Estudio químico comparativo del extracto apolar de las hojas de la especie Elaeis oleífera (H.B.K) Cortés colectada en dos diferentes hábitats de Colombia y Perú.
Alejandra Franco Rojas
Pontificia Universidad Javeriana
Facultad de Ciencias
Carrera de Biología
Estudio químico comparativo del extracto apolar de las hojas de la especie Elaeis oleífera (H.B.K) Cortés colectada en dos diferentes hábitats de Colombia y Perú.
Alejandra Franco Rojas
Jorge Robles Camargo
Profesor Asociado Depto. De Química Director
Ricardo Vera Bravo
Nota de advertencia
Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica
y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ella
AGRADECIMIENTO
Agradezco de todo corazón a todas aquellas personas que me brindaron su apoyo y compañía
en la realización de este trabajo de grado, en especial a mi hija MARIA JOSE, por ser el
motor de mi vida, a mi padre por el apoyo incondicional que me ha brindado desde que inicie
la carrera de biología. Agradezco también a mi director de tesis JORGE ROBLES por la
RESUMEN
Los aceites esenciales y los extractos vegetales son mezclas complejas de Metabolitos
secundarios que cubren un amplio espectro de efectos farmacológicos mostrando diversas
propiedades biológicas. El propósito de este trabajo es la identificación de los componentes
químicos de los extractos apolares de E. oleifera, y los compuestos encontrados se compararon entre las cuatro muestras de palmas estudiadas (P1, P2, P19 Y P129). Se
procesaron los foliolos de la hoja 17, se mezclaron por siete días en etanol y se extrajeron las
fracciones totales y apolares. La identificación química de las fracciones apolares se realizó
mediante cromatografía de capa delgada, cromatografía bidimensional y cromatografía de
gases. El análisis de los compuestos químicos mostró la presencia de similitudes entre las
cuatro palmas. Cabe destacar la presencia de los ácidos grasos omega 3 y 6, Vitamina E,
ácidos grasos de membrana. Se concluyó que hay diferencia de compuestos de la palma 129
con respecto a las palmas 1, 2 y 19.
INTRODUCCIÓN
Elaeis es un género relativamente reducido de la familia Arecaceae, existiendo solo dos especies hasta ahora registradas: Elaeis oleífera y Elaeis guineensis con sus respectivas variedades. La palma africana (E. guineensis) es la más comercial y se siembra en grandes extensiones, en el mundo hay aproximadamente 13, 5 millones de hectáreas en producción, el
país con mayor área sembrada es Malasia con 9,09 millones de hectáreas, mientras Colombia,
el país de mayor área sembrada en América, tiene una producción de 267.000 hectáreas en
producción (Fedepalma 2012). Esta especie es fuente de aceite de gran importancia
económica convirtiéndola en el cultivo de mayor crecimiento en las regiones tropicales del
mundo. E. oleífera es de origen Americano de ahí su nombre, se encuentra en países centroamericanos y suramericanos incluido Colombia. Esta especie no explota
comercialmente pese a que produce un aceite de excelente calidad y rico en fitonutrientes,
cuyas propiedades químicas son ideales para la industria cosmética, nutracéutica y
farmacéutica; también, es de gran importancia genética, por la generación de híbridos
interespecíficos con la palma africana, los cuales han mostrado ser una alternativa agronómica
para reducir el impacto de las enfermedades letales de común ocurrencia en los cultivos
Descripción taxonómica del género
Se conocen dos especies, Elaeis guineensis (especie Africana) y Elaeis oleífera (especie Americana). Son palmeras con un tallo (estipe) grueso, largas hojas pinnadas y en general
arqueadas, peciolos fuertemente armados, y foliolos basales espinosos. Las inflorescencias
masculinas y femeninas están en una misma planta (Dioicas). Los frutos tienen mesocarpio
muy aceitoso y endocarpio grueso, lo cual ha situado a la especie E. guineensis entre las palmas más cultivadas y con mayor importancia del mundo (Del Cañizo 2011). En cuanto a la
especie E. oleífera, su importancia radica en su utilización como madre en cruzamientos con padres de la palma africana para obtener híbridos interespecíficos denominados OXG, los
cuales producen una mejor calidad del aceite, presentan una menor tasa de crecimiento
vertical, que facilita la cosecha por un mayor número de años, y presentan tolerancia a las
principales enfermedades letales que atacan a los cultivos comerciales de E. guineensis (Franco 2010).
Reino: Plantae
División: Angiospermae Clase: Equisetopsida Subclase: Magnoliidae Superorden: Lilianae Orden: Arecales
Familia: Arecaceae Bercht. & J. Presl 1820 Género: Elaeis Jacq.
Especies: Elaeis oleifera (H.B.K) Cortes 1897 Elaeis guineensis Jacq 1763
Sinonimia: Alfonsia oleifera Kunth 1816 Elaeis melanococca Mart. 1824
Elaeis melanococcavar. semicircularis Oersted 1859 Elaeis oleifera (Kunth) Cortes ex Prain 1915 Corozo oleífera (Kunth) L. H. Bailey 1933
Elaeis oleifera (Kunth) Cortés ex Wess. Boer 1965
Descripción química del género Elaeis
para E. guineensis y variedades naturales dura, pisíferas y ténera, también para la especie E. oleífera y su híbrido interespecífico. En los ácidos grasos se encuentran, los isómeros de carotenoides, tocoferoles y tocotrienoles. Los carotenos, la vitamina E y los fitoesteroles son
componentes bioactivos de los alimentos ya que, además de los micronutrientes, siendo
sustancias que suministran efectos beneficiosos sobre la salud (reducción del colesterol
plasmático y prevención de arteriosclerosis, cáncer y enfermedades degenerativas)
(Cenipalma 2002).
En la fracción metanolica de las hojas de E. guineensis, se ha reportado: tetracosahexano con actividad antimicrobial (Rajoo et al. 2010). Polifenoles, Vitamina E, butilato hidroxitolueno como antioxidantes (Sasidharan et al. 2009, Vijayarathna et al. 2012). Contenido de polifenoles como antoixidante (Rosalina Tan et al. 2011). Dimetil sulfóxido; tetrahidro-trans-3,4-furanodiol; 1-amino-2, 6 - dimetilpiperidina;
2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-4H-piran-4-ona; 4-metil-1-(1-metiletil)-3-ciclohexeno-1-ol; 5-(hidroximetil)-2-Furancarboxaldehido;
D-manosa; 1,6-anhidro-α-D-glucopiranosa (levoglucosano); 3-terc-butil-4-hidroxianisol;
3,4-dihidro-2 (1H)-isoquinolinecarboximidamide; y
5-isopropenil-2-metilciclopent-1-eno-carboxaldehído (Vijayarathna et al. 2012). Xantina oxidasa como antioxidante y potencial hepatoprotector (Vijayarathna et al. 2012). Catequinas (Jaffri et al. 2011). Fenoles, difenoles y flavonoides (Han & Choo 2010)
Los principios activos de origen vegetal son sustancias que se encuentran en las distintas
partes u órganos de las mismas y que alteran o modifican el funcionamiento de órganos y
sistemas del cuerpo humano y animal. La investigación científica ha permitido descubrir una
variada gama de principios activos, de los cuales los más importantes desde el punto de vista
de la salud, son los aceites esenciales, los alcaloides, los glucósidos o heterósidos, los
mucílagos y gomas, y los taninos. Existen en las plantas otros principios activos relevantes
denominados nutrientes esenciales, como las vitaminas, minerales, aminoácidos,
carbohidratos y fibras, azúcares diversos, ácidos orgánicos, lípidos y los antibióticos. Entre
estos principios activos encontramos a los metabolitos secundarios, los productos que derivan
de ellos no son esenciales para el metabolismo de las plantas sino sustancias de defensa,
adaptación, entre otras. Sin embargo, el no ser esenciales para la planta no significa que no
JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El follaje de las plantas es parte de la biomasa producida por ellas y en muchos casos el
exceso de follaje en las plantas de los cultivos comerciales se convierte en un problema,
debido a que obstaculiza las labores agronómicas del siguiente cultivo. Algunas aplicaciones
y usos de la biomasa de los cultivos y en particular del follaje, se han enfocado a su
reutilizarla como compostaje y como materia prima básica para la industria del papel.
Cultivos como la Palma Africana, producen grandes cantidades de follaje y el alto costo del
transporte de esa biomasa, hace poco viable su reutilización en industrias como la papelera
(Corley & Tinker 2003). De otra parte, en el follaje de muchas especies de plantas se
encuentran altos contenidos de nutrientes como aminoácidos, proteínas y carbohidratos. Las
plantaciones de palma africana en Malasia, producen de 22 a 26,2 millones de toneladas de
follaje por año (Husin et al. 2012, Azlan 2008). Según Franco 2010, las hojas sobrantes de la poda o cosecha en cultivos de palma africana pueden ser un problema cuando se acumulan en
franjas continuas, mientras que cuando se distribuyen en forma radial, alrededor de cada
palma, éstas se incorporaran rápidamente como materia orgánica al suelo. Se han realizado
muchos estudios con el fin de resolver el problema del manejo del follaje. Países como
Malasia y sus grandes avances científicos, busca la máxima utilización de los subproductos
de las plantaciones (Corley & Tinker 2003). Es así como las hojas de la palma africana se han
usado para la alimentación animal, suplemento alimenticio en humanos y productos
biodegradables (Azlan 2008).
Por lo tanto, esta investigación será de utilidad a productores del sector de palma u otros
cultivos con alta producción de biomasa foliar a maximizar la utilización de subproductos
como el follaje y convertirlos en producto de mayor valor agregado, como por ejemplo la
fibra de celulosa u otros componentes como la vitamina E.
Los científicos Malayos se han enfocado siempre en la especies Elaeis guineensis (Palma Africana de Aceite) para su mejoramiento, a su vez, muestran interés en la especie Elaeis oleífera (Palma Americana) para el mejoramiento de la calidad del aceite, la tasa de crecimiento y la sanidad del cultivo, mediante el desarrollo del hibrido interespecífico entre
las dos especies, denominado comúnmente OXG, por las iniciales de la especie de cada
palma. Sin embargo, la palma americana posee mejor calidad y mayor proporción de
los compuestos de las hojas pueden ser más diversos e incluso cantidades superiores a la
especie E. guineensis.
El problema del proyecto de investigación está centrado en la escasa información que hay de
estudios químicos a partir de extractos foliares en el género Elaeis. Sin embargo, como se menciona anteriormente solo se encuentra información actualizada en la palma africana.
MARCO TEÓRICO
En el contexto mundial sobre la utilización del follaje, se enfatiza en la conversión de la
biomasa en alguna forma de energía para satisfacer necesidades de los habitantes de las
ciudades e industrias. Países como Cuba reutilizan la biomasa resultante de la caña de azúcar
en biocombustible y alimentación de ganado; la caña de azúcar es la fuente más importante de
biomasa con que cuentan para el desarrollo de energía renovable, y es la única a partir de la
cual se está generando electricidad (Montiel 2003).
La importancia industrial del uso del follaje, se ve reflejada en el avance de los brasileños,
quienes con la mayor área cultivada de caña de azúcar en el mundo (5.02 millones de
hectáreas), han mostrado desde los años 80 mediante la fabricación de bioetanol para uso
energético, de los subproductos recuperables (bagazo) que la caña. Además, se produce etanol
hidratado (con 4 o 5% de agua), que se utiliza directamente en motores de explosión
preparados para ello. Actualmente, en Brasil han llegado a funcionar más de 5 millones de
automóviles con esta tecnología, de los que 3 millones funcionan exclusivamente con este
combustible, el mismo está comenzando a convertirse en una alternativa importante frente al
uso de los combustibles fósiles tradicionales (Díaz & Portocarrero 2002).
Sin embargo, no se ha dado un uso interesante como para la industria farmacéutica o
cosmética, a partir de los componentes básicos, los cuales podrían ser precursores de un sinfín
de productos naturales muy apetecidos en los últimos tiempos.
En la palma africana se ha evidenciado contenidos bajos (según el extracto utilizado) de
Vitamina E, importante por su actividad antioxidante que a su vez protege los tejidos
corporales dañados a causa del exceso de radicales libres, la vitamina también actúa como
anticoagulante, protegiendo el sistema inmunitario, a su vez, ayuda a prevenir enfermedades
cerebrovascular (Rodríguez 2009). Se encuentra este compuesto comúnmente en el aceite del
mesocarpio de la Palma Africana, también lo encontramos en hojas. Adicionalmente se puede
suponer que en la Palma Americana también se debe presentar y posiblemente en mayor
cantidad.
La importancia de esta especie se da en que es una especie nativa de Colombia y su uso
empezó a desarrollarse muchos años atrás en el departamento de Córdoba, como una fuente
de alimento para animales y humanos, al igual que para calmar algunas dolencias de la gente,
aunque también fue utilizado como combustible (Patiño 1977). Con la llegada de la especie
africana E. guineensis, el gobierno incentivo su cultivo hasta completar en la actualidad cerca de medio millón de hectáreas y como consecuencia de este apoyo, sumado a otras causas, se
abandonó el crecimiento de una industria nacional que pudo ser muy importante en la década
de los 50 y 60 (Fedepalma 2013). A partir del interés que han tenido los diferentes centros de
investigación de palma africana en el mundo sobre esta especie, como una ruta para
desarrollar híbridos interespecíficos entre la palma africana y palma americana, dejando de un
lado el potencial de esta última especie como cultivo comercial (Patiño 1977). En el estudio
se identificaron metabolitos secundarios del extracto apolar de las hojas de Elaeis oleífera. Se propone que a partir de los resultados del mismo, sea posible fomentar la domesticación de la
E. oleífera, cuyos productos primarios como son las ácidos grasos, aceites esenciales, entre otros compuestos, sean utilizados como materia prima en la elaboración de productos
farmacéuticos y cosméticos, lo cual motivaría el desarrollo de cultivos de la especie.
OBJETIVOS Objetivo General
Detectar los metabolitos mayoritarios presentes en las hojas de Elaeis oleífera de diferentes hábitats en Colombia y Perú.
Objetivos específicos
1. Colectar los foliolos de la hoja 17 de diferentes hábitats en Colombia y Perú.
2. Obtener extractos totales y fracciones apolares de los anteriores.
3. Desarrollar cromatografías de capa delgada bidimensional y cromatografía de gases a las
fracciones apolares.
METODOLOGÍA
Colecta de material vegetal
Las muestras se colectaron en el mes de Julio, tomando foliolos del área media de la hoja
número 17 de cada palma madura, debido a que esta hoja es la utilizada para todo tipo de
análisis foliar de laboratorio en las investigaciones de palma africana (Rivera 2009). Se
tomaron cuatro muestras en dos hábitats diferentes, distribuidos así:
Código
muestra Hábitat Ubicación
Altura sobre el nivel
del mar (msnm) Departamento
Coordenadas
(Google Earth) País
Cantidad de muestras
Palma 1 Terreno drenado Montería 59 Córdoba N8° 25´56.6´´
W75° 44´31.2´´ Colombia 200 g
Palma 2 Terreno anegado Montería 65 Córdoba N8° 24´57.7´´
W75° 43´53.7´´ Colombia 200 g Palma19 Terreno anegado Campo Verde 162 Ucayali S8º 36´21.3´´
W74º 41´15.3´´ Perú 200 g
Palma 129 Terreno drenado Campo Verde 172 Ucayali S8º 36´ 19.4´´ W74º
[image:12.595.65.533.198.642.2]41´13.3´´ Perú 200 g
Figura 1. Fotografías correspondientes a las palmas estudiadas en el presente trabajo. Las fotos P1 y P2 son las palmas colectadas en Colombia y las fotos P19 Y P129 son las palmas colectadas en Perú.
Posteriormente los foliolos fueron separados del raquis, se secaron a medio ambiente por
cuatro días y se almacenaron 200 gramos de hojas secas y molidas en bolsas ziploc
Procedimiento de extracción
El material vegetal ya seco, se procesó hasta dejarlo casi polvo y se obtuvo las siguientes
fracciones:
a.Extracto total: Aproximadamente 200 g de muestra seca se extrajo con 1 L de etanol y se puso en contacto con este durante 7 días. La eliminación de la muestra a partir de disolventes
se llevaron a cabo por filtración a través de papel de filtro de celulosa pura y el filtrado se
concentró a presión reducida con rota-evaporador a 40 ºC hasta una quinta parte del volumen
inicial.
b. Fracción apolar: Se realizó fraccionamiento líquido-líquido con aproximadamente 4,5 g de la extracción total en un balón de decantación, se agregó 15 ml de Cloroformo formando
dos fases líquidas, rescatando la fase inferior debido a que el cloroformo es más denso
(pesado) que el agua. Finalmente se concentró a presión reducida con rota-evaporador a 40 ºC
hasta una quinta parte del volumen inicial.
Cromatografía de capa delgada
Se empleó gel de sílice (SiO2) para separar los compuestos polares y apolares. La fase estacionaria (gel de sílice) se agregó en láminas de vidrio en placas de 10 cm x 10 cm. Las
diferentes fracciones se sembraron en forma de punto con capilares y separadas cada 10 mm.
Se usó como fase móvil 20 mL de una solución de mediana polaridad de éter de petróleo y
acetato de etilo (16:4) y otra solución polar de diclorometano y metanol (19:1).
Posteriormente, las placas se colocaron en una cámara de vidrio de 15 cm alto por 30 cm de
largo y 7 cm de ancho, en el que se colocaron previamente la fase móvil hasta un nivel de 2-5
mm. Finalmente los cromatogramas se observaron a luz ultravioleta de longitud de onda corta
(283 nm) y se revelaron con una solución de vainillina, disueltos en ácido sulfúrico
concentrado y se colocó el cromatograma en una plancha de calentamiento hasta que se
revelaron la totalidad de los compuestos.
Cromatografía de capa delgada bidimensional
Se empleó gel de sílice (SiO2) para separar los compuestos polares y apolares. Las
absorbentes se agregaron en un soporte de lámina de vidrio en placas de 10 cm x 10 cm. Las
muestras de las fracciones apolares se sembraron individualmente (por placa) en una esquina
y el cromatograma se corre en forma paralela a uno de los bordes de la placa con una solución
placa, se giró 90º y se dejó correr con una solución polar de diclorometano y metanol
(19,6:0,4). Posteriormente, las placas se colocaron en una cámara de vidrio de 15 cm alto por
30 cm de largo y 7 cm de ancho 7 cm por 15 cm de altura, en el que se colocaron previamente
la fase móvil hasta un nivel de 2-5 mm. Finalmente los cromatogramas se observaron a luz
ultravioleta de longitud de onda corta (283 nm) y se revelaron con una solución de vainillina,
disueltos en ácido sulfúrico concentrado y se colocó el cromatograma en una plancha de
calentamiento hasta que se revelaran la totalidad de los compuestos. Cromatografía de gases
El análisis por GC-MS se realizó en un cromatógrafo de gases termo espectrómetro de masas
(Agilent GC / MS 6890N/5873I) equipado con una columna HP-5ms (30 m de largo, 0,25
mm de diámetro, espesor de película 0,25 μm). La temperatura de entrada fue de 280 °C. La
temperatura del horno se programó a 70ºC durante 2 min, aumentando 20ºC por min hasta
llegar a 280 °C, que se mantuvo durante 20 min. El gas portador fue helio a una velocidad de
flujo de 1,2 ml / min (modo sin fraccionamiento). Calentador MSD línea de transferencia se
fijó a 280 °C. El espectrómetro de masas cuadrupolo, escaneó en el rango de 10 a 700 amu,
con un voltaje de ionización de 70 eV y una temperatura de la fuente de iones de 250 °C. Los
compuestos se identificaron mediante búsquedas electrónicas en las bibliotecas comerciales
del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST) (Rajoo et al. 2010, Vijayarathna et al. 2012, Chong et al. 2008, Sasidharan et al. 2009).
RESULTADOS
Extracción de fracciones totales y apolares
En la tabla 1 se aprecia la cantidad de fracciones polares y apolares, obtenidas a partir de un
[image:14.595.76.518.636.742.2]peso inicial de follaje seco de cuatro palmas procedentes de cuatro diferentes hábitats.
Tabla 1. Pesos y rendimientos de las fracciones a partir del peso seco inicial de las hojas de E.
oleífera.
Muestras Peso seco inicial (g) Peso Fracción total (g) Rendimient o Peso Fracción apolar (4,5 g)
Rendimient o (4,5g)
Palma 1 C 200 7,74 3,87% 0,76 16,82%
Palma 2 C 200 8,84 4,42% 1,37 30,34%
Palma 19 P 200 5,29 2,65% 1,45 32,26%
Cromatografía de capa delgada (CCD)
Se hizo una CCD corrida en dos fases móviles; la primera fue con Acetato de Etilo y Éter de
Petróleo (16:4) y la segunda, con Diclorometano y Metanol (19:1). El propósito de usar estas
fases era determinar la ausencia o presencia de compuestos entre las palmas objeto de estudio
de la fracción total.
En la figura 2, se aprecia el cromatograma obtenido a partir del Éter de Petróleo y Acetato de
Etilo (16:4). A la izquierda, el cromatograma a luz visible y a la derecha el revelado con
Vainillina; en la parte inferior de cada cromatograma se identifica la palma, mientras que en
sentido vertical se enumera los colores presentes, los cuales corresponden a diferentes
compuestos. En el cromatograma a luz visible se observan seis compuestos (1 al 6), los cuales
son similares a los compuestos 1 a 6 del cromatograma revelado con Vainillina; sin embargo
en este último se aprecian tres colores adicionales que corresponden a igual número de
compuestos (6, 7 y 8), mientras que el compuesto 9 correspondería al que aparece como 6 en
el cromatograma sin revelar. También se destaca la presencia del compuesto 3 solamente en
las palmas 19 y 129, correspondientes a las colectadas en Perú.
En la figura 3, se aprecia el cromatograma obtenido a partir del Diclorometano y Metanol
(19:1). A la izquierda, el cromatograma sin revelar, en el centro el cromatograma expuesto en
luz UV y a la derecha el revelado con Vainillina; en la parte inferior de cada cromatograma se
identificada como en la figura anterior. En el cromatograma sin revelar se observan cinco
compuestos (1 al 5), los cuales son similares a los compuestos 1 al 5 del cromatograma
revelado con Vainillina; sin embargo en este último se aprecian tres colores adicionales que
corresponden a igual número de compuestos (5, 6 y 7) que se observan también en el
cromatograma expuesta en UV, mientras que el compuesto 8 correspondería al que aparece
como 5 en el cromatograma sin revelar. También se destaca la presencia del compuesto 7
solamente en las palmas 19 y 129, correspondientes a las colectadas en Perú. Asimismo en las
palmas 19 y 129, en el cromatograma expuesto a UV se observa un compuesto azul
Figura
Fi Cro
a 2. Cromato C
igura 3. Crom omatograma
ografía de cap Cromatogram
matografía d a luz visible Vainillina/H
pa delgada c ma a luz visibl
de capa delga e, B) expuest H2SO4; en lo
corrida con É le y B) revel
ada corrida c ta a luz UV d os círculos, co
Éter de petról lado con Vain
on Diclorom de onda corta ompuestos fl
eo y Acetato nillina/H2SO
metano y Met a (283nm) y luorescentes.
[image:16.595.139.452.429.694.2]Cromatografía bidimensional
Se realizó una cromatografía bidimensional con las fracciones apolares, consistió en dos fases
móviles, en la figura 4 se observa la primera fase que fue corrida con Hexano y Acetona
(16:4), en la figura 5 se observa la segunda fase que fue corrida con Diclorometano y Metanol
(19,6:0,4). Con este tipo de cromatografía se buscaba separar las mezclas complejas por la
[image:17.595.80.521.201.578.2]superposición de los colores y así facilitar su identificación.
Figura 4. Cromatografía bidimensional, primera fase, corrida con Hexano y Acetona (16:4); los
círculos rojos muestra la diferencias o similitudes en el patrón de coloración de los compuestos.
En la figura 4, se aprecian los cromatogramas de la primera fase con Hexano y Acetona
(16:4). Las cuatro fotos corresponden a las cuatro palmas, cuya identificación aparece en la
parte superior izquierda de cada recuadro. En los cromatogramas sin revelar a la luz visible se
observan cinco compuestos (1 al 5), los círculos rojos indican la presencia de un compuesto
En la figura 5, se aprecian los cromatogramas de la segunda fase con Diclorometano y
metanol (19,6:0,4) ya reveladas con vainillina. En los cromatogramas se observan de 18 a 24
compuestos. Se identifica la presencia de los compuestos mediante círculos de color verde,
rojo, azul y lila. En la tabla 2 se relacionan la presencia de los compuestos en cada una de las
[image:18.595.99.502.179.558.2]palmas.
Figura 5. Cromatografía bidimensional, segunda fase, corrida con Diclorometano y metanol (18,6:0,4)
y revelado con vainillina/H2SO4.
Tabla 2. Compuestos encontrados en la cromatografía bidimensional para cada fracción apolar de las hojas de E. oleífera.
Compuesto Color Círculos P 1 P 2 P 19 P 129
1 Azul X X X X
2 Azul X X X X
3 Lila X X
4 Lila X X
5 Rojo X X X X
6 Azul X X X X
[image:18.595.167.427.644.761.2]Compuesto Color Círculos P 1 P 2 P 19 P 129
8 Rojo X X X X
9 Rojo X X X X
10 Rojo X X X X
11 Rojo X X X X
12 Azul X X
13 Rojo X X X
14 Rojo X X X
15 Verde X X X
16 Verde X X X
17 Verde X X X X
18 Rojo X X X X
19 Azul X
20 Azul X
21 Azul X
22 Azul X
23 Azul X
24 Azul X
25 Azul X
26 Azul X
Cromatografía de gases
La cromatografía de gases fue la última técnica usada en el estudio. La fracción apolar de
cada una de las cuatro palmas fue inyectada con una jeringa hipodérmica a través de un
séptum de goma (o hule) de silicona autosellante, a un alineador de vidrio (glass insert)
contenido en un bloque metálico, donde es vaporizada y barrida hacia la columna. El bloque
se calentó a una temperatura de 70ºC durante 2 min, aumentando 20ºC por min hasta llegar a
280 °C, que se mantuvo durante 20 min. lo suficientemente alto para convertir la muestra
líquida en vapor. La cantidad de muestra inyectada fue del orden de 1 μL para líquidos. Para
la detección de compuestos, el espectrómetro de masas se une directamente al cromatógrafo
de gases y permite la identificación de los compuestos separados cromatográficamente.
En la figura 6 se observan los cromatogramas resultantes de las palmas analizadas con sus
respectivos tiempos de retención en color azul después de haber sido separados por la
columna y en la tabla 3 se relacionan los diferentes compuestos encontrados para cada palma
estudiada, con sus respectivos nombres comunes, pesos moleculares y fórmulas a excepción
Tabla 3. Principales compuestos identificados por CG-EM en cada fracción apolar de las hojas de E. oleífera, con sus respectivas fórmulas moleculares y peso molecular obtenidos en PubChem.
Nombre Químico Nombre Común % coincidencia Fórmula Peso molecular
(g/mol) P 1 P 2 P 19 P 129
2 Metoxi 4 vinilfenol 4‐Vinilguaiacol 93 C9H10O2 150,1745. X
2 (4H) Benzofuranona 5,6,7,7α tetrahidro 4,4,7α trimetil
2 (4H) Benzofuranona, 5,6,7,7a‐tetrahydro‐4,4,7a‐ trimethyl, (7aR)‐4,4,7a‐trimethyl‐6,7‐dihydro‐5H‐1‐
benzofuran‐2‐one. 90 C11H16O2 180,24354. X Quinona 4 oxime 2, 6 di tert butil Quinona 93 C12H22NO2 196,314. X 9 octadecenamide (Z) Ácido oleico amida, oleamida 90 C18H35NO 281,4766. X
Etil hexadecanoato palmítico,Etil palmitato, ácido etil hexadecanoico éster del ácido palmítico, ácido 93‐97 C18H36O2 284,47724. X X X X Fitol Fitol, 3,7,11,15 tetrametil 2 hexadeceno 1 ol 86‐91 C20H40O 296,531. X X X
Vitamina E Alfa tocoferol 99 C29H50O2 430,7061. X
Escualeno Spinacene 93 C30H50 410,718. X X
Ácido heptadecanoico, Etil éster Etil heptadecanoato, etil heptadecanoico, ácido
margárico 93‐98 C19H38O2 298,50382. X X X
9,17 Octadecadienal (Z) Dietanolamida 93 C18H32O 264,44608. X
2 etilhexil mercaptoacetato 87 C10H18SO2 222,272 X
Gama tocoferol 7,8‐Dimetiltocol 95 C28H48O2 416,67952. X
Estigmasterol 89 C29H48O 412,69082. X
Gamma sitosterol Beta Dihidrofucosterol 94 C29H50O 414,7067. X Ácido linoleico, etil éster Etil linoleato, Mandenol. Omega 6 99 C20H36O2 308,49864. X X X Ácido octadecanoico Estearato, ácido esteárico 90 C18H36O2 284,47724. X
Ácido octadecanoico, etil éster Ácidoesteárico esteárico etil éster, etil octadecanoico o etil 97 C20H40O2 312,5304. X
Miristato de etilo Etil éster tetradecanoico, etil tetradecanoico, ácido
mirístico 96 C16H32O2 256,42408. X
9,12,15 Ácido octadecatrienoico, etil éster Alfaácido ácido alfa linolénicolinolénico, o linolenato, ácido linolénico. alfa linolenato, Omega 3 90‐99 C18H30O2 278,4296. X
Figura 7. Espectro de masas del alfa tocoferol presente en la palma 19.
Figura 8. Fragmentación de la molécula alfa tocoferol.
Se obtuvo el espectro de masas de la Alfa tocoferol (Vitamina E) detectada en la palma 19
(figura 7), y en la figura 8 se muestran las respectivas fragmentaciones que suceden en la
molécula y mediante los cuales se obtienen los iones de referencia característicos para este
[image:22.595.156.441.463.622.2]DISCUSION Y CONCLUSIONES
Extracción de fracciones totales y apolares
Según la Tabla 1, durante el proceso de extracción de las fracciones total y apolar, hubo un
mayor rendimiento de la apolar, debido a la presencia mayoritaria de compuestos con baja
polaridad, como son los ácidos grasos de cadena larga C16, C18, C20, C28 O C29 y el escaso
contenido de compuestos con alta polaridad, como alcoholes, compuestos con azufre o con
nitrógeno, flavonoides, derivados del furano y compuestos no identificados, según Marrero et al (2011) el bajo rendimiento de la fracción total se da por el bajo contenido de compuestos de alta polaridad.
Cromatografía de capa delgada (CCD)
En la cromatografía de las figuras 2 y 3 se observa mayor presencia de compuestos de baja
polaridad ya que éstos avanzan fácilmente con el frente del solvente debido a la baja polaridad
del éter de petróleo separándose de los compuestos de alta polaridad. En la figura 2 se
aprecian dos tipos de clorofila, la clorofila a, cuya coloración es verde azulada (número 5 en
la escala vertical) que contiene un átomo central de Mg contenido en un anillo de porfirina
junto a un alcohol insaturado denominado fitol y un grupo metilo (-CH3). La clorofila b, es
similar a la clorofila a pero posee un grupo aldehído (-CHO), y se observa en el
cromatograma de color verde amarillento (número 4 en la escala vertical). Las manchas
amarillas (números 1 de la escala vertical) corresponderían a xantofilas (luteína, violaxantina
y neoxantina); estos compuestos son derivados oxigenados de los α, -carotenos. Las
coloraciones amarillas que están con el frente del solvente corresponderían a carotenos
(número 6 en la escala vertical - Figura No. 2 A y B), estos últimos contienen hidrógenos y
carbonos (hidrocarburos); la coloración varía desde el amarillo al anaranjado siendo más
abundante los -carotenos (Baundino 2007, García & García 1969).
En la figura 3 no hay una separación clara de compuestos como las clorofilas y carotenos,
posiblemente debido a la proporción de los solventes en la solución de la fase móvil y su alta
polaridad que no permitió la separación, ya que la clorofila b es más polar que la clorofila a,
se absorbe más intensamente y presenta, en consecuencia, una relación de frente (Rf) menor,
por lo que se deduce que el arrastre del frente del solvente genera superposición con los
carotenos los cuales quedan disueltos en la fase móvil y arrastrados por esta, fenómeno que ha
sido evidenciado en los trabajos de Baundino (2007). También se observó manchas de color
cromatograma expuesta a los UV de onda corta de la figura 3 y corresponde a fenoles
glicosilados (Wagner & Bladt 2001).
Cromatografía bidimensional
Se empleó la técnica cromatográfica bidimensional porque no eran claras las manchas
superpuestas en el frente del solvente y porque la mezcla de sustancias no se pudo separar
completamente en una dirección de desplazamiento. En la figura 4 el patrón de coloración se
observa igual que la primera cromatografía (Fig. 2) correspondiente a la primera fase corrida
con la solución Hexano-acetona (16:4), mientras que en la segunda fase corrida con la
solución Diclorometano-metanol (19,6:0,4), se hace evidente la aparición de 18 a 20
compuestos.
Los compuestos 10 y 11 (Fig. 5) en las cuatro muestras de palmas equivalen a las clorofilas b
y a respectivamente; los compuestos 7 y 8 pertenecerían a las feofitina a y b que según
Baundino (2007) presentan la misma tonalidad verdosa como la clorofila y se debe a
productos de descomposición de esa misma (sustituye el magnesio por dos átomos de
hidrógeno). Los compuestos 15, 16, 17 y 18 (Fig. 5) corresponderían a una mezcla de lípidos,
sobre todo entre tipos de combinaciones de distinta polaridad y suelen desplazarse con el
frente del solvente porque se disuelven con la fase móvil de baja polaridad; García y García
(1969) indicó que los lípidos de cadena larga, se desplazan más lejos que los lípidos de
cadena corta, sin embargo la longitud de la cadena y el número de los enlaces dobles, solo
poseen una influencia relativa sobre la velocidad de desplazamiento. Posiblemente los
compuestos serían Vitamina E, tocoferol, estigmasterol, sitosferol, componentes del ácido
linoleico y linolénico, ácido esteárico registrados por el cromatógrafo de gases del cual se
hablará a continuación. Taiz y Zeiger (2006) sugieren que los ácidos grasos insaturados como
ácido linoleico y ácido alfa-linolénico aumenta la fluidez de la membrana en condiciones de
bajas temperaturas, cuando la planta no puede regular su temperatura.
Los compuestos 9, 12, 13 y 14 (Fig. 5) podrían ser ácidos grasos saturados de mediana
polaridad y peso molecular alrededor de los 256,4 a 284,5 g/mol como los ácido palmítico y
ácido mirístico como lo indica García & García (1969) cuando separa los lípidos en grupos de
sustancias en una cromatografía de capa delgada con éter de petróleo como fase móvil. Este
tipo de ácidos grasos se encuentran en la bicapa lipídica de la membrana plasmática de las
células.
Los compuestos del 1, 2, 6, 12, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 25 y 26 encerrados en círculos azules, 3
alta polaridad, alcoholes, compuestos no identificados, compuestos con azufre o con
nitrógeno, flavonoides y derivados del furano, según Marrero (2011). Sin embargo, Tan et al.
(2011) indican en su estudio, que los extractos alcohólicos de las hojas de E. guineensis
presenta contenidos de ácido gálico, compuestos fenólicos no tóxicos como flavonoides
glicosilados, catequinas y carotenoides.
Mediante la cromatografía de gases y los respectivos pesos moleculares (Tabla 2), se podría
llegar a suponer que los compuestos podrían ser: 2 Methoxi 4 vinilfenol (4-vinylguaiacol), 2
(4H) Benzofuranona 5,6,7,7α tetrahydro 4,4,7α trimetil, quinona (Quinona 4 oxime 2, 6 di tert
butil), oleamida, ácidos mirístico, palmítico, esteárico, 2 etilhexil mercaptoacetato.
Los compuestos encerrados en los círculos rojos a pesar de ser comunes para las cuatro
palmas analizadas, no se desplazaron de la misma manera, se debe posiblemente a la
interacción entre los compuestos de alta polaridad (círculos azules) que no dejan que se
desplacen correctamente (Palmas 1 y 2) reteniéndolos, como se observan en las palmas 19 y
129.
Cromatografía de gases
En el estudio de las fracciones apolares se presentaron cromatogramas (Figura 6) con gran
cantidad de picos de bajas intensidades a partir de 4 minutos (Palmas 1, 19 y 129) y 6 minutos
para la palma 2. En la tabla 3 se observan los principales compuestos identificados por
CG-EM de las fracciones apolares de las cuatro muestras. En el espectro de masas del ion
moleculares α-tocoferol (Vitamina E) y su respectiva fragmentación (Figura 8) se observó el
ión molecular de M+ 430,4. Un pico a 205,1 (M-225,3) en correspondencia con la pérdida de
C16H34. El pico base a 166,1 (M-39,2) que corresponde a la pérdida de C3H3. La presencia de
este compuesto tiene como función biológica, fluidez de la membrana y actividad
antioxidante, de la cual se hablara más adelante.
Se evidenciaron también compuestos como el ácido palmítico encontrándose para las cuatro
palmas, en conjunto con los ácidos mirístico y ácido esteárico, comunes en las membranas
plasmáticas específicamente en la bicapa lipídica. El ácido esteárico o ácido octadecanoico, se
encontró para las palmas 1 y 2; este ácido es la forma saturada del ácido oleico
(monoinsaturado) que se encuentra también en la bicapa lipídica de las membranas
En las membranas de las células vegetales se pueden encontrar lípidos anfipáticos como el
sitosterol, el estigmasterol (P 19 de la tabla 2), el colesterol entre otros, sus características
permite que se forme la bicapa lipídica en las que las colas hidrófobas de los ácidos grasos se
mantienen unidas, mientras que las cabezas polares se orientan hacia la fase acuosa. Los
fitosteroles encontrados en la palma 19 fueron -sitosterol y estigmasterol, son esteroles de
estructura química muy similar a la del colesterol, son constituyentes de las membranas
vegetales y su concentración depende del tipo de membrana y su función a desempeñar dentro
de la célula (Azcón & Talón 2008). El consumo de fitosteroles en humanos hace que
disminuya los niveles de colesterol en sangre sin modificar los niveles de colesterol HDL,
disminuye la esterificación del colesterol en los enterocitos al inhibir la actividad de la enzima
acilCoA-colesterol-acil transferasa (Valenzuela & Roco 2004).
La fluidez de la membrana depende de la insaturación de los ácidos grasos, permitiendo el
movimiento transversal y lateral de las moléculas lipídicas como de las proteínas
transportadoras, sustratos y productos de las enzimas asociadas a la membrana, transporte de
electrones, entre otras. Los enlaces cis en las cadenas de la Vitamina E, ácido linoleico y ácido α-linolénico, provoca dobleces de la cadena y disminuye su grado de empaquetamiento,
a su vez, hace que la Tc (temperatura de transición de fase) sea menor y permitiendo mantener
la fluidez de la membrana a temperaturas más bajas. Los ácidos grasos presentes fueron ácido
octadecatrienoico 9, 12, 15 etil éster (ácido linolénico) conocido como omega 3 y el 2
cloroetil linoleato y ácido linoleico etil éster (ácido linoleico) también conocido como omega
6, ambos compuestos están presentes en la palma 1 y sólo el ácido linoleico se encuentra en
las palmas 1, 2 y 19 (Azcón y Talón 2008); estos compuestos también son conocidos por sus
propiedades antioxidantes, es decir tienen una amplia capacidad para atrapar radicales libres
causantes del estrés oxidativo lo cual les atribuye un efecto beneficioso en la prevención de
padecimientos tales como enfermedades cardiovasculares, circulatorias, cancerígenas y
neurológicas, también poseen actividades antiinflamatorias, antialérgicas, antitrombóticas,
antimicrobianas y antineoplásicas (García et al. 2010).
Según Jara (2012) la Vitamina E (α-tocoferol) es el componente más abundante de los aceites
vegetales siendo el principal de los tocoferoles, y -tocoferol es uno de los tres ( , , δ
-tocoferol) compuestos que están en cantidades menores a comparación de los tocotrienoles
como el -tocotrienol que es el más abundante en los aceites vegetales, sin embargo en la
las membranas biológicas, evitando la oxidación de los componentes celulares esenciales o
evitando la formación de productos tóxicos de oxidación como los peróxidos de ácidos grasos
no saturados (antioxidante) al igual que sitosterol (PubChem 2013), actuando así como
estabilizador de las estructuras lipídicas de los tejidos (Jara 2012).
El escualeno se detectó en las palmas 1 y 19, se forma por dos colas de farnesil difosfato
(DFF) es precursor de los triterpenos e intermediario en la biosíntesis del colesterol (Azcón &
Talón 2008) encontrados en los aceites de oliva, soya, germen de trigo y salvado de trigo.
Farmacológicamente, se ha reportado que disminuye la incidencia de patologías habituales de
la sociedad occidental, como infarto de miocardio, diabetes, dislipidemias, cáncer, entre otras
(Ronco 2009). A su vez, se detectó el fitol en las palmas 1, 19 y 129, es un alcohol insaturado
que hace parte de la clorofila (Lacruz 2012), tiene una larga cadena hidrófoba que les facilita
el anclaje de zonas o estructuras poco polares, por las propiedades del fitol, las clorofilas son
capaces de absorber la radiación luminosa en la zona del azul y también en la zona rojas; por
esto es que la clorofila es de color verde, y dan a las plantas ese color característico (Azcón y
Talón, 2008).
En la palma 129 se encontraron los siguientes compuestos: 2 Methoxy 4 vinylfenol
(4-vinylguaiacol), 2 (4H) Benzofuranona 5,6,7,7α tetrahidro 4,4,7α trimetil, quinona (Quinona 4
oxime 2, 6 di tert butil) y oleamida (9-octadecenamida). En PubChem (2013) se sugiere que el
2 Methoxy 4 vinylfenol posee propiedades antiinflamatoria y funciona como inhibidor de la
germinación; la oleamida o dietanolamida de acido oleico relacionado estructuralmente con
ácido araquidónico, importante por la formación de estructuras coloidales en agua,
estabilizador de espuma y en el aumento de la viscosidad de disoluciones tensioactivos
aniónicos para la industria cosmética (PubChem 2013, Urresta et al 2004); el 2 (4H) Benzofuranona 5,6,7,7α tetrahidro 4,4,7α trimetil y quinona (Quinona 4 oxime 2, 6 di tert
butil) no se encuentra reporte de función o relación con otro compuesto en la base de datos
Pubchem (2013) ni tampoco del compuesto 2 etilhexil mercaptoacetato.
Finalmente el ácido heptadecanoico o conocido también como ácido margárico es un ácido
graso saturado al igual que los ácidos palmíticos, mirísticos, pentanoico, esteárico y
araquidónico; se encuentra en muy poca proporción en los aceites de origen vegetal ya que
De los resultados obtenidos en los cromatogramas (Figura 6) no se tuvieron en cuenta los
tiempos de retención y % de áreas debido a que no se obtuvieron valores representativos,
cromatogramas con gran cantidad de picos de poca intensidad; predomina la presencia de
picos pequeños o conocidos también como errores aleatorios denominadas ruido, y se observa
generalmente en la palma 129 (Figura 6) (Gomis 2008). Esto puede deberse a múltiples
factores, la temperatura inicial del método cromatográfico propuestos por Rajoo et al. 2010, Vijayarathna et al. 2012, Chong et al. 2008, Sasidharan et al. 2009; el método de extracción de la fracción apolar; las condiciones en las que se colectaron las muestras foliares, como fue
la diferencia en los estados de maduración de los frutos, condiciones climáticas, épocas, años
y lugares de recolección, así como las variaciones intrínsecas de los métodos de preparación y
análisis empleados se debe también a que posiblemente la base de datos del equipo pueda
estar desactualizada (Gomis 2008). Otro factor que pudo afectar fue la cantidad de muestra
inyectada (1 μl) al cromatógrafo, donde sólo entra a la columna 0.01 μL en modo split; el resto es desechado, impidiendo así, la sobrecarga de la columna. Otro factor que pudo influir
(Gomis 2008).
El presente trabajo puede ser un comienzo para la identificación de compuestos químicos en
extractos apolares de las hojas de E. oleífera. Este indica que la fracción apolar de las hojas de E. oleífera presenta compuestos químicos de actividad antioxidante como la Vitamina E, -sitosterol, ácido linoléino y α-linolénico, encontrándose también en la bicapa lipídica con los
ácidos mirístico, esteárico y palmítico. En los métodos usados para la identificación de
compuestos, como la cromatografía bidimensional y cromatografía de gases, se permitió la
identificación de los compuestos y las diferencias entre la palma 129 con respecto a las
palmas 1, 2 y 19 por el patrón de distribución de los compuestos en la cromatografía
bidimensional y la presencia de compuestos novedosos en la CG-EM, llegando a prever que
no pertenezca a la misma especie. Se reportaron por primera vez los compuestos Quinona 4
oxime 2, 6 di tert butil y 2 etilhexil mercaptoacetato.
Se recomienda estudiar más la fisiología de Elaeis oleífera, implementar nuevas técnicas de extracción y métodos de cuantificación de compuestos. A su vez, cuantificar la concentración
de los compuestos antioxidantes detectados en el presente estudio como una posible fuente
compuestos nuevos merecen un mayor análisis para determinar su participación en la
fisiología de la palma o su utilidad como principio activo.
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ANEXO 1
