2.- La concentracibn de polietilenglicol-6000 reauerida para
lograr el máximo porcentaje de reciperación en la precip'
tacibn de los fagos es particular para cada uno de ellos.
3 . - La técnica de precipitación con polietilenqlicol-6000 es sencilla, econbrica y, al parecer, no afecta la viabili-
dad de los bacteribfagos.
4 . - Mediante la ultracentrifuqacibn en gradientes contínuos
de CsCl se purificaron los faqos y además se determinaron
sus densidades de flotación y sus patrones de sedimenta--
ción, los cuales son datos importantes para la caracteri-
Se ectablecib la identidad de once bacteriófagos ais15
dos de distintos sueros bovinos comerciales, determinando su
amplitud de huésped y su morfología de placa.
Cuatro de estos bacteribfagos fueron precipitados con
polietilenglicol-6000 para concentrarbs en volúmenes peaus
fios y se determinó s u patrón de sedimentacidn en gradientes
continuos de CsCl, a s í CODO su densidad de flotacibn. Es- ta técnica también permitió purificarlos y así tenerlos di2
ponibles para probar sus posibles efectos sobre células eu-
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