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Tesis. J. Chirinos.; K. Vegas

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Academic year: 2019

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UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL “FRANCISCO DE MIRANDA”

ÁREA DE TECNOLOGÍA

COMPLEJO ACADÉMICO “EL SABINO” PROGRAMA DE INGENIERÍA QUÍMICA

OBTENCIÓN DE β-CAROTENOS CON FINES INDUSTRIALES

A PARTIR DE BIOFACTORÍAS FOTOSINTÉTICAS DE

Dunaliella sp. DEL SECTOR LAS CUMARAGUAS, MUNICIPIO

FALCÓN, ESTADO FALCÓN.

Autores:

Br. Chirinos, Johanny, J .C.I: V- 18.359.638 Br. Vegas, Karems, A. C.I: V- 19.220.930

Tutor Académico:

Araujo, José A. C.I: V-13.300.545

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ii

UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL “FRANCISCO DE MIRANDA”

ÁREA DE TECNOLOGÍA

COMPLEJO ACADÉMICO “EL SABINO” PROGRAMA DE INGENIERÍA QUÍMICA

OBTENCIÓN DE β-CAROTENOS CON FINES INDUSTRIALES

A PARTIR DE BIOFACTORÍAS FOTOSINTÉTICAS DE

Dunaliella sp. DEL SECTOR LAS CUMARAGUAS, MUNICIPIO

FALCÓN, ESTADO FALCÓN.

Trabajo de Grado presentado ante la

Ilustre Universidad Nacional Experimental

“Francisco de Miranda” como requisito

para optar al Título de Ingeniero Químico.

Autores:

Br. Chirinos, Johanny, J .C.I. 18.359.638 Br. Vegas, Karems, A. C.I. 19.220.930

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DEDICATORIA

Primeramente a dios padre todo poderoso que nos dio la vida a todos. Te lo dedico por haberme acompañado en todo momento y darme fuerza para solventar cualquier problema que se me presentara.

A mis padres, que lo dieron todo por mí para que yo lograra esta meta.

A ti mami, sin tu apoyo nunca podría haber logrado este triunfo. Gracias por estar siempre conmigo y hacer hasta lo imposible para que yo lograra esta meta, una de tantas que tengo propuestas en mi vida. Te amo mami eres la mejor.

A ti papi te lo dedico porque siempre conté con tu apoyo, siempre estabas hay para ayudarme de cualquier manera y confiaste en mi con los ojos cerrado. Te quiero mucho papi y te amo.

A todos mis hermanos y sobrinos que siempre confiaron en mí, se los dedico con todo el corazón, los quiero a todos.

A mi novia que siempre me acompaño en los momentos difíciles y me brindaba todo su apoyo para salir siempre adelante. Te amo mi reina preciosa.

A ti Karems porque luchaste conmigo hasta el final, y batallamos contra viento y marea para lograr este sueño tan anhelado para los dos.

A mi abuela, todos mis tíos, primos, amigos que de alguna u otra manera siempre me apoyaron a que yo cumpliera este sueño de ser Ingeniero Químico.

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iv

DEDICATORIA

A Dios por estar presente en cada paso que doy, darme una Familia maravillosa, cuidarme, sobre todo por darme la fortaleza y paciencia necesaria para seguir cuando pensé que todo estaba perdido.

A mis padres, Marisol y Carlos quienes fueron el motivo más grande de este éxito, gracias por existir. Mamá gracias por tu ayuda, tus consejos, te amo. Papá esto también te pertenece a ti porque cada obstáculo q se me presentaba luchaba por salir adelante para ser lo que quizás un día tu hubieses querido ser.

A mi segunda madre mi tía Nelly quien me ayudó y apoyo desde el inicio, en mis primeros pasos hasta lo que soy ahora. Tía te amo.

A mi abuela toña y mi tía Edelys por su apoyo de siempre por su ayuda, sus consejos que nunca faltaron. Las quiero.

A la mejor amiga y hermana que existe Carla, por compartir conmigo todas las alegrías y tristezas, por tu apoyo. Dios te bendiga.

A Javier, por tu apoyo incondicional y por la ayuda que me has brindado. Te amo mi loco.

A mi Hermanos Carlí y Eduardo, mi sobrina Dabriela, a mis niñas Barby y Catherine, a mi negro lindo Kevin, a la greñuita Jessamy y la que está por llegar…para que este ejemplo sea de estimulo a seguir. Los quiero. Dios me los Bendiga.

A mi inseparable compañero de tesis Johanny, por tu constancia, porque juntos logramos terminar esta difícil pero hermosa Carrera: Ser Ingenieros.

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v

AGRADECIMIENTO

A ti dios padre, te doy las gracias por darme la vida y siempre guiarme por el camino correcto, para así lograr todas mis metas propuestas.

A mis padres que lo dieron absolutamente todo para que este triunfo se me diera, esto es de ustedes también porque sin el apoyo de ustedes esto jamás seria realidad. Gracias por brindarme todo su amor y llenarme de alegrías todos los día, los amo a los dos. Te lo digo una y mil veces mami “Eres la mejor”. No se cómo agradecerte todo lo que me has dado en esta vida, esta alegría que tengo es tan inmensa y te la debo es gracias a ti. GRACIAS MA.

A mi hermano mayor Jhon Manuel, gracias por confiar siempre en mí y siempre enseñarme como hacer las cosas bien, siempre llevo presente todos los consejos que me has dado.

A mi única hermana Yohana, siempre he seguido tus pasos y te admiro porque en ti vi que si se puede llegar a ser profesional cuando uno se lo propone. Te quiero mucho.

Amis hermanos Johan y Jofrank, gracias porque ustedes me apoyaron también para que esto fuera realidad, siempre diciéndome que yo si podía lograrlo y que yo era capaz de salir adelante. Gracias por confiar en mí. Los quiero.

A mi primo y hermano Alejandro, gracias por ayudarme siempre en todo.

A mi tía Moraima, gracias por haberme formado desde pequeño a tener una buena educación.

A mi Abuela Carmen, por todos tus consejos y apoyo que recibí de tu parte. A toda mi familia, que siempre me apoyaron en esta carrera, gracias a todos.

A Mi Princesa Bonitica Luisany, gracias por compartir tantos momentos tan felices a mi lado, siempre contando con tu apoyo, gracias por darme fuerzas cuando más la necesitaba, sin ti a mi lado nunca hubiera salido adelante porque siempre conté contigo en las buenas y en las malas, agradezco a dios por ponerme en mi camino a una persona tan especial como tú que significa mucho en mi vida. Eres mi gran amor. Te amo mami preciosa.

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vi

A quien fue mi compañero de estudio, pero ya es Ingeniero, Pedro Roos, gracias por aguantar tantas necedades mías. Pronto seremos colegas, gracias brother.

A Rafael por toda la ayuda prestada. Gracias hermano. Dios lo bendiga.

A mi gran tutor José Araujo, gracias por tanta dedicación, y por estar ahí cuando más necesitábamos de su ayuda. Gracias profe.

A los técnicos del Laboratorio de Análisis Químico, especialmente a Rómulo, gracias por tu gran ayuda

A todos mis amigos que siempre me incentivaron a salir adelante. Pedro Matheus, Richard Velásquez, Gabriela Velásquez, Ronald Velásquez, Linncold Rodríguez, Fransue Romero, Elisaul Romero, Norma Sivíra, Ruth Duno, Jessica Cruces, Jheanny Bracho, Adrian Rodríguez, Daniela Ávila y todos aquellos que siempre estuvieron apoyándome. Gracias a todos.

Finalmente a mi casa de estudio Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda y los profesores que me ayudaron a tener una formación Académica y salir bien preparado para cualquier campo de trabajo.

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vii

AGRADECIMIENTO

Cuando todo se deja atrás para emprender un camino siempre hay que agradecer, muchos si en él se han encontrado razones para seguir…

Quiero agradecer primeramente a Dios por tantas bendiciones que me ha dado, por las alegrías y los momentos no tan buenos que viví durante mi carrera porque de ellos también aprendí a ser constante y perseverante.

A mi madre por darme la vida y así vivir este momento de alegría, por su apoyo incondicional, por tu preocupación de que todo saliera bien. A mi padre por su apoyo. Espero que se sientan orgullosos de mí.

A mi tía Nelly por tu apoyo, la educación y la oportunidad que me brindaste de prepararme. Ahora si te puedo decir ¡Lo logré! Perdona las decepciones; espero esta sea un motivo de orgullo porque esto también lo logre por ti y para ti.

A mi Abuela toña, para agradecerte viejita no alcanzarían estas páginas; pero tú también fuiste mi motivo para seguir adelante, Dios te de mucha vida para seguirte disfrutando y seguir celebrando mis éxitos a tu lado. Gracias!

A mi tía Edelys y abuela Isabel por su apoyo y sus atenciones.

A mi hermana carla que a veces hiciste hasta de madre, gracias por apoyarme en las buenas y en las malas, manita eres especial. TE QUIERO.

A mi loco, gracias por tu paciencia, cariño, apoyo y ayuda, eternamente agradecida contigo y agradecida con Dios por permitirme compartir este éxito a tu lado.

A mi compañero Johanny por el tiempo compartido, tus ocurrencias, por soportarme, y por tu ayuda para que juntos culmináramos este proyecto.

A nuestro tutor José Araujo, por su asesoramiento, confianza y dedicación en la culminación exitosa de este trabajo. Mil Gracias.

A mi prima Betzabeth por sus consejos y por tu apoyo.

A mi negra Andreina por tu amistad, tus consejos y por ser mi pañito de lágrimas. A la Familia Adrians Coello por todo el apoyo brindado.

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viii

A mis amigas de siempre Cristina, Ludetsy y Rosa por su amistad y apoyo incondicional. Especialmente a Lude por sus horas de dedicación cuando estuve en apuros, por estar en los buenos y malos momentos. Gracias!

A Verica Vásquez, Nelcy Dirinot, Saidí Duno, Magaly García y mis compañeras de residencia... por su amistad y los gratos momentos compartidos.

A Hoiraly Gómez por la colaboración que nos diste en la realización de este trabajo, por tus buenas intenciones.

A Javier Darío por tus consejos y las veces que te moleste y nunca dijiste un No. A la Familia Hernández Matheus, especialmente a Oliver y Nohemí por la ayuda sincera en uno de los momentos más difíciles que viví en mi carrera.

A Mary Revilla por tu ayuda, lastima q nunca pude darte las gracias en vida, pero tu tiempo de dedicación y tu ayuda fueron valiosos.

Al Señor Julio Cuauro por ayudarme y por su disposición para resolver mis dudas. A mamá Jorgina por sus atenciones, por abrirme las puertas de su casa cuando necesite calor de hogar.

A mi tío Miguel y su familia por su receptividad y ayuda cuando apenas comenzaba esta carrera.

A los técnicos del Laboratorio de Análisis químico UNEFM por su colaboración durante la realización de este trabajo.

A Rafael por el tiempo que nos dedicaste, toda su colaboración y ayuda en la realización de este trabajo.

A los profesores por transmitirme sus conocimientos y ser parte de mi formación académica.

A La Universidad Francisco de Miranda porque en ella lleve a cabo uno de mis propósitos.

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ix

ÍNDICE GENERAL

Pág.

DEDICATORIAS……….. iii

AGRADECIMIENTOS……… v

ÍNDICE DE TABLAS………... xii

ÍNDICE DE FIGURAS………. xiv

ÍNDICE DE GRÁFICOS………. xv

ÍNDICE DE APÉNDICE……….. xvi

ÍNDICE DE ANEXOS……….. xvii

RESUMEN………. xix

INTRODUCCIÓN………... 1

CAPÍTULO I: EL PROBLEMA………. 4

1.1. Planteamiento del problema..………... 4

1.2. Objetivos de la investigación...……… 5

1.2.1. Objetivo General..………... 5

1.2.2. Objetivo Específicos..……….. 5

1.3. Justificación de la investigación..……… 5

1.4. Alcance y delimitación..………... 6

CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO……….. 9

2.1. Antecedentes la investigación..……… 9

2.2. Bases teóricas..………. 11

2.2.1. Los Carotenoides..……… 11

(10)

x

2.2.1.2. Distribución y estado natural……….. 12

2.2.1.3. Extracción de los carotenoides……… 12

2.2.2. El β-caroteno……… 13

2.2.2.1. Producción β-caroteno……… 14

2.2.3. Biofactorias Fotosintéticas………... 15

2.2.4 Dunaliella sp……… 15

2.2.4.1. Clasificación y morfología………. 16

2.2.5. Cromatografía en columna………... 17

2.2.6. Cromatografía en papel……… 18

2.3. Definición de términos básicos……… 19

CAPÍTULO III: MARCO METODOLÓGICO……… 22

3.1. Tipo y diseño de la investigación………. 22

3.2. Técnicas e instrumentos de recolección de datos……… 23

3.3. Técnicas de procesamiento y análisis de datos……… 23

3.4. Población y muestra………. 24

3.5. Fases de la investigación………... 25

CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS. 4.1.Muestreo a partir de Biofactorias fotosintéticas localizadas en las Cumaraguas……….. 31 4.2. Análisis fisicoquímicos y microbiológicos de muestras deDunaliella sp… 32 4.2.1. Caracterización Microbiológica………... 31

4.2.2. Análisis de los parámetros fisicoquímicos………... 33

(11)

xi

4.5. Estudio de las cantidades de β-carotenos extraídos respecto a los

Pigmentos Totales y Carotenos totales………...

56

CONCLUSIONES………. 60

RECOMENDACIONES………... 61

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………... 62

APÉNDICES………... 69

(12)

xii

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla Pág.

1 Estadísticos descriptivos para las medias de pH………... 33

2 Análisis de varianza para el pH……….... 34

3 Prueba de post Hoc (basada en tukey) para el pH……….... 35

4 Estadísticos descriptivos para las medias de Oxígeno Disuelto………... 36

5 Análisis de varianza para Oxígeno Disuelto………... 37

6 Prueba de post Hoc (basada en tukey)para Oxígeno Disuelto………... 38

7 Estadísticos descriptivos para Nitrógeno Total……… 39

8 Análisis de varianza para Nitrógeno Total………... 39

9 Prueba de post Hoc (basada en tukey) para Nitrógeno Total……... 40

10 Estadísticos descriptivos para las medias de Conductividad Eléctrica…. 41 11 Análisis de varianza para Conductividad Eléctrica……….. 42

12 Prueba de post Hoc (basada en tukey) para Conductividad Eléctrica…. 43 13 Estadísticos descriptivos para las medias de Salinidad……….. 44

14 Análisis de varianza para la Salinidad………. 45

15 Prueba de post Hoc (basada en tukey) paraSalinidad………. 45

16 Concentraciones y rendimientos a partir de los pigmentos totales y carotenos totales extraídos de Dunaliella sp………. 48 17 Peso de los pigmentos Totales en acetona(A) y carotenos totales con Hexano (H)... 49 18 Peso de las fracciones y valores de RF para las fracciones obtenidas en cromatografía en columna……….... 50

19 Concentraciones de las fracciones obtenidas en cromatografía en columna………

(13)

xiii

20 Estadísticos descriptivos para las medias RF………... 51 21

Análisis de Varianza para: RF………... 52

22 Prueba de Post Hoc (basada en Tukey) para la Variable RF………. 53 23 Estadísticos descriptivos para la Concentración de las fracciones de

β-carotenos de las muestras integradas…….………

53

24 Análisis de Varianza para la Concentración de las fracciones de β-carotenos de las muestras integradas……….

54 25 Prueba de Post Hoc (basada en Tukey) para la Concentración…………

55 26 Rendimiento del β-caroteno obtenido en las fracciones respecto a los

pigmentos totales y los carotenos totales………..

56

27 Datos Experimentales de Nitrógeno Total……… 69

28 Datos experimentales para las concentraciones de carotenos totales en el ensayo de factibilidad………

71 29 Datos experimentales para el rendimiento del ensayo de factibilidad…. 73 30 Datos experimentales para la determinación de las concentraciones de

carotenos totales en las muestras integradas………... 74 31 Datos experimentales para determinación de las concentraciones de las

fracciones de β-carotenos por cromatografía de columna……… 76 32 Datos experimentales para la determinación de Rf por cromatografía en

papel………. 78 33 Datos experimentales del rendimiento del β-caroteno obtenido, con

(14)

xiv

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura Pág.

1 Estructura del β-caroteno………... 14

2 Morfología del alga Dunaliella sp……….. 17

3 Orden de elución de compuestos y polaridad………... 18 4 Georeferenciación de estaciones de muestreo en el sector Las

Cumaraguas, Municipio Falcón, Estado Falcón, Venezuela...

31 5 Dunaliella sp Identificada a través de un Microscopio óptico

marca Nikon modelo FDX, con aumento de 40X y Dunaliella

sp de referencia..………..

(15)

xv

ÍNDICE DE GRÁFICO

Gráfico Pág.

1 Curva de absorción del β-caroteno en Hexano……….. 47

2 Rendimiento de β-caroteno obtenido respecto a los pigmentos totales en cada estación………

56 3 Rendimiento de β-caroteno obtenido respecto a los carotenos

totales en cada estación………..

57 4 Rendimiento de β-caroteno obtenido respecto a los pigmentos

totales en general………..

58 5 Rendimiento de β-caroteno obtenido respecto a los carotenos

totales en general………

(16)

xvi

ÍNDICE DE APÉNDICE

Apéndice Pág.

A Determinación de Nitrógeno Total………... 69

B Determinación de la concentración de carotenos totales en el ensayo de factibilidad……….

71 C Cálculo del porcentaje de rendimiento para el ensayo de

Factibilidad………..

73 D Determinación de las concentraciones de carotenos totales en

las muestras integradas………

74 E Determinación de las concentraciones de las fracciones de

β-carotenos por cromatografía de columna……….………

76 F Determinación de RF para cromatografía en papel………. 78 G Determinación del rendimiento del β-caroteno obtenido, con

respecto a los pigmentos totales y los carotenos totales...

(17)

xvii

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo Pág.

A Determinación de pH. Método Electrométrico……… 82

B Determinación de Oxígeno Disuelto. Método winkler modificado. 82 C Determinación de Nitrógeno total. Método Kjeldahl………. 84

D Determinación de Fósforo Total. Método del Cloruro Estañoso… 86 E Determinación de Conductividad Eléctrica. Método Electrométrico……….. 87 F Determinación de salinidad. Método Electrométrico……….. 88

G Determinación de la concentración de los carotenos totales para el ensayo de factibilidad y de las muestras de las estaciones integradas………. 88 H Determinación de la concentración de las fracciones de β-carotenos. Cromatografía en Columna………... 89 I Cromatografía de papel……….. 91

1 Establecimiento de las estaciones de muestreo, sector Las Cumaraguas, Falcón, Venezuela………... 93 2 Evidencia de Dunaliella sp, en el sector Las Cumaraguas, Falcón, Venezuela……… 93 3 Equipo GPS utilizado para georeferenciar el área de estudio……. 94

4 Toma y recolección de las muestras……….... 94

5 Muestras recolectadas……….. 95

6 Medición de Radiación Solar………. 95

7 Medición de la Temperatura……..………. 95

(18)

xviii

9 Kits de campo para la medición de Oxígeno Disuelto………….. 96

10 Equipo para la medición de Conductividad Eléctrica………. 97

11 Proceso de destilación para la medición de Nitrógeno Total…….. 97

12 Calentamiento para la medición de Fósforo Total………... 98

13 Aplicación de Ensayo de Factibilidad………... 98

14 Extracción de pigmentos………. 98

15 Extracciones de las Muestras de las estaciones integradas…... 99

16 Concentración de las muestras en rota vapor………. 99

17 Espectrofotómetro……….. 99

18 Cromatografía en Columna………. 100

19 Fracciones recolectadas en la cromatografía de columna……….. 100

20 Patrón de β-caroteno……….. 101

21 Reveladores para la Cromatografía en Papel………... 101

22 Cromatografía de Papel……….. 102

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xix RESUMEN

OBTENCIÓN DE β-CAROTENOS CON FINES INDUSTRIALES A PARTIR DE BIOFACTORIAS FOTOSINTÉTICAS DE

Dunaliella sp.

DEL SECTOR LAS CUMARAGUAS, MUNICIPIO FALCÓN, ESTADO FALCÓN. Chirinos J. Johanny J.; Vegas C. Karems A., Araujo J.; López A. Trabajo de grado para optar al título de Ingeniero Químico. UNEFM. Área de tecnología. Programa de Ingeniería Química. Punto Fijo. Enero 2012.

La presente investigación consistió en la obtención de β-carotenos a partir de biofactorías fotosintéticas de Dunaliella sp, para su posible uso industrial, obtenidas en el sector Las Cumaraguas, Municipio Falcón, Estado Falcón; a través de una investigación de tipo descriptiva y de campo. Se tomaron muestras de 10 estaciones por triplicado, luego se caracterizó la presencia de Dunaliella sp, a través de un estudio por microscopia óptica. Se determinaron las condiciones fisicoquímicas de la microalga, obteniéndose rango de valores de pH de (6,82 a 7,69); Oxígeno Disuelto (OD) (1,833 a 2,80) mg/L; Nitrógeno Total (2,720 y 5,467) ppm; Conductividad Eléctrica (582719,19 a 580719,70) µS/cm; Salinidad (265067,68 a 378406,603) µS/cm, en lo que respecta al fósforo total cantidad mínima detectable. Se aplicaron ensayos de factibilidad donde el método más efectivo fue el método manual con un rendimiento de 68,68% reflejando que la vibración ocasionada por la centrifugación y la sonicación originan cambios en la moléculas dando lugar la oxidación en las acciones biológicas de la misma y por tanto no resultaran factibles. Se utilizó solventes con alta solubilidad sobre los carotenos, la acetona para la extracción de los pigmentos totales y hexano en la obtención de β-caroteno. La caracterización de las muestran se realizó mediante técnicas cromatográficas que permitieron identificar la presencia de β-caroteno con un patrón de referencia de β-caroteno, el cual fue solidificado para su posible uso industrial, obteniendo un porcentaje de rendimiento de β-carotenos extraído respecto a los pigmentos totales y los carotenos totales de 45,18% y 76,14% respectivamente.

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1

INTRODUCCIÓN

La exploración de nuevas formas de aprovechamiento de la energía solar por medio de sistemas biológicos se ha enfocado en los últimos años hacia la explotación comercial de las microalgas; en un sentido amplio y desde el punto de vista biotecnológico, el término microalga se refiere a aquellos microorganismos con estructura eucariota, fotoautrofos, capaces de transformar la energía solar en energía química mediante fotosíntesis oxigénica con una elevada eficiencia y capaces de asimilar carbono en forma de CO2 (López, 2008).

En las últimas décadas el desarrollo tecnológico en cuanto a la producción de microalgasa gran escalaha sido importante, todo ello vinculado con su incorporación en la alimentación y recientemente, en la industria farmacéutica y cosmética (Sánchez, 2004).

Entre los compuestos de más interés estudiados en especie de microalgas como la Dunaliella sp destacan los carotenoides; estos son una clase de pigmentos terpenoides que contienen en su estructura 40 átomos de carbono derivados biosintéticamente a partir de dos unidades de geranil-geranilpirofosfato, en su mayoría son solubles en solventes apolares y de coloraciones que oscilan entre el amarillo y el rojo (Martínez, 2003).

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2

el β-caroteno es el más abundante y el más eficiente que se halla en los alimentos (Martínez, 2003).

Se estableció un muestreo aleatorio simple para estudiar las condiciones fisicoquímicas de las cepas de Dunaliella sp recolectadas en las salinas de Las Cumaraguas; en cuanto a su morfología se utilizó un microscopio de luz con el fin de caracterizar el género mediante su forma, tamaño y color. Para obtener el contenido de β-carotenos se realizaron ensayos de factibilidad para la extracción de los pigmentos de Dunaliella sp; a los carotenoides encontrados se les aplicó una separación y purificación mediante cromatografía de columna, comprobando las

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3

CAPÍTULO I

EL PROBLEMA

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4 CAPÍTULO I EL PROBLEMA 1.1. Planteamiento del problema.

El Estado Falcón está situado en la zona Noroeste de Venezuela en una posición geográfica privilegiada, cuenta con aproximadamente 660 kilómetros de costa que presentan porciones con formaciones naturales conocidas como salinas, las cuales han sido originadas por deshidratación de una porción de mar sobre tierra firme. Las Cumaraguas es una de ellas, está ubicada al noreste de la Península de Paraguaná, Municipio Falcón, poseen una extensión de 310 hectáreas y constituyen una superficie de lagunas naturales y artificiales interconectadas en las cuales las aguas del mar, propias de la precipitación y nivel freático, fluyen por gravedad o bombeo por zonas donde se forman diversos cristales de sal. (Álvarez y Col. 1994).

En la actualidad no se han considerado los espacios de las cumaraguas como una biofactoria fotosintética donde se lleve cabo un estudio sobre la extracción de metabolitos secundarios o compuestos orgánicos de microalgas capaces de generar una gran variedad de productos con aplicación industrial, como el β-caroteno presente en la Dunaliella sp.

Por otra parte a pesar de las investigaciones realizadas se conocen muy poco sobre las condiciones fisicoquímicas en donde se desarrolla y los rendimientos de extracción del compuesto a partir de esta microalga también son desconocidos en el sector Las Cumaraguas.

(24)

5

Para minimizar esta problemática se planteó aprovechar esta zona y utilizarla como materia prima para la producción de β-caroteno, el cual resalta de los demás carotenoides, dado que en la actualidad se le han atribuido propiedades de interés, que lo catapultan como un compuesto muy demandado por la industria medico-farmacéutica y cosmética.

1.2. Objetivos de la investigación.

1.2.1. Objetivo General.

Obtener β-carotenos con fines industriales a partir de Biofactorias fotosintéticas de

Dunaliellasp. Del sector Las Cumaraguas, Municipio Falcón, Estado Falcón.

1.2.2. Objetivos Específicos.

 Muestrear a partir de las biofactorías fotosintéticas localizadas en Las Cumaraguas.

 Caracterizar las condiciones fisicoquímicas y microbiológicas en donde se desarrolla el alga para evaluar su relación con la cantidad de β-caroteno.

 Aplicar ensayos de factibilidad con el fin de seleccionar el método adecuado para la obtención de β-caroteno a partir de Dunaliella sp.

 Caracterizar el β-caroteno presente en la Dunaliella sp.

 Evaluar el rendimiento de la cantidad de β-caroteno presente en la microalga

Dunaliella sp para su posible uso Industrial.

1.3. Justificación.

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6

es metabolizada para generar vitamina A, la cual es necesaria para lograr una dieta balanceada, y coadyuvar en el mantenimiento de una buena salud, fortaleciendo el sistema inmunitario, la visión y el crecimiento sano, brindándonos protección de los efectos nocivos de los radicales libres, que pueden ocasionar enfermedades cardiovasculares e incluso al cáncer (Bejarano, 2008). Es decir, la utilización de la

Dunaliella sp como biofactorías del β-caroteno se perfila como una solución al requerimiento industrial de esta sustancia. Hasta los actuales momentos, la mayor fuente natural de β-caroteno es la de la zanahoria.

El estudio de los parámetros fisicoquímicos y microbiologicos ocupan un lugar importante en lo que se refiere a la obtención de β-caroteno ya que estas variables influyen directamente en los requerimientos y crecimiento de los microorganismos (Tovar, 2007). La determinación de los mismos permitió conocer las condiciones que permiten el desarrollo de estas microalgas.

Por otra parte, la selección del método de extracción Manual permitió conocer que existen algunos métodos que oxidan la molécula impidiendo la obtención del producto deseado.

Con este proyecto de investigación se busca el aprovechamiento de estos microorganismos, los cuales se pueden utilizar como materia prima para la obtención de β-caroteno; producto que puede tener mucha utilidad en el mercado, presentando una alternativa factible debido a su disponibilidad de forma natural, presente en salinas, como ocurre actualmente en Las Costas del Estado Falcón.

1.4. Alcance y delimitación del Estudio.

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7

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8

CAPÍTULO II

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9 CAPITULO II MARCO TEÓRICO

2.1. Antecedentes.

Existen diversos trabajos de investigación reportados sobre la determinación de los parámetros fisicoquímicos y microbiologicos en Dunaliella sp y los métodos de extracción y caracterización de carotenos que se han tomado como referencia por los autores ya que pueden aportar beneficios a esta investigación. Entre los estudios más revelantes que tienen relación con el tema se citan los siguientes.

Martínez, (2003). “Carotenoides”. Realizó una descripción amplia de la descripción de los carotenoides, su clasificación, distribución, estructuras y métodos analíticos de extracción. Este trabajo aporta a la investigación lo referente a su fundamento teórico.

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10

Romero y colaboradores, (2008). “Cuantificación de carotenoides totales y β-caroteno en dos cepas de Dunaliella salina (Chlorophyta, Volvocales) aisladas de lagunas hipersalinas de Venezuela”. El objetivo principal de esta investigación fue separar e identificar los carotenoides totales y en especial el β-caroteno. La identificación y cuantificación del β-caroteno en este estudio se realizó mediante una Cromatografía de Líquidos de Alta Eficacia (HPLC), haciendo uso de un patrón comercial o estándar. Se probaron diferentes mezclas de solventes: acetona/agua, acetona/metanol y tetrahidrofurano/etanol, en tres proporciones cada una, 50/50, 70/30 y 90/10 V/V para obtener la mayor cantidad de estos carotenoides.

Esta investigación contribuyó con la metodología utilizada para la extracción de carotenoides totales y en especial β-carotenos a partir de en cepas de Dunaliella sp.

Tovar y colaboradores, (2007). “Análisis Físico-químico y Estudio De Microalgas Y Hongos de las aguas de la salina “Las Cumaraguas” en Paraguaná, Estado Falcón”.Esta investigación se basó en un estudio de campo en la que se describieron microalgas y hongos, al mismo tiempo se descartó la presencia de Escherichia coli. Este trabajo se caracterizó por la metodología dentro de la cual se analizó parte de las condiciones fisicoquímicas de la salmuera en Las Cumaraguas. Para cumplir con los objetivo, en el trabajo se tomaron cinco (05) muestras semanales en un período de cinco (05) semanas entre marzo y abril. Los análisis fueron realizados en los laboratorios de la UNEFM según la metodología descrita en la American Public Health Asociation (1989). Mediante la observación directa a microscopio de luz se identificó la microalga Dunaliella sp además de esto se hicieron pruebas de tolerancia a diferentes niveles de salinidad.

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11

oxígeno disuelto, conductividad eléctrica; entre otros, que proporcionarían conocimientos sobre los valores que esta microalga tendría.

2.2. Bases teóricas.

2.2.1. Los Carotenoides.

Los carotenoides son una clase de pigmentos terpenoides con una estructura de 40 átomos de carbono derivados biosintéticamente a partir de dos unidades de geranil-geranilpirofosfato, en su mayoría son solubles en solventes apolares y de coloraciones que oscilan entre el amarillo (por ejemplo el β-caroteno) y el rojo (por ejemplo el licopeno). Dentro de los carotenoides más distribuidos en la naturaleza se encuentra el α-Caroteno, β-Caroteno, γ-Caroteno, ε-Caroteno, Licopeno, Luteína, Violaxantina, Zeaxantina, Neoxantina, Rubixantina Fucoxantina y Criptoxantina (Santizo, 2004).

Otra definición de los carotenoides, es que estos son un amplio grupo de pigmentos, muy difundidos en los reinos vegetal y animal. La coloración de estos pigmentos es desde el amarillo, naranja, rojo, hasta el púrpura. Químicamente son insolubles en agua y se disuelven en grasas y en disolventes orgánicos, además de esto, se les clasifica como pigmentos lipocromos (pigmento graso), cabe mencionar que en la actualidad se conocen alrededor de 800 carotenoides presentes en la naturaleza (Ong y Tee, 1992).

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sanos, tejidos blandos y óseos, de las membranas mucosas y de la piel, mejora la visión nocturna, como elemento para la reproducción y la lactancia (Zamora, 2007).

2.2.1.1. Clasificación.

En la naturaleza existen dos grupos claramente definidos de carotenoides: el primer grupo los carotenos y el otro grupo las xantofilas, los primeros son denominados como hidrocarburos y estos están de manera minoritaria, por otra parte, las xantofilas contienen al menos un átomo de oxígeno en su molécula y de manera general estas representan la mayoría de los carotenoides. Además de esto, los autores destacan que todos los carotenos incluyen α, ß y γ-Caroteno, los únicos que poseen actividad como vitamina A (Bendich y Olson, 1989).

2.2.1.2 Distribución y Estado natural.

Los carotenoides se encuentran ampliamente distribuidos en el reino vegetal, en bacterias, y muy pocos se han reportado en animales (por ejemplo los colores rojizos de las plumas del flamingo son debidos a la cantaxantina, un carotenoide), y particularmente invertebrados marinos como las esponjas, estrellas de mar, pepinos de mar, erizos de mar, y otros. En los animales superiores el ß-caroteno es un requerimiento dietario esencial pues es precursor de la vitamina A la cual es un suplemento vitamínico que previene una serie de enfermedades en el ser humano. Los carotenoides también están presentes en partes aéreas de las plantas, especialmente en hojas, tallos y flores, en frutos (por ejemplo tomate, pimentón, etc.), y en menor proporción en raíces (por ejemplo la zanahoria) (Martínez, 2003).

2.2.1.3 Extracción de los carotenoides.

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(por ejemplo isomerismo cis y trans) es un factor a considerar al momento de realizar su extracción. El calor también favorece reacciones térmicas de degradación. El aire debido al oxígeno favorece la oxigenación de los enlaces dobles a funciones epóxido, hidroxilos y peróxidos, entre otros (Contreras, 2004).

Por estas razones la extracción de carotenoides se debe preferiblemente realizar en condiciones de ausencia de luz, a temperatura ambiente o menor, y en ausencia de oxígeno (por ejemplo con una atmósfera artificial de nitrógeno). Además se debe realizar lo más rápido posible para evitar la degradación por la acción conjunta de estos factores adversos (Martínez, 2003).

Debido a que los carotenoides son solubles en solventes apolares para la extracción se utiliza solvente como éter etílico, benceno, cloroformo, acetona, acetato de etilo, entre otros (Duran y Moreno, 2000).

2.2.2. El β-caroteno

Es un miembro de la familia de los carotenoides, que son compuestos liposolubles con una gran pigmentación roja, naranja o amarilla presentes de forma natural en muchas especies vegetales. Estos carotenoides se dan de forma natural y al ser engestados pueden ser convertidos en vitamina A por el organismo, de igual forma, son denominados como “carotenoides provitamina A”, el β-caroteno es el más abundante y el más eficiente que se halla en diversas especies vegetales (Restrepo, 2007).

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actividad como vitamina A), parecen ofrecer protección contra el cáncer de pulmón, colorectal, glándulas mamarias, útero, próstata y demás enfermedades (Carranco, 2002).

Figura 1. Estructura del β-caroteno.

Fuente: Restrepo, 2007.

2.2.2.1. Producción de β-caroteno.

Dunaliellasp es un organismos fotosintético capaz de generar una variedad de productos con interés industrial, de aquí deriva el interés científico y socio-económico de estas algas en cuanto a la biotecnología que estas pequeñas plantas acuáticas representan, Entre los compuestos de gran interés comercial de la

Dunaliella sp sobresale precisamente los carotenoides y de estos es el β-caroteno el caroteno que en mayor cantidad se presenta en las cepas de Dunaliella sp (García y col .2005).

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lo que se busca es precisamente métodos de extracción seguros y que pueda extraer con precisión y pureza los debidos carotenoides (Costa y Col. 2000).

2.2.3. Biofactorias Fotosintéticas.

Las biofactorías fotosintéticas son aquellas aéreas donde se producen en grandes cantidades un compuesto de interés con el uso de microorganismos autótrofos que se desarrollan en un sistema abierto. La utilización de la dunaliella sp

como factorías celular, puede usarse para extracción de metabolitos secundarios con importantes actividades biológicas tales como β-caroteno, vitaminas, enzimas y proteínas, entre otros que representan un especial interés para la industrial. En este sentido Olaizola (2003) describe que el proceso para la producción de compuestos bioactivos contempla al menos dos etapas: 1) la identificación de nuevos compuestos, así como el mejoramiento de los ya identificados y 2) desarrollo de sistemas de producción adecuados que permitan el escalamiento a nivel industrial. No obstante, advierte que aunque las microalgas poseen una alta productividad primaria, muchos compuestos químicos de interés son producto del metabolismo secundario, este último activado en condiciones no conducentes al crecimiento rápido.Este hecho ha sido corroborado en la obtención de pigmentos de interés a partir de Dunaliella sp.

(Naranjo, 2010).

2.2.4. Dunaliella sp.

Dunaliella sp es una microalga verde halotolerante, y probablemente el microorganismo fotosintético más estudiado para la obtención de cultivos masivos. La especie Dunaliella sp es la fuente algal más rica en β-caroteno y glicerol (Sánchez, 2004).

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 Es uno de los pocos organismos que pueden vivir en medios con tal alta concentración salina junto con un pH alcalino óptimo.

 El crecimiento de organismos no fotosintéticos (bacterias, hongos) que no se alimenten de la propia alga se ve severamente limitado, ya que ésta sobrevive en un medio inorgánico simple.

 En condiciones de crecimiento seleccionadas, Dunaliella sp acumula cantidades masivas de β-caroteno.

 Al carecer de pared celular, el alga seca es fácil y completamente digerible para los animales y humanos (López, 2008).

2.2.4.1 Clasificación y morfología de Dunaliella sp.

El género Dunaliella sp pertenece a la clase Chlorophyceae y al orden Volvocales. Fue descrito por primera vez por Teodoresco en 1905, y su nombre es debido a M. F. Dunal, quien fue el primero en reconocer que el color rojo de ciertos reservorios hipersalinos era producido por esta alga. Este género posee 29 especies y una gran cantidad de variedades aún no muy bien definidas (Gómez, 1996).

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Figura 2. Morfología deDunaliella sp. Fuente: López, 2008; Calvo, 2007.

2.2.5. Cromatografía en columna.

Es una técnica que se emplea para la separación de los componentes individuales de una mezcla y en ciertos casos, para identificar un compuesto comparando su comportamiento cromatográfico con el de sustancias conocidas empleadas como patrón. La cromatografía en columna es muy utilizada en química orgánica, ya que permite separar y purificar cantidades apreciables de compuestos presentes en una mezcla (Alonso, 2010).

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Algunos compuestos se ven más fuertemente retenidos por el adsorbente (fase estacionaria) y por lo tanto avanzarán más despacio. Por el contrario, otros apenas son retenidos y avanzarán a mayor velocidad (Valcaces, 1988).

El orden aproximado de elución de compuestos y de polaridad es aproximadamente el que se indica:

Figura 3. Orden de elución de compuestos y polaridad. Fuente: (López, 2009).

2.2.6. Cromatografía de papel.

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somete a procesos de revelado con un reactivo que tiña a las sustancias de interés así como ocurre en la cromatografía en capa fina (Alonso, 2010).

2.3. Definición de términos básicos.

Alga: Organismo eucariótico fotosintético, unicelular o multicelular simple (Curtis y Col. 2006).

ANOVA ó Análisis de Varianza: Método estadístico que permite encontrar la relación entre la variable independiente y la dependiente, comparando simultáneamente varios parámetros (Puentes, 2005).

Antioxidante: Una molécula capaz de retardar o prevenir la oxidación de otras moléculas (Puentes, 2005).

Biofactoria: Son sistemas abiertos donde se usan microorganismos, que producen grandes cantidades de uno o varios compuestos de interés (Naranjo, 2005).

Dunaliella: Género de microalgas microscópicas de la clase Chlorophyceae y del orden Volvocales. Son unicelulares y con morfologías muy variadas (Guevara, 2005).

Espectrofotómetro: Instrumento usado en la física óptica que sirve para medir, en función de la longitud de onda (Duboi, 2006).

Liposoluble: Sustancias solubles en solventes no polares como grasas, aceites, ceras y carotenos (Barnes, 2006).

Microalga: Organismo unicelular o pluricelular cuyas células realizan todas las funciones vitales de forma independiente mediante la fotosíntesis (Curtis y Col. 2006).

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20

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CAPÍTULO III

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22 CAPÍTULO III

MARCO METODOLÓGICO

3.1. Tipo y Diseño de la investigación.

El tipo de investigación en el desarrollo de este proyecto fue Descriptiva, de acuerdo con los objetivos planteados ya que busca especificar las propiedades importantes de un fenómeno que sea sometido a análisis (Hernández y Col. 2006). De campo, con dos diseños; uno no experimental para toma de muestra, y otro experimental posterior a la toma de muestra. Según Hernández y Col. (2007) los estudios no experimentales son aquellos donde el o los investigadores no varían ningunos de los factores que pueden influir en el fenómeno u objeto de estudio. Por su parte, la investigación experimental estudia la relación de causa efecto entre la variable dependiente e independiente, exponiendo a uno o más grupos a un tratamiento y a otro no, para luego comparar los resultados (Rísquez y Col. 1999). En este trabajo sólo se limitó a tomar las muestras y se evaluaron las condiciones donde fueron obtenidas dichas microalgas, por lo tanto, en ningún momento se controlaron los niveles de pH, temperatura, ni radiación solar, solo se observaron y evaluaron estos parámetros sin ninguna manipulación o control sobre ellos, en todo caso, la manipulación deliberada de las condiciones fue precisamente en la extracción y cuantificación del β-caroteno de las cepas de Dunaliella sp, provenientes de las salinas de Las Cumaraguas del Estado Falcón.

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3.2. Técnicas e instrumentos de recopilación de datos.

Un instrumento de recolección de datos es cualquier recurso, dispositivo o formato (en papel o digital), que se utiliza para obtener, registrar o almacenar información de interés (Arias, 2006).

Los instrumentos utilizados en esta investigación fueron:

 Libreta de campo donde el investigador anota lo observado.

 Computadora portátil con sus respectivas unidades para almacenaje de información: disco duro o CD.

 Dispositivo GPS (Anexo 3).

 Unidades de almacenamiento masivos USB.

 Cámara fotográfica.

Con la finalidad de ampliar y profundizar en el tema, los investigadores recurrieron aparte de estos instrumentos, recurrieron a revisiones bibliográficas, para establecer de manera concreta los criterios y metodología para llevar a cabo la investigación.

Los análisis de laboratorio, también fueron realizados con la finalidad de observar de forma cualitativa y cuantitativa los parámetros físicoquímico y microbiológicos del β-caroteno extraído de la especie Dunaliellasp.

3.3. Técnicas de procesamiento y análisis de datos.

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Una vez realizada la recolección de datos cualitativos y cuantitativos tanto en campo como a nivel de laboratorio, la información se codificó mediante el uso de programas informáticos, específicamente transcribieron los datos en el software estadístico Statistics, versión 20 (Morgan, 2001). De esta manera se realizó una matriz de datos organizada según las especificaciones técnicas del paquete estadístico SPSS® una vez obtenido este diseño se efectuó un modelo factorial para generar un análisis de varianza y una prueba de post-hoc basada en una Prueba de Tukey (a un nivel de significancia de 5%, α=0,05) para corroborar significancias e inferencias estadísticas y de esta manera analizar cuantitativamente las cantidades de β-caroteno presente en extractos de Dunaliella sp proveniente de las zonas salinas de la Península de Paraguaná, estado Falcón.

Este tipo de procedimientos estadísticos permite evaluar el efecto individual y conjunto de dos o más factores (variable independiente categórica) sobre una o varias variables dependientes y cuantitativas. Además de esto, cabe destacar que el programa estadístico SPSS ® es desarrollado por la Universidad de Chicago y es uno de los paquetes estadísticos más difundido y utilizado por diversas universidades en América.

3.4. Población y muestra

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muestreo correspondió a un muestreo en zig-zag generando tres (03) réplicas de la muestra. Cabe mencionar que estas muestras luego fueron integradas en el momento de realizar su extracción, es decir; se agrupó la estación 1,2; 3,4; 5,6; 7,8; 9,10 dando lugar a 5 muestras en total tomando en cuenta que se contaba con cantidades suficientes de reactivos.

3.5. Fases de la investigación.

El siguiente proyecto de investigación se regirá por las siguientes cinco fases:

Fase I. Muestreo a partir de las biofactorías fotosintéticas localizadas en Las Cumaraguas:

A. Establecimiento de las estaciones de muestreo.

En el área ubicada en las coordenadas UTM 406615 E y 1130480 N hasta 401911 E y 1342114 N se seleccionaron diez (10) estaciones de trabajo de forma aleatoria, utilizando como criterio las zonas de biofactorías de β-carotenos con coloración rojiza intensa o de mayor presencia de Dunaliella sp (Anexo 2). Cada estación fue georeferenciada con un GPS marca Garmin modelo Etrex. (Anexo 3).

B. Toma de la Muestra.

El tipo de muestreo fue aleatorio simple con un patrón de muestreo en zig-zag de forma puntual. Las muestras fueron colectadas en cada estación por triplicado para un total de treinta unidades experimentales. Se utilizaron envases con una capacidad de 2 litros. Tanto estos como sus tapas fueron previamente esterilizados. El llenado se realizó hasta aproximadamente el 80 % de la capacidad del envase y se cerró de manera hermética e identificándolo según el lugar (estación) fecha, hora y número de la muestra (Anexo 4).

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26

estas muestras se obtuvieron dos alícuotas, una para los análisis fisicoquímicos y otra alícuota para la obtención de β-caroteno (Anexo 5).

Fase II. Caracterización de las condiciones fisicoquímicas y microbiológicas para evaluar su relación con la cantidad de β-caroteno.

En la zona de estudio se midieron los parámetros de radiación solar (Anexo 6) y temperatura (Anexo 7), utilizando un Termómetro y un radiómetro portátil respectivamente. Las características fisicoquímicas se midieron para determinar las propiedades que presentaba la microalga. Los parámetros fueron los siguientes:

pH: La medición de pH (Anexo 8) en cada muestra se llevó a cabo por el método electrométrico descrito en el manual de aguas potables y residuales basado en la medida de la actividad de los iones hidrógenos por medición potenciométrica utilizando un electrodo patrón de hidrógeno y otro de referencia (Franson, 1992).

Oxígeno Disuelto: Para este análisis se aplicó el método “Winkler modificado” (Anexo 9) el cual consiste en la adición de soluciones de manganeso divalente, seguido de álcali fuerte, a la muestra contenida en un frasco con tapón de vidrio. Se oxida rápidamente una cantidad equivalente del precipitado disperso de hidróxido manganoso divalente a hidróxidos con mayor estado de valencia. En presencia de iones yoduro, en solución ácida, el manganeso oxidado revierte al estado divalente con liberación de yodo equivalente al contenido original de Oxigeno disuelto. Entonces se valora el yodo con una solución patrón de tiosulfato. El punto final de la titulación se puede detectar visualmente, con un indicador de almidón, o electrométricamente, con técnicas potenciométricas (Franson, 1992).

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Fósforo Total: Para este caso se aplicó el método del “Cloruro estañoso” (Anexo 12) fundamentado en la formación de acido molibdofósforico que se reduce con cloruro estañoso a azul de molibdeno de color intenso (Franson, 1992).

Conductividad Eléctrica: Para determinar la conductividad se utilizó el método electrométrico (Anexo 10) descrito en el manual de aguas potables y residuales en el que se obtiene una expresión numérica de la capacidad de una solución para transportar una corriente eléctrica (Franson, 1992).

Salinidad: Para este análisis se utilizó el método electrométrico donde incluye la medida de una propiedad física como lo es la conductividad partiendo de una relación empírica entre la salinidad y la propiedad física determinada (Franson, 1992).

Las Muestras colectadas también fueron observadas por microscopía óptica en un microscopio Marca Nikon FX-35DX para conocer sus características microscópicas.

Fase III. Aplicación de ensayos de factibilidad con el fin de seleccionar el método adecuado para la obtención y caracterización de β-caroteno.

Extracción de β-caroteno presente en Dunaliella sp.

Las alícuotas seleccionadas para la extracción de β-carotenos fueron tomadas al azar e integradas en una sola muestra, aplicándole cuatro (4) métodos por triplicado, para la ruptura de la membrana celular:

A. Sin aplicación de algún metodo (Manual).

B. Centrifugación a 2000 R.P.M. durante 10 min (Anexo 13).

C. Sonicación a 60 Hz (Anexo 13).

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28

Posterior a esto se realizó la extracción utilizando como solvente la acetona (Anexo 14), debido a que los carotenoides en su mayoría son solubles en solventes apolares, la acetona es uno de ellos y el más utilizado a nivel de laboratorio por resultar ser el más accesible de encontrar en el mercado (Guevara, 2005).

Luego de la extracción, las muestras fueron llevadas a un rotavapor para concentrar la solución, midiendo de esta manera el peso de los pigmentos totales presentes. A la solución concentrada se le agregó hexano como solvente de extracción de los carotenoides y sulfato de sodio anhidro (Na2SO4) como agente desecante, extrayendo asi únicamente los carotenoides, dejando a un lado los demás pigmentos que la microalga contenía como por ejemplo: la Xantofila, entre otros. La solución que contenía hexano fue llevada a espectrofotometría para medir su absorbancia a 490nm, (punto máximo de absorción, el cual se determinó realizando lecturas a todas las ondas en el spectronic 20 (Anexo 17), a una solución patrón de β-caroteno diluida en hexano, y luego se llevo a rotavapor (Anexo 16) para obtener el peso de los carotenos totales presentes en la muestra (López, 2005).

En cuanto a la factibilidad, se consideró el rendimiento en relación a la cantidad de carotenos totales extraído dividido por la cantidad de pigmentos totales multiplicada por 100 (Arango, 2006).

El método con el que se obtuvo mayor rendimiento fue el utilizado para la extracción de las muestras de las estaciones a estudiar.

Fase IV.Caracterización del β-caroteno.

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estación seis (6), la estación (7) con la estación (8), y finalmente la estación (9) con la estación diez (10).

Luego de la extracción realizada a cada una de las muestras integradas, se llevaron a cromatografía en columna (Anexo 18) para su separación utilizando como fase estacionaria sílica gel de carácter polar y como fase móvil (eluyente) se utilizó un solvente único en este caso Hexano. Dicho disolvente se hizo pasar a través de la columna por efecto de gravedad. La columna se preparó mezclando el soporte con disolvente y se relleno poniendo en el fondo de ésta un poco de algodón, para evitar que la sílica quedara retenida en la columna. Después se introdujo la muestra por la parte superior de la columna y se eluyó con el disolvente elegido, colectándose fracciones (Anexo 19) de cada muestra para medirle su absorbancia y llevarlas a rotavapor (Anexo 16) para obtener su peso y determinar las concentraciones. Estas fracciones fueron sometidas a cromatografía de papel (Anexo 22), con el fin de determinar su grado de pureza y comparar las muestras con el patrón de β-caroteno (Anexo 20) (López, 2009).

Fase V. Evaluación del rendimiento de la cantidad de β-caroteno presente en la microalga, para su posible uso en la Industria.

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30

CAPÍTULO IV

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CAPÍTULO IV

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Muestreo a partir de biofactorias fotosintéticas localizadas en las Cumaraguas.

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4.2.Análisis fisicoquímicos y microbiológicos de muestras de Dunaliella sp.

4.2.1. Caracterización Microbiológica

Figura 5. Dunaliellasp Identificada a través de un Microscopio óptico marca Nikon modelo FDX, con aumento de 40X y Dunaliellasp de referencia.

Todas las muestras estudiadas presentaron la morfología descrita para

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33 4.2.2. Análisis de los parámetros fisicoquímicos.

En el sector las Cumaraguas, al momento de colectar las muestras se midió en campo una temperatura promedio de 32 ºC, cielo totalmente despejado y una radiación solar de 1490 W/m2.

En cuanto a los datos arrojados en los ensayos de la variable pH (Tabla 1), se puede apreciar que los valores se encuentran relativamente próximos al centro de la distribución, en este caso en todas la zonas como estaciones, se pudo observar claramente que los valores asociados con la media están entre 6,8 y 7,6. En todas las observaciones se apreciaron que la desviación típica, están asociados a los valores de la raíz cuadrada de la varianza, en este caso las puntuaciones de la variable pH no se alejan significativamente de su media. En base a intervalos de confianza 95% Los valores detallan que en la estación ocho (08) se apreció un pH mínimo o inferior de 6,3 y en la estación seis (6) se observó un pH máximo o superior de 8,05.

Tabla 1. Estadísticos descriptivos para las medias de pH. .

Estación Media Desv. Típica Intervalo de confianza 95%

Límite inferior Límite superior

1 6,827 0,006 6,386 7,268

2 6,910 0,01 6,469 7,351

3 6,977 0,006 6,536 7,418

4 6,967 0,012 6,526 7,408

5 6,907 0,006 6,466 7,348

6 7,613 0,157 7,172 8,054

7 6,907 0,012 6,466 7,348

8 6,827 0,006 6,386 7,268

9 6,910 0,01 6,469 7,351

10 6,933 0,376 6,492 7,374

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34 Tabla 2. Análisis de varianza para el pH.

Origen Suma de

cuadrados tipo

III

Grados de

libertad

Media

cuadrática

Coeficiente F

(Fisher-Snedecor)

Significancia

Modelo

corregido 1,413

a

9 ,157 1,171 ,364

Intersección 1460,635 1 1460,635 10894,841 ,000

Estaciones 1,413 9 ,157 1,171 ,364

Error 2,681 20 ,134

Total 1464,729 30

Total corregida 4,094 29

Fuente: datos procesados con IBM® SPSS® Statistics, v. 20

(54)

35

Tabla 3. Prueba de Post Hoc (basada en Tukey) para el pH.

Estación Número de datos

Subconjunto

1

1 3 6,827

8 3 6,827

5 3 6,907

7 3 6,907

2 3 6,910

9 3 6,910

10 3 6,933

4 3 6,967

3 3 6,977

6 3 7,613

Fuente: datos procesados con IBM® SPSS® Statistics, v. 20

En la Tabla 3, se muestra un resumen basado en el procedimiento de Tukey del resultado obtenido con las comparaciones múltiples del pH observado en el muestreo para cada estación. Se refleja que todas las medias no difieren entre sí ya que se agrupan en el mismo subconjunto. Para este caso de estudio, se observó que la estación uno tenía una media de 6,827 y la estación seis con 7,613 de pH. Las comparaciones múltiples posthoc definida para este caso, especifica que el pH no tiene de manera significativa un efecto en relación a cada estación, o en otras palabras, en cada estación se puede tener una gran probabilidad de conseguir un pH relativamente igual.

(55)

36

en cultivos se han presentado valores superiores pH 8,3 (Borowitzka, 1988) sin embargo Ben-Amotz (1989) propone que el pH óptimo para el crecimiento de

Dunaliella sp, se encuentra entre 7 y 9 en medios de cultivo, aunque en el medio natural o biofactorias fotosintéticas la media total obtenida fue de pH 6,98≈7, lo que propone que este sea el pH optimo para la obtención de β-caroteno a partir formas evolutivas de cisto en la que se recupera un buen rendimiento de β-caroteno.

Tabla 4. Estadísticos descriptivos para las medias de Oxígeno disuelto (OD).

Estación Media

(mg*L-1)

Dev. Típica Intervalo de confianza 95%

Límite inferior Límite superior

1 2,800 0,10 2,524 3,076

2 2,533 0,058 2,257 2,810

3 2,167 0,289 1,890 2,443

4 2,333 0,289 2,057 2,610

5 2,333 0,289 2,057 2,610

6 2,733 0,208 2,457 3,010

7 2,633 0,231 2,357 2,910

8 2,333 0,289 2,057 2,610

9 2,000 0,0 1,724 2,276

10 1,833 0,289 1,557 2,110

Fuente: datos procesados con IBM® SPSS® Statistics, v. 20

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Tabla 5. Análisis de varianza para Oxigeno Disuelto (OD).

Origen Suma de

cuadrados tipo III Grados de libertad Media cuadrática Coeficiente F (Fisher-Snedecor) Significancia Modelo

corregido 2,650

a

9 ,294 5,590 ,001

Intersección 168,507 1 168,50

7 3199,500 ,000

Estaciones 2,650 9 ,294 5,590 ,001

Error 1,053 20 ,053

Total 172,210 30

Total

corregida 3,703 29

Fuente: datos procesados con IBM® SPSS® Statistics, v. 20

La Tabla 5, muestra que el efecto de la variable independiente (estación), muestra un efecto significativo asociado al nivel crítico soportado para el presente estudio (α=0,05); la variable estación presentó un nivel de significancia de 0,001 esto indica que está muy por debajo del nivel alfa, lo que representa que si existen diferencias significativas para los datos de (OD) en relación a cada estación.

La prueba de Tukey, refleja que en relación a las medias, existen diferencias entre los datos y en este caso el análisis de Tukey agrupa en tres subconjuntos los datos sometidos a estudio. Las estaciones 4, 5 y 8 arrojaron medias semejantes en cuanto a los valores de (OD) (2,333 mg*L-1). En este mismo sentido, la estación (10) sostuvo una media estadística de 1,833 mg*L-1 lo que la ubica como la estación con menor cantidad de (OD); por el contrario la estación con la mayor media máxima fue la número (1) con valores de 2,80 mg*L-1.

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38

encontró en esta investigación valores superiores que oscilan entre (OD) 2,3 a 2,8, con una media total de 2,37 lo que clasifica el tipo de ambiente analizado en un medio hipóxico (OD) (1-5) mg.L-1 propicio para la generación de un estrés ambiental, el cual caracteriza la formación de una forma evolutiva de cisto por parte de la microalga Dunaliella sp a este bajo nivel de oxigeno se hace casi exclusivo el crecimiento de este tipo de microalga ya que en este tipo de ambiente, las especies piscícolas, e incluso gran parte de muchas microalgas del plancton marino no sobreviven, lo que hace a estos microorganismos, ``extremos´´ por su capacidad para desarrollarse en ambientes con poco oxigeno (Cisterna, 2008).

Tabla 6. Prueba de Post Hoc (basada en Tukey) para Oxigeno Disuelto (OD).

Estación Número

de datos

Subconjunto

1 2 3

10 3 1,833

9 3 2 2

3 3 2,167 2,167 2,167

4 3 2,333 2,333 2,333

5 3 2,333 2,333 2,333

8 3 2,333 2,333 2,333

2 3 2,533 2,533

7 3 2,633 2,633

6 3 2,733

1 3 2,8

Fuente: datos procesados con IBM® SPSS® Statistics, v. 20

(58)

39

encontrar valores de (NT) entre 1,992 ppm como limite interior y 3,448 ppm como límite superior. En el caso de la estación 5, existe la probabilidad de 95 % de encontrar valores entre 4,7ppm y 6,1 ppm.

Tabla 7. Estadísticos descriptivos para Nitrógeno Total (NT).

Estación Media

ppm

Dev. Típica Intervalo de confianza 95%

Límite inferior Límite superior

1 5,160 0,597 4,432 5,888

2 3,733 0,647 3,005 4,462

3 4,787 0,531 4,058 5,515

4 4,107 0,323 3,378 4,835

5 5,467 0,115 4,738 6,195

6 5,160 0,597 4,432 5,888

7 2,720 1,346 1,992 3,448

8 4,293 0,323 3,565 5,022

9 4,107 0,323 3,378 4,835

10 4,293 0,323 3,565 5,022

Fuente: datos procesados con IBM® SPSS® Statistics, v. 20

Tabla 8. Análisis de varianza para Nitrógeno Total (NT)

Origen Suma de

cuadrados tipo III Grados de libertad Media cuadrática Coeficiente F (Fisher-Snedecor) Significancia Modelo

corregido 17,704

a

9 1,967 5,380 ,001 Intersección 576,233 1 576,233 1575,900 ,000 Estaciones 17,704 9 1,967 5,380 ,001

Error 7,313 20 ,366 Total 601,250 30

Total corregida 25,017 29

(59)

40

Los valores estadísticos muestran que el efecto de la variable independiente (estación) correspondiente muestra un efecto significativo asociado al (NT) ya que su nivel crítico (α=0,05) considerado al realizar el estudio estadístico, al compararlo con el nivel se significancia = 0,001 indica que está muy por debajo del nivel alfa (α=0,05), lo que induce a inferir que estadísticamente, si existen diferencias significativas para los datos de (NT) muestreados en las estaciones.

Tabla 9. Prueba de Post Hoc (basada en Tukey) para Nitrógeno Total (NT).

Estación Número

de datos

Subconjunto

1 2

7 3 2,720

2 3 3,733 3,733 4 3 4,107 4,107 9 3 4,107 4,107 8 3 4,293 4,293 10 3 4,293 4,293 3 3 4,787 1 3 5,160 6 3 5,160 5 3 5,467

Fuente: datos procesados con IBM® SPSS® Statistics, v. 20

La Tabla 9, muestra que en relación a las medias existen diferencias entre los datos. En este caso, el análisis de se agrupa en dos (02) subconjuntos que según el programa estadístico lo considera como diferentes. Sin embargo se percibe que las estaciones 2, 4, 9, 8, y 10 sostienen valores que la incorporan en ambos grupos. En los marcos de las observaciones anteriores, la estación 7 reflejó la menor media estadística de 2,720 ppm de NT, y en cuanto a la estación 5 arrojó una media de 5,467 ppm lo que la ubica como la estación mayor cantidad de (NT) observado.

Figure

Figura 4. Georeferenciación de estaciones de muestreo en el sector Las
Figura 5. Dunaliella sp Identificada a través de un Microscopio óptico marca Nikon
Tabla 3. Prueba de Post Hoc (basada en Tukey) para el pH.
Tabla 4. Estadísticos descriptivos para las medias de Oxígeno disuelto (OD).
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