Aislamiento e identificación de Microorganismos

(1)

Microbiología General

Seminario Nro 4

Seminario Nro. 4

Aislamiento e identificación

(2)

¿P

é i l

i

?

• ¿Para qué aislar microorganismos ?

é

• ¿Para qué identificar un microorganismo ?

• Caracterización vs. Identificación

1. Pruebas bioquímicas Identificación presuntiva

(3)

Aislamiento e identificación de microorganismos

9 Procedencia

9 Características

9 Tratamiento inicial

9 Expectativas

9 Tratamiento inicial

9 Siembra

9 Ai l

i

t

(4)

Tratamiento

9 Enriquecimiento

Tratamiento

inicial

(selectivo o no)

9 Calentamiento

9 Filt

ió

9 Filtración

9 Homogeneización, etc

Si

b

9 Selección de medios

de cultivo

9 Inóculo

Siembra

9 Inóculo

(5)

Aislamiento

9 Agotamiento por estrías, dils

seriadas, etc

9 Subcultivo

Macroscópicos

Criterios de pureza

Microscópicos

Cultivo puro

(6)

Muestras

Microorganismos

9 Coliformes

Agua

Microorganismos

_indicadores

9 P. aeruginosa

Alimentos

Detección de

B. cereus

en leche en polvo,

miel, arroz

Detección de

S. aureus

en alimentos

Alimentos

Detección de

S. aureus

en alimentos

procesados y leche cruda

Aislamiento de

Lactobacillus spp

de

productos fermentados

(7)

Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo

Selección de esporas

Calentamiento

Enriquecimiento

Agotamiento por estrías

Mossel

Colonias aisladas

Man (-), Lecitinasa (+)

Repique

Tinciones

(8)

Morfología de las colonias

9 Forma y tamaño de las colonias

Irregular, puntiforme

g

p

9 Bordes

liso rugoso

liso, rugoso.

9 Elevación

C

l

d

b

d

li

Convexo, elevado, umbonado, liso.

9 Color

Pigmento, opaca, translucida, brillante.

9 Textura

(9)

Bacillus subtilis

Proteus vulgaris

Klebsiella pneumoniae

Forma de la colonia y tamaño: irregular Bordes: ondulado

Elevación: umbonada Color: Blanca crema

Típico movimiento sobre la caja de petri

(10)

Pruebas bioquímicas

para la identificación de

(11)

Catalasa

Para determinar microorganismos que producen la enzima catalasacatalasa.

H2O2 es producido por bacterias aerobias o facultativas mediante reacciones

no enzimáticas de reducción de flavoproteínas o por acción enzimática de no enzimáticas de reducción de flavoproteínas o por acción enzimática de radicales superóxido.

Micrococcaceae, Staphylococcus catalasa (+)

Streptococcaceae, Streptococcus Enterococcus catalasa (-)

2H

₂

O

₂

Catalasa

2H

₂

O+ O

₂

+ +

(12)

-Oxidasa

Para identificar bacterias que contengan la enzima citocromocitocromo oxidasaoxidasa cc

(respiración). Oxidasa negativaoxidasa positiva.

La enzima citocromo oxidasa cataliza el transporte de electrones de un donor hacia el aceptor final de la respiración (oxígeno). En este test un donor de electrones artificial (phenylenediamine) se usa para Reducir la citocromo

d oxidasa.

oxidasa (+)

Pseudomonas

oxidasa (-)

(13)

I M Vi C

IIndol

Rojo de M

Metilo

V

V h

P

k

V

Vohes Proskauer

C

Citrato

C

(14)

Indol

Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar el indol de la molécula de triptofano

Triptofano

triptofanasa

Indol + ácido piruvico + amonio

Triptofano Indol + ácido piruvico + amonio

Indol + p-dimetletilenamino-benzaldehido Rosindol (Rojo)

HCl

Alcohol isoamilico

(15)

Indol

(16)

Rojo de metilo – Voges Proskauer

Glucosa Piruvato Lactato

Lactato

Succinato

CO

₂

Acetil-CoA

Etanol

A t t

Succinato

+

Formiato

CO

₂

Acetato

H

₂

+

2.3Butanodiol

2.3Butanodiol + CO

₂

Glucosa Piruvato

(17)

Voges-Proskauer (VP)

Daniel Voges Bernhard Proskauer

Para identificar microorganismos capaces de producir acetoina y 2,3-butanediol como resultado de la degradación de glucosa.

Glucosa Piruvato Acetoina 2.3-butanediol

O

₂

+

α

- naphtol

+

40% KOH

Barritt's A Barritt's B

Diacetilo +

Creatina (Rojo)

Alcohol

Barritt s A Barritt s B

Diacetilo +

Creatina (Rojo)

α - naphtol

en etanol absoluto

(18)

Rojo de metilo

Rojo de metilo (MR) Para identificar bacterias que producen fermentación mixta de la glucosa y liberan ácidosácidos establesestables.

(19)

Citrato

Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar Citrato como única fuente de carbono.

Ci d S di Citrato permeasa A id i i A id l i CO

Citrato de Sodio Acido piruvico + Acido oxalacetico + COp ₂

Citrasa

Exceso de Sodio + CO₂ + H₂O Na₂CO₃

(liberado luego de usar el citrato)

(20)

Citrato

Agar Citrato de Simmon: Es un medio definido

(21)

T

Tree S

Sugar IIron Agar (TSI)

Para diferenciar bacterias basado en su habilidad para fermentar glucosa, lactosa y/o sacarosa, y para producir sulfuro de Hidrogeno.

Se usa para distinguir entre bacterias de la familia Enterobacteriaceae, Que

d á d f l d á d d f l

además son capaces de fermentar glucosa y producir ácidos como producto final.

Azúcar

Productos ácidos

pH (

Amarillo

)

Azúcar Productos ácidos pH (

Amarillo

)

Peptonas Amoniaco (NH

₃

) pH (

Rojo

)

Fermentación (

medio ácido

) + Tiosulfato de Sodio SH

₂

(gas)

(22)

Triple Sugar Iron Agar (TSI)

Fermentación

Utilización de

_{Las peptonas}

_{p p}

Producción de gas

(23)

Resultados (Tubo/Base) Símbolo Interpretación

Rojo/Amarilloj K/A Solo fermenta la Glucosa, y luego _{utiliza las peptonas}_{utiliza las peptonas}

Amarillo/Amarillo A/A Fermenta la glucosa y la lactosa y _{o la Sacarosa}

Rojo/Rojo K/K No hay fermentación, Solo se _l _l Rojo/Rojo K/K _{utilizan las Peptonas}

Rojo/sin cambio K/NC No hay fermentación, Solo se utilizan las Peptonas aeróbicamente

Amarillo/Amarillo con disrupción

del agar A/A,G

Fermenta la glucosa y la lactosa y o la Sacarosa con producción de gas

Rojo/Amarillo con disrupción del _{Solo fermenta la Glucosa con} agar K/A,G Solo fermenta la Glucosa, con _{producción de gas}

Rojo/Amarillo con disrupción del

agar y PP negro K/A,G, H2S Solo fermenta la glucosa con producción de gas y H₂S

Rojo/Amarillo y PP negro K/A, H2S Solo fermenta la glucosa y produce _H

2S

Amarillo/Amarillo y PP negro A/A, H2S

Fermentación de glucosa, lactosa y / o Sacarosa con producción de H₂S

(24)

Fermentación de carbohidratos

(Caldo - rojo fenol)

Se adiciona

un

azúcar al medio: Lactosa, sacarosa, glucosa, etc.

Propósito: Se usa para determinar fermentación de ciertos azúcares y

producción de gases. Se usa para identificar bacterias entéricas Gram

negativas

(25)

1- Control sin inocular

2 A ill Utili ió d l ú d ió d á id 2- Amarillo: Utilización del azúcar, producción de ácido sin gas.

3- Amarillo y producción de gas.

4- Fermentación negativa. Oscurecimiento del medio

de cultivo producto de utilización de peptonas y liberación de amonio.

Fermentación de glucosa Fermentación de lactosa Fermentación de sacarosa

orgamismos

1 Control Negative

resultados

Fermentación de glucosa

organismos resultados

1 Control Negative

Fermentación de lactosa

organismos resultados

1. Control Negative

Fermentación de sacarosa

1. Control Negative 2. S. aureus Acid 3. P. vulgaris Acid, Gas

1. Control Negative 2. S. aureus Acid 3. P. vulgaris Negative

. Co t o Negat ve

2. S. aureus Acid

3. P. vulgaris Acid, Gas

4 P i N ti _{4. P. aeruginosa} _Negative

5. E. coli Acid, Gas

4. P. aeruginosa Negative 5. E. coli Acid, Gas

4. P. aeruginosa Negative

(26)

Reducción de nitrato

Muestra la capacidad de un m.o de reducir nitrato (NO₃) a nitrito (NO₂) u otros componentes del nitrógeno como (N₂), usando la enzima nitratonitrato ReductasaReductasa.

NO

₃

+ 2 H + 2e-

NO

₂

+ H

₂

O

nitrato reductasa

Nitrato (NO₃) puede ser reducido por diferentes compuestos incluso por respiración anaerobia o por denitrificación. El medio de cultivo contiene nitrato de potasio como sustrato

potasio como sustrato.

NO

NH

N

(27)

Reducción de nitrato

Acido Sulfanilico + NN dimetil-1-naftalenamina + inoes nitratoinoes nitrato

(Reactivo A) (Reactivo B)

+ inoes nitratoinoes nitrato

Sulfobenzeno azo-NN dimelethylen-1-naptalenamino (rojo)

Si l d l ti A B

Si luego de agregar los reactivos A y B no aparece coloración se agrega Zn.

El Zn es capaz de formar un complejo coloreado con el Nitrato. Por lo tanto si no aparece coloración este fuep utilizado y entonces el MO es capaz de reducir el Nitrato

(28)

Prueba de decarboxilación de aminoácidos

Muestra la capacidad de un microorganismo para decarboxilar un aminoácido para formar una amina, con al consiguiente alcalinidad.

Indicador de pH: púrpura de bromocresol Indicador de pH: púrpura de bromocresol.

Se coloca aceite mineral para crear un ambiente de anaerobiosis para promover la fermentación. Se necesita un ambiente ácido porque la enzima solo funciona en estas condiciones.

Aceite mineral

(29)

Prueba de fenilalanina-desaminasa

ó

Se utiliza para identificar acción de la enzima phenilalaninaphenilalanina--deaminasadeaminasa. Usado para distinguir Morganella, Providencia, y Proteus (Positivos) de otros grupos como

Enterobacteriaceae (negativos).

El medio contiene el aminoácido fenilalanina. La enzima remueve el grupo (NH₂) y libera amonio (NH₃). Se obtiene acidofenilpiruvico, que puede ser detectado por la

di ió d t id t (Cl F i l 10%) U bi d l l d

adición de un agente oxidante (Cloruro Ferrico al 10%). Un cambio de color al verde indica una reacción positiva.

Negativo Positivo

(30)