Frmacos esteroides y el GM CSF modulan la actividad de Egr 1 en clulas de glioma

Fármacos esteroides y el GM-CSF modulan la actividad

de Egr-1 en células de glioma

Francisco Martínez-Flores,* Catalina Machuca-Rodríguez,** Hugo Sandoval-Zamora,*

Lucinda Aguirre-Cruz,*** Margarita Valdez-Flores,**** Hilda Villegas-Castrejón*

/DERUDWRULR GH %LRWHUDSpXWLFD 0ROHFXODU ,QVWLWXWR 1DFLRQDO GH 5HKDELOLWDFLyQ6HFUHWDUtDGH6DOXG0p[LFR

/DERUDWRULRGH7HUDSLD0ROHFXODU80,(=)(6=DUDJR]D81$00p[LFR /DERUDWRULRGH1HXURLQPXQRHQGRFULQRORJtD,QVWLWXWR1DFLRQDOGH

1HXURORJtD\1HXURFLUXJtD³'U0DQXHO9HOD]FR6XiUH]´6HFUHWDUtD GH6DOXG0p[LFR

'HSDUWDPHQWRGH*HQpWLFD,QVWLWXWR1DFLRQDOGH5HKDELOLWDFLyQ 6HFUHWDUtDGH6DOXG0p[LFR

Correspondencia:

)UDQFLVFR0DUWtQH])ORUHV0'3K'

3URJUDPDGH%LRWHUDSpXWLFD0ROHFXODU%DQFRGH3LHO\7HMLGRV,QVWLWXWR 1DFLRQDOGH5HKDELOLWDFLyQ6HFUHWDUtDGH6DOXG

&DO]DGD0p[LFR;RFKLPLOFR1R$UHQDOGH*XDGDOXSH&3 ')0p[LFR

7HO([W

&RUUHRHOHFWUyQLFRIFRPDUWLQH]#LQUJREP[

Recibido para publicación:

Aceptado para publicación: Resumen

Introducción: la proteína Egr-1 es un factor transcripcional de respuesta temprana a crecimiento. La regulación transcripcional de su promotor ha sido descrita como responsiva al estrés físico, a los cambios osmóticos, a la luz ultravioleta y a radiación gamma. Sin embargo, no existen reportes de los efectos de fármacos sobre la regulación del promotor y menos aún, en gliomas. Aquí se describen los efectos de fármacos esteroides y el GM-CSF sobre la actividad transcripcional del promotor Egr-1 con un adenovirus no replicativo en células de gliomas humanos.

Material y métodos: células de glioma humano de diferente grado de malignidad (CH235-GM Grado II; U373-GM Grado III; D54-GM Grado IV) fueron infectados con un adenovirus recombinante no replicativo AdEgr-1/Luc7 y expuestos a betametasona, progesterona y b- estradiol y GM-CSF. La actividad transcripcional del promotor fue monitorizada por el gen reportero de la luciferasa, clonado corriente abajo del promotor. La actividad de luciferasa fue cuantificada mediante ensayo de luminometria.

Resultados: líneas celulares de glioma humano muestran un patrón diferencial, que correlaciona con el grado de malignidad. La línea U373-GM que en presencia de GM-CSF, presenta una activación transcripcional del promotor Egr-1 mayor, incluso de manera endógena. En esta línea celular, se observa que fármacos esteroides, tienen un efecto de regulación positiva para la activación de Egr-1, en los tiempos estudiados. En las líneas CH235-GM y '*0IiUPDFRVHVWHURLGHVFRPRODSURJHVWHURQDHOȕHVWUDGLRO y la betametasona, muestran un comportamiento pleiotrópico.

Conclusión: la respuesta de inhibición o activación del promotor Egr-1, en líneas celulares de glioma, muestra nuevos escenarios para la exploración de mecanismos de acción de fármacos esteroides sobre la regulación genética y epigenética en procesos tumorales.

Palabras clave: adenovirus, fármacos esteroides, GM-CSF, ensayo reportero, regulación transcripcional, gliomas.

Abstract

Introduction: The Egr-1 protein is a transcriptional factor responsive to early growth. Transcriptional regulation of the promoter has been described like responsive to physical stress, osmotic changes, and cellular growth marker. However, there is no report about the pharmacological effect on the transcriptional regulation in gliomas. Hereby we report the modulation of the Egr-1 promoter transcriptional activity induced by the Granulocytes Macrophages Colony Stimulating Factor (GM-CSF) and steroid drugs in human glioma cells (CH235-GM Grade II, U373-GM Grade III, D54-GM Grade IV) using a reporter system transduced by a recombinant adenoviral vector AdEgr-1/luc7.

Methods: Human glioma cells shows with different malignity grade (CH235-GM Grado II; U373-GM Grado III; D54-GM Grado IV) were transduced with no replicative adenoviral vector AdEgr-1/Luc7 and exposed to GUXJVDVSURJHVWHURQHȕHVWUDGLRODQGEHWDPHWDVRQH and GM-CSF. Transcriptional activity of the egr-1 promoter was quantified by Luciferase reporter gene, cloned downstream to the tata box. Luciferase activity was quantified from whole cell proteins using luminometry assays.

Results: U373-GM cell line with GM-CSF, shows an increment on transcriptional activity of Egr-1 promoter, also in endogen way. U373-GM showed a positive regulation of Egr-1, with steroid drugs RQWKHWLPHVDQDO\]HG6WHURLGGUXJVDVSURJHVWHURQHȕHVWUDGLRO and betametasone, shows a pleiotropic behavior on CH235-GM and D54-GM, glioma cell lines.

Conclusions: Inhibition or activation response of Egr-1 promoter shows new framework to explore a mechanism of action of steroid drugs on genetic and epigenetic regulation on tumoral process.

Key words: Adenoviral vector, steroid-drugs, GM-CSF, reporter assay, transcriptional regulation, glioma.

Introducción

Los gliomas son los tumores primarios más agresivos del

sis-WHPDQHUYLRVRFHQWUDO\UHSUHVHQWDQDSUR[LPDGDPHQWHHO GHORVWXPRUHVFHUHEUDOHVHQ0p[LFR1_{6XUiSLGRFUHFLPLHQWR}

ODDSDULFLyQGHUHVLVWHQFLDFORQDOSRUODTXLPLRWHUDSLD\OD OLPLWDFLyQ TXLU~UJLFD SRU VX VLWXDFLyQ DQDWyPLFD FRQWULEX

-\HQDXQDUHDFWLYDFLyQWXPRUDO\DXQDVREUHYLGDQRPD\RUD PHVHV(OFUHFLPLHQWRFHOXODUHVWiDVRFLDGRDODH[SUHVLyQ GHJHQHVDODSUHVHQFLDGHIDFWRUHVGHFUHFLPLHQWR\GHORV VHJXQGRVPHQVDMHURVTXHDFWLYDQYtDVGHVHxDOL]DFLyQPLWR

La proteína Egr-1 tiene un peso molecular de

.LOR 'DOWRQHV .' \ HVWi FRQVWLWXLGD SRU DPL

-QRiFLGRV DD (O JHQH FRGL¿FDQWH SDUD (JU VH ORFDOL]D HQHOFURPRVRPDTFRQSDUHVGHEDVHES3RU VXHVWUXFWXUDTXtPLFDSHUWHQHFHDXQDIDPLOLDGHSURWHtQDV FDUDFWHUL]DGDVSRUVXVPRWLYRVHQGHGRVGH=LQF_que reco-nocen secuencias consenso en el promotor de varios cientos

GHJHQHV&&**7***&&*TXHOHFRQ¿HUHQXQPHFD

-QLVPRGHDXWRUUHJXODFLyQVREUHVXSURSLRSURPRWRUDWUDYpV GHXQVLWLRGHXQLyQGHODSURWHtQD(JU\(JU(%6/DV IXQFLRQHVGH(JUVRQGLYHUVDVGHSHQGLHQGRGHODHVWLUSH FHOXODUVLQHPEDUJRWRGDVHVWiQDVRFLDGDVDOFUHFLPLHQWR GLIHUHQFLDFLyQ \ SUROLIHUDFLyQ HQ OLQIRFLWRV ¿EUREODVWRV \

neuroglia.(JUWDPELpQUHJXODODH[SUHVLyQGHFLWRFLQDV\

UHFHSWRUHVGHVXSHU¿FLHDFUHFLPLHQWRODVtQWHVLVGHIDFWR

-UHVGHFUHFLPLHQWRVtQWHVLV\UHPRGHODFLyQGHSURWHtQDVGH PDWUL]H[WUDFHOXODU\SURWHDVDVHQSURFHVRVGHFLFDWUL]DFLyQ DVt FRPR HQ DUUHVWR FHOXODU \ DSRSWRVLV FRPR UHVSXHVWD D HVWUpV

5HFLHQWHPHQWHVHOHKDDVRFLDGRFRPRXQIDFWRUDQWLD

-SRSWyWLFRHQDOJXQRVPRGHORVKHPDWROyJLFRVSRUVXLQWH

-UDFFLyQUHSUHVRUDFRQODSURWHtQD5%FRPRXQPHFDQLVPR

en la supresión de tumores.(QHOVLVWHPDQHUYLRVRFHQWUDO

OD SUHVHQFLD GH (JU HVWi LQYROXFUDGD HQ OD UHJXODFLyQ \ HOFRQWUROGHODSODVWLFLGDGQHXURQDO_{\VXVREUHH[SUHVLyQ}

HVWiUHODFLRQDGDFRQPXWDFLRQHVGHSHQFpOXODVWXPRUD

-OHVGHJOLRPD\FiQFHUGHSUyVWDWDHQGRQGHORVQLYHOHVGH 51$P\ODSURWHtQD(JUHVWiQVXSULPLGDVHQJOLREODVWR

-PDV\HQFpOXODVGHFXOWLYRVSULPDULRV

/DVVHFXHQFLDVJHQpWLFDVHQHOSURPRWRUTXHUHJXODQGH PDQHUDSRVLWLYDODUHVSXHVWDDIDFWRUHVH[yJHQRVVRQPH

-GLDGDVSULQFLSDOPHQWHSRUHOHPHQWRVGHUHVSXHVWDDVXH

-UR 65( VHFXHQFLDV GH XQLyQ DFWLYDGDV SRU$03 FtFOLFR &5(%VRDWUDYpVGHVLWLRVGHXQLyQGHODSURWHtQD(JU (%6 DGHPiV GH VLWLRV GH XQLyQ GHO IDFWRU WUDQVFULS

-FLRQDO 63_{7DPELpQ VH KD UHSRUWDGR TXH OD DFWLYLGDG}

WUDQVFULSFLRQDOGH(JUSXHGHVHULQGXFLGDSRUODOX]XO

-WUDYLROHWD89\UDGLDFLyQJDPPDDWUDYpVGHVHFXHQFLDV PRWLYR FRQRFLGRV FRPR FDMDV &$U*&&$7 ULFDV HQ 7LPLQD**.12-14

3RU VX SDUWH ORV HVWHURLGHV VRQ XQ JUXSR GH IiUPD

-FRVGHULYDGRVGHXQQ~FOHRFHQWUDOGHFROHVWHUROTXHVH

encuentran de manera endógena en el organismo

(hor-PRQDV R GH RULJHQ VLQWpWLFR IiUPDFRV HVWHURLGHRV /RVPHFDQLVPRVGHDFFLyQGHODVKRUPRQDVHVWHURLGHDV VRQPHGLDGRVSRUXQUHFHSWRUHVSHFtILFRQXFOHDURFLWR

-SOiVPLFR TXH SHUPLWHQ OD WUDQVORFDFLyQ QXFOHDU \ OD

expresión o represión de genes blanco. En el caso de los corticoesteroides (derivados del cortisol como

glu-FRFRUWLFRLGHV \ PLQHUDORFRUWLFRLGHV HO PHFDQLVPR GH

acción se basa esencialmente en la unión de un receptor

FLWRSODVPiWLFRTXHWUDVORFDDOQ~FOHR\TXHHVFDSD]GH

XQLUVHDVHFXHQFLDVJHQpWLFDVGHFRQVHQVRGHQRPLQDGDV FRPR HOHPHQWRV GH UHVSXHVWDV D HVWHURLGHV *5( 5H

-FLHQWHPHQWHHVWRVUHFHSWRUHVKDQVLGRGHVFULWRVHQFpOX

-ODVGHJOLRPDFRQHIHFWRVREUHHOFUHFLPLHQWRFHOXODU

(VWDV VHFXHQFLDV WDPELpQ VH HQFXHQWUDQ HQ SURPRWRUHV

que regulan la actividad de proteína cinasas o vías de

se-xDOL]DFLyQPLWRJpQLFDVFos, Jun, Egr-1) o de las cinasas

DFWLYDGRUDVGHPLWyJHQRV0$3NLQDVDV\TXHWDPELpQ

son activados por Egr-11 en neuronas.

6DNDPRWRet al., KDQFDUDFWHUL]DGRXQIUDJPHQWR

GHSEGHOVLWLRGHLQLFLRGHODWUDQVFULSFLyQGHOJHQ(JU ¶\VXUHJXODFLyQSRUHOIDFWRUHVWLPXODGRUGHJUDQXOR

-FLWRV\PDFUyIDJRV*0&6)\GHODLQWHUOHXFLQD,/ HQFpOXODVKHPDWROyJLFDV_{(VWDUHJXODFLyQWDPELpQKDVLGR}

GHVFULWR HQ ODV FpOXODV & GH JOLRPD PXULQR SRU XQD YtD QR JHQyPLFD 5DI0(.(U.(ON _{6LQ HPEDUJR OD}

PRGXODFLyQWUDQVFULSFLRQDOLQGXFLGDSRUIiUPDFRV\IDFWR

-UHVGHFUHFLPLHQWRQRHVWiGHVFULWDHQJOLRPDVKXPDQRV\ SRFRV HVWXGLRV KDQ H[SORUDGR ORV HIHFWRV GH ORV IiUPDFRV HVWHURLGHRVVREUHODDFWLYLGDG\ODUHJXODFLyQWUDQVFULSFLR -nal de Egr-1.

'HELGRDTXHHOSURPRWRURUHJLyQUHJXODGRUDGHODH[ -presión de la proteína ha sido descrito como responsivo a

IDFWRUHVItVLFRVTXtPLFRVIDUPDFROyJLFRV\RWUDVSURWHtQDV RIDFWRUHVGHFUHFLPLHQWR)*)(*)N5DVHOobjetivo de este estudioHVGHWHUPLQDUHOHIHFWRGHIiUPDFRVHVWHURL

-GHV\GH*0&6)VREUHODUHJXODFLyQGHOSURPRWRU(JU HQFpOXODVGHJOLRPDKXPDQR&+*0JUDGR,,8 *0JUDGR,,,'*0JUDGR,9

6H EXVFD GHWHUPLQDU HO SDSHO GH ORV IiUPDFRV HVWHURL

-GHRV\GHOIDFWRUHVWLPXODGRUGHJUDQXORFLWRV\PDFUyIDJRV *0&6)DVtFRPRVXHPSOHRFRPRFRDG\XYDQWHVGHOD

terapia antineoplásica mediante la modulación de la

activi-GDGWUDQVFULSFLRQDOGHOSURPRWRU(JUHQFpOXODVGHJOLRPD KXPDQRORVFXDOHVUHSUHVHQWDQXQRGHORVWLSRVGHFiQFHU FRQPDVDOWRtQGLFHGHSUROLIHUDFLyQ\FUHFLPLHQWR

Materiales y métodos

Diseño experimental

3DUDOOHYDUDFDERORVHQVD\RVGHUHVSXHVWDDIiUPDFRVHQ FpOXODVGHJOLRPDVHHPSOHyXQVLVWHPDUHSRUWHURSRUWHF

-QRORJtDGHO$'1UHFRPELQDQWHFRQVWUX\HQGRXQFDVHWHTXH FRQWLHQHODVHFXHQFLDGHSEGHODUHJLyQSURPRWRUDGH

gen Egr-1 al sitio de inicio de la trascripción del gen de la

Renila luciferasaVHJXLGDGHXQDVHFXHQFLDGHSROLDGHQLOD

FpOXODV LQIHFWDGDV IXHURQ H[SXHVWDV D IiUPDFRV \ HQ GLIH

-UHQWHVWLHPSRVVHREWXYLHURQSURWHtQDVWRWDOHVSDUDUHDOL]DU HQVD\RVGHDFWLYLGDGGHOXFLIHUDVD'HELGRDTXHODVFpOXODV KXPDQDVQRH[SUHVDQGHPDQHUDFRQVWLWXWLYDODOXFLIHUDVD ORVH[WUDFWRVWRWDOHVTXHVRQFDSDFHVGHKLGUROL]DUODOXFLIH

-ULQDHQSUHVHQFLDGH$73VRQGLUHFWDPHQWHSURSRUFLRQDOHV DOHIHFWRUHJXODGRUSRVLWLYRRQHJDWLYRGHOIiUPDFRHQFRP

-SDUDFLyQGHORVQLYHOHVEDVDOHVVLQIiUPDFRV/DHYDOXDFLyQ FXDQWLWDWLYD GHO HIHFWR GHO IiUPDFR VREUH HO SURPRWRU VH UHDOL]yFRQXQOXPLQRPHWURH[SUHVDGRHQFXHQWDVOXPtQLFDV SRUVHJXQGR&/VHJXQGR)LJXUD%

/D WUDQVIHUHQFLD GH JHQHV PHGLDGD SRU DGHQRYLUXV VRQ DOWDPHQWHH¿FLHQWH\UHSURGXFLEOHVDOFRQ¿HULUXQDH[SUH

-VLyQGHOWUDQVJHQPD\RUDOGHODVFpOXODVLQIHFWDGDVOR FXDOGHSHQGHGHODFDQWLGDGGHSDUWtFXODVLQIHFWDQWHV\GHO

tropismo del virus.

Diseño y construcción de los plásmidos adenovirales no replicativos

(ODGHQRYLUXVUHFRPELQDQWHQRUHSOLFDWLYRǻAdEgr-1/ Luc7 IXH GLVHxDGR SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD D SDUWLU GHO

sistema AdEasy PHGLDQWH UHFRPELQDFLyQ KRPyORJD HQ

bacterias '+Į5HF$8QIUDJPHQWRGHSEGHO

H[WUHPRGHOVLWLRGHLQLFLRGHODWUDQVFULSFLyQGHOSUR -motor Egr-1KXPDQRIXHVXEFORQDGRHQHOYHFWRUpShutle

()LJXUD (O YHFWRU UHVXOWDQWH IXH UHSOLFDGR HQ EDFWH

-ULDV'+%,QYLWURJHQ&RUS\XVDGRSDUDVXEFORQDUHO

gen de la Renila luciferasaVHJXLGRGHXQIUDJPHQWRGH

SROLDGHQLODFLyQGHSE609SRO\$/DFRQVWUXF -ción resultante pShutle-Egr1/Luc IXH OLQHDUL]DGR FRQ OD

HQ]LPDPme 1 1HZ(QJODQG%LRODEV86$\SXULILFDGR

para recombinación homóloga en bacterias '+Į con el

JHQRPDGHODGHQRYLUXVWLSRǻAdEasy 1) usando la

WpFQLFDGHUHFRPELQDFLyQKRPyORJDHQEDFWHULDVGHVFULWD SRU+HHWDO20/DVFORQDVUHVXOWDQWHVVHOHFFLRQDGDVIXH

-URQFUHFLGDVHQPHGLR/%FRQNDQDPLFLQD—JPO\ ORVSOiVPLGRVIXHURQDLVODGRVHQSUHSDUDFLRQHVPLQLSDUD DQiOLVLVSRUPDSDVGHUHVWULFFLyQ8QDFORQDVHOHFFLRQDGD \QRPEUDGDpAdEgr-1/Luc7,IXHVHFXHQFLDGDSDUDYHULIL

-FDUODRULHQWDFLyQGHOFDVHWHVXEFORQDGR\SRVWHULRUPHQWH SXULILFDGRDJUDQHVFDODFRQUHVLQDVGHLQWHUFDPELRLyQL

-FR\OLEUHGHHQGRWR[LQDV(QGRIUHH*LJD.LW'1$4LD

-JHQ $OHPDQLD SDUD HPSDTXHWDPLHQWR YLUDO HQ FpOXODV +(.

Figura 1A. Construcción y diseño del plásmido AdEgr-1/Luc7. Estructura del casete subclonado en pShuttle en los sitio Kpn1/Hind III, el plásmido contiene un gen de resistencia a kanamicina, el cual es transferido durante la recombinación homóloga al plásmido adenoviral resultando en el plásmido pAdEgr-1/Luc7. Figura 1B. Diagrama que ilustra el modelo experimental para determinar el efecto de fármacos sobre la actividad transcripcional de Egr-1 en células de glioma.

Pac1

pShutle 6736pb

Ori kan

LIT R 1

-600 +1 1730-1742 2010 kpn1,486

Hind III, 520 pb

Egr-1 Luciferasa Poly A

Egr-1 A ITR

IZQ. Pac I

Brazo Izq

Luciferasa

Poly-Hind III Kpn 1

pAd-Egr1-/Luc7. 45.3 kb.

ITR DER Brazo Der

Luciferina + ATP = Luz Luciferasa Núcleo

Fármaco

Activador Represor

Cultivo de células HEK-293

/DV FpOXODV +(. IXHURQ FUHFLGDV HQ PHGLR +\46

-)0+(. +\FORQH &RUS 86$ VXSOHPHQWDGR FRQ GH VXHUR IHWDO ERYLQR LQDFWLYDGR SRU FDORU )%6 +\FORQH &RUS 86$ DQWLELyWLFRDQWLPLFyWLFR 3HQLFLOL

-QD*PLO8PO—JGHHVWUHSWRPLFLQDPO\—J GHDQIRWHULFLQD%POHLQFXEDGDVGHDFXHUGRFRQODVLQV

-WUXFFLRQHVGHOD$7&&$PHULFDQ7\SH&XOWXUH&ROOHFWLRQ 86$\HVWDQGDUL]DGDVHQHOODERUDWRULR21

Generación a gran escala del inóculo inicial del adenovirus recombinante AdEgr-1/Luc7

6HXVDURQ—JGHOSOiVPLGRpAdEgr-1/Luc7 OLQHDUL]DGR

FRQODHQ]LPDPme 1\OLEUHGHHQGRWR[LQDVSDUDWUDQVIHFWDU

î_{FpOXODV+(.HPSOHDQGRHOPpWRGRGHHQFDSVX}

-ODPLHQWR SRU OLSRVRPDV 7UDQVIHFWHQH 4LDJHQ$OHPDQLD /DVFpOXODVWUDQVIHFWDGDVVHPDQWXYLHURQHQFXOWLYRKDVWDOD DSDULFLyQGHSODFDVOtWLFDVHQODPRQRFDSDGtD$OWpUPL

-QRGHOGtDVHFROHFWDURQ\OLVDURQSDUDVHUHPSOHDGRVHQ LQIHFFLRQHVVXEVHFXHQWHVKDVWDODSURGXFFLyQDJUDQHVFDOD

de viriones recombinantes no replicativos de AdEgr-1/Luc7

GHDFXHUGRD0DUWtQH])ORUHVet al.22

Producción a gran escala del adenovirus recombinante AdEgr-1/Luc7

/DSURGXFFLyQGHYHFWRUHVDGHQRYLUDOHVVHEDVyHQHOSURWR

-FRORGHSXUL¿FDFLyQGHDGHQRYLUXVUHFRPELQDQWHSDUDDSOL -caciones in vivo3DUDHOORVHVHPEUDURQî_GHFpOX

-ODV+(.HQODVFRQGLFLRQHVDQWHVGHVFULWDV&XDQGRODV FpOXODVDOFDQ]DURQXQDFRQÀXHQFLDGHOVHLQIHFWDURQ GXUDQWHKRUDVFRQXQ02,GHHQPHGLRUHGXFLGRGH VXHURIHWDOERYLQR/DVFpOXODVLQIHFWDGDVVHPRQLWRUL]DURQ SRUPLFURVFRStDySWLFDKDVWDODDSDULFLyQGHHIHFWRFLWRSi

-WLFRHQPiVGHODODVKRUDV'HVSXpVGHHVWHWLHPSR ODV FpOXODV IXHURQ FROHFWDGDV FRQFHQWUDGDV \ OLVDGDV SRU FLFORVGHFKRTXHWpUPLFRFRQEDxRGHQLWUyJHQROtTXLGR HQ FDPSDQD GH ÀXMR ODPLQDU +HUDVDIH FODVH ,,$% .HQ

-GUR+HUDXV$OHPDQLD/RVOLVDGRVWRWDOHVaPOIXHURQ PDQWHQLGRV HQ KLHOR \ SXUL¿FDGRV SRU XOWUDFHQWULIXJDFLyQ FRQHOPpWRGRGHJUDGLHQWHVGHFORUXURGHFHVLR*PO \ *PO D PLO * D ƒ& \ GXUDQWH KRUDV :; 7KHUPR&RUS86$FRQHOREMHWRGHVHSDUDUORVYL

-ULRQHV PDGXURV GH ORV LQPDGXURV \ ORV GHWULWXV FHOXODUHV /RVYLULRQHVVHDLVODURQSRUSXQFLyQHVWpULO\VHGLDOL]DURQ HQSUHVHQFLDGHPDJQHVLR\P0GH+(3(6Dƒ&SRU KRUDVXVDQGRXQDPHPEUDQDGH0:&23LHUFH ELRVFLHQFH86$/RVYLULRQHVUHFRPELQDQWHVSXUL¿FDGRV IXHURQDOPDFHQDGRVHQVROXFLyQGHSUHVHUYDFLyQYLUDO

GHDOEXPLQD\P0GH+(3(6Dƒ&/DH¿FLHQFLDGH ODLQIHFWLYLGDG\ODWLWXODFLyQGHODVSDUWtFXODVYLUDOHVLQIHF

-WDQWHVVHGHWHUPLQySRUHQVD\RGHSODFDHQPRQRFDSDVGH FpOXODV+(.DGLOXFLRQHVVHULDGDV 10-10-11\SRUODOHFWXUDGHODGHQVLGDGySWLFDGHOGLDOL

-]DGRDQPGHDFXHUGRDODVFRQGLFLRQHVHVWDQGDUL]DGDV

de rutina en el laboratorio.

Cultivo de células de glioma

/DVOtQHDVFHOXODUHVGHJOLRPDKXPDQRFRQGLIHUHQWHJUDGR GHPDOLJQLGDG&+0**UDGR,,80**UDGR,,, \'0**UDGR,9IXHURQFUHFLGDVHQPHGLRGHFXOWLYR '0(0DOWDJOXFRVDVXSOHPHQWDGRFRQGHVXHURIHWDO ERYLQR LQDFWLYDGR SRU FDORU \ FRQFHQWUDFLRQHV HVWiQGDUHV

de antibiótico-antimicótico. Los cultivos se mantuvieron a

XQDFRQÀXHQFLDPHQRUDOHQXQDPELHQWHFRQGH

CO₂GHKXPHGDG\ƒ&

Determinación del múltiplo de infección (MOI) óptimo en células de glioma infectado con el adenovirus AdCMV-GFP

3DUDGHWHUPLQDUODFDQWLGDGySWLPDGHDGHQRYLUXVUHFRPEL

-QDQWHFRQWUDQVGXFFLyQH¿FLHQWHHQODVFpOXODVGHJOLRPD VHVHPEUDURQî_{FpOXODVHQFDMDVGHSR]RV&RVWDU}

0DGLVRQ86$KDVWDDOFDQ]DUXQDFRQÀXHQFLDGHO$O LQLFLR GHO HQVD\R ODV FpOXODV IXHURQ ODYDGDV HQ VROXFLyQ DPRUWLJXDGRUDGHIRVIDWRVFRQ&D_\0JS+\VH

LQIHFWDURQFRQ\02,VFRQHODGHQRYL -rus reportero AdCMV-GFP en medio reducido en suero. Al

WpUPLQRGHGRVKRUDVGHH[SRVLFLyQHOPHGLRLQIHFWDQWHIXH UHPSOD]DGR SRU PHGLR IUHVFR \ VH PDQWXYLHURQ HQ FRQGL

-FLRQHVHVWiQGDUHVGHFXOWLYRSRUKRUDV3DUDGRFXPHQWDU ODH¿FLHQFLDGHODLQIHFFLyQVHEXVFyODVHxDOGHODSURWHt

-QDYHUGHÀXRUHVFHQWH*)3XVDQGRXQHTXLSR$[LRSODQ &DUO=HLVV$OHPDQLD/DSURWHtQDYHUGHÀXRUHVFHQWHHPL

-WHXQDVHxDOOXPLQRVDH[FLWDEOHDQPHQODVFpOXODVLQ

-IHFWDGDVSRUHODGHQRYLUXVAdCMV-GFP)LJXUD

Ensayo reportero de luciferasa inducido por esteroides

/DVFpOXODVGHJOLRPDVHVHPEUDURQHQFDMDVGHSR]RV î _{FpOXODVSR]R \ PDQWXYLHURQ HQ FRQGLFLRQHV QRU}

-PDOHVGHFXOWLYR'HVSXpVGHKRUDVHOPHGLRGHFXOWLYR IXHUHPSOD]DGRSRUPHGLR'0(0FRQGHVXHURIHWDO ERYLQRWUDWDGRFRQFDUEyQDFWLYDGR\VHPDQWXYLHURQHQHV

-WDVFRQGLFLRQHVSRUKRUDV$OWpUPLQRGHHVWHWLHPSRODV FpOXODVVHLQIHFWDURQFRQAdEgr-1/Luc7, XVDQGRXQ02,GH

LQDFWLYDFLyQGHORVYLULRQHV3RVWHULRUPHQWHODVFpOXODVVH ODYDURQ \ PDQWXYLHURQ HQ PHGLR '0(0 *LEFR,QYLWUR

-JHQ86$FRQGHVXHURIHWDOERYLQRWUDWDGRFRQFDUEyQ DFWLYDGR GXUDQWH KRUDV SRVWHULRUHV D OD LQIHFFLyQ SDUD HOLPLQDUODSUHVHQFLDGHKRUPRQDVHVWHURLGHV/RVHQVD\RV GHLQGXFFLyQVHUHDOL]DURQSRUWULSOLFDGRDODVKRUDVSRVW LQIHFFLyQFRQHOAdEgr-1/Luc7\VHH[SXVLHURQDEHWDPHWD

-VRQD QJPO ȕHVWUDGLRO QJPO \ SURJHVWHURQD QJPOHQPHGLR'0(0FRQGHVXHURIHWDOERYLQR WUDWDGR FRQ FDUEyQ DFWLYDGR /DV SURWHtQDV WRWDOHV IXHURQ H[WUDtGDVDGLIHUHQWHVWLHPSRV\KRUDVSDUDGH -terminar la actividad del promotor basado en la actividad de

ODOXFLIHUDVDFRPRSURWHtQDUHSRUWHUR

Ensayo reportero de luciferasa inducido por GM-CSF

/RVHQVD\RVGHLQGXFFLyQSRU*0&6)VHUHDOL]DURQFRQ ODPLVPDSUHSDUDFLyQFHOXODU\VHH[SXVLHURQHQPHGLR' 0(0DGLIHUHQWHVFRQFHQWUDFLRQHVGH*0&6) \ QJPO$O WpUPLQR GH ORV WLHPSRV GH H[SRVLFLyQ \KRUDVODVFpOXODVVHODYDURQFRQ'3%6S+ *LEFR,QYLWURJHQ86$\VHOLVDURQSDUDODH[WUDFFLyQGH

proteínas totales.

Extracción de proteínas totales

/DH[WUDFFLyQGHSURWHtQDVWRWDOHVGHODVFpOXODVH[SXHVWDV DIiUPDFRVVHUHDOL]yGHODVLJXLHQWHPDQHUDSUHYLRODYDGR FRQ 3%6 D ƒ& ,QYLWURJHQ &RUS ODV FpOXODV VH OLVDURQ FRQ—OGHVROXFLyQGHOLVLV*OR&HOOOLVLV%XIIHU3UR

-PHJD&RUSDWHPSHUDWXUDDPELHQWHGXUDQWHPLQXWRV(O

OLVDGR IXH FROHFWDGR HQ XQ PLFURWXER HVWpULO DJLWDGR SRU PLQXWRHLQPHGLDWDPHQWHVHFHQWULIXJyDPLO*Dƒ& (OVREUHQDGDQWHIXHGHFDQWDGR\DOPDFHQDGRDƒ&KDVWD VXXVRHQORVHQVD\RVGHOXPLQRPHWUtD

Ensayos de luminometría

/RV HQVD\RV GH OXPLQRPHWUtD VH UHDOL]DURQ SRU WULSOLFDGR FRQ—OGHOOLVDGRFHOXODUFRQXQDUHODFLyQGHYRO~PH -nes de sustrato*OR/XFLIHUDVHGHDFXHUGRDODVLQVWUXFFLR

-QHVGHOIDEULFDQWH*OR/XFLIHUDVHV\VWHP3URPHJD86$ /DPH]FODVHLQFXEyGXUDQWHPLQXWRVDƒ&HQSODFDV GHSR]RVSDUDOXPLQRPHWULD&RVWDUZDUH86$,QPH

-GLDWDPHQWHODUHDFFLyQIXHFXDQWL¿FDGDHQXQOXPLQyPHWUR '7;%HFNPDQ&RXOWHU/DOXFLIHUDVDSUHVHQWHHQHO H[WUDFWR SURWHLFR KLGUROL]D OD OXFLIHULQD HQ SUHVHQFLD GH $73\JHQHUDXQDVHxDOOXPLQRVDLGHQWL¿FDGDSRUHOVHQVRU GHOPXOWLGHWHFWRU\VHH[SUHVDHQFXHQWDVOXPtQLFDVVHJXQ

-GR&/V/DVFXHQWDVOXPtQLFDVSRUVHJXQGRIXHURQDMXV -tadas a la concentración de proteínas para obtener los datos

UHDOHVGHDFWLYLGDGGHOXFLIHUDVDH[SUHVDGDSRUHOSURPRWRU (JUGHODVFpOXODVLQIHFWDGDVFRQAdEgr-1/Luc7. El

análi-VLVGHGDWRVVHUHDOL]yFRQHOSURJUDPD0XOWLPRGH$QDOLV\V 6RIWZDUH%HFNPDQ&RXOWHU86$

Resultados

/DLQWURGXFFLyQGHHOHPHQWRVJHQpWLFRVDODVFpOXODVFOi

-VLFDPHQWHVHKDUHDOL]DGRSRUPpWRGRVTXtPLFRV226LQHP

-EDUJR OD WUDQVIHUHQFLD GH JHQHV PHGLDGD SRU DGHQRYLUXV QRUHSOLFDWLYR15$GPXHVWUDXQDPD\RUH¿FLHQFLDFRQ

una expresión temporal en modelos tanto in vitro como

in vivo. /RV HVWXGLRV GH OD UHJXODFLyQ IXQFLRQDO GH ORV

SURPRWRUHV VH UHDOL]DQ FRQ OD WUDQVIHUHQFLD GH XQ VLVWH

-PDUHSRUWHURTXHSHUPLWHHYDOXDUODDFWLYDFLyQUHSUHVLyQ WUDQVFULSFLRQDOVZLFKRQVZLFKRIIGHXQSURPRWRU(QHO

caso de la construcción del adenovirus AdEgr-1/Luc7HO

casete transducido por el adenovirus no replicativo es de

ORFDOL]DFLyQQXFOHDU\HSLVRPDO$GLFLRQDOPHQWHVXVLWLR

dentro del genoma adenoviral le permite ser responsivo

DODVVHxDOHV\IDFWRUHVTXHDFWLYDQGHPDQHUDHQGyJHQD DO SURPRWRU \ WUDGXFH VX UHVSXHVWD HQ OD H[SUHVLyQ GH OD OXFLIHUDVD

El plásmido recombinante pAdEgr-1/Luc7 fue empaquetado

GHPDQHUDH¿FLHQWHHQODVFpOXODV+(.

/DFRQVWUXFFLyQGHOFDVHWHUHSRUWHURVHUHDOL]ySRUODWpF

-QLFDGHUHDFFLyQHQFDGHQDGHODSROLPHUDVD3&5XVDQGR ROLJRQXFOHyWLGRV FHEDGRUHV FRQ VHFXHQFLDV VLQWpWLFDV SD -Figura 2. Células D54-GM, grado IV transducidas con AdCMV-GFP.

lindrómicas de Hind III y Kpn 1)LJXUD(ODGHQRYLUXV

FRQVWUXLGRHLOXVWUDGRHQHOGLDJUDPDGHOD¿JXUD$PXHV -tra la orientación del casete reportero con el promotor de

(JUGHQWURGHODFRQVWUXFFLyQ¿QDOGHVSXpVGHODUHFRP

-ELQDFLyQ KRPyORJD (O HPSDTXHWDPLHQWR GH ORV YLULRQHV IXHFRUURERUDGRSRUPLFURVFRStDHOHFWUyQLFDGHWUDQVPLVLyQ GHODVFpOXODVKXPDQDVGHULYDGDVGHOPHVRQHIURVHPEULRQD

-ULR+(.ODVFXDOHVH[SUHVDQGHPDQHUDFRQVWLWXWLYD OD VXEXQLGDG WUDQVFULSFLRQDO ( OR TXH GHPXHVWUD TXH HO

genoma del AdEgr-1/Luc7, es responsivo para iniciar la se-ñal del empaquetamiento adenoviral. 'HODPLVPDPDQHUD

ORVYLULRQHVREWHQLGRVWDPELpQPRVWUDURQFDSDFLGDGLQIHF

-WLYDGRFXPHQWDGDSRUODJHQHUDFLyQGH]RQDVOtWLFDVHQORV HQVD\RVGHSODFDHQPRQRFDSDGHFpOXODV+(.. Los vi-riones de AdCMV-GFPJHQHUDGRV\SXUL¿FDGRVSRUHOPLV

-PRPpWRGRWDPELpQPRVWUDURQH¿FLHQFLDHQODLQIHFFLyQGH ODVFpOXODVGHJOLRPD. (OVWRFNYLUDOGHAdEgr-1/Luc7IXH

REWHQLGRGHPDQHUDSDUDOHOD\UHSURGXFLEOHGHDFXHUGRDOR UHSRUWDGRSRU+HHWDO20

El adenovirus recombinante AdCMV-GFP fue capaz de

LQIHFWDUH¿FLHQWHPHQWHODVFpOXODVGHJOLRPD

'HELGRDTXHODDGVRUFLyQGHODGHQRYLUXVUHTXLHUHGHXQ PHFDQLVPR GH LQWHUQDOL]DFLyQ PHGLDGR SULQFLSDOPHQWH SRU HO UHFHSWRU &$5 &R[VDFNLH$GHQRYLUXV 5HFHSWRU OD LQIHFFLyQ HV GHSHQGLHQWH GH OD SUHVHQFLD \ Q~PHUR GH UHFHSWRUHV HQ OD VXSHU¿FLH GH FDGD HVWLUSH FHOXODU22 3DUD

GHWHUPLQDUODH¿FLHQFLDGHODWUDQVIHUHQFLDGHOVLVWHPDUH

-SRUWHURSRUHODGHQRYLUXVVHUHDOL]DURQHQVD\RVGHLQIHFWL

-YLGDGFRQHODGHQRYLUXVUHSRUWHUR$G&09*)3EDVDGR HQHOPLVPRVLVWHPD&RPRSULPHUSDVRIXHIXQGDPHQWDO GHWHUPLQDUODGRVLVySWLPDGHODVOtQHDVFHOXODUHV&+ *0*UDGR,,8*0*UDGR,,,\'*0*UDGR,9 FRQHOREMHWRGHHYLWDUHOHIHFWRFLWRWy[LFR/DVFpOXODVLQ

-IHFWDGDVFRQHOAdCMV-GFP 02,\

PRVWUDURQXQDH[SUHVLyQH¿FLHQWHGHOD*)3DODVKR

-UDV 6LQ HPEDUJR HO HIHFWR Wy[LFR GHO YLUXV IXH GLUHFWD -mente proporcional al incremento del número de viriones

GDWRVQRPRVWUDGRV(ODQiOLVLVSRUPLFURVFRSLDGHÀXR

-UHVFHQFLDGHWHUPLQRTXHHO02,ySWLPRIXHGHSDUWt

-FXODVYLUDOHVSRUFpOXODHQODVWUHVOtQHDVFHOXODUHV)LJXUD

2). %DVDGRVHQHVWHGDWRWRGRVORVHQVD\RVVHUHDOL]DURQ

FRQXQ02,GH

Efecto de GM-CSF en células de glioma transducidos con AdEgr-1/Luc7

*0&6) LQGXFH DFWLYLGDG WUDQVSFULSFLRQDO GHO SURPRWRU (JUVRORHQFpOXODV8*0/DH[SRVLFLyQD*0&6) QRWXYRHIHFWRVLJQL¿FDWLYRVREUHODOtQHD&+*0JUD

-GR ,, HQ OD FXUYD GH WLHPSR FRPSDUD-GR FRQ OD DFWLYLGDG EDVDO GH ODV FpOXODV GH FRQWURO *0&6) /D DFWLYLGDG GHOXFLIHUDVDHQODVFpOXODVWUDWDGDVVHPDQWXYRHQWUH\ &/VHJXQGRVHQODVGLIHUHQWHVGRVLVGHH[SRVLFLyQ/D

actividad más alta se encontró a las 12 horas

post-exposi-FLyQ)LJXUD(QHOFDVRGHODVFpOXODV'*0JUDGR,9

tampoco se encontró una actividad importante del promotor

HQORVWLHPSRVDQDOL]DGRV,QWHUHVDQWHPHQWHODOtQHD8 *0JUDGR,,,PRVWUyXQDDFWLYLGDGEDVDO*0&6)PD

-\RUTXHODVOtQHDV&+*0JUDGR,,\'*0JUDGR,9 )LJXUD/DDFWLYLGDGGHOXFLIHUDVDGHODVFpOXODV8 *0HQSUHVHQFLDGH*0&6)VHHQFRQWUySRUDUULEDGHOD DFWLYLGDGEDVDOGHOSURPRWRUFpOXODVFRQWUROVLQIiUPDFRD ODV\KRUDVFRQXQSLFRPi[LPRGHH[SUHVLyQKDVWD YHFHVDODVKRUDV&/VHJXQGRV(VWRVHWUDGX

-FHFRPRXQHIHFWRGHUHJXODFLyQSRVLWLYDVREUHODDFWLYLGDG WUDQVFULSFLRQDOGHOSURPRWRU(JUGHYHFHVHQUHODFLyQ

a la actividad basal.

La expresión de luciferasa inducida por fármacos esteroides en las células de glioma transformados con AdEgr-1/Luc7

3DUD GHWHUPLQDU HO HIHFWR GH ORV IiUPDFRV HVWHURLGHRV VR

-EUH OD DFWLYLGDG WUDQVFULSFLRQDO GHO SURPRWRU GH (JU ODV FpOXODV IXHURQ SUHYLDPHQWH LQIHFWDGDV FRQ HO DGHQRYL

-UXV$G(JU/XF \ PDQWHQLGDV HQ FRQFHQWUDFLRQHV EDMDV

de suero tratado con carbón activado con objeto de llevar la actividad del promotor en un medio sin elementos de

res-SXHVWD D VXHUR X KRUPRQDV HVWHURLGHDV (O GtD GHO HQVD\R GHLQGXFFLyQODVFpOXODVVHH[SXVLHURQDPHGLRIUHVFRFRQ ORVGLIHUHQWHVIiUPDFRVDGRVLVFRQRFLGDV\HVWDQGDUL]DGDV GDWRVQRPRVWUDGRV/RVHQVD\RVVHGHWXYLHURQDGLIHUHQ

-WHVWLHPSRV\KRUDV,QPHGLDWDPHQWHODVFpOXODV IXHURQODYDGDVUiSLGDPHQWHFRQ3%6Dƒ&\OLVDGDVFRQ PLFUROLWURVGHFHOO/\VLV%XIIHUSDUDH[WUDFFLyQGHODV SURWHtQDVWRWDOHV/DVSURWHtQDVIXHURQDOPDFHQDGDVDƒ& KDVWDODUHDOL]DFLyQGHORVHQVD\RVGHDFWLYLGDGGHOXFLIHUD

-VD\VXFXDQWL¿FDFLyQSRUOXPLQRPHWULD7RGRVORVHQVD\RV VHUHDOL]DURQSRUWULSOLFDGR

Efecto de fármacos esteroides en las células CH235-GM grado II

/DDFWLYLGDGEDVDOGHOSURPRWRUHQODVFpOXODV&+*0 LQIHFWDGDV FRQ AdEgr-1/Luc7, IXH GH

\ &/VHJXQGRV D OD \ KRUDV

respectivamente; la exposición a betametasona mostró un

SDWUyQLQKLELWRULRFRQXQSLFRPi[LPRDODVKRUDV Beta-metasona: &/VHJXQGRV,

D OD \ KRUDV UHVSHFWLYDPHQWH. La exposición a

HQHVWDOtQHDFHOXODU\VHKDFHPiVHYLGHQWHDODVKRUDV ȕHVWUDGLRO&/VHJXQGRVFRPSDUDGRFRQODDFWL

-YLGDGEDVDOGH&/VHJXQGRV/DSURJHVWHURQDQR PRVWUy HIHFWRV VLJQL¿FDWLYRV VREUH OD DFWLYLGDG GHO SURPR

-WRU(JUHQORVWLHPSRVHQVD\DGRVSDUDODVFpOXODV&+ *0Progesterona&/

VHJXQGRVDOD\KRUDVUHVSHFWLYDPHQWHXQHIHFWR LQKLELGRUVREUHODH[SUHVLyQ(JUVHHQFRQWUyDODVKRUDV FRPSDUDGRFRQODVFpOXODVGHFRQWUROVLQHPEDUJRODDFWLYL

-GDGDXPHQWDDODV\KRUDV)LJXUD

Efecto de células esteroides en células U373-GM grado III

/DOtQHDFHOXODU8*0PRVWUyXQDDFWLYLGDGEDVDOVLQ IiUPDFRV GH &/VH

-JXQGRV D OD \ KRUDV UHVSHFWLYDPHQWH /D H[SR

-VLFLyQ D EHWDPHWDVRQD PRVWUy XQD DFWLYLGDG GH OXFLIHUDVD

(Betametasona: \&/

VHJXQGRVDODV\KRUDVFRQXQSLFRPi[LPRD ODVKRUDVSRUHQFLPDGHODDFWLYLGDGEDVDO)LJXUD/D

H[SRVLFLyQDȕHVWUDGLROPDQWXYRXQSDWUyQSRUHQFLPDGH ODDFWLYLGDGEDVDOSULQFLSDOPHQWHDODVKRUDVȕHVWUDGLRO

\&/VHJDOD\

12 horas). El patrón de inducción por progesterona se

ob-VHUYyDODVKRUDVProgesterona

\&/VHJXQGRVDOD\KRUDVUHVSHFWLYD -mente).

Efecto de fármacos esteroides en células D54-GM grado IV

/D DFWLYLGDG EDVDO GH ODV FpOXODV VLQ H[SRVLFLyQ D IiUPD

-FRVPRVWUyXQLQFUHPHQWRSURJUHVLYRGH &/VHJXQGRV D OD \ KRUDV

respectivamente. La betametasona (Betametasona:

\ &/VHJXQGRV D OD \ KRUDV HO ȕHVWUDGLRO ȕHVWUDGLRO &/VHJXQGRVDOD\KRUDV\

la progesterona 3rogesterona:

&/VHJXQGRVDOD\KRUDVQRPRVWUD

-URQFDPELRVVLJQL¿FDWLYRVHQUHODFLyQDODDFWLYLGDGEDVDO )LJXUD

Figura 3. Efecto de GM-CSF sobre el promotor de Egr-1 en células de glioma humano.

Las células de las líneas CH235-GM grado II, U373-GM grado III y D54-GM IV fueron expuestas a GM-CSF a concentraciones crecientes de 1 ng, 3 ng, 5 ng, 10 ng y 20 ng. La luminometría fue medida a los tiempos 1, 3, 6 y 12 horas, resalta la actividad endógena de las células U373-GM mayor que la de las líneas CH235-GM y D54-GM.

CH235

-GCSF 1nM 3nM 5nM 10nM 20nM

139

70

2038 3220

96 166

2496 93 135

2191 86 123

2255 103 139

1382 96 182

D54

U373

CL/Seg

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

Figura 4. Efecto de diferentes fármacos esteroides sobre el promotor de Egr-1 en la línea celular CH235-GM, grado II.

La presencia de betametasona muestra una actividad por debajo de la basal, excepto a las 6 horas, (3,472.45 y 2,083.48 CL/Seg a la 1, 3, 6 y 12 horas respectivamente)6HREVHUYDXQDGLVPLQXFLyQGHODDFWLYLGDGGHOSURPRWRUHQSUHVHQFLDGHȕHVWUDGLRO/DSURJHVWHURQDPXHVWUD un patrón ligeramente progresivo después de las 6 horas.

Figura 5. Efecto de los fármacos esteroides sobre el promotor de Egr-1 en la línea celular U373-GM, grado III.

La actividad transcripcional del promotor Egr-1 en las células U373-GM expuestas a betametasona, mostraron un pico máximo de 2,923.92 &/6HJ(OȕHVWUDGLROPXHVWUDXQDUHJXODFLyQSRVLWLYDGHVGHODVKRUDV\XQSLFRPi[LPRDODVKRUDV/DVFpOXODVH[SXHVWDVDSURJHVWH-rona, también alcanzan este efecto a las 6 horas.

CL/Seg.

30000

25000

20000

15000

10000

5000

0

1 Hr 3 Hr 6 Hr 12 Hr

4534.7062

13330.0399

2083.7826

4156.68535 3546.9924

2582.0693

3472.4518

3220.8449 630.7586

570.5601

707.8544

1989.2441 115.1674

171.8395

105.8176

346.4962 Progesterona

Bestradiol

Betametasona

Control

Control 136.74157

157.63446 136.74157

274.51069

702.19891

574.83271 1227.40389

733.20049

1814.89178

2923.92873 2601.4078

3145.14147

1814.89178

2923.92873 2054.23526

1520.65583

1 Hr 3 Hr 6 Hr 12 Hr

Betametasona Bestradiol

Discusión

(OFUHFLPLHQWRFHOXODUHVXQIHQyPHQRFRPSOHMRHQODELR -logía celular; que se vuelve más complejo en la bio-logía de

ODVFpOXODVQHRSOiVLFDV6HKDUHSRUWDGRTXHODUHVLVWHQFLD GHODVFpOXODVQHRSOiVLFDVHVHOUHVXOWDGRGHXQDVHOHFFLyQ FORQDO LQGXFLGD HQ SDUWH FRPR UHVSXHVWD D OD FLWRGHIHQVD DORVDJHQWHVTXLPLRWHUDSpXWLFRVDQWLQHRSOiVLFRVUDGLRWH

-UDSLDHLQFOXVRDIDFWRUHVSDUiFULQRV\DXWyFULQRV_6LELHQ

HO HVWUpV ItVLFR FRPR OD UDGLDFLyQ OD OX] XOWUDYLROHWD OD WHPSHUDWXUD\IHQyPHQRVRVPyWLFRVGHVFULWRVFRPRLQGXF -tores de genes de respuesta celular temprana que activan

YtDVPLWRJpQLFDV0$3.LQDVDVRDQWLDSRSWyWLFDVPHGLDQWH HO EORTXHR GLUHFWR GH S _{HV IDFWLEOH VXSRQHU TXH HVWD} respuesta se presenta en condiciones neoplásicas que

pu-GLHUDQUHSHUFXWLUHQODVHOHFFLyQFORQDO\SRUORWDQWRDOFUH

-FLPLHQWRWXPRUDO/DFRDFWLYDFLyQGHYtDVGHVHxDOL]DFLyQ \ODWUDQVFULSFLyQGHJHQHVUHODFLRQDGDVFRQHOFUHFLPLHQWR SRUODYtDQRJHQpWLFDHVWiGHVFULWDHQFpOXODVWXPRUDOHVGH

glioma._{/DE~VTXHGDGHIDFWRUHVGHWUDQVFULSFLyQFRPR}

UHVSXHVWDDHVWRVHYHQWRVKDVLGRGHVFULWDSDUDRWURVJHQHV LQFOX\HQGRODGHOIDFWRUWUDQVFULSFLRQDO(JU24

(Q QXHVWUR PRGHOR ORV H[WUDFWRV SURWHLFRV GH FpOXODV LQIHFWDGDVFRQAdEgr-1/Luc7,H[SXHVWRVDGLIHUHQWHVGRVLV

Figura 6. Efecto de fármacos esteroides sobre el promotor de Egr-1 en la línea celular D54-GM, grado IV.

/DVFpOXODV'*0H[SXHVWDVDEHWDPHWDVRQDȕHVWUDGLRO\SURJHVWHURQDQRPRVWUDURQDFWLYLGDGVLJQL¿FDWLYDGLIHUHQWHFRQUHVSHFWRDO control.

GH *0&6) QR PRVWUDURQ XQD DFWLYLGDG VLJQL¿FDWLYD HQ ODVFpOXODV&+*0JUDGR,,\'*0JUDGR,96LQ HPEDUJRODVFpOXODV8*0JUDGR,,,H[SXHVWDVD*0 &6)PRVWUDURQLQFUHPHQWRGHODDFWLYLGDGWUDQVFULSFLRQDO GHOSURPRWRU(JUFRQLQFUHPHQWRGHODDFWLYLGDGGHOXFL

-IHUDVD)LJXUD

(VLQWHUHVDQWHTXHODIDOWDGHUHVSXHVWDGH*0&6)HQODV FpOXODV GH PHQRU JUDGR GH PDOLJQLGDG &+*0 *UD

-GR,,SXHGHH[SOLFDUVHSRUODQRLQWHUYHQFLyQGHO*0&6) HQODVYtDVGHDFWLYDFLyQPLWRJpQLFDVRDEORTXHRDXWyFULQR

de los elementos de respuesta a Egr-1 sobre su propio

pro-PRWRU/DDFWLYDFLyQGHOSURPRWRUHQODVFpOXODV8*0

se puede interpretar como la participación del promotor de

(JUGHPDQHUDDXWRUUHJXODGD(VWHKDOOD]JRHVFRQJUXHQ -te con los datos reportados por Mueller et al.,_{quienes han}

GHVFULWRXQDUHJXODFLyQDXWyFULQDSRVLWLYDGH*0&6)\VX UHFHSWRUHQGLIHUHQWHVPXHVWUDVGHJOLRPDVKXPDQRVORTXH

correlaciona con el grado de malignidad del tumor.

Consi-GHUDQGRTXH8*0JUDGR,,,HVXQWXPRUGHDOWRJUDGR GH PDOLJQLGDG QXHVWURV GDWRV VXJLHUHQ XQ PHFDQLVPR LQ

-WUtQVHFRSDUHFLGR3RURWUDSDUWHODH[SUHVLyQFRQVWDQWHGHO SURPRWRU(JUWDPELpQSXHGHGHEHUVHDTXHODFDVFDGDGH WUDQVGXFFLyQGHVHxDOHVTXHDFWLYDQDOSURPRWRUGHPDQHUD EDVDOHQHVWDOtQHDSHUPLWHXQDH[SUHVLyQLQFUHPHQWDGDGH ODOXFLIHUDVDLQGXFLGDSRUXQDYtDQRJHQpWLFDFRPRHVOD YtD GH 5DI0(.(U.(ON _{La activación del}

promo-Control

1 Hr 3 Hr 6 Hr 12 Hr

4297.70657

5353.5912

4170.6403

4863.2843 3118.53589

3004.6719

3964.3805

3846.7189 2051.97821

2372.16204

1718.926

1806.912 124.55089

170.8028

92.22803

191.22141 Betametasona

Bestradiol

Progesterona 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

WRU (JU HVWXGLDGR HQ HVWH UHSRUWH DSRUWD HOHPHQWRV TXH VXJLHUHQ HVWD KLSyWHVLV$GLFLRQDOPHQWH OD LQWHUDFFLyQ GH (JUFRQRWUDVSURWHtQDVFRPRSWDPELpQSRGUtDQHVWDU DVRFLDGDDOIHQyPHQRREVHUYDGRHQODVFpOXODV8*0 (VSRVLEOHTXHODVPXWDFLRQHVDVRFLDGDVDS\GHVFULWDV HQHVWDOtQHDFHOXODUQRSHUPLWDQODLQWHUDFFLyQFRQ(JU SDUD UHJXODU OD DFWLYLGDG GH DPERV \ TXH SXGLHUDQ HVWDU

presentes en este tipo de astrocitoma (astrocitoma anaplási-co) tal como ha sido descrito en cáncer de próstata.

3RURWURODGRQRVHKDLQYROXFUDGRODDFWLYDFLyQWUDQV -cripcional de Egr-1 como elemento responsivo a hormonas

HVWHURLGHV6HVDEHTXHDOJXQDVOtQHDVFHOXODUHVVRQUHVSRQ

-VLYDVHQPD\RURPHQRUJUDGRSRUODSUHVHQFLDGHORVUHFHS

-WRUHVDHVWUyJHQRVRSURJHVWHURQDVLQHPEDUJRQRVHVDEH

cuáles sean los mecanismos que participen en ellos.

Adi-FLRQDOPHQWHORVUHSRUWHVUHFLHQWHVPXHVWUDQXQSDQRUDPD GHUHVSXHVWDKRUPRQDOGHGLIHUHQWHVOtQHDVFHOXODUHVGHSHQ

-GLHQWHGHOFRQWH[WR¿VLROyJLFRRSDWROyJLFR_{la presencia}

\Q~PHURGHUHFHSWRUHVDSURJHVWHURQD\RHVWUyJHQRV2 _Este

es uno de los primeros reportes que describen una

asocia-FLyQ GH IiUPDFRV HVWHURLGHV \ *0&6) FRQ OD DFWLYDasocia-FLyQ WUDQVFULSFLRQDOVREUHHOSURPRWRUGHXQIDFWRUWUDQVFULSFLR -nal de respuesta temprana a crecimiento como Egr-1.

&RQFOXVLRQHV\SHUVSHFWLYDV

La respuesta de inhibición o activación transcripcional del

SURPRWRU(JUHQUHVSXHVWDGHORVIiUPDFRVHVWXGLDGRVHQ HVWHWUDEDMRPXHVWUDQXHYRVHVFHQDULRVSDUDODH[SORUDFLyQ GHORVHIHFWRVHSLJHQpWLFRVGHORVIiUPDFRVHVWHURLGHVVR

-EUH OD UHJXODFLyQ JHQpWLFD \ HQ QHRSODVLDV FHUHEUDOHV /D IDUPDFRJHQyPLFDPXHVWUDDVSHFWRVTXHSXHGHQURPSHUFRQ

los paradigmas tradicionales de mecanismos de acción de

KRUPRQD\IiUPDFRV

(VWHUHSRUWHWDPELpQSHUPLWHXQDSHUVSHFWLYDSDUDHO DQiOLVLVGHODWUDQVGXFFLyQGHVHxDOHVUHFHSWRUHVVHJXQ

-GRV PHQVDMHURV \ DFWLYDGRUHV HQ HO GHVDUUROOR WXPRUDO GH JOLRPDV SULPDULRV \ GHWHUPLQDU OD SDUWLFLSDFLyQ GH ORV HVWHURLGHV \ GHULYDGRV DVt FRPR VX LQWHUDFFLyQ GH RWUDV YtDV GH VHxDOL]DFLyQ FHOXODU_{HQ XQ FRQWH[WR IL}

-VLRSDWROyJLFRDJXGRRGHUHJXODFLyQGHODSUROLIHUDFLyQ

o muerte celular. 6H UHTXLHUHQ HVWXGLRV SRVWHULRUHV para determinar la inhibición o activación

transcripcio-QDOGHOSURPRWRU(JUTXHVHWUDGX]FDDXQDUHVSXHVWD VREUH OD YHORFLGDG GH OD SUROLIHUDFLyQ \ GLIHUHQFLDFLyQ FHOXODU DVt FRPR SDUD GHWHUPLQDU OD SRVLEOH HYDOXDFLyQ

de la actividad del promotor endógeno tumoral como

PDUFDGRU GH FUHFLPLHQWR SUROLIHUDFLyQ \ SURJUHVLyQ GH OD HQIHUPHGDG$GLFLRQDOPHQWH VX DVRFLDFLyQ FRQ RWUDV SURWHtQDVFRPRSNUDV9*)REFOSHUPLWLUiQOD DVRFLDFLyQ GH PXWDFLRQHV R YtDV GH VHxDOL]DFLyQ DOWHUD

-GDVTXHFRQIOX\HQHQODDFWLYLGDGGHOSURPRWRUHQFpOXODV

tumorales.

El sistema reportero transducido mediante un vector

ade-QRYLUDO QR UHSOLFDWLYR HPSOHDGR HQ HVWH UHSRUWH SXHGH VHU

traspolado a otros modelos para estudiar la regulación trans-cripcional de genes relacionados con el crecimiento tumoral

\ODUHVSXHVWDDDJHQWHVItVLFRVWDOHVFRPRODUDGLDFLyQJDP

-PDRODOX]XOWUDYLROHWDFRQHOREMHWRGHHVWXGLDUODVSRVLEOHV

interacciones o respuestas celulares en presencia de un

in-GXFWRUGHHVWUpVFHOXODUPDVD~QODSRVLELOLGDGGHLGHQWL¿FDU PHFDQLVPRVGHUHJXODFLyQWUDQVFULSFLRQDOGHOSURPRWRUSHU -mite el conocimiento de reguladores positivos para conducir

OD H[SUHVLyQ GH GLYHUVRV JHQHV GH LQWHUpV HQ HVWUDWHJLDV GH

terapia con genes. Los reportes previos en el uso del

promo-WRUFRPRUHJXODGRUSRWHQFLDOSDUDODH[SUHVLyQGHSURWHtQDV LQFOX\HGHVGHODVSURDSRSWyWLFDVS%D[RODH[SUHVLyQ GH JHQHV VXLFLGDV WLPLGLQD FLQDVDV +697. GHVDPLQDVD GHFLWRVLQDRIDFWRUHVTXHPRGXODQODGLIHUHQFLDFLyQFHOX

-ODURIUHFHXQHVFHQDULRSURPHWHGRUGHDSOLFDFLRQHVELRWHUD

-SpXWLFDFRQUHJXODFLyQ¿QD\SUHFLVDGHODH[SUHVLyQJpQLFD HPSOHDQGR IiUPDFRV FRQRFLGRV HQ OD SUiFWLFD FOtQLFD \ OD SRVLELOLGDGGHH[SORUDURWUDVDSOLFDFLRQHVFRPRODGLIHUHQ

-FLDFLyQFLFDWUL]DFLyQ\ODUHJHQHUDFLyQGHWHMLGRV8QVXHxR PXFKRWLHPSRDFDULFLDGRSRUODWHUDSLDJpQLFD

Agradecimientos a:

Dra. Khatleen Sakamoto.'LYLVLyQGH+HPDWRORJtD2QFR

-ORJtDGHO&KLOGUHQV+RVSLWDORI8&/$/RV$QJHOHV&$ 86$3RUSURSRUFLRQDUODVHFXHQFLDGHOSURPRWRU(JUKX -mano usado en este reporte.

Dr. Bert VogelsteinGHOD8QLYHUVLGDG-RKQV+RSNLQV

86$SRUHOVRSRUWHWpFQLFRFLHQWt¿FR\ODGRQDFLyQGHOVLV -tema AdEasy.

(VWHSUR\HFWRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHO,&<7')DWUDYpV GHOSUR\HFWRPIFUT08-169HO&21$&<7\OD6HFUHWDUtDGH

6DOXGDWUDYpVGHOSUR\HFWRFOSIS-Salud-2011-1-161624.

Referencias

+HUQiQGH]5H\QD 5 0HGHOOtQ6iQFKH] 5 &HUGD)ORUHV 50 &DOGHUyQ*DUFLGXHxDV $/ 6XUYLYDO SURQRVWLF IDFWRUV LQ 0H[LFDQ SDWLHQWV ZLWK PXOWLIRUPH JOLREODVWRPD 5HY 0HG ,QVW 0H[ 6HJXUR 6RF

6DNDPRWR .0 %DUGHOHEHQ & <DWHV .( 5DLQHV 0$ *ROGH ': *DVVRQ-&XSVWUHDPVHTXHQFHDQGJHQRPLFVWUXFWXUHRIWKHKXPDQ SULPDU\UHVSRQVHJHQH(*57,62QFRJHQH $LFKHU:.6DNDPRWR.0+DFN$(LEHO+$QDO\VLVRIIXQFWLRQDO

HOHPHQWV LQ WKH KXPDQ (JU JHQH SURPRWHU 5KHXPDWRO ,QW

S6WUHVVDFWLYDWHG 3URWHLQ .LQDVH ,V 0HGLDWHG E\ D F$03 UHVSRQVLYH 3URPRWHU (OHPHQW LQ D 0$3.$3 NLQDVH LQGHSHQGHQW 0DQQHU-%LRO&KHP

-RVHSK /- /H %HDX 00 -DPLHVRQ *$ -U$FKDU\D 6 6KRZV7% 5RZOH\ -' HW DO 0ROHFXODU FORQLQJ VHTXHQFLQJ DQG PDSSLQJ RI (*5 D KXPDQ HDUO\ JURZWK UHVSRQVH JHQH HQFRGLQJ D SURWHLQ ZLWK ]LQFELQGLQJ ¿QJHU VWUXFWXUH 3URF 1DWO $FDG 6FL 86$

+VX + 5DLQRY 1* 4XLQRQHV $ (OLQJ '- 6DNDPRWR .0 6SHDU 0$ &RPELQHG UDGLDWLRQ DQG &\WRFKURPH &<3% LSRPHDQROJHQHWKHUDS\XVLQJWKH(*5SURPRWHU$QWLFDQFHU5HV %

/L 6 6\PRQGV$/- =KX % /LX 0 5D\PRQG 09 0LDR 7 HW DO (DUO\*URZWK5HVSRQVH*HQH(JU5HJXODWHVWKH'HYHORSPHQW RI%DQG7FHOOV3/R62QHH

3DVVLDWRUH * *HQWLOHOOD $ 5RP 6 3DFL¿FL 0 %HUJRQ]LQL 9 3HUX]]L ) ,QGXFWLRQ RI ,G E\ )*) LQYROYHV DFWLYLW\ RI (*5 DQG VHQVLWL]HV QHXUREODVWRPD FHOOV WR FHOO GHDWK - &HOO 3K\VLRO

;LH % :DQJ & =KHQJ = 6RQJ % 0D & 7KLHO * HW DO (JU 7UDQVDFWLYDWHV%LP*HQH([SUHVVLRQWR3URPRWH1HXURQDO$SRSWRVLV -1HXURV

*XELQD ( /XR ; .ZRQ ( 6DNDPRWR . 6KL <) 0XIVRQ 5$ ‰ &\WRNLQH5HFHSWRU,QGXFHG6WLPXODWLRQRIF$035HVSRQVH(OHPHQW %LQGLQJ 3URWHLQ 3KRVSKRU\ODWLRQ 5HTXLUHV 3URWHLQ .LQDVH & ,Q 0\HORLG &HOOV$ 1RYHO &\WRNLQH 6LJQDO 7UDQVGXFWLRQ &DVFDGH -,PPXQRO

6FKZDFKWJHQ -/ &DPSEHOO &- %UDGGRFN 0 )XOO 3URPRWHU 6HTXHQFH RI +XPDQ (DUO\ *URZWK 5HVSRQVH )DFWRU (JU 'HPRQVWUDWLRQRID)LIWK)XQFWLRQDO6HUXP5HVSRQVH(OHPHQW'1$ 6HT

=KDQJ : &KHQ 6 (*5 D 89LQGXFLEOH JHQH LQ S 0RXVH &HOOV([S&HOO5HV

'DWWD55XELQ(6XNKDWPH94XUHVKL6+DOODKDQ':HLFKVHOEDXP 55HWDO,RQL]LQJUDGLDWLRQDFWLYDWHVWUDQVFULSWLRQRIWKH(*5JHQH YLD &$U* HOHPHQWV 3URF 1DWO$FDG 6FL 86$

%XWWLJOLRQH 0 5RFD / 0RQWHPXUQR ( 9LWLHOOR ) &DSR]]L 9 &LEHOOL*5DGLRIUHTXHQF\UDGLDWLRQ0+]LQGXFHV(JUJHQH H[SUHVVLRQ DQG DIIHFWV FHOOF\FOH FRQWURO LQ KXPDQ QHXUREODVWRPD FHOOV-&HOO3K\VLRO

*RQ]iOH]$JHUR * *XWLpUUH] $$ *RQ]iOH](VSLQRVD ' 6RODQR -'0RUDOHV5*RQ]iOH]$UHQDV$HWDO3URJHVWHURQHHIIHFWVRQFHOO JURZWKRI8DQG'KXPDQDVWURF\WRPDFHOOOLQHV(QGRFULQH

&DORJHUR$/RPEDUL9'H*UHJRULR*3RUFHOOLQL$8FFL6$UFHOOD $ HW DO ,QKLELWLRQ RI FHOO JURZWK E\ (*5 LQ KXPDQ SULPDU\ FXOWXUHVIURPPDOLJQDQWJOLRPD&DQFHU&HOO,QW %HQ] $+ 6KDMDUL 0 3HUX]NL 1 'HKJKDQL ) 0DURQGH ( (DUO\

JURZWK UHVSRQVH LQGXFWLRQ E\ ¿EUREODVW JURZWK IDFWRU YLD LQFUHDVHRIPLWRJHQDFWLYDWHGSURWHLQNLQDVHDQGLQKLELWLRQRISURWHLQ NLQDVH%LQKLSSRFDPSDOQHXURQV%U-3KDUPDFRO

6DNDPRWR .0 )UDVHU -. /HH +- /HKPDQ ( *DVVRQ -& *UDQXORF\WHPDFURSKDJHFRORQ\VWLPXODWLQJIDFWRUDQGLQWHUOHXNLQ VLJQDOLQJSDWKZD\VFRQYHUJHRQWKH&5(%ELQGLQJVLWHLQWKHKXPDQ HJUSURPRWHU0RO&HOO%LRO

.LP -+ -HRQJ ,< /LP< /HH<+ 6KLQ 6< (VWURJHQ UHFHSWRU ‰ VWLPXODWHV (JU WUDQVFULSWLRQ YLD 0(.(UN(ON FDVFDGH LQ & JOLRPDFHOOV%0%5HS

+H 7& =KRX 6 GD &RVWD /7 <X - .LQ]OHU .: 9RJHOVWHLQ %$ VLPSOL¿HG V\VWHP IRU JHQHUDWLQJ UHFRPELQDQW DGHQRYLUXVHV 3URF 1DWO$FDG6FL86$

0DUWtQH])UDQFLVFR9HQWXUD*DOOHJRV-RVp/XLV(VWUDGD9LOODVHxRU(UpQGLUD *9LOOHJDV&DVWUHMyQ+LOGD&UX]=DUDJR]D(SLIDQLR&RYDUUXELDV5REOHV /XLV HW DO ³(QKDQFHG VSOHQLF SURWHFWLRQ DQG UHGXFWLRQ RI SDUDVLWDHPLD IROORZLQJWUDQVSODQWDWLRQRIVSOHQRF\WHVRYHUH[SUHVVLQJ%FOLQDPXULQH PDODULDPRGHO´*HQH7KHU0RO%LRO

0DUWtQH])ORUHV ) -LPpQH]2UR]FR )$ 9LOOHJDV&DVWUHMyQ + 0ROHFXODUELRORJ\RIDGHQRYLUDOYHFWRUV&LU&LU 0DUWtQH]))6DNDPRWR.0DFKXFD5&6DQGRYDO/9LOOHJDV&+

³$G(JU/XF DGHQRYLUDO YHFWRU LV IXQFWLRQDOO\ DFWLYDWHG E\ 89 /LJKW´0RO7KHU

&DORJHUR$3RUFHOOLQL$/RPEDUL9)DEELDQR&$UFHOOD$0LVFXVL 0 HW DO 6HQVLWLYLW\ WR FLVSODWLQ LQ SULPDU\ FHOO OLQHV GHULYHG IRUP KXPDQ JOLRPD FRUUHODWHV ZLWK OHYHOV RI (*5 H[SUHVVLRQ &DQFHU &HOO,QW

0XHOOHU 00 +HUROG0HQGH && 5LHGH ' /DQJH 0 6WHLQHU ++ )XVHQLJ 1( $XWRFULQH *URZWK 5HJXODWLRQ E\ *UDQXORF\WH &RORQ\6WLPXODWLQJ )DFWRU DQG *UDQXORF\WH 0DFURSKDJH &RORQ\ 6WLPXODWLQJ)DFWRUDQG*UDQXORF\WH0DFURSKDJH&RORQ\6WLPXODWLQJ )DFWRU LQ +XPDQ *OLRPDV ZLWK 7XPRU 3URJUHVVLRQ $P - 3DWKRO

%DGLH%*RK&6.ODYHU-+HUZHLMHU+%RRWKPDQ'$&RPELQHG UDGLDWLRQ DQG S JHQH WKHUDS\ RI PDOLJQDQW JOLRPD FHOOV &DQFHU *HQH7KHU

/LX-*URJDQ/1DX00$OOHJUD&-&KX(:ULJKW--3K\VLFDO LQWHUDFWLRQ EHWZHHQ S DQG SULPDU\ UHVSRQVH JHQH (JU ,QW -2QFRORJ\

9LUROOH7.URQHV+HU]LJ$%DURQ9'H*UHJRULR*$GDPVRQ(' 0HUFROD'(JU3URPRWHV*URZWKDQG6XUYLYDORI3URVWDWH&DQFHU &HOOV ,GHQWL¿FDWLRQ RI 1RYHO (JU 7DUJHW *HQHV - %LRO &KHP

0DQGRNL--*DUFtD0RQGUDJyQ0-&DVD7LUDR%-LPpQH]2UR]FR )$5HÀHFWLRQVRQWKH0RGHRI)XQFWLRQLQJRI(QGRFULQH6\VWHPV $UFK0HG5HV

.DEDW*&(WJHQ$05RKDQ7('R6WHURLG+RUPRQHV3OD\D5ROH LQ WKH (WLRORJ\ RI *OLRPD" &DQFHU (SLGHPLRO %LRPDUNHUV 3UHY

5LWFKLH 0) =KRX < 6RERORII - :7(*5PHGLDWHG &RQWURO RI 67,0 ([SUHVVLRQ DQG )XQFWLRQ LQ &DQFHU &HOOV )URQW %LRVFL

(UQVW$$LJQHU01DNDWD6(QJHO)6FKORWWHU0.ORRU0HWDO$ JHQHVLJQDWXUHGLVWLQJXLVKLQJ&'KLIURP&'FRORUHFWDOFDQFHU FHOOV HVVHQWLDO UROH IRU (*5 DQG GRZQVWUHDP IDFWRUV 3DWKRORJ\

0DQFXVR0/HRQDUGL6*LDUGXOOR33DVTXDOL(%RUUD)6WHIDQR ,' HW DO 7KH HVWURJHQ UHFHSWRU EHWD DJRQLVW GLDU\OSURSLRQLWULOH '31LQKLELWVPHGXOOREODVWRPDGHYHORSPHQWYLDDQWLSUROLIHUDWLYH DQGSURDSRWRWLFSDWKZD\V&DQFHU/HWW 6KLPR\DPDGD + <D]DZD 7 6DWR + 2NXGHOD . ,VKLL - 6DNDHGD